KR20170026350A - 가닥-침투 기반 dna 증폭방법 - Google Patents

가닥-침투 기반 dna 증폭방법 Download PDF

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Abstract

가닥 침투를 포함하는 표적 핵산 서열의 증폭 방법이 제공되되 여기서 가닥 침투는 표적 핵산 서열의 상향 및 하향 영역들 양자 모두에서 일어난다. 또한 이러한 방법에서 사용되는데 적합한 키트 및 조성물도 제공된다. 이 방법들은 미지 서열 영역을 포함하는 표적 핵산 서열을 증폭시키거나 미지 서열 영역을 포함하는 표적 핵산의 서열을 탐지하는 것을 포함할 수 있다.

Description

가닥-침투 기반 DNA 증폭방법{STRAND-INVASION BASED DNA AMPLIFICATION METHOD}
본 발명은 가닥 침투 (strand invation)을 포함하는 표적 핵산 서열의 증폭 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용되는데 적합한 키트 및 조성물에 관한 것이다.
가닥 침투에 의해 표적 핵산 서열을 증폭시키는 방법은 예컨대 WO2009/150467에 개시되어 있다. 표적 핵산 서열의 침투는 표적 듀플렉스를 오픈하여 상향 및 하향 프라이머들 양자 모두의 결합을 가능케 하는, 단일 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 의해 매개된다.
발명의 개요
본 발명은 적어도 2개의 위치에서 표적 핵산 서열의 가닥 침투를 위한 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용하여 표적 핵산 서열의 상향 및 하향 영역들에 결합 및 침투함으로써, 상향 및 하향 프라이머들을 결합시켜 표적 핵산 서열을 증폭시킨다.
상향 및 하향 위치 양방 모두에서 표적 핵산 서열의 가닥 침투가 제공되면 각 프라이머 결합 이벤트가 가닥 침투 이벤트와 커플링되어 증폭 프라이머들과 중첩되지 않는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 서열들의 사용 가능성이 증가된다. 2개의 상이한 위치에서 매개된 가닥 침투는 또한 일반적으로 한 지점의 가닥 침투로부터 증폭될 수 있는 것 보다 더 긴 표적 핵산 서열들을 증폭시킨다는 장점도 제공한다.
이에 더해, 적절한 결합 서열들이 표적 서열의 상향 및 하향 영역 양쪽 모두에 존재할 경우, 동일한 가닥 침투 종들(species)이 상향 및 하향 위치 양쪽 모두에서 침투할 수 있다. 마찬가지로, 단일 프라이머 종들이 이용될 수도 있는데 이 경우 적절한 서열 결합 서열이 표적 서열의 양쪽 영역 모두에 존재한다. 이러한 구체예들은 표적 서열을 포함하는 주형(template)에 공지의 결합 영역들(이를테면 어댑터 서열들)존재하는, 미지의 서열들의 증폭 및 시퀀싱을 가능케 한다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들은 또한 듀플렉스 표적 핵산 서열의 향 및 하향 결합 영역들에 또 다른 배열로 결합하도록 설계될 수도 있다. 이것은 특정 앰플리콘의 표적화를 위한 서열 디자인을 다양화시켜 증폭 파라미터들을 최적화시키는 기회를 제공한다. 또한, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머들은 비-중첩 결합 영역들을 갖도록 설계될 수 있어 앰플리콘의 영역이 프로브에 대한 결합이 가능하도록 남아 있을 수 있음으로 해서, 증폭 동안 앰플리콘에 대한 결합을 두고 일어나는 올리고뉴클레오타이드 종들 간의 경쟁을 감소시키고 비-특이적인 증폭 산물들이 검출되지 않게 한다. 따라서, 본 발명은 표적 핵산 서열의 증폭 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 상기 표적 핵산 서열을, 상기 표적 핵산 서열의 증폭을 촉진하는 조건, 즉 제1 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산 서열의 상향 결합 영역을 단일-가닥으로 만들어 상향 프라이머의 결합을 허용하고, 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산 서열의 하향 결합 영역을 단일-가닥으로 만들어 하향 프라이머의 결합을 허용하는 조건 하에, 적어도 한 개의 상향 프라이머, 적어도 한 개의 하향 프라이머 및 제1 및 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 상향 및 하향 결합 영역들을 포함하는 표적 핵산 서열의 증폭 방법을 추가로 제공하되, 상기 방법은 상기 표적 핵산 서열을 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 한 개 이상의 프라이머들과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열의 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 단일-가닥으로 만들어 상기 한 개 이상의 프라이머들의 결합을 허용하는 것이다.
본 발명은 또한 표적 핵산 서열에 대한 적어도 한 개의 상향 및 적어도 한 개의 하향 프라이머 및 표적 핵산 서열 중에 각각 상향 및 하향 결합 영역들을 갖는 제1 및 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들을 포함하는 키트도 제공한다.
본 발명은 또한 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 한 개 이상의 프라이머들, 및 적어도 한 개의 DNA 어댑터를 포함하를 포함하는 키트도 제공하는데, 여기서 상기 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열의 상향 결합 영역 및 하향 결합 영역에 존재하는 경우 DNA 어댑터에 결합할 수 있고, 상기 한 개 이상의 프라이머들은 상기 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 것이다.
본 발명은 또한 미지 서열 영역을 포함하는 표적 핵산 서열의 증폭 방법도 제공하는데 상기 방법은 상기 미지 서열 영역의 상향 및 하향에 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 표적 핵산 서열을 만들고, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들 및 프라이머들을 이용하여 본 발명의 방법을 수행하여 표적 핵산 서열을 증폭시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 미지 서열 영역을 포함하는 표적 핵산의 서열을 탐지하는 방법도 제공하는데, 이 방법은 상기 미지 서열 영역의 상향 및 하향에 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 표적 핵산 서열을 만들고, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들 및 프라이머들을 이용하여 본 발명의 방법을 수행하여 표적 핵산 서열을 증폭시킨 다음, 상기 미지 서열 영역의 서열을 탐지하는 것을 포함한다.
발명의 상세한 설명
기술분야의 특정 필요에 따라 개시된 방법들이 적절히 달리 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에 사용된 용어들은 오직 본 발명의 특정 구체예들을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도느 s아니다. 이에 더해, 명세서와 청구범위에 걸쳐 사용된 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 달리 명시되지 않는 한 복수 형태를 포함하는 것이다. 그러므로, 예컨대 "폴리펩타이드(a polypeptide)"라는 표현은 2개 이상의 그러한 폴리펩타이드들을 포괄하는 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그 내용 전체가 본 발명에 참조 통합된다.
표적 핵산 서열의 증폭 방법
본 발명의 방법은 두 개의 별개 부위에서의 핵산의 가닥 침투에 의해 표적 핵산 서열을 증폭시킨다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 의해 매개된 각 부위에서의 가닥 침투는 표적 핵산 서열을 단일-가닥으로 만들어 프라이머에 대한 결합을 허용한다. 프라이머들은 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)의 부재시 표적 핵산 서열과 접촉한 경우에는 일반적으로 표적 핵산 서열을 증폭시키지 못한다. 달리 설명하면, 프라이머들은 그들의 결합 영역들을 단일-가닥으로 만드는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들에 그들의 결합 영역들이 노출되지 않는 한, 표적 핵산 서열 중의 그들의 결합 영역들에 결합하지 못한다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들은 또한 일반적으로는 DNA 폴리머라제에 의해 신장시킬 수 없다. 특히, 본 발명의 방법은 표적 핵산 서열이 핵산 듀플렉스로 존재하는 등온 조건 하에서 표적 핵산 서열을 증폭시키는 것이 바람직하다. 듀플렉스의 적어도 2개 부위에서의 가닥 침투는 등온 조건 하에서 표적 핵산 서열을 단일-가닥으로 만들어, 프라이머-기반 증폭을 허용한다.
표적 핵산 서열
표적 핵산 서열은 그 기원을 불문하고, 인공적이건 자연발생적이건 무방하다. 표적 핵산 서열은 공지 서열 또는 공지 및 미지 서열 영역을 포함할 수 있다.표적 핵산 서열은 인간, 포유동물, 세균 또는 바이러스성일 수 있다. 표적 핵산 서열은 유전자 또는 염색체 영역일 수 있다. 표적 핵산 서열은 DNA 증폭에 의해 탐지하고자 하는 생명체(이를테면 병원균) 또는 유전형에 특이적인 것일 수 있다. 표적 핵산 서열은 특정 종들의 게놈에 대해 독특한(unique) 것일 수 있다. 그러므로, 특정 종을 탐지하기 위한 표적 핵산 서열은 일반적으로 관련된 종 중의 상동 핵산 서열과는 일반적으로 상이하다. 일반적으로, 표적 핵산 서열은 관련 종들 중의 상동 핵산 서열과 수 개의 미스맷치들을 포함한다. 표적 핵산 서열은 특정한 세균 균주 또는 특정한 혈청형, 바이러스의 분기군(clade)에 특이적인 서열일 수 있다.
탐지하고자 하는 표적 핵산 서열의 크기와 서열은 어느 것이든 무방하다. 표적 핵산 서열 또는 앰플리콘은 상향 및 하향 프라이머들의 혼성화(hybridisation) 및 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)을 적절한 방식으로 표적 서열의 상향 및 하향 부위에 결합시키는데 충분한 길이를 갖는다. 앰플리콘은 일반적으로 상향 프라이머의 5' 결합 부위로부터 하향 프라이머의 5' 결합 부위를 측정할 경우 길이가적어도 60 뉴클레오타이드, 더욱 좋기로는 길이가 적어도 65, 또는 적어도 70 뉴클레오타이드인 것이 바람직하다. 앰플리콘은 길이가 약 60 내지 약 80 뉴클레오타이드일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 앰플리콘은 길이가 80 뉴클레오타이드 초과, 이를테면 100 뉴클레오타이드 초과, 이를테면 150, 200, 300, 400, 500, 1000 뉴클레오타이드 또는 그 이상의 길이일 수 있다. 앰플리콘은 길이가 약 70 내지 약 1000 뉴클레오타이드, 이를테면 길이가 약 70 내지 약 800, 약 70 내지 약 600, 약 70 내지 약 500 뉴클레오타이드, 길이가 약 70 내지 약 400, 약 100 내지 약 400, 또는 약 100 내지 약 200 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 방법에 적합한 표적 핵산 서열들의 예에는 SEQ ID NOs 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20 및 26이 포함된다.
표적 핵산 서열은 각각 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머에 대한 결합 영역들을 포함하는 상향 (5') 및 하향 (3') 영역들을 포함한다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머에 대한 상향 결합 영역들은 서열 내에서 중복되거나 또는 중복되지 않을 수 있다. 마찬가지로, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머에 대한 하향 결합 영역들 역시 서열 내에서 중복되거나 또는 중복되지 않을 수 있다. 표적 핵산 서열은 또한 한 개 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브들에 대한 결합 영역들을 포함할 수도 있다. 프로브에 대한 결합 영역들은 서열 내에서 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및/또는 프라이머에 대한 상향 또는 하향 결합 영역들과 중복될 수 있고 또는 어떠한 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 또는 프라이머에 대한 결합 영역과도 중복되지 않을 수 있다. 프로브에 대한 결합 영역은 좋기로는 표적 핵산 서열의 상향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역과 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역 사이에 위치할 수도 있다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들, 프라이머들 및 프로브에 대한 결합 영역들의 선택 및 이들에 대한 적절한 서열의 설계에 관하여는 이하에서 상세히 설명하기로 한다.
가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들, 프라이머들 및 프로브들에 대한 결합 영역들의 길이는 이하에서 상세히 설명되는 바와 같이, 그에 포함된 표적에 대한 상보 서열들의 길이에 의해 정의된다. 후술되는 바와 같이, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 표적에 대해 적어도 25 뉴클레오타이드 길이의 상보 서열을 포함하고, 프라이머는 적어도 10개 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 따라서, 표적 서열의 각각의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역은 길이가 적어도 25 뉴클레오타이드이고, 각각의 프라이머 결합 영역은 길이가 적어도 10 뉴클레오타이드일 수 있다. 표적 서열은 적어도 10 뉴클레오타이드 길이의 프로브 결합 영역을 추가로 포함할 수 있다.
상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들은 표적 핵산 서열의 동일 가닥 내에 존재할 수도 있고, 그 표적 핵산 서열을 포함하는 듀플렉스의 반대 가닥에 위치할 수도 있다. 그러므로 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)은 동일한 가닥에서 평행 방향으로 5'에서 3'으로 동일 방향으로 정렬하여 표적 핵산 서열과 결합할 수 있다. 별법으로, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)은 표적 핵산 서열의 반대 가닥과 역평행 방향으로 결합하되, 표적 듀플렉스 상에서 반대 방향으로 5'에서 3'으로 정렬될 수 있다. 역평행 방향에서는, 각각의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단들이 서로를 향해 또는 서로로부터 멀어지도록 배향될 수 있다. 따라서, 각각의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단들은 앰플리콘의 중심을 향하거나(역평행 배열) 또는 그의 각각의 앰플리콘 종점을 향할 수 있다 (반 역평행 배열). 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단은 각 프라이머에 대한 결합 영역에 근접하여(proximal) 결합할 수 있다. 전술한 결합 배열들을 도 1에 나타내었다.
특정한 결합 배열들을 사용함으로써 증폭 파라미터들에 대체 효과를 줄 수 있다. 예를 들어, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드가 각 프라이머에 대한 결합 영역 근방에 위치한 그의 5' 말단과 결합할 경우, 그 프라이머의 결합은 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 근방의 프라이머 결합과 상이한 특이성 및 키네틱 프로파일을 가질 수 있다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단은 일반적으로 그에 근접한 프라이머 결합의 결합 상호작용에 영향을 미칠 수 있는 몇몇 변형된 뉴클레오타이드(이를테면 2'-O-메틸 RNA 뉴클레오타이드)를 포함한다. 평행 및 반 역평행 배열의 경우에도, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들(일반적으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는)의 3' 말단의 브랜치 이동(branch migration)이 프라이머 결합이 가능하기 전에 필요하므로 증폭 특이성이 향상될 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명의 방법은 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)의 결합 배열을 변형시킴으로써 증폭 특이성 및 증폭 속도의 변형을 제공하는 것이다.
표적 핵산 서열의 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들은 동일한 종의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 따라서, 이하에서 후술하는 바와 같이, 단일 종의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드를 제공하여 표적 핵산 서열의 두 지점에서 가닥 침투를 개시할 수 있다. 이 구체예에서, 상향 및 하향 결합 영역들 각각은 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 적어도 일부분에 대한 상보 서열을 각각 포함한다. 상향 및 하향 결합 영역들은 일반적으로 서로 상동성(homologous)이거나 동일하다. 상향 및 하향 결합 영역들은 서로 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동적 또는 동일하거나, 또는 완전히 동일하다. 상향 및 하향 결합 영역들은 서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개, 이를테면 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 미스맷치들을 가질 수 있다. 이에 더해, 이하에서 후술되는 바와 같이, 단일 종의 프라이머를 제공하여 표적 핵산 서열의 두 지점에서 증폭을 개시할 수 있다. 이 경우 표적 핵산 서열은 각기 적어도 프라이머의 일부에 대한 상보 서열을 포함하며 전술한 바와 같이 서로 상동적이거나 동일할 수 있다.
상이한 표적 핵산 서열에 대해 각각 특이적인 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들), 프라이머들 (및 임의로 프로브들)의 복수개의 조합을 제공함으로써 본 발명의 방법으로 두 개 이상의 표적 핵산 서열을 탐지할 수 있다. 일반적으로, 상이한 표적 핵산 서열들에 결합하는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드/프라이머 쌍 및/또는 프로브들을 상이한 형광단/소광단(형광단/소광단) 쌍으로 표지하여, 다중화(multiplexing)를 꾀한다. 적어도 2, 3, 4, 5, 10개 또는 그 이상의 상이한 표적 서열들이 탐지될 수 있다. 동일한 개체로부터 두 개 이상의 표적 핵산 서열이 탐지될 수 있다. 별법으로, 적어도 2, 3, 4, 5, 10개 또는 그 이상의 상이한 유전형, 개체 또는 병원체에 특이적인 표적 핵산 서열들이 탐지될 수 있다.
상향 및 하향 프라이머들 ( Upstream and downstream primers )
관심 대상 표적 핵산 서열에 기초하여, 그리고, 상향 또는 표적 핵산 서열의 하향 결합 영역을 단일-가닥으로 만들어 각각의 프라이머들과의 결합을 허용하는 각각의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 결합 부위와 관련해서, 적절한 상향 및 하향 프라이머들을 선택한다.
상향 및 하향 프라이머들은 표적에 대해 부분적으로 또는 완전히 상보적인 서열 및 임의로 5' 및/또는 3' 플랭킹(flanking) 비-상보 서열을 포함한다. 별법으로, 상향 및 하향 프라이머들은 표적에 대해 부분적으로 또는 완전히 상보적인 서열만으로 구성될 수도 있다. 표적에 상보적인 프라이머 서열의 길이는 표적 핵산 서열과 특이적인 혼성화를 제공하는데 충분한 길이이다. 상보 서열의 길이는 적어도 10 뉴클레오타이드, 더욱 좋기로는 적어도 15, 적어도 16, 또는 적어도 17 뉴클레오타이드이다. 상보 서열의 길이는 10-25, 15-25, 10-30 또는 15-30 뉴클레오타이드일 수 있다.
전술한 서열 길이는 표적 핵산 서열과 부분적으로 또는 완전히 상보적일 수 있는 프라이머들의 일부의 길이를 가리키는 것이다. 프라이머들과 표적 서열 사이의 특정 위치에서 미스맷치들이 존재할 수 있지만, 그런 한편으로 여전히, 특히 상향 및 하향 프라이머들의 조합 사용과 증폭시키고자 하는 표적 핵산 서열의 상향 및 하향 영역들에 대한 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)의 결합시 표적 서열의 특이적인 증폭 및 탐지가 가능하다. 프라이머의 상보 영역과 표적 서열의 대응하는 영역들 사이에는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 미스맷치들이 존재할 수 있다.
일반적으로, 상향 및 하향 프라이머는 총 길이가 30 뉴클레오타이드 미만, 더욱 좋기로는 길이가 25 뉴클레오타이드 미만, 이를테면 15 내지 25, 또는 15 내지 23 뉴클레오타이드 길이이다. 가닥 침투에 재조합효소가 사용되는 경우 길이가 30 뉴클레오타이드 미만인 프라이머들을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 프라이머들을 재조합효소에 대한 기질로서 작용할 수 없다. 몇몇 구체예에서, 길이가 15 뉴클레오타이드 미만인 프라이머들, 이를테면 길이가 약 8 내지 약 14, 약 10 내지 약 14 또는 약 12 내지 약 14 뉴클레오타이드인 프라이머들이 사용될 수 있다. 이러한 숏 프라이머는 표적 핵산 서열 내 결합 영역이 프라이머 또는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 결합 영역과 중복되지 않는 프로브와 조합 사용하는 것이 바람직하다. 숏 프라이머들에 의해 생산된 비-특이적인 증폭산물들의 탐지는 비-중복적인 결합 위치를 갖는 프로브를 사용함으로써 감소 또는 제거될 수 있다.
상향 (또는 정방향) 프라이머는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 결합 부위 근방 또는 그것과 중복되는 위치에서 듀플렉스 표적 핵산 서열의 한 가닥의 3' 영역에 결합한다. 하향 (또는 역방향) 프라이머는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 결합 부위 근방 또는 그것과 중복되는 위치에서 상향 프라이머에 대해 듀플렉스 표적 핵산 서열의 한 가닥의 반대 가닥의 3' 영역에 결합한다. 상향 및 하향 프라이머들의 5' 결합 부위들은 듀플렉스 표적 서열 상에서 일반적으로 적어도 60 뉴클레오타이드만큼 이격되어 있고, 더욱 좋기로는 적어도 65, 또는 적어도 70 뉴클레오타이드 길이만큼 이격되어 있는 것이 바람직하다.
도 1에 도시된 바와 같이 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 결합 배열에 따라, 상향 프라이머는 각각의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 서열과 중복되는 서열 영역 또는 상보적인 영역을 가질 수 있다. 중복되거나 상보적인 서열 영역은 길이가 1-8 뉴클레오타이드일 수 있고, 적어도 5 또는 적어도 6 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 마찬가지로 하향 프라이머는 각각의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 서열과 1-8 뉴클레오타이드 길이, 이를테면 적어도 5 또는 적어도 6 뉴클레오타이드 길이로 중복되거나 상보적인 서열 영역을 가질 수 있다.
별법으로, 표적 서열 중 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 결합 부위 근방의 위치에서 관련있는 프라이머 결합에 있어서, 상향 프라이머와 대응하는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 간에는 중복 또는 상보 서열이 없을 수 있고, 및/또는 하향 프라이머와 대응하는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 간에 중복 또는 상보 서열이 없을 수 있다.
표적에서 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들에 대한 결합 영역들과 중복되지 않는 결합 영역들을 갖는 프라이머들을 한 개 이상 사용함으로써 여러가지 장점을 얻을 수 있다. 본 발명의 방법이 DNA 증폭을 탐지하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프로브들을 이용하는 구체예에서도, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 프로브 사이 및/또는 상향 및/또는 하향 프라이머와 프로브 사이에 중복되거나 상보적인 서열이 없을 수 있다. 상향 프라이머, 하향 프라이머, 각각의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드, 및 어떠한 프로브이건 표적 핵산 서열 내의 결합 영역들 사이에 서열 중복이 없을 수 있다. 또한 프라이머들, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들 또는 프로브들 간에 상보성도 없을 수 있다. 여러가지 올리고뉴클레오타이드 종들에 있어서 표적 핵산 서열과 표적 중 독립적으로, 비중복 영역들과 결합할 수 있도록 서열들을 설계함으로써, 표적 핵산 서열에 대한 결합을 두고 올리고뉴클레오타이드 종들 간의 경쟁을 감소시키고, 또한 원치 않는 증폭 산물들의 형성을 감소시키거나 및/또는 탐지를 피할 수 있다.
보다 구체적으로, 단일 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 (SIBA 방법)을 이용한 가닥 침투 기반 방법에서는 길이가 16 내지 23 염기인 프라이머들이 가닥 침투 기반 증폭 방법에 일반적으로 사용된다. 프라이머들의 3' 말단의 서열들은 대개 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 8 염기만큼 중복 또는 상보적이다 (상향 프라이머는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 중복되는 반면 하향 프라이머는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 상보적임). 이 배열은 표적 DNA의 증폭 효율을 제거하면서도 비-특이적인 증폭 위험은 감소시켜준다. 또한, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 중복되지 않는 길이가 ≤14 염기인 숏 프라이머를 사용할 수도 있다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 중복되는 서열들을 갖지 않는 숏 프라이머들은 길이가 길고 중복되는 롱 프라이머들에 비해 표적 DNA를 더 효과적으로 증폭시킬 수 있다. 이것은 길이가 더 긴 중복 프라이머의 3' 말단이 표적 주형의 결합 부위를 두고 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 경쟁하기 때문이다. 예를 들어, 상향 프라이머는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 대체(displacing)에 앞서 듀플렉스 상에서 먼저 브랜치 이동을 수행할 필요가 있다.
그러나, 숏 프라이머들 (≤ 14 염기)은 비-특이적 증폭 산물들을 생성할 수 있다. 이 문제를 피하기 위해, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 중복 또는 상보적인 3' 말단을 갖는 보다 긴 프라이머들(16-23 염기)이 일반적으로 SIBA에 사용된다. 이 배열에서, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 말초 영역은 여전히 약 14개의 베이스 길이이다. 이에 따라 표적 DNA가 증폭될 때 해리되는 숏 말초 영역만이 남게된다.
표적 내 두 지점(상향 및 하향)에서 가닥 침투하는 본 발명의 방법에서는 SIBA에서보다 더 짧은 프라이머들을 사용할 수 있다. 또한, 비-중폭 프라이머들을 더 효과적으로 이용할 수 있다. 이것은 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들 및 프라이머들과 관계없이 표적 DNA 상의 프로브 결합 부위를 통합하는 것이 가능하기 때문이다. 또한, 본 발명의 방법에서 상이한 프라이머 및 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 배열들을 이를테면 반 역평행 배열로 이용할 수 있음으로 해서, 숏 프라이머에 의해 유발되는 비-특이적 증폭 위험성을 최소화하거나 없앨 수 있다.
프라이머가 그의 대응하는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 근방에 결합하는 경우 (서열 중복 또는 상보성 없이), 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 결합 영역과 각각의 프라이머의 결합 영역의 가장 가까운 바운더리 사이에 일반적으로 15 뉴클레오타이드 이하, 좋기로는 10 뉴클레오타이드 이하, 이를테면 약 1 내지 약 15 뉴클레오타이드, 약 5 내지 약 15 뉴클레오타이드, 약 5 내지 약 10 뉴클레오타이드, 또는 약 3 내지 약 8 뉴클레오타이드가 존재한다. 이로 인해 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 결합에 의해 만들어진 단일-가닥 영역에 프라이머가 혼성화될 수 있다.
좋기로는, 각각의 프라이머는 특정 표적 핵산 서열, 이를테면 특정 유전형, 또는 특정 표적, 이를테면 특정한 개체 또는 특정 병원체에 존재하는 핵산 서열을 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계되는 것이 바람직하다. 따라서, 일반적으로 각각의 프라이머는 표적에서만 발견되는 상보 서열에 특이적으로 또는 선택적으로 혼성화한다. 그러나, 각 프라이머는 제2의 프라이머, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들) 및 임의의 올리고뉴클레오타이드 프로브와 조합 사용될 경우, 다른 서열들, 이를테면 다른 종에서 발견되는 서열들과 혼성화하여, 표적 핵산 서열이 특이적으로 탐지된다.
본 발명에서 사용된 모든 상향 또는 하향 프라이머는 한 개 이상의 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 탐지가능한 표지, 예컨대 형광 염료를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서 상향 또는 하향 프라이머는 각각의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 FRET 쌍을 형성함으로 해서, 후술하는 바와 같은 형광단(fluorophore) 또는 소광단(소광단)를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서는 일반적으로 멀티플렉스 시스템에서 두 개 이상의 표적 서열을 탐지하고자 할 경우, 두 쌍 이상의 상향 및 하햐야 프라이머들을 사용할 수 있음을 이해하여야 한다.
가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 (들)( Strand invasion olionucleotid (s))
관심 대상인 표적 핵산 서열에 기초하여, 그리고 상향 및 하향 프라이머들의 결합 부위 및 관련 영역에서 표적 핵산 서열을 단일-가닥으로 만들어 상향 프라이머 및 하향 프라이머의 결합을 허용하기 위한 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 요구사항의 관점에서 한 개 이상의 적절한 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들을 선택한다. 표적 핵산 서열이 상동적이거나 동일한 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함할 경우, 증폭을 실현하기 위해 단일 종의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드가 제공될 수 있다. 별법으로, 표적 핵산 서열의 상향 및 하향 부위들에서 다양한 서열들과 결합하는 두 개의 별개 종의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들 (제1 및 제2)이 제공될 수도 있다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 특징에 관한 다음 설명은 제1 및 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들 양자 모두가 사용될 경우 이들에 대하여도 적용된다.
각각의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 표적에 상보적인 서열 및 임의로 부가적인 플랭킹 비-상보적 서열(들)을 포함한다. 통상의 기술자는 표적에 상보적인 서열의 길이를 실험적으로 구할 수 있으며 그 길이는 임의로 등온 조건 하에서, 표적 핵산 서열의 효과적인 가닥 침투를 제공하는데 충분한 길이이다. 상보 서열은 RNA-DNA 상보적 염기쌍 형성(basepairing) 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상보 서열의 길이는 적어도 25 또는 적어도 27 뉴클레오타이드, 일반적으로 적어도 30 뉴클레오타이드, 이를테면 적어도 32, 적어도 33 또는 적어도 35 뉴클레오타이드, 더욱 좋기로는 적어도 36, 37, 38, 39 또는 40 뉴클레오타이드 이상의 길이일 수 있다. 상보 서열의 길이는 30-50, 32-50, 35-50, 40-50, 35 내지 48, 35 내지 46, 38 내지 45 또는 40 내지 45 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
상기 서열 길이는 표적 핵산 서열에 대해 부분적으로 또는 완전히 상보적일 수 있는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 일부에 대한 것이다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 표적 서열 사이의 특정 위치에 미스맷치들이 존재할 수 있지만, 그런 한편으로 여전히, 증폭 달성을 위해 특히 상향 및 하향 프라이머들과 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 조합 사용과 관련하여 표적 서열의 특이적인 증폭 및 탐지가 가능하다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 상보 영역과 표적 서열의 대응하는 영역들 사이에는, 상보 서열의 총 길이에 따라, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8, 이를테면 1 내지 5 또는 1 내지 3개의 미스맷치들이 존재할 수 있다.
가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 상보 서열은 프라이머에 대한 결합 영역을 형성하는 표적 서열의 일부와 중복되거나 중복되지 않을 수 있는 표적 서열의 일부와 혼성화한다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 각각의 상향 또는 하향 프라이머와 1-8 뉴클레오타이드 길이, 이를테면 적어도 5개 또는 적어도 6개 뉴클레오타이드 길이 영역만큼 중복되거나 상보적인 영역을 가질 수 있다. 별법으로, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 서열은 상향 또는 하향 프라이머의 서열과 중복되는 영역을 갖지 않을 수 있다. 이 구체예에서는 전술한 바와 같이, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드가 상향 또는 하향 프라이머에 대한 결합 영역 근방의 위치에 결합함으로 해서, 프라이머의 결합 영역을 단일-가닥으로 만들 수 있다.
표적 핵산 서열의 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들의 가장 가까운 바운더리들은 표적 핵산 서열에서 적어도 15, 이를테면 적어도 20 또는 적어도 25 뉴클레오타이드 길이만큼 이격되어 위치할 수 있으나, 몇몇 구체예에서는 결합 영역들 간에 더 짧은 거리가 이용될 수도 있다.
가닥 침투 올리고뉴클레오타이드의 상보 서열의 5' 부분은 용융될 듀플렉스 표적 뉴클레오타이드 서열 (앰플리콘)의 관련 바운더리로부터 일반적으로 25 뉴클레오타이드 이내, 더욱 좋기로는 20 뉴클레오타이드 이내에서 결합한다.
가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 또한 임의로 상보 서열 영역 전후의(flank) 표적에 대해 비-상보적인 서열 영역(들)을 포함한다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 비-상보적인 5' 영역을 포함할 수 있는데 그 뉴클레오타이드 서열은 어느 것이든 무방하다. 이러한 5' 비-상보 영역은 일반적으로, 길이가 적어도 3 뉴클레오타이드, 일반적으로 적어도 6, 적어도 8, 좋기로는 적어도 10, 적어도 12 또는 적어도 14 뉴클레오타이드 길이이다. 5' 비-상보 영역은 재조합효소의 결합을 도울 수 있는데, 이는 재조합효소가 협동적으로 결합하기 때문이다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로, 이를테면 3'-프라임 역전된 dT와 같이, 폴리머라제 신장을 차단하는 뉴클레오타이드를 포함하는 1-3 뉴클레오타이드로 된 3' 비-상보 영역을 포함할 수 있다.
가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 증폭법에서 가닥 침투를 위해 재조합효소가 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 함께 사용될 경우 일반적으로 길이가 적어도 30 뉴클레오타이드이다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 좋기로는 적어도 35, 적어도 40 또는 적어도 45 뉴클레오타이드 길이, 더욱 좋기로는 적어도 50 뉴클레오타이드 길이, 및 적어도 55 뉴클레오타이드 이상의 길이일 수 있다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 40-70, 45-70, 45-70, 50-70, 55-70, 45-65, 50-65, 50-60 또는 55-65 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
일반적으로, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 비-신장성(non-extendible) 3' 말단을 가짐으로 해서, DNA 폴리머라제의 기질로서 작용할 수 없으므로, 표적 서열은 특이적인 상향 및 하향 프라이머들의 추가 결합시에만 증폭될 수 있을 뿐이다. 이에 따라 비-특이적 증폭 산물들의 형성을 회피할 수 있다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 그의 3' 영역에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 이를테면 3' 말단으,로부터 10-15 또는 10-20 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 가닥-침투 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단 뉴클레오타이드의 3' 변형을 포함할 수 있고, 디데옥시뉴클레오타이드일 수 있으며, 또는 3' 아미노-알릴기, 3' 카본 스페이서, 3' 포스페이트, 3' 바이오틴, 3' 시알릴 또는 3' 티올을 포함할 수 있다. 3' 뉴클레오타이드는 3'-3' 결합에 의해 역전된 방향으로 통합된 뉴클레오타이드일 수 있다. 별법으로 또는 이에 더해, 가닥-침투 올리고뉴클레오타이드의 3' 영역은 DNA 폴리머라제에 대해 저조한 기질능을 갖는 뉴클레오타이드, 이를테면 PNA (펩타이드 핵산) 뉴클레오타이드, LNA (잠금 핵산), 2'-5' 링크된 DNA, 2'-플루오로 RNA 또는 2'-O-메틸 RNA, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
가닥-침투 올리고뉴클레오타이드가 PNA 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이것으로 구성되거나 또는 이것으로 기본적으로 구성된 PNA 올리고머인 경우, 이러한 올리고뉴클레오타이드는 재조합 효소 부재 하에 듀플렉스 DNA를 탈안정화시켜 이에 침투할 수 있다. 따라서, PNA 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 본 발명의 방법은 재조합 효소 존재 없이 수행될 수 있다. PNA 올리고뉴클레오타이드는 그 올리고뉴클레오타이드가 듀플렉스의 가닥 침투를 매개하는데 충분한 PNA 뉴클레오타이드를 포함할 경우, PNA 뉴클레오타이드 및 기타 뉴클레오타이드, 이를테면 DNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 통상의 기술자라면 가닥 침투를 일으켜 DNA를 증폭시킬 수 있는 그의 능력을 테스트함으로써, 올리고뉴클레오타이드에 통합될 PNA의 수준을 실험적으로 구할 수 있다.
가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 검출가능한 표지, 예컨대 형광 염료를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 상향 또는 하향 프라이머와 함께 FRET 쌍을 형성하여, 후술하는 바와 같이 형광단 또는 소광단을 포함한다.
본 발명의 방법은 제1 및 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들, 또는 동일한 종의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 의해 매개되는, 표적 핵산 서열의 적어도 2개 부위에서의 가닥 침투를 포함하는데, 여기서 표적 핵산 서열은 동일한 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 2개의 결합 부위를 포함하는 것이다. 본 발명의 방법은 표적 핵산 서열의 부가적인 부위, 이를테면 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 8개 이상, 또는 10개 이상의 부위에서 부가적인 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들에 의한 가닥 침투를 추가로 포함할 수 있다. 이에 더해, 멀티플렉스 시스템에서, 본 발명의 방법은 부가적인 표적 서열들의 상향 및 하향 결합 영역들을 표적화하는 부가적인 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들의 사용을 포함할 수 있다.
표적 핵산 서열의 증폭
DNA 증폭 방법은 가닥 침투 기반 증폭을 포함한다. 가닥 침투 증폭은 표적 핵산 서열들에서 적어도 두 개의 부위에서의 가닥 침투를 포함한다. 가닥 침투는 표적 핵산 서열의 상향 영역과 하향 영역 모두에서 일어난다.
표적 핵산 서열을, 상기 표적 핵산 서열의 증폭을 촉진하는 조건 하에서, 각각의 프라이머들에 대한 상향 및 하향 결합 영역들 양자 모두를 단일-가닥으로 만들 수 있는 한 개 이상 (이를테면 제1 및 제2) 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들, 상향 프라이머, 및 하향 프라이머와 함께 인큐베이션시킨다. 몇몇 구체예에서, 단일 종의 프라이머가 상향 및 하향 프라이머 양방으로 기능할 수 있다.
이러한 조건은 일반적으로 DNA 폴리머라제 효소의 존재를 포함한다. 적절한 조건은 기술분야에 공지인 폴리머라제 효소의 활성을 제공하는데 사용되는 여하한 조건을 포함한다. 이 조건은 일반적으로 dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP 및 이의 유사체로부터 선택된 dNTPs, 적절한 완충제/pH 및 효소 성능 또는 안정성에 필요한 기타 인자의 존재를 포함한다. 일반적으로 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP의 4종 모두가 존재할 것이다. 이 조건은 세제(detergents) 및 안정화제의 존재 역시도 포함할 수 있다. 이용되는 온도는 일반적으로 등온(isothermal), 즉, 증폭 프로세스 내내 일정하여야 한다. 이용되는 온도는 일반적으로 폴리머라제 효소 및 기타 효소 성분의 특징에 따라 달라지며, 프라이머들 및 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들에 요구되는 혼성화 온도 역시도 반영된다.
사용되는 폴리머라제는 일반적으로 가닥-대체(strand-displacement) 활성을 갖는다. 본 명세서에서 "가닥 대체"라는 용어는 임의로 보조(accessory) 단백질과 연계하여 DNA 폴리머라제가 DNA 합성 동안 이중 가닥 DNA의 영역 상의 상보 가닥을 대체하는 능력을 설명하기 위해 이용된다. 적절한 DNA 폴리머라제에는 E. coli, B. subtilis, 또는 B. stearothermophilus로부터의 polI 및 그의 기능성 단편 또는 변이체, 및 T4 및 T7 DNA 폴리머라제 및 그의 기능성 단편 또는 변이체가 포함된다. 바람직한 폴리머라제는 Bsu DNA 폴리머라제 또는 그의 기능성 단편 또는 변이체이다.
증폭 조건은 좋기로는 재조합효소의 존재를 포함하는 것이 바람직하다. 어떠한 재조합효소 시스템도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 재조합효소 시스템은 원핵 또는 진핵 기원일 수 있고 세균, 효모, 파지 또는 포유동물의 것일 수 있다. 재조합효소는 5'-3' 또는 3'-5; 방향에서 단일-가닥형 올리고뉴클레오타이드 상에 중합될 수 있다. 재조합효소는 미오비리대(myoviridae) 파지, T4, T2, T6, Rb69, Aeh1, KVP40, 아시네토박터 파지 133, 아에로모나스 파지 65, 시아노파지 P-SSM2, 시아노파지 PSSM4, 시아노파지 S-PM2, Rbl4, Rb32, 아에로모나스 파지 25, 비브리오 파지 nt-1, phi-1, Rbl6, Rb43, 파지 31, 파지 44RR2.8t, Rb49, 파지 Rb3, 또는 파지 LZ2로부터 유래될 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, T4 재조합효소 UvsX (수탁번호: P04529) 또는 그의 기능성 변이체 또는 단편이 사용된다. 진핵세포의 Rad 시스템 또는 E. coli의 recA-Reco 시스템 또는 기타 원핵세포 시스템 역시도 이용가능하다. 재조합효소는 E. coli RecA일 수 있다.
상기 조건은 재조합효소 보조 단백질, 이를테면 단일-가닥형 결합 단백질 (예컨대 T4 gp32, 수탁번호 P03695) 및 재조합효소 로딩 물질(예컨대 UvsY, 수탁번호 NP_049799.2)의 존재를 추가로 포함할 수도 있다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 조건은 T4 gp32, UvsX 및 UvsY 단백질의 존재를 포함한다. 재조합효소(이를테면 UvsX), 및 사용될 경우 재조합효소 로딩 물질 (이를테면 UvsY) 및 단일가닥형 DNA 결합 단백질 (이를테면 gp32)은 각각 동일한 또는 상이한 미오비리대 파지 공급원으로부터의 천연의 것, 하이브리드 또는 돌연변이 단백질일 수 있다. 천연 단백질은 야생형 단백질이거나 또는 천연 변이체일 수 있다.
상기 조건은 재조합효소의 효능을 향상시키는데 사용되는 기타 인자들 이를테면 DNA 상호반응을 제어하는데 사용되는 화합물, 예컨대 프롤린, DMSO, BSA, PEG 또는 DNA 상의 재조합효소의 로딩을 향상시키는 것으로 알려진 기타 크라우딩 물질을 더 포함할 수 있다 (Lavery P. et al. J. Biol. Chem. 1992, 267, (13), 9307-9314).
상기 조건은 또한 ATP 재생 시스템의 존재를 더 포함할 수 있다. 다양한 ATP 재생 시스템이 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 여기에는 해당효소가 포함된다. ATP 재생 시스템의 적절한 성분들은 포스포크레아틴, 크레아틴 키나아제, 미오키나아제, 파리오포스파타제, 수크로스 및 수크로스 포스포릴라제 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 조건은 또한 ATP의 존재를 더 포함할 수 있다.
부가적인 성분들, 이를테면 마그네슘 이온, DTT 또는 기타 환원제, 염 역시도 포함될 수 있다.
추가 성분들에는 표적 핵산 서열을 기타 증폭 시약과 접촉시키기 전, 또는 증폭시킴과 동시에, 표적 핵산 서열을 포함하는 핵산을 절단하기 위한 1종 이상의 제한 효소들(이를테면 1종 이상의 제한 엔도뉴클레아제)가 포함될 수 있다. DNA 플라스미드에 포함된 표적 핵산 서열의 증폭 속도는 플라스미드를 제한 효소로 절단함으로써, 그에 따라 출발 주형을 선형화하도록 증가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 증폭시킬 표적 핵산을 포함하는 핵산을 제한 효소와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 표적 핵산 서열을 포함하는 핵산 중에 적절한 인식 부위를 갖는 적절한 제한 효소이면 어느 것이든 절단에 이용될 수 있다. 인식 부위는 일반적으로 표적 핵산 서열 이외의 핵산의 영역 중에 위치한다.
전술한 다양한 화합물들은 다양한 농도로 DNA 증폭을 위해 제공될 수 있다. 통상의 기술자는 다양한 성분들의 실무상 적절한 작업 농도를 선택할 수 있다.
증폭된 DNA 존재 여부의 탐지
표적 핵산 서열을 DNA 증폭 촉진 조건 하에 프라이머들 및 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)과 접촉시킴으로써 결과되는 증폭된 DNA의 존재를 적절한 수단에 의해 모니터링할 수 있다.
프라이머들 중 일방 또는 양방 또는 한 개 이상의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)(이를테면 제1 및/또는 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들))은 표지 또는 기타 검출가능한 모이어티와 통합될 수 있다. 모든 표지 또는 검출가능한 모이어티를 사용할 수 있다. 적절한 표지의 예로는 형광 모이어티, 및 억셉터 모이어티와 형광단의 FRET 쌍을 들 수 있다. 예를 들어, 상향 프라이머는 표적 핵산 서열에 상향 결합 영역을 갖는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 FRET 쌍을 형성할 수 있고, 및/또는 하향 프라이머는 표적 핵산 서열에 하향 결합 영역을 갖는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 FRET 쌍을 형성할 수 있다. 프라이머(들)은 형광단 또는 소광단으로 표지될 수 있고, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)은 FRET 쌍, 소광단 또는 형광단의 대응하는 멤버로 표지될 수 있다. 적절한 표지 및 부착 부위에 대하여 후술한다. 이러한 FRET 쌍을 표적 핵산 서열의 가닥 침투 및 증폭을 탐지하는 방법에 제공하여 사용할 수 있다. 2개의 검출가능한 모이어티들의 상호 작용 변화를 검출하는 그 밖의 소광 시스템도 이용할 수 있으며, 이에는 접촉 소광이 포함된다.
더욱 좋기로는, 또는 이에 더해, 역시 표지 또는 기타 검출가능한 모이어티가 통합되어 있는, 증폭된 DNA를 탐지하는 1개 이상의 프로브들도 이용가능하다. 좋기로는, 프로브로부터의 시그널을 표적 핵산 서열의 증폭과 연계하여 실시간으로 모니터링하는 것이 바람직하다. 프로브는 표적 핵산 서열의 적합한 어느 부위에서든 결합할 수 있다. 프로브는 특히 좋기로는 프라이머 및/또는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 결합 영역과 중복되지 않는 표적 핵산 서열의 영역에 결합할 수 있다. 따라서, 프로브는 한 개 이상의 다른 올리고뉴클레오타이드 종들에 대한 결합 부위(들)과 무관한 표적 핵산 서열 내의 결합 부위를 갖는 것이 특히 바람직하다. 프로브에 대한 비-중복 결합 영역의 선택은 증폭 중 프로브의 결합에 대한 경쟁을 저하시킬 수 있다. 표적 핵산 서열 중의 독립적인 위치에서의 프로브 결합을 이용하는 것 역시 비-특이적 증폭 산물들, 이를테면 프라이머-다이머들의 검출을 감소 또는 제거할 수 있어, 표적 핵산 서열의 증폭 검출 정확도를 높일 수 있다.
여러 가지 상이한 증폭된 표적 서열들을 탐지하는 프로브들은 상이한 형광 파장에서 신호를 나타내 멀티플렉스 검출을 제공할 수 있다. 2개 이상, 이를테면 3, 4, 5, 6, 8, 10개 또는 그 이상의 프로브들을 단일 반응 중 여러 가지 상이한 표적 서열들의 멀티플렉스 검출에 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용 가능한 올리고뉴클레오타이드 프로브는 일반적으로 그 길이가 약 8 내지 약 25 뉴클레오타이드, 이를테면 약 10 내지 약 20, 약 12 내지 약 25, 또는 약 15 내지 약 25 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 몇몇 구체예에서 프로브는 또한 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드로서 기능할 수도 있다(및 그에 따라 상기 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들에 대해 설명된 특징을 가짐). 예컨대, 프로브로서 작용하는 부가적인 표지된 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에는 표적 핵산 서열 중 상향 또는 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역 근방의 표적 핵산 서열결합 영역을 갖는 것이 제공될 수 있어, 상향 또는 하향 영역에 결합하는 각각의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 FRET 쌍을 형성할 수 있다. 이 구체예에서, 상향 또는 하향 영역에 결합하는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 형광단 또는 소광단으로 표지될 수 있고, 부가적인 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 대응하는 상호반응성 검출가능 모이어티(소광단 또는 형광단)로 표지될 수 있다.
프로브는 표적 핵산 서열과 서열이 완전히 상보적인 서열을 포함할 수 있거나 또는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들) 및 프라이머(들)과 조합시 표적 서열을 특이적으로 검출할 수 있음을 전제로, 표적 서열에 대해 한 개 이상 미스맷치들, 이를테면 2 또는 3 미스맷치들을 가질 수 있다. 본 발명에서 사용되기 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브는 표적 결합시 배열 변화를 나타내는 혼성화 프로브(예컨대 US7241596에 설명된 바와 같음), 분자 표지(beacon) (예컨대 US5925517에 설명된 바와 같음), 또는 절단가능한 프로브, 이를테면 엔도뉴클리아제-절단가능한 프로브 (예컨대 US7435561 및 US20050214809에 설명된 바와 같음) 또는 제한 효소-절단가능한 프로브일 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 프라이머, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드, 또는 프로브는 어떠한 형광단 또는 소광단으로든 표지될 수 있다. 형광단 및 소광단은 표적 주형과의 혼성화시 형광단이 감소된 소광 효과로 인해 증가된 시그널을 생산하는 방식으로 선택 및 위치할 것이다.
소광단은 비-형광성, 예컨대 비-형광성 발색단일 수 있다. 소광단은 암색(dark) 소광단일 수 있다. 별법으로, 소광단은 형광단에 대해 상이한 발광 스펙트럼으로 형광을 내어, 형광단 또는 소광단의 형광을 특별히 모니터링할 경우, 시그널의 어떤 변화가 표적 주형에 대한 혼성화를 나타낼 수 있는 것이다. 형광단 또는 소광단은 표지된 올리고뉴클레오타이드 종의 5' 또는 3' 말단에 위치할 수 있다. 3' 말단 위치는 특히 폴리머라제-의존성 신장이 바람직하지 않은 구체예에서 유용할 수 있다. 형광단 또는 소광단은 또한 내부 위치에 자리할 수도 있는데, 이를테면, 표지된 종의 5' 또는 3' 말단으로부터 10개 이하의 뉴클레오타이드 만큼 이격되어 있을 수 있다.
형광단은 어떠한 형광 모이어티여도 무방하며, 일반적으로 형광 유기 염료일 수 있다. 소광단은 형광단의 형광으르 소광시키는 물질이면 어느 것이든 무방하고 일반적으로는 발색 분자, 이를테면 오렌지색 염료일 수 있다. 통상의 기술자라면 일반 상식에 기초하여 올리고뉴클레오타이드 프로브에 대한 적절한 형광단-소광단 쌍을 선택할 수 있다. 적절한 짝짓기는 예컨대 다음 문헌에 상세히 설명되어 있다: Marras SE: Selection of fluoropore anc quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes. In: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Proteins. Edited by Didenko V, vol. 335: Humana Press; 2006: 3-16, 및 Didenko VV: DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs 및 applications. Biotechniques 2001, 31(5):1106-1116, 1118, 1120-1101.
적절한 형광단의 비제한적인 예로는 플루오레신 및 플루오레신 유도체, 이를테면 카르복시플루오레신(FAM, 예컨대 6-FAM, 5-FAM, dT FAM), VIC, 헥사클로로-6-카르복시플루오레신(HEX), 및 JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 쿠마린 및 쿠마린 유도체 이를테면 3-페닐-7-이소시아네이토쿠마린, 루시퍼 옐로우, NED, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 카르복시테트라메틸로다민(TAMRA), 6-카르복시-X-로다민(ROX), 5 카르복시로다민, N-(p-2-벤족사졸릴)페닐)말레이미드, 시아닌 염료 이를테면 CY5, 로다민 염료, 잔텐 염료, 나프틸아민, 아크리딘, 벤족사디아졸, 스틸벤 및 피렌을 들 수 있다. 적절한 소광단의 비제한적인 예로는, DABSYL, 4'-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL), 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드 (DABMI), 테트라메틸로다민, 카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA), 블랙홀 소광단 1, 블랙홀 소광단 2, 블랙홀 소광단 3, 다크 소광단 1, 다크 소광단 2, 아이오와 블랙 RQ, 아이오와 블랙 FQ을 들 수 있다.
바람직한 형광단/소광단 쌍에는 다음이 포함된다:
- TAMRA 및 블랙홀 소광단 2;
- ROX 및 블랙홀 소광단 2;
- ROX 및 DABCYL;
- FAM (이를테면 dT-FAM) 및 아이오와 블랙 FQ;
- FAM (이를테면 dT-FAM) 및 DABCYL;
- ROX 및 아이오와 블랙 FQ;
- CY5 및 아이오와 블랙 RQ.
형광단 또는 소광단은 일반적으로 올리고뉴클레오타이드의 표지된 종에 공유 결합된다. 형광단 또는 소광단은 올리고뉴클레오타이드 종의 서열 내에 존재하는 한 개 이상 뉴클레오타이드의 적절한 링커에 의해 결합될 수 있다. 통상의 기술자라면 일반적인 기술 상식에 기초하여 적절한 링커를 선택할 수 있을 것이다. 적절한 링커는 예컨대 문헌 [Agrawal S (ed.): Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties: Humana Press; 1993]에 논의되어 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 표적 핵산 서열에 상보적인 영역을 포함하는 한 개 이상의 프로브, 형광단 및 소광단을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 서열은 적어도 20% RNA 뉴클레오타이드, 변형된 RNA 뉴클레오타이드 및/또는 PNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 프로브들의 사용은 상보적 주형 서열의 부재 하에 단일-가닥형 DNA (이를테면 재조합효소)에 결합할 수 있는 단백질의 존재 하에 프로브로부터의 형광 시그널을 예방한다는 장점을 갖는다. 달리 설명하면, 올리고뉴클레오타이드 프로브에 존재하는 뉴클레오타이드의 적어도 20%는 RNA 뉴클레오타이드, 변형된 RNA 뉴클레오타이드 및/또는 PNA 뉴클레오타이드이다. 더욱 좋기로는, 올리고뉴클레오타이드 프로브의 서열은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% RNA 뉴클레오타이드, 변형된 RNA 뉴클레오타이드 및/또는 PNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. RNA 염기가 프로브에 포함된 경우, RNase H 효소, 이를테면 RNase H2는 프로브-표적 듀플렉스의 절개 및 소광 감소에 의해 프로브로부터의 시그널을 향상시키기 위해 본 발명의 방법에 제공될 수 있다. 바람직한 RNase H2 효소는 Thermococcus gammatolerans RNase H2이다. 별법으로, 전술한 바와 같이, 절단가능한 프로브의 기타 형태, 이를테면 제한 효소 또는 엔도뉴클리아제-절단가능한 프로브들을 이용할 수 있다.
형광단 및 소광단으로 표지된 프로브가 사용될 경우, 그 형광단 및 소광단은 일반적으로 그 프로브 서열 중에서 프로브 길이에 따라 적어도 8개 뉴클레오타이드, 더욱 좋기로는 적어도 10개, 또는 적어도 12개 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치한다. 형광단 및 소광단은 5' 및 3' 말단에 위치할 수 있는데, 이 경우가 따라서 프로브 내 가능한 최대 거리만큼 이격되어 위치하는 것이다. 형광단과 소광단 사이의 거리는 프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화될 때 (오픈 또는 선형 배열로), 소광단에 의핸 형광단의 소광이 감소되어, 표적 핵산 서열의 존재에 대한 검출가능한 시그널을 이끌어내도록 선택될 수 있다. 형광단과 소광단 사이의 적절한 거리는 실험적으로 최적화될 수 있다.
Sybr 그린 I 및 티아졸 오렌지와 같이 증폭된 DNA와 인터컬레이트하는 염료를 이용하여 증폭된 DNA를 검출하는데 이용할 수도 있다.
증폭된 DNA로부터의 시그널의 검출은 실시간 검출방법을 비롯하여 모든 적절한 시스템에 의해 수행될 수 있다.
증폭 방법의 적용
본 발명의 증폭 방법은 표적 핵산 서열의 특이적인 증폭이 요망되는 경우이면 어디에든 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 표적 핵산 서열의 검출 및 예컨대 임상적 샘플이 표적 핵산 서열을 함유하는지 여부를 진단하는데 이용될 수 있다. 본 발명은 특히 의학적 세팅에 유리하다. 본 발명의 검출 방법은 표적 핵산 서열의 존재를 탐지하게 해주는 고도로 특이적인 테스트를 제공한다. 이 방법은 일련의 질병 세팅에 적용가능하다. 본 발명은 대상자에 있어서 질병의 진단 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 질병과 연계된 표적 핵산 서열을 탐지하기 위해 상기 대상자로부터의 샘플에서 본 발명의 표적 핵산 서열의 증폭 방법을 수행하는 것을 포함한다.
핵산이 샘플로부터 수득가능하거나 유도될 수 있는 한, 표적 핵산 서열의 검출을 위해 어떤 샘플이건 이용될 수 있다. 샘플은 예컨대 환경적 샘플, 레퍼런스 샘플 또는 임상 샘플일 수 있다. 본 발명의 방법이 표적 핵산 서열의 검출에 의해 질병을 진단하는데 사용될 경우, 그 샘플은 흔히 임상 샘플, 예컨대 그 질병에 걸려있거나 걸린 것으로 의심되는 환자로부터 수득된 샘플일 수 있다. 적절한 임상 샘플의 종류는 대상자에 존재하거나 또는 존재하는 것으로 의심되는 특정 유형의 질병이나 감염에 따라 달라진다. 샘플은 타액, 가래, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨 또는 변 샘플일 수 있다. 샘플은 세포 또는 조직 샘플일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 샘플은 동물 대상자, 이를테면 포유동물 대상자로부터 채취된다. 샘플은 흔히 인간 대상자로부터 채취되지만, 본 발명은 일반적으로 가정용 동물, 가축, 조류 및 어류에도 적용가능하다. 예컨대, 본 발명은 수의용 또는 농업용으로 적용될 수도 있다. 샘플은 DNA 또는 RNA일 수 있는 핵산을 포함한다. 만일 핵산이 본 발명의 방법으로 검출가능한 적절한 형태로 샘플에 존재할 경우, 그 샘플을 직접 이용할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 핵산은 샘플로부터 유래, 샘플로부터 수득 또는 추출된다. 검출 방법에 사용하기 위해 핵산을 함유하는 샘플의 가공, 핵산의 추출 및/또는 핵산을 정제하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 총 핵산을 단리하거나 또는 DNA 및 RNA를 별도로 단리할 수 있다.
일반적으로, 샘플은 핵산을 프라이머들 및 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들) 및 임의의 추가 시약과 접촉시키기에 간편한 형태로 제공하는데 적절한 방식으로 가공된다. 핵산이 DNA이면, DNA는 일반적으로 이중-가닥 형태로 제공된다. 핵산이 RNA이면 일반적으로 역전사 효소 또는 역전사효소 활성이 있느느 폴리머라제를 이용하여 dDNA로 전환시킨다. RNA는 표적 서열의 농도를 효과적으로 증폭시키는 세균 세포에 존재하는 매우 많은 수의 리보좀 덕분에, 세균을 검출하는데 유용할 수 있다. 리보좀 RNA (rRNA)에 더해, 다른 형태의 RNA, 예컨대 운반 RNAs (tRNA), 메신저 RNAs (mRNA), 소형 간섭 RNAs (siRNA), 소형 핵 리보핵산 (snRNA), 마이크로RNAs (miRNA) 역시 원핵 및 진핵세포 검출에 유용하게 이용가능하다.
본 발명의 방법은 병원체로부터 표적 핵산 서열을 검출하는 것을 포함하는, 대상자에서 병원체에 의한 감염을 진단하는데 이용될 수 있다. 병원체가 존재하는지 아닌지를 알아내는 것은 환자가 걸려있거나 걸린 것으로 의심되는 질병의 맥락에서 이루어질 수 있다. 이러한 질병은 병원체의 존재에 의해 야기되거나, 이와 연결되거나 악화된 것들을 포함할 수 있다. 따라서, 환자는 병원체의 존재를 가리키는 증상을 나타낼 수 있고 상술한 방법에 의해 병원체의 존재를 알아내기 위해 환자로부터 샘플을 얻을 수 있다.
어떠한 병원체라도 검출될 수 있다. 병원체는 바이러스이거나 세균 또는 기생출일 수 있다. 병원체는 비제한적인 예로서 곰팡이, 인간 유두종 바이러스(HPV), HIV, HSV2/HSV1, 인플루엔자 바이러스 (A, B 및 C형), 소아마비 바이러스, RSV 바이러스, 코감기바이러스, 로타바이러스, A형 간염 바이러스, 노워크 바이러스 군, 엔테로바이러스, 아스트로바이러스, 홍역 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 시토메갈로바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 아데노바이러스, 루벨라 바이러스, I형 인간 T-세포 림프종 바이러스 (HTLV-I), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), D형 간염 바이러스, 폭스바이러스, 마버그 및 에볼라와 같은 바이러스; 미코박테리움 결핵, 클라미디아, 임균, 시겔라, 살모넬라, 비브리오 콜레라, 트레포네마 팔리둠, 슈도모나스, 보르데텔라 백일해, 브루셀라, 프란시셀라 야토병균, 헬리코박터 파일로리, 렙토스피라 인테로간스, 레지오넬라 뉴모필라, 예르시니아 페스티스, 스트렙토코커스(A형 및 B형), 뉴모코커스, 뇌척수막염균, 헤모필루스 인플루엔자(b형), 톡소플라스마 곤디이, 캄필로박테리오시스, 모락셀라 카타랄리스, 도노바노시스 및 악티노미코시스와 같은 세균; 칸디다증 및 아스퍼질러스를 비롯한 진균 병원체; 촌충, 디스토마, 회충, 아메바증, 편모충증, 크립토스포르디움, 주혈흡충, 주폐포자충, 트리코모나스증 및 선모충증을 비롯한 기생충 병원체일 수 있다.
본 발명의 방법의 추가 적용에는 단편 분석, 클로닝 및 단일염기 다형성(SNP) 검출이 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 표적 핵산 서열의 서열을 알아내기 위하여 이것을 증폭시킬 수 있다. 이러한 구체예에서는 그 서열이 부분적으로 또는 완전히 미지인 핵산 서열을, 서열을 결정하고자 하는 영역 전후의 한 개 이상 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)에서 적절한 결합 영역들을 제공함으로써 증폭시킬 수 있다. 본 발명은 따라서 미지 서열 영역을 포함하는 표적 핵산의 서열을 알아내는 방법을 제공하는데, 이 방법은 미지 서열의 상기 영역의 상향 및 하향에 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 표적 핵산 서열을 만들고, 상기 표적 핵산 서열을 전술한 본 발명의 증폭 방법에 따라 증폭시키며, 미지 서열의 상기 영역의 서열을 탐지하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 미지 서열의 영역을 포함하는 표적 핵산 서열의 증폭 방법도 제공하는데 상기 방법은 미지 서열의 상기 영역의 상향 및 하향에 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 표적 핵산 서열을 만들고, 상기 표적 핵산 서열을 전술한 본 발명의 증폭 방법에 따라 증폭시키는 것을 포함한다. 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 표적 핵산 서열은 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 올리고뉴클레오타이드들을 관심 대상의 핵산 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 접합시킴으로써 만들 수 있다. 별법으로, 관심 대상 핵산 서열을, 핵산 서열을 도입하고자 하는 부위 전후의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 플라스미드와 같은 적절한 핵산 벡터 내로 삽입 또는 접합시켜, 표적 핵산 서열을 만들 수 있다. 다른 구체예에서, 결정하고자 하는 서열은 부분적으로 알려진 것일 수 있다. 즉 한 종의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(및 그의 대응 프라이머)를 기지 서열 영역에 결합하도록, 그리고 다른 종의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머를 미지 서열 영역 전후에 도입된 어댑터 서열과 결합하도록 설계할 수 있다. 이어서 기지 서열의 상향 및 미지 서열의 하향에서의 가닥 침투-기반 증폭을 이용하여 그 서열을 결정할 수 있도록 미지 서열 영역을 증폭시킬 수 있다.
가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 올리고뉴클레오타이드들은 오버행이 있거나 없이 일반적으로 이중-가닥 형태로 제공되는, 적절한 DNA 어댑터이다. 어댑터는 일반적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드로서 제공될 경우 관심대상 DNA 단편에 대한 그의 접합을 허용하는, 평활 말단형(blunt ended)이다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 올리고뉴클레오타이드들은 추가로 프라이머 결합 영역들을 포함할 수 있다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역 (및 임의로 프라이머 결합 영역도)을 포함하는 단일 종의 올리고뉴클레오타이드가 제공될 수 있는데 여기서 동일 종의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 (및 임의로 동일 종의 프라이머)가 상향 및 하향 위치에서 표적 핵산 서열을 침투하는데 이용된다.
표적 핵산의 서열 결정은 적절한 시퀀싱 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 적절한 시퀀싱 방법으로는 생거(Sanger) 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱법 예컨대 Ion Torrent, SOLiD, Illumina 및 454 시퀀싱을 들 수 있다. 서열결정하고자 하는 단편들을 그들의 결합되니 어댑터로부터 직접 예비증폭시키거나 또는 시퀀싱 플라스미드 내로 먼저 클로닝시킬 수 있다. 후자의 경우 클론된 단편은 어댑터 서열(들)을 함유할 수 있거나 또는 이들은 그 단편이 접합되는 플라스미드에 의해 제공될 수 있다.
표적 핵산 서열을 증폭시키기 위해 표적 핵산 서열 내 또는 그 전후 위치에 통합될 경우 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및/또는 프라이머의 결합을 허용하는 적절한 어댑터 서열이면 어느 것이든 사용가능하다. 표적 핵산 서열의 상향 영역 내 또는 그 전후의 위치에 통합된 어댑터 서열은 일반적으로 표적 핵산 서열의 상향 영역 내 또는 그 전후의 위치에 통합된 어댑터 서열과 동일할 것이다. 그러나, 상이한 어댑터들에 기초하여 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 한 개 이상의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들 및 한 개 이상의 프라이머들이 제공된다면, 표적 핵산 서열의 상향 및 하향 말단에 상이한 어댑터 서열들을 사용할 수도 있다. 통상의 기술자라면 특정한 표적 서열에 대한 적절한 어댑터 서열을 선택할 수 있다. 어댑터 서열들은 잠재적으로 존재할 수 있는 어떠한 서열과도 간섭되지 않도록 자유로이 선택할 수 있다. 어댑터 서열들은 또한 피리미딘에 대한 재조합 선호도에 부합하도록 선택될 수도 있다. 어댑터 서열들은 증폭 전 또는 그 후에 정제 또는 분리를 위한 태그를 포함할 수 있다. 앰플리콘의 추가 가공에 도움이 되도록 제한효소 자리 또는 절단 효소 인식 부위를 첨가할 수 있다.
키트 및 조성물
본 발명은 표적 핵산 서열에 대한 적어도 한 개의 상향 및 적어도 한 개의 하향 프라이머, 및 상기 표적 핵산 서열 중에 상향 및 하향 결합 영역들을 갖는 제1 및 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들을 포함하는 키트 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 표적 핵산 서열 중 상향 결합 영역 및 하향 결합 영역 양자 모두와 결합할 수 있는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드, 상기 표적 핵산 서열를 증폭시킬 수 있는 한 개 이상의 프라이머들 및 적어도 한 개의 DNA 어댑터를 포함하는 키트 또는 조성물을 제공한다. DNA 어댑터는 일반적으로 이중-가닥 형태이다. 키트 또는 조성물은 DNA 어댑터를 관심 대상 핵산과 접합시키는데 사용될 수 있는 DNA 접합효소(ligase)를 추가로 포함할 수 있다. 키트 또는 조성물은 한 개 이상의 제한 효소들을 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로. Typically, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 상향 및 하향 결합 영역은 DNA 어댑터 서열을 포함하므로, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 DNA 어댑터의 적어도 일부에 결합할 수 있다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 한 개 이상의 프라이머들에 대한 상향 및 하향 결합 영역들을 단일-가닥으로 만들 수 있다. 따라서 한 개 이상의 프라이머들은 표적 핵산 서열 중 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들 근방의 영역과 결합한다. 한 개 이상의 프라이머들은 또한 DNA 어댑터의 서열에 결합할 수 있으므로 해서, DNA 어댑터는 미지 서열의 가닥 침투와 증폭 두 가지 모두에 대한 메카니즘을 제공한다. 키트 또는 조성물은 표적 핵산 서열 (일반적으로 어댑터 서열), 또는 표적 핵산 서열에 대한 상향 및 하향 프라이머들 중 상향 및 하향 결합 영역 양자 모두와 결합할 수 있는 단일 종의 프라이머를 포함할 수 있다.
연관된 측면에서, 본 발명은 표적 핵산 서열 중 상향 결합 영역 및 하향 결합 영역 양자와 결합할 수 있는 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 상기 표적 핵산 서열을 증폭할 수 있는 한 개 이상의 프라이머들을 포함하는 키트 또는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 한 개 이상의 프라이머들에 대한 상향 및 하향 결합 영역들을 단일-가닥으로 만들 수 있고, 상기 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 한 개 이상의 프라이머들 각각은 DNA 어댑터 서열에 결합할 수 있는 것이다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 한 개 이상의 프라이머들은 따라서 각각 표적 핵산 서열 내의 상향 및 하향 위치에 존재하는 동일한 DNA 어댑터 서열과 결합할 수 있다. 키트 또는 조성물은 클로닝 부위 전후의 어댑터 서열들을 포함하는 핵산 벡터를 포함할 수 있다.
상기 키트 또는 조성물에 제공된 프라이머(들) 및 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들)은 본 발명의 적절한 방법에 사용하기 위해 전술된 것들 중 어느 것이든 무방하다. 본 발명의 키트와 조성물은 또한 한 개 이상의 부가적인 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들을 추가로 포함할 수 있다.
조성물은 예컨대 용액, 동결건조물(lyophilisate), 현탁액 또는 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼일 수 있다.
본 발명의 키트에서, 상이한 올리고뉴클레오타이드 종들 (이를테면 프라이머(들) 및 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드(들))은 혼합물로서 제공되거나 또는 별개 용기에 제공된다. 키트는 임의로 본 발명의 방법에 사용하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 제1 및 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들을 포함하는 키트는 제1 및 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들의 사용을 포함하는 표적 핵산 서열 증폭을 위한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 키트는 증폭된 DNA를 검출하기 위한 수단을 포함할 수있다. 키트는 DNA를 시퀀싱하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트 또는 조성물은 증폭된 DNA를 검출하는 한 개 이상의 프로브들을 임의로 포함할 수 있다. 키트 또는 조성물에 제공된 프로브는 본 발명의 방법에 사용하도록 전술된 것들이면 어느 것이든 무방하다.
키트 또는 조성물은 DNA 폴리머라제, 재조합효소, 및 재조합효소 보조 단백질 중 1종 이상을 임의로 포함할 수 있다. 좋기로는, DNA 폴리머라제는 Bsu 폴리머라제인 것이 바람직하다. 좋기로는, 재조합효소는 재조합효소 보조 단백질 UvsY 및 gp32와 임의로 조합된, 박테리오파지 T4 UvsX인 것이 바람직하다. 키트 또는 조성물은 dNTPs, 적절한 완충액 및 본 발명의 방법에서 DNA 증폭에 필요한 기타 인자들을 더 포함할 수 있다.
후술되는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
도 1: 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들과 평행 침투(parallel iinvasion) 올리고뉴클레오타이드 배열, 역평행 침투(anti-parallel invasion) 올리고뉴클레오타이드 배열 또는 반 역평행(reverse anti-parallel invasion) 배열을 이용한 표적 DNA의 증폭. IO1 - 제1 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드; IO2 - 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드. F-프라이머 - 정방향(forward) 또는 상향(upstream) 프라이머; R-프라이머 - 역방향(reverse) 또는 하향(downstream) 프라이머. IO1 및 IO2의 비-신장가능한 말단들은 점선으로 나타내었다.
도 2: 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 표적 DNA의 증폭. 증폭 플롯을 (a) 평행 침투 올리고뉴클레오타이드 배열, (c) 역평행 침투 올리고뉴클레오타이드 배열 및 (e) 역평행 반(reverse) 침투 올리고뉴클레오타이드 배열에 대해 나타내었다.
듀플리케이트(Duplicate) 반응들이 제시된다. Sybr 그린 I을 탐지함으로써 증폭을 모니터링하였다. 증폭 플롯의 X-축: 시간(분), Y-축: SybrGreen I 형광(형광 강도, 임의 단위). 반응의 특이성을 용융-곡선 분석에 의해 추가 평가하였다. 용융 곡선 분석은 (b) 평행 침투 올리고뉴클레오타이드 배열에 대해, (d) 역평행 침투 올리고뉴클레오타이드 배열에 대해 그리고 (f) 반 역평행 침투 올리고뉴클레오타이드 배열에 대하여 행하였다. 용융 곡선 분석의 X-축: 온도(섭씨), Y-축 (-d(형광/d(온도), (임의 단위).
도 3: 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 표적 DNA의 증폭. 반응은 2개의 상보적 침투 올리고뉴클레오타이드들 또는 1개의 상보적 침투 올리고뉴클레오타이드와 한 개의 비-상보적 침투 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 수행하였다. 증폭 플롯에서 X 및 Y-축은 도 2에서와 같다. (a)는 사용된 올리고뉴클레오타이드들의 평행 배열을 이용한 결과를 나타낸다. (b)는 올리고뉴클레오타이드들의 역평행 배열에 대한 결과를 나타낸다. 듀플리케이트 반응이 제시되었다.
도 4: 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 증폭 반응에서 프라이머들의 특이성. 반응은 상보적인 정방향 및 역방향 프라이머들을 이용하거나 또는 상보적인 정방향 비-상보적 프라이머를 이용하여 수행하였다. 표적 DNA의 농도는 1pM이었다. 증폭 플롯에서 X 및 Y-축은 도 2에서와 같다.
도 5: 표적 특이적 프로브들과 함께 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 반응의 상용성(compatibility). (a)는 표적 특이적 프로브들들의 사용을 뒷받침하는 배열들을 도식적으로 나타낸 도면이다. (b) 및 c)는 (b) 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들 또는 (c) 단일 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 (SIBA)를 이용한 표적 DNA의 증폭 및 실시간 탐지를 나타낸 도면이다. 트레이스에 대한 표지에서 나타난 바와 같이, Sybr 그린 I 또는 표적 특이적 프로브를 이용하여 증폭을 실시간 모니터링하였다. 각 차트의 X-축: 시간(분). Y-축: Sybr 그린 I 또는 프로브의 형광 (임의 단위).
도 6: (a) 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 반응 및 (b) 단일 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 (SIBA)를 이용한 표준 반응의 비-특이적 증폭 탐지에 대한 내성(resistance). 표준 SIBA는 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용하여 수행된 증폭보다 숏 프라이머들을 이용한 비-특이적 증폭의 탐지에 대해 덜 내성적이었다. 표적 DNA의 농도는 롱 프라이머들의 경우 1 pM이었고 숏 프라이머들의 경우 1 fM이었다. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들 또는 프라이머들의 결합 부위와 중첩되지 않는 결합 부위를 갖는 프로브 또는 Sybr 그린 I을 이용하여 증폭을 모니터링하였다. 각 차트에 있어서 X-축: 시간(분). Y-축: Sybr 그린 I 또는 프로브의 형광 (임의 단위). (a)는 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용항 증폭 동안의 프로브 또는 Sybr 그린 I을 이용한 증폭을 모니터링한 도면이다. (b)는 SIBA에서 Sybr 그린 I을 이용한 증폭을 모니터링한 도면이다.
도 7: 두 개의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 플라스미드 DNA로부터 표적 DNA의 증폭. 플라스미드 DNA는 직접 사용하거나 또는 EcoRV-HF 제한 효소로 처리하였다. Sybr 그린 I을 이용하여 증폭을 모니터링하였다. X-축: 시간(분). Y-축: Sybr 그린 I의 형광 (임의 단위).
도 8: 두 개의 동일한 침투 부위를 갖는 표적 DNA의 증폭. 표적 DNA의 두 개의 침투 부위 모두에 결합하는 단일 침투 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 반응을 수행하였다. (a), (c), (e) 및 (g)는 Sybr 그린 I을 이용하여 표적 DNA 증폭을 실시한 모니터링한 증폭 플롯을 나타낸다. (b), (d), (f) 및 (h)는 대응하는 용융 곡선 분석을 나타낸다. (i)는 반응 산물들의 비변성 전기영동을 나타낸다. a) 및 b): 324 염기쌍의 듀플렉스 표적 DNA를 증폭시키는데 사용된 침투 올리고뉴클레오타이드들의 평행 배열. (c) 및 (d): 표적 DNA를 증폭하는데 사용된 침투 올리고뉴클레오타이드들의 평행 배열. (e) 및 (f): 표적 DNA를 증폭하는데 사용된 침투 올리고뉴클레오타이드들의 역평행 배열. (g) 및 (h): 표적 DNA를 증폭하는데 사용된 침투 올리고뉴클레오타이드들의 반 역평행 배열. (i) 표적 DNA를 증폭하는데 사용된 침투 올리고뉴클레오타이드들의 역평행 배열. 증폭 플롯 및 용융 곡선 분석에 있어서 X 및 Y-축은 도 2에서와 같다. Sybr 그린 I을 이용하여 표적 DNA 증폭을 실시간 모니터링하였다. (i) 전기영동도의 레인은 다음과 같다: 레인 1, BioRad EZ Load 20 bp Molecular Ruler; 레인 2-6, 각각 107, 106, 105, 104 및 103 카피됨(copied); 레인7, 물 대조군.
도 9: 실시간 모니터링 침투 및 증폭을 위한 FRET 기반 시스템: (a) 표지된 프라이머들 및 침투 올리고뉴클레오타이드들을 도식적으로 나타낸 도면. (b) 평행 배열에서 FRET 표지된 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 표적 DNA의 침투 및 증폭 및 탐지의 실시간 모니터링. (b)에서 X-축: 시간(분). Y-축: 프로브의 형광 (임의 단위).
도 10: 두 개의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 가닥 침투 기반 증폭의 민감성. 1 카피의 표적 DNA에 대한 106 연속 희석을 이용하여 3 가지 상이한 분석법으로 민감ㅁ성을 평가하였다. Sybr 그린 I을 이용한 표적 DNA 증폭의 실시간 모니터링. 증폭 플롯: (a) 검사법 1 (b) 검사법 2 및 (c) 검사법 3. X-축): 시간(분). Y-축: Sybr 그린 I의 형광 (임의 단위).
서열들에 대한 간단한 설명
SEQ ID NO: 1은 침투 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 2는 침투 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 3은 DNA 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 4는 DNA 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 5는 DNA 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 6은 비-상보적 침투 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 7은 비-상보적 DNA 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 8은 프로브의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 9는 프로브의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 10은 DNA 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 11은 표적 주형의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 12는 표적 주형의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 13은 침투 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 14는 DNA 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 15는 DNA 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 16은 표적 주형의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 17은 표적 주형의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 18은 표적 주형의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 19는 표적 주형의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 20은 표적 주형의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 21은 표지된 침투 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 22는 표지된 침투 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 23는 표지된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 24는 표지된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 25는 DNA 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 26은 표적 주형의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 27은 어댑터의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 28은 어댑터의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 29는 어댑터의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 30은 어댑터의 뉴클레오타이드 서열이다.
SEQ ID NO: 31은 어댑터의 뉴클레오타이드 서열이다.
실시예
실시예 1. 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 표적 증폭 DNA의 증폭
인공 표적 DNA의 증폭에 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용하는 것을 도 1 및 2에 도시하였다. 사용된 모든 올리고뉴클레오타이드들은 MWG Eurofins (독일) 또는 IDT DNA Technologies (벨기에)로부터 구득하였다. 크레아틴 키나아제와 수크로스 포스포릴라제를 비롯한 모든 시약과 완충액은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. T4 단일 가닥 결합 단백질 (gp32) 및 BSU 폴리머라제는 New England Biolabs (Ipswich, MA, 미국)로부터 구입하였다. UvsX 및 UvsY는 전술한 바와 같이 정제하였다 [1, 2]. 써모코커스 감마톨레란스 RNase HII는 GeneSys Ltd (영국)으로부터 구입하였다.
등온 DNA 증폭 반응을 40℃에서 적어도 90분간 실시하였다. 반응 부피는 달리 언급하지 않는 한 20㎕였다. 반응을 위한 완충 용액은 10mM Tris-아세테이트 pH 8.0, 10mM 마그네슘 아세테이트, 5% DMSO, 5% PEG 1000, 4mM DTT, 0.5mM EDTA, 0.1mg/ml BSA, 150mM 수크로스, 2mM ATP, 200μM DNTPs, 1:100000 SybrGreen I, 60mM Tris-포스포크레아틴이었다. 완충액에 포함된 단백질은 250ng/㎕ gp32, 5μM UvsX, 0.0625U/㎕ BSU, 0.0125U/㎕ 수크로스 포스포릴라제, 및 0.025U/㎕ 크레아틴 키나아제였다. 프라이머 및 침투 올리고뉴클레오타이드의 각 농도는 달리 언급하지 않는 한, 200nM였다. 침투 올리고뉴클레오타이드들을 표적 듀플렉스에 평행 또는 역평행 배열로 결합하도록 설계하였다(도 1). 10 fM 또는 1pM으로 존재하는 표적 DNA와 함께 또는 그와 별도로 마그네슘 아세테이트를 첨가함으로써 반응을 개시하였다. Agilent MX 프로-장비를 사용하여 증폭을 실시간 탐지하였다. 상기 장비는 40℃ 사이클로 60초 동안 각 사이클의 형광을 검출하도록 프로그램되었다. 반응 산물의 특이성은 사이클 직후 용융 분석을 수행함으로써 평가하였다. 이것은 반응물을 95℃에서 15초간 급속히 가열한 다음, 25℃로 60초간 급속 냉각시킴으로써 행하였다. 이어서, 반응물을 25℃에서 85℃로 서서히 승온시키면서 0.5℃ 간격마다 형광을 측정하였다.
평행 배열의 경우, 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들 (SEQ ID NO: 1 및 2) 및 정방향 (SEQ ID NO: 3) 및 역방향 (SEQ ID NO: 4) 프라이머들을 이용하였다. SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 표적 DNA를 함유한 반응물에서만 증폭이 탐지되었다. 표적 DNA가 없는 반응물 (무 주형 대조군(no template control: NTC))은 Sybr 그린 I 시그널의 부재로부터 감지되는 바와 같이 증폭을 일으키지 않았다 (도 2a). 표적 DNA를 함유하지 않는 15 종의 세균으로부터의 게놈 DNA 혼합물을 첨가함으로써 평행 배열의 특이성을 추가로 입증하였다 (하나의 종에 대해 반응 당 1000 카피의 게놈 DNA를 첨가하였다). 이 혼합물에서는 증폭이 탐지되지 않았는데, 이는 이 배열이 표적 DNA만을 탐지함을 추가로 입증하는 것이다. Sybr 그린 I을 이용한 용융 분석 결과 표적 DNA를 함유하는 반응관에서 특이적인 증폭 반응이 일어난 것으로 추가 확인되었다 (도 2b)
역평행 배열의 경우, 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들 (SEQ ID NO: 1 및 2) 및 정방향 (SEQ ID NO: 3) 및 역방향 (SEQ ID NO: 5) 프라이머들을 사용하였다. 증폭은 반응에 SEQ ID NO: 12의 표적 서열을 포함하는 표적 DNA가 첨가되었을 때만 탐지되었다 (도 2c). 이에 더해, NTC도, 세균 종들로부터의 게놈 DNA의 혼합물도 이 배열을 증폭시키지 않았다. Sybr 그린 I을 이용한 용융 분석 결과 표적 DNA를 함유하는 반응관에서 특이적인 반응이 일어난 것으로 추가 확인되었다 (도 2d).
도 1c에 도시된 반 역평행 배열도 테스트하였다. 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들 (SEQ ID NO: 1 및 13)와 정방향 (SEQ ID NO: 14) 및 역방향 (SEQ ID NO: 25) 프라이머들을 이용하여 SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 표적 DNA 주형을 증폭시켰다. 증폭은 오직 표적 DNA가 반응에 첨가되었을 때만 탐지되었다(도 2e).표적 DNA가 존재하지 않는 샘플에서는 탐지지능한 시그널이 관찰되지 않았다. Sybr 그린 I을 이용한 용융 분석 결과 표적 DNA를 함유하는 반응관에서 특이적인 반응이 일어난 것으로 추가 확인되었다 (도 2f)
실시예 2. 증폭을 위한 침투 올리고뉴클레오타이드들의 필요성
표적 DNA의 대수(exponential) 증폭을 위해서는 두 가지 모두의 침투 올리고뉴클레오타이드들이 필요하다. 이것은 표적 DNA 서열에 상보적인 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들 또는 하나의 상보적 침투 올리고뉴클레오타이드과 하나의 비-상보적 침투 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 입증되었다. 평행 (도 3a) 및 역평행 (도 3b) 배열에서, 표적 DNA 서열에 상보적인 다른 침투 올리고뉴클레오타이드 (SEQ ID NO: 1)를 비-상보적 침투 올리고뉴클레오타이드 (SEQ ID NO: 6)로 대체시켰다. 양 배열 모두에 사용된 프라이머들과 시약들에 대하여는 실시예 1에서 설명한 바 있다. 1pM 표적 DNA의 존재 하에 증폭 반응을 수행하였다. 두 가지 침투 올리고뉴클레오타이드들 양자 모두가 표적 DNA 서열에 상보적일 때 표적 DNA만이 증폭되었다 (도 3). 이것은 또한 증폭 생성물이 표적 주형의 전장을 함유함을 시사하는 것이기도 하다. 또한, 상보적인 침투 올리고뉴클레오타이드를 비-상보적인 것으로 대체한 것이나 NTC는 증폭을 일으키지 않았다. 이것은 침투 올리고뉴클레오타이드 부재하에서는 프라이머들이 표적 DNA를 증폭시키지 않음을 입증하는 것이다.
실시예 3. 증폭을 위한 프라이머들의 필요성
표적 DNA의 증폭을 위해서는 정방향 및 역방향 프라이머들이 필요하다. 이것은 표적 DNA에 상보적인 프라이머들 중 하나를 비-상보적 프라이머로 치환시킴으로써 입증되었다. 역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 4)의 존재 하 또는 표적 DNA에 대해 비-상보적인 프라이머 (SEQ ID NO: 7)의 존재 하에 증폭 반응을 수행하였다. 표적 DNA의 농도는 1pM이었다. 증폭은 오직 표적 DNA에 상보적인 역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 4)를 함유하는 반응물에서만 탐지되었다 (도 4). 상보적인 역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 4) 가 비-상보적인 역방향 프라이머(SEQ ID NO: 7)에 의해 치환된 반응에서는 증폭이 탐지되지 않았다. 이러한 결과는 침투 올리고뉴클레오타이드들이 폴리머라제 기질로서 작용할 수 있는 능력이 없기 때문에 그 단독으로는 독립적으로 표적 DNA 서열을 증폭시키지 못함을 가리키는 것이다. 또한, 이것은 증폭이 일어나기 위해서는 모든 올리고뉴클레오타이드들이 요구됨을 입증하는 것이다.
실시예 4. 두 개의 표적 침투 올리고뉴클레오타이드들과 표적 특이적인 프로브의 상용성(compatibility)
두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 가닥 침투 기반 증폭은 표적 DNA 특이적인 프로브의 설계 가능성을 향상시킨다. 평행 배열과 역평행 배열 양자 모두에서는 침투 올리고뉴클레오타이드들에 대해서도, 프라이머들에 대해서도 상보적이지 않은 영역이 표적 DNA 상에 존재한다. 이것은 침투 올리고뉴클레오타이드들이나 프라이머들과의 경쟁 없이 이들 영역에 결합하도록 부가적인 프로브들을 설계할 수 있음을 시사한다 (도 5a). 표적 특이적인 프로브 존재 하에 역평행 배열에서의 증폭을 테스트하였다. 프로브는 RNA 염기에 의해 이격된 형광단 및 소광단을 포함한다. 프로브는 또한 비-특이적 신장이 확실히 일어나지 않도록 3'-말단이 블로킹되었다. 침투 올리고뉴클레오타이드들 (SEQ ID NO: 1 및 2)의 농도는 200nM인 반면, 프라이머들 (SEQ ID NO: 3 및 4) 및 프로브 (SEQ ID NO: 8)의 농도는 400nM였다. 10㎍/ml의 써모코머스 감마톨러런스 RNase H2의 존재 하에 실시예 1에서 설명된 바와 같이 표준 증폭 반응을 실시하였다. Sybr 그린 I 또는 형광단 및 소광단으로 표지된 프로브를 이용하여 실시간 증폭을 탐지하였다 (도 5b). 이로부터 프로브가 반응 중 표적 DNA에 효과적으로 결합하여 검출가능한 시그널을 생성하는 것으로 나타났다.
오직 하나의 침투 올리고뉴클레오타이드만을 이용하는 전술한 가닥 침투 기반 증폭에서 프로브 화학의 (SIBA) 설계는 복잡한데, 이는 상기 배열이 표적 DNA 영역 상에서 프로브의 자유로운 결합을 쉽게 뒷받침하지 않기 때문이다. 이것은 표적 DNA의 모든 영역이 일반적으로 침투 올리고뉴클레오타이드 또는 프라이머들에 대한 결합 부위로서 작용하기 때문이다. 따라서, 표적에 특이적인 프로브는 달리 특별히 설계되지 않는 한, 결합을 두고 침투 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머들과 경쟁해야만 할 것이다. 도 5c에 도시된 결과는 SIBA에서 침투 올리고뉴클레오타이드과 동일한 표적 영역에 대해 특이적인 표적 특이적 프로브를 이용하는 경우 생기는 문제점을 나타낸 것이다. 이 SIBA 검사법에서, 침투 올리고뉴클레오타이드 (SEQ ID NO: 1), 정방향 프라이머 (SEQ ID NO: 3), 및 역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 5) 농도는 200nM인 반면, 프로브 (SEQ ID NO: 9) 농도는 400nM였다. 실시간 증폭을 Sybr 그린 I 또는 프로브 (도 5c)를 이용하여 모니터링하였다. 표적 DNA를 함유하는 반응물에서 Sybr 그린 I 시그널의 증가는 증폭이 일어났음을 보여주었다. 그러나, 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 부위와 중폭된 프로브의 경우 아무런 시그널도 탐지되지 않았는데, 이는 이 프로브가 표적 DNA와 결합하지 못하였음을 시사하는 것이다. 이것은 아마도 침투 올리고뉴클레오타이드와 프로브 간의 경쟁에 기인하는 듯 하다.
실시예 5. 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 갖는 배열에서 표적 특이적인 프로브를 사용하면 숏 프라이머들에 의해 만들어진 비-특이적 증폭이 감소된다 .
매우 짧은 프라이머들을 사용하면 침투 올리고뉴클레오타이드의 잠재적인 신장으로 인해 SIBA에서 비-특이적 증폭이 결과될 수 있다. 이러한 비-특이적 증폭은 침투 올리고뉴클레오타이드의 DNA 영역을 잠재적으로 신장시킬 수 있는 특정한 숏 프라이머들(14 염기)를 이용하여 탐지되었다 (도 6b). 그러므로, 표준 SIBA에서 프라이머들은 약 16-23 염기 길이, 이들의 3'-말단은 침투 올리고뉴클레오타이드와 부분적으로 상동적이 되도록 설계된다. 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 갖는 배열에서는 증폭 방법이 숏 프라이머들로부터의 비-특이적 증폭 산물들 덜 검출되기 쉽다. 이것은 침투 올리고뉴클레오타이드들이나 또는 프라이머들의 결합 부위와중복되지 않는 프로브 결합 부위가 이용될 수 있다는 사실에 기인한다.
도 6은 두 개의 침투올리고뉴클레오이드들을 역평행 배열로 하여 또는 종래의 SIBA를 이용하여 증폭 반응을 수행한 결과를 입증한 것이다. 양가닥 침투 기반 방법에서는, 숏 프라이머들(이 예에서는 14개 염기) 및 롱 프라이머들 (이 예에서 21개 염기)의 사용은 표적 주형의 Sybr 그린 I 시그널의 증가를 유도하였다. 그러나, 롱 프라이머들은 NTC에서 시그널을 생산하지 않은 반면 숏 프라이머들의 경우 NTC로부터도 작은 시그널이 탐지되었다. 그러나 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 갖는 배열은 침투 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머들과의 경쟁 없이 표적 서열에 프로브가 결합하도록 항T다 이러한 배열은 NTC에서 숏 프라이머에 의해 만들어진 시그널의 검출을 제거하였다 (도 6a).
실시예 6. 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 플라스미드 DNA의 증폭
두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드 증폭 방법을 이용하여 여러 종류의 DNA 주형들을 증폭시켰다. 표적 DNA 듀플렉스 (역평행/평행 배열을 위한 표적, SEQ ID NO: 20)를 시판되는 pCR2.1 벡터 MWG Eurofins (독일) 내로 클로닝시켰다. 삽입체 전후에 EcoRI 제한효소 자리를 두었다. 이어서 이 플라스미드를 실시예 1에 설명된 바와 같이 두 개의 침투 올리고뉴클레오타이드들의 역평행 배열을 위한 주형으로서 이용하였다. 각 침투 올리고뉴클레오타이드, 프라이머 및 프로브 각각의 농도는 각각 200, 400 및 600nM이었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 적절한 양(100fM-10pM)의 절단되거나 절단되지 않은 플라스미드를 반응물에 첨가하였다. 절단된 플라스미드는 표적 플라스미드를 EcoRV-HF 제한 효소 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)와 함께 37℃에서 3 시간 인큐베이션함으로서 준비하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 이 방법은 절단된 플라스미드와 절단되지 않은 플라스미드 양자 모두로부터 표적 DNA를 증폭시킬 수 있었다. 제한 효소로 절단된 플라스미드 DNA는 그러나 절단되지 않은 플라스미드보다 먼저 탐지되었다. 이것은 아마도 원형 플라스미드를 표적 주형으로 사용할 경우 1차 증폭 라운드와 연계된 지연에 기인하는 듯 하다. 이것은 또한 주형으로서 복잡한 DNA가 사용될 경우, 증폭 1 라운드 동안 랙 타임(lag time)을 최소화하는데 제한 효소들을 이용할 수 있음을 시사하는 것이기도 하다. 이것은 먼저 적절한 제한 효고와 함께 복잡한 DNA를 인큐베이션하거나 또는 제한 효소를 증폭 시약에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
실시예 7. 복수개의 침투 부위를 갖는 표적 DNA의 증폭
침투 올리고뉴클레오타이드들에 대해 동일한 결합 부위를 함유하는 말단 영역들을 갖는 표적 듀플렉스를 설계할 수 있다. 이것은 오직 하나의 침투 올리고뉴클레오타이드만이 표적 듀플렉스의 양 말단에서 분리(dissociated)되면 된다는 것을 의미하는 것이다. 이러한 표적 듀플렉스는 어댑터들(공지 서열)과 접합되어 있거나 DNA 단편 서열의 일부만이 알려져 있는 미지의 DNA 단편 라이브러리를 모방한다. 이들 미지의 DNA 단편을 이어서 어댑터에 특이적인 프라이머들을 이용하여 증폭시킬 수 있다. 이어서 증폭 산물은 하향 적용 이를테켠 DNA 시퀀싱에 대한 주형으로서 작용한다. 이러한 시스템은 또한 다른 하향 적용 이를테면 단편 분석, 클로닝, 단일염기 다형성(SNP) 탐지에도 이용가능하다. DNA 단편은 단일 침투 올리고뉴클레오타이드를 평행, 역평행 또는 반 역평행 배열에 사용하여 효과적으로 증폭될 수 있다 (도 8). 이 구체예에서, 표준 증폭 반응은 5% PEG 1000를 7.5 % PEG 400로 대체한 것을 제외하고 실시예 1에서 설명된 것과 동일하게 수행하였다.
평행 배열의 경우, 400nM의 침투 올리고뉴클레오타이드 (SEQ ID NO: 13), 200nM 정방향 (SEQ ID NO: 14), 및 200nM 역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 15)를 이용하여 324 bp 표적 듀플렉스 DNA(SEQ ID NO: 16)의 적절한 양을 증폭시켰다. 표적 듀플렉스 (SEQ ID NO: 16)는 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 결합 부위 역할을 하는 서열들을 전후에 갖는 200 bp 인간 락테이트 (LCT) 유전자 단편을 함유하였다 (SEQ ID NOs 28 및 29). 증폭은 오직 표적 듀플렉스 DNA (SEQ ID NO: 16)를 함유한 반응물에서만 탐지되었고 표적 듀플렉스 DNA가 없는 반응물 (무 주형 대조군, NTC)은 탐지가능한 Sybr 그린 I 시그널을 생성하지 않았다 (도 8A). 증폭 속도는 매우 빠르고 효과적이었으며 반응 개시 후 20분 이내에 1000 카피의 표적 DNA가 탐지되었다. Sybr 그린 I을 이용한 용융 분석 결과 반응물이 특이적인 것으로 확인되었다 (도 8B).
평행 배열은 400nM의 침투 올리고뉴클레오타이드 (SEQ ID NO: 2), 200nM 정방향 (SEQ ID NO: 5), 및 200nM 역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 4)를 이용함으로써 침투 올리고뉴클레오타이드에 대해 결합 부위들로서 기능하는 전후(flanking) 서열들(SEQ ID NOs 30 및 31)을 포함하는 또 다른 표적 DNA(SEQ ID NO: 17)를 증폭시킬 수 있는 것으로 추가 입증되었다. 이 반응은 도 8A에서 앞서 나타난 것과 유사한 성능을 나타내었다. 표적 DNA (SEQ ID NO: 17)의 증폭 역시 매우 효율적인 것으로 밝혀졌으며 반응 개시 20분 이내에 1000 카피가 탐지되었다(도 8C). Sybr 그린 I 을 이용한 용융 분석 결과 표적 DNA를 함유하는 반응관에서 특이적인 증폭이 일어난 것으로 추가 확인되었다 (도 8D).
역평행 배열의 경우, 400nM의 침투 올리고뉴클레오타이드 (SEQ ID NO: 2) 및 400nM 프라이머 (SEQ ID NO: 5)가 어댑터 서열 (SEQ ID NO:27)을 포함하는 표적 DNA (SEQ ID NO: 18)를 증폭하는데 이용되었다. 프라이머(SEQ ID NO: 5)는 정방향 및 역방향 프라이머 두 가지 모두의 역할을 하였다. 따라서, 적절한 결합 서열들이 제공된 표적 DNA<를 증폭시키는데 오직 한 개의 IO 및 한 종류의 프라이머 만을 사용하여도 좋다. 증폭은 표적 DNA (SEQ ID NO: 18)를 함유한 반응물에서만 탐지되었다. 표적 DNA가 없는 반응물 (무 주형 대조군, NTC)은 Sybr 그린 I 시그널에서 아무런 탐지가능한 시그널을 생성하지 않았다(도 8E). Sybr 그린 I을 이용한 추가 분석 결과 반응이 표적 특이적임이 추가 입증되었다 (도 8F).
반 역평행 배열을 이용하여 유사한 연구를 수행하였다. 400nM의 침투 올리고뉴클레오타이드 (SEQ ID NO: 13) 및 400nM 프라이머 (SEQ ID NO: 15)를 이용하여 표적 DNA (SEQ ID NO: 19)를 증폭시켰다. 프라이머 (SEQ ID NO: 15)는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 두 가지 모두로 작용하였다. 이 배열은 또한 표적 DNA를 특이적으로 증폭시킬 수 있었고 비-특이적 반응은 NTC에서 관찰되지 않았다 (도 8G). Sybr 그린 I을 이용한 용융 분석은 반응이 표적 특이적이었음을 추가 입증하였다 (도 8H).
반 역평행 배열을 이용한 증폭 속도는 평행 및 역평행 배열의 경우보다 느린 것으로 나타났다. 평행 배열은 가장 빠른 증폭 속도를 나타내는 것으로 보였다. 증폭 속도의 차이는 다양한 인자에 의해 매개되는 것일 수 있다. 예컨대, 비록 이들 세 가지 시스템은 모두 유사한 침투 올리고뉴클레오타이드를 사용하지만, 이들의 프라이머들은 상이하다. 이것은 프라이머들의 용융 온도와 길이가 증폭 속도에 영향을 미칠 수 있는 것이므로 증폭 속도의 차이를 어느 정도 설명할 수 있다.
역평행 배열을 이용한 반응물을 비변성 아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 추가 처리하였다 (도 8i). 마그네슘 아세테이트를 20mM로 사용하고, 5% PEG 1000을 대신 7.5 % PEG 400을 사용하며 Bio Rad CFX 96 PCR 디바이스를 이용하여 120분간 44℃에서 반응시킨 것을 제외하고 실시예 1에 설명된 것과 같은 표준 증폭 반응을 수행하였다. 200nM의 침투 올리고뉴클레오타이드 (SEQ ID NO: 2) 및 400nM 프라이머 (SEQ ID NO: 5)를 이용하여 적절한 양의 표적 DNA (SEQ ID NO: 18)를 증폭시켰다. 프라이머(SEQ ID NO: 5)는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 두 가지 모두의 역할을 하였다. 따라서, 적절한 결합 서열들이 제공되었으므로 오직 하나의 IO 및 한 종류의 프라이머를 이용하여 표적 DNA를 증폭시켰다. PAGE의 경우, 5 ㎕ 혼합물 분주액(aliquot)을 8% TBE 겔 (Invitrogen, 영국)에 로딩하여 150V (constant)로 60분간 전기영동시켰다. 겔을 형광 겔 염료(GelRed; Biotium, 미국)으로 염색하고 Gel Doc™ EZ System (BioRad, 영국)을 이용하여 가시화하였다. 예측된 길이의 증폭 산물에 대응하는 뚜렷한 밴드가 표적 주형을 함유한 반응물에서만 관찰되었다. 표적 주형이 없는 샘플에서는 밴드가 검출되지 않았는데, 이는 비-특이적 증폭 산물들이 없음을 입증하는 것이다.
실시예 8. 모니터링 가닥 침투 및 증폭을 위한 FRET 기반 프로브
실시예 8은 표적 DNA의 침투 및 증폭을 모니터링하기 위한 FRET 프로브 화학의 개발을 설명한다. 이 화학은 표적 듀플렉스의 양 말단 영역들에서 일어나는 침투 과정의 동시적인 모니터링을 허용한다. 이것은 또한 반드시 표적 DNA의 전장(전체 길이)을 증폭시키도록 하는 확인적인 방법이기도 하다. 프라이머들 및 침투 올리고뉴클레오타이드들을 각각 형광단과 소광단으로 표지하여 도 9a에 도시된 바와 같이 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer: FRET)을 형성하도록 하였다. 표적 듀플렉스의 말단 영역을 결정하는 프라이머들을 5'-말단에서 또는 내부적으로 형광단으로 표지하였다 (정방향 및 역방향 프라이머에 대해 상이한 형광단). 표적 DNA의 하향 말단에 결합하는 침투 올리고뉴클레오타이드를 3'-말단에서 소광단으로 표지하는 한편 표적 DNA의 하향 터미널에 결합하는 침투 올리고뉴클레오타이드는 5'-말단에서 소광단으로 표지하였다.
평행 배열을 이용한 표준 증폭 반응을 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행하되 단 5% PEG 1000을 7.5 % PEG 400으로 대체하였다. 그의 5'-말단 근방을 소광단으로 표지시킨 200nM의 침투 올리고뉴클레오타이드(SEQ ID NO: 21) 및 3'-말단을 소광단으로 표지한 200 nM의 침투 올리고뉴클레오타이드(SEQ ID NO: 22)를 사용하였다. 내부적으로 표지된 형광단 ROX 및 Cy5를 각각 갖는 정방향 프라이머 (SEQ ID NO: 23) 및 역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 24)를 200nM로 사용하였다. 이들 올리고뉴클레오타이드들을 이용하여 표적 DNA (SEQ ID NO: 17)를 증폭시켰다. Bio Rad CFX 96 PCR 디바이스를 이용함으로써 증폭을 실시간으로 탐지하였다. 시그널들을 120 사이클 동안 각 사이클 후에 측정하고(각 사이클은 30초에 해당) 시그널들을 상대적인 형광 유닛(RFU: relative fluorescence unit)로서 나타내었다.
도 9B는 표적 주형 (SEQ ID NO: 17)의 증폭 동안 FRET 시스템의 시그널 프로파일을 나타낸다. 반응 도중, 앰플리콘의 말단 영역들에 상이한 형광단을 통합시켰다. 이 경우 상향 영역은 ROX 형광단에 통합하고 하향 영역에는 Cy5 형광단이 통합된다. 앰플리콘 침투 도중, 방출된 형광단 시그널은 도 9B에 도시된 바와 같이 감소하였다 (소광단으로 표지된 침투 올리고뉴클레오타이드들이 앰플리콘의 말단 영역들 부근에 밀접하게 되기 때문임). 정방향 및 역방향 프라이머들에 의해 방출된 시그널의 동시적인 감소는 이들 양 프라이머들 모두가 앰플리콘 내로 통합되었음을 시사하는 것이다.
실시예 9. 다중 침투 시스템의 민감도
이 실시예에서는, 3 가지 상이함 검사법의 분석적 민감도를 평가하였다. 실시예 1에 설명된 바와 같이 표준 증폭 반응을 수행하되 단 5% PEG 1000을 7.5 % PEG 400로 대체하였다. 검사법 1, 2 및 3을 이용하여 표적 DNA 1 (SEQ ID NO: 16), 표적 DNA 2 (SEQ ID NO: 17) 및 표적 DNA 3 (SEQ ID NO: 18)을 각각 증폭시켰다. 올리고뉴클레오타이드들 및 이들의 사용 농도는 실시예 7에 설명된 바와 같았다. 106 카피로부터 1 카피까지 표적 DNA에 대한 10배 연속 희석을 검사하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 모든 3 가지 분석법은 적어도 100 DNA 표적 카피에 대하여는 민감하였다 (검사법 1, 2 및 3는 각각 도 10A, 10B 및 10C에 도시되어 있음). 검사법 3은 몇몇 실험에서 표적 DNA의 단일 카피조차 검출하는 민감도를 나타내었다 (도 11C).
SEQUENCE LISTING <110> ORION DIAGNOSTICA OY <120> METHOD <130> N402749WO <150> GB 1410022.6 <151> 2014-06-05 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INVASION OLIGONUCLEOTIDE <220> <221> misc_feature <222> (48)..(60) <223> 2'-O-METHYL RNA <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> INVERTED dTTP <400> 1 ttgtccatag actgctcgac ctgatacacg ttatcgtcca tacggatucg ggaucucaua 60 t 61 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INVASION OLIGONUCLEOTIDE <220> <221> misc_feature <222> (44)..(56) <223> 2'-O-METHYL RNA <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> INVERTED dTTP <400> 2 tcctcctgta cctcgttaca aacaggtgta tttagtacag aagauggauu uaaauat 57 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 3 aacaagaagg cgtactcgac c 21 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 4 tggggcaaaa tattta 16 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Claims (31)

  1. 표적 핵산 서열의 증폭 방법으로서, 상기 방법은 상기 표적 핵산 서열을, 적어도 한 개의 상향 프라이머, 적어도 한 개의 하향 프라이머 및 제1 및 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들과 상기 표적 핵산 서열의 증폭을 촉진하는 조건 하에서 접촉시키는 것을 포함하되, 여기서 제1 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열의 상향 결합 영역을 단일-가닥으로 만들어 상향 프라이머를 결합시키고, 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열의 하향 결합 영역을 단일-가닥으로 만들어 하향 프라이머를 결합시키는 것인 표적 핵산 서열의 증폭 방법.
  2. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 상향 및 하향 결합 영역들을 포함하는 표적 핵산 서열의 증폭 방법으로서, 상기 표적 핵산 서열을 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 한 개 이상의 프라이머들과 접촉시키는 것을 포함하되, 여기서 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열의 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 단일-가닥으로 만들어 상기 한 개 이상의 프라이머들을 결합시키는 것인 표적 핵산 서열의 증폭 방법..
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들은 표적 핵산 서열과 동일한 가닥에 존재는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들은 표적 핵산 서열의 반대 가닥 내에 존재하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들은 표적 핵산 서열의 반대 가닥에 결합하되 그들의 3' 말단들은 서로를 향해 또는 서로로부터 멀어지도록 배향된 것인 방법.
  6. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 핵산 서열의 상향 및/또는 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역은 각각의 상향 또는 하향 프라이머에 대한 결합 영역과 중복되지 않는 것인 방법.
  7. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열의 증폭을 촉진하는 조건은 재조합 효소의 존재를 포함하는 것인 방법.
  8. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열의 증폭을 촉진하는 등온 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
  9. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열을 하나 이상의 부가적인 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드와 접초시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  10. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 핵산 서열을 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  11. 제11항 또는 제12항에 있어서, 표적 핵산 서열 중 프로브에 대한 결합 영역은 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 결합 영역 및/또는 프라이머에 대한 결합 영역과 중복되지 않는 것인 방법.
  12. 제11항 또는 제12항에 있어서, 프로브에 대한 결합 영역은 표적 핵산 서열의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역과 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역 사이에 있는 것인 방법.
  13. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산 서열과의 결합을 허용하는 프라이머는 형광 공명 에너지 전이(FRET) 시스템을 형성하는 것인 방법.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열을 적어도 한 개의 상향 및 적어도 한 개의 하향 프라이머과 접촉시키되, 상기 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열의 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 단일-가닥으로 만들어, 상향 및 하향 프라이머의 결합으르 허용하는 것인 방법.
  15. 제2항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열 내의 하향 및 하향 결합 영역 양자 모두와 결합할 수 있는 단일 종의 프라이머와 상기 표적 핵산 서열을 접촉시키는 것을 포함하되, 상기 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열의 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 단일-가닥으로 만들어 상기 단일 종의 프라이머를 그의 상향 및 하향 결합 영역들 양쪽 모두에 결합시키는 것인 방법.
  16. 제2항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 상향 및 하향 결합 영역들은 어댑터 서열들인 것인 방법.
  17. 표적 핵산 서열에 대해 적어도 한 개의 상향 및 적어도 한 개의 하향 프라이머 및 표적 핵산 서열에서 각각의 상향 및 하향 결합 영역들을 갖는 제1 및 제2 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들을 포함하는 키트.
  18. 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 한 개 이상의 프라이머들, 및 적어도 한 개의 DNA 어댑터를 포함하는 키트로서, 상기 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열의 상향 결합 영역 및 하향 결합 영역에 존재할 경우 DNA 어댑터에 결합할 수 있고, 상기 한 개 이상의 프라이머들은 상기 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 것인 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열에 대해 적어도 한 개의 상향 및 적어도 한 개의 하향 프라이머를 포함하는 것인 키트.
  20. 제18항에 있어서, 표적 핵산 서열 내의 상향 및 하향 결합 영역 양자 모두와 결합할 수 있는 단일 종의 프라이머를 포함하는 것인 키트.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 핵산 서열 중의 상향 및/또는 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역은 상향 또는 하향 프라이머 각각에 대한 결합 영역과 중복되지 않는 것인 키트.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 한 개 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가로 포함하는 것인 키트.
  23. 제22항에 있어서, 표적 핵산 서열 내의 프로브에 대한 결합 영역은 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드에 대한 결합 영역 및/또는 프라이머에 대한 결합 영역과 중복되지 않는 것인 키트.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 프로브에 대한 결합 영역은 표적 핵산 서열의 상향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역과 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역 사이에 있는 것인 키트.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 핵산 서열의 상향 및/또는 하향 영역에 대한 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머 결합은 FRET 시스템을 형성하는 것인 키트.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 한 개의 제한 엔도뉴클리아제를 더 포함하는 것인 키트.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 한 개 이상의 부가적인 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드들을 포함하는 것인 키트.
  28. 제18항 또는 제18항에 종속된 제19항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서 적어도 한 개의 DNA 접합효소를 더 포함하는 것인 키트.
  29. 미지 서열 영역을 포함하는 표적 핵산 서열을 증폭시키는 방법으로서, 상기 미지 서열 영역의 상향 및 하향에 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 표적 핵산 서열을 만들고, 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법을 수행함으로써 상기 표적 핵산 서열을 증폭시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  30. 미지 서열 영역을 포함하는 표적 핵산의 서열을 탐지하는 방법으로서, 상기 미지 서열 영역의 상향 및 하향에 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들을 포함하는 표적 핵산 서열을 만들고, 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법을 수행함으로써 상기 표적 핵산 서열을 증폭시킨 다음, 상기 미지 서열 영역의 서열을 탐지하는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상향 및 하향 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드 결합 영역들은 각각 DNA 어댑터 서열을 포함하고 단일 종의 가닥 침투 올리고뉴클레오타이드는 상향 결합 영역 및 하향 결합 영역 양쪽 모두에서 DNA 어댑터 서열과 결합하는 것인 방법.
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