KR101024493B1 - 사과 바이로이드 감염 진단을 위한 프라이머 및 이를이용한 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일측에 RNA 폴리머라제 프라이머가 결합되는 서열번호 1로 이루어지는 프라이머를 제 1프라이머로 하여 NASBA 검정법에 의해 사과 바이로이드 안티센스 RNA를 증폭하여 사과 바이로이드 감염여부를 확인하는 사과 바이로이드 진단방법을 제공한다.

ASSVd, NASBA

Description

사과 바이로이드 감염 진단을 위한 프라이머 및 이를 이용한 진단방법{Primer for Diagnosis of Apple Scar Skin Viroid Infection and Method for Diagnosis using the same}

본 발명은 사과 바이로이드 감염 진단을 위한 프라이머 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 기존의 RT-PCR 방법에 의한 사과 바이로이드 ASSVd(Apple Scar Skin Viroid)에 의한 감염을 보다 정밀하게 검정할 수 있는 사과 바이로이드 감염 진단을 위한 프라이머 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다.

사과묘목은 생산성과 품질을 결정하는 가장 중요한 생산요소로서, 최근 바이러스, 바이로이드 감염이 확산되어 농가의 피해가 점차 증가되고 있기 때문에 무독묘를 생산하여 공급하는 체계를 시급히 구축해야하는 상황이다. 따라서 농림수산식품부에서는 FTA 기금 과수산업지원사업을 통해 중앙과수묘목관리센터를 설립하여 농가에 묘목을 공급하고 원예연구소에서는 과수 품종의 무독화와 기술개발 및 지원을 담당하고 있다.

사과 바이로이드 중 ASSVd는 1998년 경북지역의 한 농가에서 처음 발견된 이후로 지금까지 여러 지역의 과수원에서 발견되고 있어 큰 문제가 되고 있다. ASSVd 감염과실은 크기가 작아지며 과피가 얼룩덜룩해지고 상품성을 잃게 되어 농가에 큰 손실을 주게 되었고 특히 유목기에 잎이나 줄기 등에 병징이 나타나지 않고 결실기의 과일 표피에 비로소 병징이 나타나기 때문에 투자비용의 막대한 손실을 야기하고 있다.

따라서 ASSVd가 감염되어 있지 않은 무독묘를 선발, 보급하는 것이 가장 근원적인 대책이기 때문에 ASSVd를 정밀하게 진단하는 여러 방법들이 개발되어 왔다. 그 중 하나가 RT-PCR 검정법으로 여러 학자들에 의해 다양하게 발전되어 왔다. 처음 2001년에 Lee 등에 의해 RT-PCR 검정법이 개발된 이후 Hassen et al.(2006)이 RT-PCR을 이용한 검정 방법을 제안하기 시작했다. 그러나 RT-PCR은 역전사 효소(reverse transcriptase)와 Taq 폴리머라제를 이용해 증폭한 후 아가로즈겔 상으로 검정하는 방법으로 정밀하게 진단하는 데 그 한계가 있다. 그래서 이러한 단점을 보완하기 위해 Kim 등(2006)이 RT-PCR보다 정밀하게 진단하기 위한 방법으로 NASBA-ECL 검정법을 개발하였다. 이 NASBA-ECL검정법은 RT-PCR보다 100배 정밀하게 진단할 수 있어 아가로즈겔상으로는 볼 수 없는 감염주까지 찾을 수 있게 되었다.

핵산증폭 방법 중의 하나인 Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)는 PCR과 달리 RNA를 증폭하는 방법으로 AIDS나 결핵 등 RNA 바이러스를 진단하는데 적합한 증폭방법이다. 기존 PCR의 경우 RNA는 역전사 효소를 이용해 DNA로 전환하고 이를 증폭하여 진단하게 되는데 그 과정 중에 오염이 발생할 가능성이 높아 진단시 어려움이 많았다. 그러나 NASBA는 RNA를 기반으로 RNase H, AMV 역전사효소, T7 RNA 폴리머라제 세 효소를 이용해 그 염기서열과 상보적인 RNA를 연속적으로 증폭하는 방법으로 진단 과정 중에 오염이 될 가능성이 줄게 되었다. 이에 최근 개발된 분자비컨(molecular beacon)과 실시간 정량 기술이 결합되어 실시간 NASBA 장비 및 진단법이 개발되게 되었다.

선진국에서는 농가에 심각한 피해를 초래하는 바이러스, 바이로이드 병을 제거하기 위해 무독묘 공급체계를 구축하고 전문 단체 및 기관을 조직하여 전담, 유지토록 하고 있다. 이러한 기관들은 바이러스, 바이로이드를 진단하기 위해 다양한 진단법을 개발하고 업무에 활용하고 있다. 따라서 우리 나라에서도 이러한 단체를 조직해야 할 뿐만 아니라 정밀한 진단방법을 개발해야 한다. 그 일환으로써 사과 바이로이드 ASSVd를 정밀하게 진단할 수 있는 검정법의 개발은 사과 무독묘의 선발 및 보급에 있어서 절실하게 요구되고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 사과 바이로이드 ASSVd에 의한 감염을 보다 정밀하게 검정할 수 있는 사과 바이로이드 감염 진단용 프라이머를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 사과 바이로이드 ASSVd에 의한 감염을 보다 정밀하게 검정할 수 있는 사과 바이로이드 감염 진단방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 사과 바이로이드 ASSVd에 의한 사과의 감염을 진단함에 있어 위양성을 제거하여 실험의 정확성을 제고할 수 있는 사과 바이로이드 감염 진단방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기한 바와 같은 목적은 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) 서열번호 1로 이루어지는 사과 바이로이드 감염진단용 프라이머.

(2) 서열번호 2로 이루어지는 사과 바이로이드 감염진단용 프라이머.

(3) NASBA 검정법을 이용하는 바이로이드 진단방법에 있어서, 일측에 RNA 폴리머라제 프라이머가 결합되는 서열번호 1로 이루어지는 프라이머를 제 1프라이머로 하여 사과 바이로이드 안티센스 RNA를 증폭하는 과정을 포함하여 사과 바이로이드 감염여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 사과 바이로이드 진단방법.

(4) NASBA 검정법을 이용하는 바이로이드 진단방법에 있어서, 서열번호 2로 이루어지는 프라이머를 제 2프라이머로 하여 사과 바이로이드 안티센스 RNA를 증폭하는 과정을 포함하여 사과 바이로이드 감염여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 사과 바이로이드 진단방법.

(5) 상기 (3)에 있어서, 서열번호 2로 이루어지는 프라이머를 제 2프라이머로 하는 것을 특징으로 하는 사과 바이로이드의 진단방법.

(6) 서열번호 3의 연속된 DNA 분자로 이루어진 분자비컨.

(7) 상기 (3)에 있어서, 서열번호 3의 연속된 DNA 분자로 이루어진 분자비컨을 타겟 RNA에 반응시켜 사과바이로이드 감염여부를 확인하는 사과 바이로이드 진단방법.

(8) 상기 (3)에 있어서, 서열번호 4로 이루어지는 프라이머를 제 1프라이머로 하여 시료에 반응시켜 nad5 유전자의 증폭을 확인하는 과정을 포함하는 사과 바이로이드 진단방법.

(9) 상기 (3)에 있어서, 서열번호 5로 이루어지는 프라이머를 제 2프라이머로 하여 시료에 반응시켜 nad5 유전자의 증폭을 확인하는 과정을 포함하는 사과 바이로이드 진단방법.

(10) 상기 (3)에 있어서, 서열번호 6의 연속된 DNA 분자로 이루어진 분자비컨을 타겟 RNA에 반응시켜 사과바이로이드 감염여부를 확인하는 사과 바이로이드 진단방법.

본 발명의 상기 구성에 의하면,

(1) 본 발명에 따른 프라이머들은 사과 바이로이드 ASSVd에 의한 감염을 보다 정밀하게 검정할 수 있게 하고,

(2) 이를 이용한 사과 바이로이드 감염 진단방법은 기존의 RT-PCR 방법에 의한 것 보다 정밀하게 검정할 수 있으며,

(3) 내부 유전자인 nad5 유전자를 증폭하여 봄으로써 위양성을 제거하여 실험의 정확성을 제고할 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 사과 바이로이드인 ASSVd에 의한 감염을 진단하기 위해 NASBA(nucleic acid sequence based amplification) 방법이 적용된다.

동 방법은 타겟인 센스 RNA (sense RNA)상에 제 1프라이머를 어닐링하고, 여기에 역전사효소를 작용시켜 단일가닥의 DNA 분자를 합성하는 제 1단계; 상기 DNA-RNA 하이브리드 분자에 RNA 분해효소를 작용시켜 RNA를 제거하는 제 2단계; 상기 얻어진 단일가닥의 DNA 분자상에 제 2프라이머를 어닐링하고, 여기에 역전사효소를 반응시켜 두가닥 DNA 분자를 합성하는 제 3단계; 및 제 2프라이머를 사용하여 합성된 상기 단일가닥 DNA 분자를 템플릿으로 하여 RNA 중합효소를 매개하여 안티센스 RNA를 합성하는 제 4단계를 포함한다.

이와 함께 얻어진 안티센스 RNA가 또 하나의 주형이 되어 여기에 프라이머가 붙어 다시 역전사효소가 주형 DNA를 합성한다. 이 DNA가 다시 안티센스 RNA를 합성하여 타겟 RNA와는 반대방향의 RNA 증폭산물을 축적하게 된다.

따라서, 제 1프라이머의 일측에는 실험에 사용할 RNA 중합효소가 인식할 수 있는 프로모터 부위가 결합되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 제 1프라이머는 서열번호 1로 이루어지는 염기서열, 또는 이 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 DNA 분자를 포함한다.

또한 상기 서열번호 1로 이루어지는 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열을 포함한다.

또한 상기 제 1프라이머를 위한 DNA 분자는 상기 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열을 포함할 수 있다.

상기에서 변형서열의 경우 실질적으로 사과 바이로이드인 ASSVd 게놈과 혼성화(hybridization)능을 유지하는 범위내에서의 일부 염기의 결실, 삽입, 부가 및 치환된 서열을 의미한다.

변이의 위치는 혼성화를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지는 않지만 바람직하게는 신장단계(elongation step)에 영향을 미치는 3‘말단 부위는 배제되거나, 최소한도의 변이만이 허용되는 것이 바람직하다.

상기 DNA 분자상에 결합하는 표식물(marker)은 방사선 물질 또는 비방사선 물질의 어느 것도 포함될 수 있다. 방사선 물질은 예를 들면, 인산에스테르 부분에 방사선 동위체를 포함하는 것일 수 있다. 비방사선 표식물의 예로는 로다민, 플로오로세인 및 이들 유도체 등의 형광물질 등일 수 있다. 또한 간접적인 표식물로서 비오틴, 햅텐 등이 도입될 수도 있다.

고상 담체(solis-phase carrier)와 결합가능한 부위는 예를 들면, 샌드위치혼성화 반응 등 핵산의 특이 단편을 고상 담체에 특이적으로 결합할 경우에 이용된다. 고상 담체는 중합효소 연쇄반응 생성물의 선택적인 검출을 더욱 효과적으로 수행할 수 있도록 하는 한 특별히 한정되지는 아니한다. 이들 고상 담체의 예로는 예로는 아가로스비드, 폴리아크릴비드, 라텍스, 마이크로타이터, 폴리스티렌볼 등의 고상담체에 프라이머 중에 도입된 결합부위를 포착가능하도록 프트렙토아비딘, 항체 등을 도입한 것 등이 있다.

상기 표식물 또는 고상담체와 결합가능한 부위는 중합연쇄반응시 신장에 방해를 주지 않기 위해 바람직하게는 5’말단부위에 도입된다.

상기 서열번호 1로 이루어지는 연속된 DNA 분자와는 구체적인 배열은 상이하지만 상기와 같이 핵산단편에서 변형서열, 표식물, 고체상 담체 등을 사용하는 보다 구체적인 예가 특허공개 2001-0095120호에 개시되어 있어 이를 본 발명의 내용에 인용하는 것으로 한다.

또, 본 발명의 상기 제 2프라이머는 서열번호 2로 이루어지는 염기서열, 또 는 이 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 DNA 분자를 포함한다.

또한 상기 서열번호 2로 이루어지는 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열을 포함한다.

또한 상기 제 2프라이머를 위한 DNA 분자는 상기 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열을 포함할 수 있다.

상기에서 변형서열의 경우 실질적으로 상기 제 1프라이머를 신장하여 얻은 단일 DNA 분자상에 혼성화(hybridization)능을 유지하는 범위내에서의 일부 염기의 결실, 삽입, 부가 및 치환된 서열을 의미한다.

변이의 위치는 혼성화를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지는 않지만 바람직하게는 신장단계(elongation step)에 영향을 미치는 3‘말단 부위는 배제되거나, 최소한도의 변이만이 허용되는 것이 바람직하다.

상기 DNA 분자상에 결합하는 표식물(marker)은 방사선 물질 또는 비방사선 물질의 어느 것도 포함될 수 있다. 방사선 물질은 예를 들면, 인산에스테르 부분에 방사선 동위체를 포함하는 것일 수 있다. 비방사선 표식물의 예로는 로다민, 플로오로세인 및 이들 유도체 등의 형광물질 등일 수 있다. 또한 간접적인 표식물로서 비오틴, 햅텐 등이 도입될 수도 있다.

고상 담체(solid-phase carrier)와 결합가능한 부위는 예를 들면, 샌드위치혼성화 반응 등 핵산의 특이 단편을 고상 담체에 특이적으로 결합할 경우에 이용된 다. 고상 담체는 중합효소 연쇄반응 생성물의 선택적인 검출을 더욱 효과적으로 수행할 수 있도록 하는 한 특별히 한정되지는 아니한다. 이들 고상 담체의 예로는 아가로스비드, 폴리아크릴비드, 라텍스, 마이크로타이터, 폴리스티렌볼 등의 고상담체에 프라이머 중에 도입된 결합부위를 포착가능하도록 프트렙토아비딘, 항체 등을 도입한 것 등이 있다.

상기 표식물 또는 고상담체와 결합가능한 부위는 중합연쇄반응시 신장에 방해를 주지 않기 위해 바람직하게는 5‘말단부위에 도입된다.

상기 서열번호 2로 이루어지는 DNA 분자와는 구체적인 배열은 상이하지만 상기와 같이 핵산단편에서 변형서열, 표식물, 고체상 담체 등을 사용하는 보다 구체적인 예가 특허공개 2001-0095120호에 개시되어 있어 이를 본 발명의 내용에 인용하는 것으로 한다.

또한 본 발명에 따른 사과 바이로이드 감염 진단방법은 최종적으로 생성된 RNA를 확인하기 위해 분자비컨(molecular beacon)이 사용될 수 있다.

분자비컨은 SNP를 감지할 수 있는 대표적인 DNA센서이다. 전형적인 분자비컨은 머리핀(stem-and-loop) 구조를 가지며, 5’과 3’ 각각의 말단에 형광체와 소광체를 연결하여 두 물질간의 에너지이동(energy transfer)에 의해 형광이 소멸되어 있다가, 머리핀 부분의 상보적인 서열을 만나면 소광체와 형광체의 거리가 멀어지면서 형광이 나타나는 것을 보고 표적을 감지하는 반면, 적어도 하나 이상의 염기가 불일치하는 DNA를 만났을 경우에는 머리핀 구조를 그대로 유지하여 형광이 소멸 되는 DNA 분자를 말한다. 본 발명의 진단방법에 사용될 수 있는 분자비컨의 예는 서열번호 3으로 이루어지는 DNA 분자를 들 수 있다.

나아가 본 발명은 사과 바이로이드 감염 진단에 있어서 위양성(false positive)을 제거하기 위하여 사과의 미토콘드리아에 존재하는 nad5(NADH dehydrogenase subunit 5) 유전자를 사용할 수 있다. 이 유전자의 RNA를 증폭하여 확인하는 것에 의해 RNA가 없기 때문에 바이로이드에 감염되어 있지 않은 것으로 판단하는 오류 즉, 위양성을 제거할 수 있게 한다.

nad5 유전자의 RNA 증폭과정은 앞서 ASSVd RNA의 증폭방법과 동일한 절차를 통해 이루어진다. 이를 위해 본 발명에서는 서열번호 4로 이루어지는 염기서열 또는 이 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 DNA 분자를 제 1프라이머로 이용한다. 변형서열에 대한 설명은 위 서열번호 1과 2를 통해 설명한 바를 인용하는 것으로 하고 여기서는 이에 대한 상세한 설명은 생략하기로 한다.

또 nad5 유전자의 RNA 증폭을 위해 사용되는 제 2프라이머는 서열번호 5 또는 이 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 DNA 분자가 이용될 수 있다. 마찬가지로 변형서열에 대한 것은 위 서열번호 1과 2를 통해 설명한 바를 인용하는 것으로 하고 여기서는 이에 대한 상세한 설명은 생략하기로 한다.

nad5 유전자의 RNA 증폭 및 증폭의 정도는 ASSVd RNA의 경우에서와 마찬가지로 분자비컨이 사용될 수 있다. 이에 사용될 수 있는 분자비컨의 예로는 서열번호 6으로 이루어지는 DNA 분자를 들 수 있다.

후술하는 본 발명의 실시예에서는 NASBA를 통한 증폭과정에서 최적화된 증폭조건을 제공한다. 이는 NASBA를 통한 증폭과정은 장비를 만든 업체의 일반적인 조건에 따라 증폭하는 것보다 최적화된 증폭조건을 설정하여 검정할 경우 그 효율이 더 높아지기 때문이다.

따라서, 본 발명의 실시예에서는 사용되는 프라이머의 농도, KCl의 농도, ITP 농도 등을 실험하여 그 최적 조건을 설정하고 있다. 뿐만 아니라, 감염(양성반응), 무감염(음성반응)으로 판단할 수 있는 기준선, 즉 한계레벨(threshold level)을 설정하여 대량으로 바이로이드를 검정하는 시스템을 제시하며, ASSVd RNA 농도별 실험을 통해 정량을 할 수 있는 방법을 제시하고자 한다.

<실시예 1>

사과바이로이드(ASSVd)의 특이적 프라이머와 분자비컨을 설계하기 위해서 GenBank에 등록되어 있는 ASSVd 단리물의 염기서열을 확보하고(AF421195, DQ362906, DQ362907), 수원원예연구소 과수과 포장에 재식되어 있는 감염부의 ASSVd RNA를 클로닝하여 그 염기서열을 확인하였다.

이 서열을 ClustalW 프로그램을 이용해 비교한 결과 수원 단리물의 염기서열과 ASSVd-K(Korea strain, AF421195)의 서열과 100% 매치하는 것으로 밝혀졌다. 외국에서 밝혀진 ASSVd의 염기서열에는 약간의 차이가 있을 뿐 전부 98% 이상으로 상동성이 높았다(도 1). 이 염기서열을 대상으로 120~250bp 정도의 증폭산물이 발생하게 하는 제 1프라이머(이하 P1), 제 2프라이머(이하 P2) 위치를 AlleleID 프로그램을 이용하여 결정하였다. P1, P2 프라이머 둘다 길이 20~30bp 정도에 GC 함량이 40~60%가 되어야 하며, P1은 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함해야 한다(도 2A).

또한 이 증폭산물을 검출하기 위해 특이적인 분자비컨도 결정하여 그 이차구조를 Mfold DNA 폴딩 프로그램으로 조사하였다. 그 결과 일반적인 NASBA 증폭조건(41℃, [Na+]=0.1M, [Mg2+]=0.012M, ΔG=-3±0.5kcal/mole)에서 이 ASSVd 분자비컨은 머리핀 구조인 스템루프 형태를 이루어 요건을 제대로 갖추었음을 확인하였다(도 2B). 분자비컨은 스템, 즉 서로 상보적인 염기서열(arm sequence)의 끝부분에 있어 평상시에는 서로 맞붙어 닫혀 있는 상태로 있다가 타겟 RNA를 만나게 되면 스템이 열리고 여기에 루프가 결합하여 길게 늘어진다. 이때 스템의 끝부분에 달려 있던 형광물질(본 실험에서는 FAM을 사용)이 닫혀 있을 때에는 열로써 방출하던 에너지를 열리게 되면 빛으로 그 에너지를 방출하게 되어(FRET) 이 빛의 정도를 수치로 읽어 들여 타겟 RNA의 존재 여부와 양을 알 수 있게 되는 것이다.

내부 대조구인 사과 미토콘드리아에 존재하는 nad5 유전자의 특이적 프라이머, 분자비컨 또한 같은 방식으로 설계하였다. 각 프라이어머의 분자 비컨의 염기 서열은 도 2C와 같다.

<실시예 2> ASSVd 진단을 위한 실시간 NASBA 조건 설정

NASBA는 RNase H, AMV 역전사효소, T7 RNA 폴리머라제의 세 효소가 PCR과 달리 41℃에서 일정하게 RNA를 증폭하는 과정이다. 즉, 타겟 RNA에 프라이머가 붙고 역전사효소가 상보적인 DNA를 합성한 후, RNase H가 RNA를 제거한다. 여기에 다시 프라이머가 붙어 역전사효소가 DNA를 완성시킨다.

이 주형을 대상으로 T7 RNA 폴리머라제가 타겟 RNA와는 반대방향의 RNA를 만들어낸다. 이와 동시에 이 반대방향의 RNA(안티센스 RNA)가 또 하나의 주형이 되어 여기에 프라이머가 붙어 다시 역전사효소가 주형 DNA를 생성한다. 이 DNA가 또 안티센스 RNA를 합성하여 타겟 RNA와 반대방향의 RNA 증폭산물(amplicon)을 축적하게 된다.

위에서 제작한 프라이머를 이용하여 최적의 증폭을 유도하기 위해서 여러 조건을 설정하였다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, KCl 및 ITP의 적정농도를 설정하였는데 그 실험을 위해 각각 여러 범위의 농도에서 검정실험을 수행하였다. 그 결과 최적의 조건, 즉 가장 높은 형광수치를 나타내는 농도 또는 Time To Positive(TTP, 증폭되기 시작했을 때의 시간) 수치가 가장 낮을 때의 조건을 조사하였는데 (A) 프라이머 농도는 30μM일 때, (B) KCl의 농도는 60mM, (C) ITP 농도는 2mM 이었을 경우였다. 따라서, 이 조건으로 ASSVd를 진단하기 위한 실시간 NASBA 증폭조건으로 설정하였다.

<실시예 3> ASSVd 진단을 위한 한계레벨 설정

분자비컨은 평상시, 즉 머리핀 구조를 이루어 스템이 닫혀 있는 경우에는 형광물질의 에너지가 소광제(quencher)로 건너가 열로 방출되나 어느 정도는 빛의 형태로 그 에너지가 발산된다. 따라서 각 분자비컨 마다 자연적으로 방출되는 형광값(fluorescence signal)을 조사하여야만 정확한 증폭시점을 판단할 수 있다. 이 값을 구하기 위해서 ASSVd에 감염되어 있지 않은 무독주 샘플 20개를 준비하여 5개씩 총 4번의 독립적인 실험을 통해 형광 초기값(baseline fluorescence)을 조사하였다(표 1).

이 결과를 이용해 기저(baseline) 값의 평균을 구하고, 이 값에 최고값과 최저값의 비율을 곱하여 한계레벨, 즉 증폭이 되는지 판단할 수 있는 기준값(1.414)을 결정하였다. 즉, 이 한계레벨을 넘어 형광값(fluorescence signal)이 발생하면 이 샘플은 ASSVd에 감염되어 그 RNA가 증폭되고 있다는 것을 의미한다. 또한, 이 한계레벨을 넘으면 양성반응, 넘지 않으면 음성반응으로 판단하므로 차단레벨(cut-off level)이라 표현하기도 한다.

<표 1>

Run1	Run2	Run3	Run4	BF mean	BF high	BF low	ratio	Cut-off
0.9659	0.9555	0.9156	1.0467	1.00889	1.24792	0.89019	1.40186	1.41433
0.9926	0.9322	0.9772	1.1091
0.9948	0.8902	1.0008	1.0894
1.0084	0.9726	1.0198	1.0289
0.9511	1.0481	1.2479	1.0311

<실시예 4> 실시간 NASBA를 이용한 사과 바이로이드 ASSVd의 진단

위에서 설정한 조건을 이용하여 ASSVd 감염주와 무독주를 대상으로 실시간 NASBA 검정을 실시하였다. 샘플 RNA 5㎕와 10㎕ NASBA 믹스(40mM Tris HCl(pH 8.5), 12mM MgCl₂, 60mM KCl, 5mM 다이치오스레이톨, 15% v/v DMSO, 1mM dNTPs, 2mM rATP, rUTP, rCTP, 1.5mM rGTP, 2mM ITP, 30μM 프라이머 P1 및 P2, 10μM 분자비컨)를 혼합한 뒤 가닥내 염기쌍(intra basepairing)이 되어 있는 ASSVd를 풀어주기 위해 94℃에서 2분간 변성하고, 65℃에서 5분, 41℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 그런 다음 5㎕의 효소 믹스(375mM 솔비톨, 2.1㎍ BSA, 0.08U RNase H, 32U T7 RNA 폴리머라제, 6.4U AMV 역전사효소)를 첨가하여 섞은 뒤 41℃에서 150분간 검정하였다.

그 결과 도 4A와 같이 한계레벨을 기준으로 넘는 것과 그렇지 않는 것이 발생하게 되었다. ASSVd 감염주는 A1, 2와 같이 한계수준(1.414)을 넘어 그 형광 수치가 발생되고 무독주는 ASSVd RNA가 없어 증폭되지 않아 형광수치가 한계레벨을 넘지 않았다. B에서 확인할 수 있듯이 감염주는 과실 표면에 그 병징이 나타나지만 무독주는 깨끗한 것을 알 수 있다.

또한, ASSVd RNA가 많은 샘플은 Time to Positive(TTP)가 적게 걸리는 것으로 보아(B2가 B1 보다 더 심한 증상을 보이고 있고 TTP 또한 A1 보다 A2가 더 적은 시간, 38분 정도에 증폭이 시작되는 것으로 보아) 이를 통해 정량이 가능함을 알 수 있었다.

<실시예 5> ASSVd 및 nad5 RNA의 in vitro RNA 전사

ASSVd의 정량과 nad5 유전자를 이용한 검정을 위해서 RT-PCR을 수행하였다. 각 RT-PCR용 프라이머는 ASSVd, nad5 전체 길이의 유전자를 클로닝하기 위해서 각각의 끝부분의 염기서열을 사용하여 제작하였다.

그 결과 도 5A와 같은 결과를 얻어(ASSVd 330bp, nad5 유전자 1.4kb) 밴드를 잘라 클로닝하기 위해 추출하였다. 도 5B는 실시간 NASBA 프라이머(nad5-P1, P2)와 분자비컨(nad5-MB)의 위치를 나타내고 있다. 사과 미토콘드리아에 존재하는 NADH 디하이드로게나아제 서브유닛 5(nad5) 유전자는 도 5B와 같이 DNA 상에서는 엑손 사이에 인트론(848bp)이 끼어 있어서 NASBA 증폭가능한 길이 (120~250bp)를 넘기 때문에 NASBA용 프라이머로는 증폭이 되지 않는다. 만약 샘플에 DNA가 섞여 있을 경우에도 이 NASBA용 프라이머로는 증폭되지 않아 RNA가 아닌 DNA에 의해 증폭되지 않았음을 보여준다. 더욱이 이 nad5 유전자를 내부 대조군으로써 실험하게 되면 샘플의 RNA가 제대로 추출되었는지 확인할 수 있어 위양성, 즉 RNA가 제대로 뽑히지 않아서 ASSVd에 감염되지 않았다고 잘못 판정하게 되는 오류를 제거할 수 있게 된다.

도 6을 보면 ASSVd 검정시 동시에 nad5 유전자의 검정을 통해 실험결과의 정확성을 보장해 주고 있음을 알 수 있다. 즉, A행은 ASSVd를 검정한 결과이고, B행은 nad5 유전자를 검정한 결과이다. 샘플 1은 nad5 유전자 뿐만 아니라 ASSVd도 검정되어 RNA가 제대로 뽑혀있고, ASSVd에 감염되어 있음을 알 수 있다. 샘플 2는 RNA는 제대로 뽑혀있지만 ASSVd에는 감염되어 있지 않아 건강한 무독주로 판정할 수 있고, 샘플 3은 nad5 유전자가 검출되지 않았으므로 RNA가 추출되지 않았으므로 ASSVd가 검출된 것으로 보아 이 RNA가 실험도중에 오염되었다고 생각된다. 샘플 4는 둘다 검출되지 않았으므로 RNA가 추출되지 않았음을 확인할 수 있다. 즉, 이 샘플 4는 ASSVd 검정결과에 대하여 위양성 판정을 방지해 주는 역할을 하므로 nad5 유전자 검정은 매우 중요하다는 것을 보여주고 있다.

ASSVd와 nad5의 PCR 산물을 추출하여 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝하였다. 이 플라스미드는 화학적인 방법을 통해 TOP 10F'(Invitrogen) 세포에 도입시켰다. 그 후 콜로니 PCR을 통해 제대로 들어가 있는지 확인하고, High Pure Plasmid isolation Kit(Roche)를 이용해 추출하였다.

이 플라스미드는 시퀀싱을 통해 염기서열을 결정하였고, 기존의 염기서열(ASSVd는 수원 단리물의 염기서열, nad5 유전자는 D37958의 염기서열)과 비교 확인하였다. ASSVd는 제한효소 ApaⅠ을, nad5 유전자는 PstⅠ으로 잘라 in vitro RNA 전사를 위해 DNA를 직선화하였다. ASSVd는 SP6 RNA 폴리머라제로, nad5 유전자는 T7 RNA 폴리머라제로 RNA를 전사시켰다(도 7).

RNA 전사가 완료된 후에는 플라스미드 DNA를 제거하기 위해서 RNase free DNase를 처리하였다. 또한 전사된 RNA의 복제수를 계산하기 위해서 UV 스펙트로포토미터로 260nm의 수치를 조사하였다.

<실시예 6> ASSVd 절대정량을 위한 표준곡선 작성

ASSVd RNA를 절대 정량하기 위해서 ASSVd RNA 농도별 샘플을 작성하였다. 위에서 제작한 ASSVd RNA의 복제수를 계산하여 10¹²(1.0E+12) 농도의 샘플을 제작하여 이를 기준으로 10배씩 희석시켜 1.0E+5 까지 희석한 샘플을 준비하였다. 이 샘플을 대상으로 실시간 NASBA 검정을 하여 그 수치를 표에 나타낸 결과, 농도별로 일정하게 증폭하는 것을 알 수 있었다(도 8A).

도 8A에서 한계레벨(푸른선)을 넘는 시간값(TTP)을 독립적인 실험을 3번 수행하여 도 8B와 같이 표준곡선을 작성하였다. 도에서 볼 수 있듯이 RNA 복제수 10¹²에서부터 10⁷까지 상관관계가 높다는 것을 알 수 있는 데 이 상관관계의 회귀직선을 이용해 ASSVd RNA의 정량이 가능하다. 즉 어떤 샘플의 TTP 수치가 55.5분이라면 이 샘플안에는 ASSVd RNA가 1×10⁸ copies/㎕가 존재한다고 판단할 수 있게 된다. 이 표준곡선을 통해서 ASSVd Limit of Quantification(LOQ)가 1×10⁷ copies/㎕까지 임을 알 수 있다.

<실시예 7> RT-PCR과 실시간 NASBA의 비교

기존에 개발된 ASSVd RT-PCR 검정법의 경우 도 9A를 보면 RNA 복제수가 10¹²부터 10⁸ copies/㎕까지 검정이 가능하나 10¹² copies/㎕ 경우 RNA가 너무 많아 밴드가 늘어진 것을 볼 수 있고, 10⁸ copies/㎕의 경우에는 RNA가 적어 밴드가 희미한 것을 알 수 있다. 그러나 실시간 NASBA를 이용해 검정하게 되면 10¹²부터 10⁴ copies/㎕까지 검정이 가능하여 RT-PCR 보다 10,000배 이상 정밀하게 검정이 가능하다.

이 결과를 통해 ASSVd Limit of Detection(LOD)가 ASSVd RNA 10⁴ copies/㎕까지로 결정하였다.

상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 다양한 ASSVd의 염기서열 및 보존적 서열을 도시한 그림이다.

도 2는 본 발명에 따른 각 프라이머, 분자비컨 서열 및 ASSVd 상에서의 결합도를 도시하고 있다.

도 3은 본 발명에 따른 실험에 요구되는 최적의 증폭을 유도하기 위한 조건을 설정하기 위한 실험결과의 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따른 실시간 NASBA를 이용한 사과 바이로이드 ASSVd의 진단결과를 나타내는 사진이다.

도 5는 본 발명에 따른 ASSVd의 정량 및 nad5 유전자를 이용한 검정을 위한 RT-PCR 수행결과 및 실시간 NASBA 프라이머(nad5-P1, P2)와 분자비컨(nad5-MB)의 위치를 나타내는 그림이다.

도 6은 본 발명에 따른 ASSVd 및 nad5 유전자의 검정결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 본 발명에 따른 ASSVd 및 nad5 유전자의 전사과정을 나타내는 그림이다.

도 8은 본 발명에 따른 ASSVd 절대정량을 위한 표준곡선을 나타낸다.

도 9는 본 발명에 따른 실시간 NASBA과 RT-PCR의 비교 실험결과를 나타낸다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer for Diagnosis of Apple Scar Skin Viroid Infection and Method for Diagnosis using the same <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gagcgtgaga gaacagg 17 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gcagatagat aaagaaaacg agga 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Molecular beacon <400> 3 aaggagctgc cagcactaag ccg 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gatggaccaa gctacttatg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ttcgatctta tctctgattg c 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Molecular Beacon <400> 6 cgatagcccg accgtagtga tgt 23

Claims (10)

1. NASBA(nucleic acid sequence based amplification) 검정법을 이용하는 바이로이드 진단 방법에 있어서,

   일측에 RNA 폴리머라제 프라이머가 결합되는 서열번호 1로 이루어지는 프라이머를 제 1프라이머로 하고, 서열번호 2로 이루어지는 프라이머를 제 2프라이머로 하여 시료에 반응시켜 사과 바이로이드 안티센스 RNA를 증폭하는 단계; 및

   서열번호 4 및 5로 이루어지는 프라이머를 각각 제1 및 제2 프라이머로 하여 시료에 반응시켜 nad5(NADH dehydrogenase subunit 5) 유전자의 증폭을 확인하여 위양성을 판단하는 단계를 포함하여 사과바이로이드 감염여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 사과 바이로이드 진단방법.
2. 제 1항에 있어서, 서열번호 3의 연속된 DNA 분자로 이루어진 분자비컨을 타겟 RNA에 반응시켜 사과바이로이드 감염여부를 확인하는 사과 바이로이드 진단방법.
3. 제 1항에 있어서, 서열번호 6의 연속된 DNA 분자로 이루어진 분자비컨을 타겟 RNA에 반응시켜 사과바이로이드 감염여부를 확인하는 사과 바이로이드 진단방법.
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