KR102516117B1 - 선인장 감염 바이러스 4종(CMMoV, RCNaV, SgCV, TSWV) 다중진단용 특이 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

선인장 감염 바이러스 4종(CMMoV, RCNaV, SgCV, TSWV) 다중진단용 특이 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 선인장 감염 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 구체적으로 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)로 이루어진 총 4종의 선인장 감염 바이러스를 단독 및 다중으로 진단할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 선인장 감염 바이러스를 효과적으로 진단할 수 있다.

Description

선인장 감염 바이러스 4종(CMMoV, RCNaV, SgCV, TSWV) 다중진단용 특이 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법 {Specific primer set for multiple detection of 4 types of cactus infectious virus and detection method using the same}
본 발명은 선인장 감염 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 구체적으로 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)로 구성된 4종의 바이러스를 다중으로 진단할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
선인장과(family　Cactaceae)의 선인장(Opuntia ficus-indica {Linne} Mill.)은 주로 북아메리카와 남아메리카가 자생지이며, 전세계에 약 20속, 2000종 이상이 분포하고 있다. 우리나라의 경우 관상용 선인장 재배면적은 2018년 47.6㏊이며, 2019년 선인장 수출액은 406만달러로 우리나라 화훼 전체 수출액의 23.7%를 차지하고 있다. 수출하는 선인장은 비모란 등 접목선인장류가 대부분이며, 우리나라 접목선인장은 세계 거래량의 약 70%를 점유하고 있다. 선인장은 종자번식의 경우 성장속도가 늦고 모주가 교배종인 경우 이형이 나오는 단점이 있어서 주로 삽목 또는 접목으로 번식시킨다. 그러나 이러한 영양번식으로 묘를 생산하는 경우 다음세대에 바이러스 감염률이 높아 수량과 품질이 나빠지는 것이 일반적이다. 삼각주는 수출용 접목선인장의 대목으로 이용되는데 선인장바이러스X(CVX)에 감염되면 접목활착률이 50%까지 낮아지고 색이 변질되어 노동력 낭비, 상품성 저하 등 농가에 심각한 피해를 주게 된다(Chung et al., 2003; Chessin, 2000).
이러한 선인장에 감염하는 바이러스는 전 세계적으로 5속 14종의 바이러스가 알려져 있으며, 국내 선인장에서는 선인장바이러스 X(CVX)를 포함한 8종의 바이러스가 보고되었다(표 1).
Genus Virus Transmission 국내보고*
Potexvirus Cactus virus X CVX 즙액전염 국내보고
Opuntia virus X OpVX
Pitaya virus X PiVX
Zygocactus virus X ZyVX
Schlumbergera virus X SchVX　
Tobamovirus Cactus mild mottle virus CMMoV 즙액전염 국내보고
Rattail cactus necrosis-associated virus RCNaV
Sammons's opuntia virus SOV 국내미보고
Tobacco mosaic virus TMV
Orthotospovirus Tomato spotted wilt virus TSWV 총채벌레, 즙액전염 국내미보고
impatiens necrotic spot virus INSV
Tomato chlorotic spot wilt virus TCSV
Carmovirus Saguaro cactus virus SgCV 즙액전염 국내보고
Calravirus cactusvirus2 CV2 진딧물 국내미보고
현재 국내에 보고된 선인장 바이러스는 매개충이 없고 주로 영양번식 시 기구에 의한 즙액 전염이나 토양에 뿌리의 상처 부위를 통하여 전염되고 있는 것으로 보인다. 병징은 주로 줄기에 원형황화, 이중원형황화, 모자이크 무늬 등이 나타나고 때로는 그 부위가 옴푹 들어가며, 심하면 포기 전체가 노랗게 변하고 꽃에는 품종 고유 색깔 이외에는 다른 색깔이 들어가 칼라 브레이크 현상이 나타난다. 이와 같은 증상은 종류나 생육 시기에 따라 다르고, 선인장 종류에 따라서는 병징이 나타나지 않는다(한국원예학회 학술발표요시, 116-116).
이러한 피해를 야기하는 바이러스는 2종 이상이 복합감염 되었을 때 피해가 크며, 특히 토바모바이러스속에 속하는 2종의 바이러스, 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV)와 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV)는 선인장바이러스X(CVX) 등의 포텍스바이러스 등과 복합감염되어 피해를 주고 있다(The plant pathology journal, 34(1), 65).
선인장연한모틀바이러스(CMMoV)와 선인장괴사바이러스(RCNaV)는 Virgaviridae 과 Tobamovirus 속에 속하며, 320　nm 길이 X 18　nm 직경의 막대형 입자형태로 즙액 전염되며, 주요 병징은 괴사증상으로 선인장을 포함한 몇몇 기주에서 전신감염을 보인다. CMMoV는 2001년에 국내 삼각주(Hylocereus trigonus)에 접목한 접목선인장인 비모란(Gymnocalycium mihanovichii)에서 처음 발생이 확인되었으며, CMMoV 감염된 비모란은 연한 모자이크 병징을 보이며 삼각주에서는 원형의 얼룩덜룩한 모틀 증상을 보였다(Min et al. 2006, Arch. Virol. 151:13-21). 바이러스의 전체유전자(6,449 nucleotides)를 분석한 결과 viral replicase와 movement protein(MP)은 선인장 감염 토바모바이러스와 유사하지만, coat protein(CP)은 유채속 또는 가지과 감염 토바모바이러스와 상동성이 높음을 확인할 수 있었다(Archives of viology, 154(3), 1371-1374).
선인장괴사바이러스(RCNaV)는 괴사증상을 보이는 국내 쥐꼬리선인장(Aporocactus flagelliformis)에서 처음 보고되었고, 이후에 멕시코의 백년초(prickly pear fruit, Opuntia albicarpa Scheinvar)에서도 보고되었다. RCNaV의 전체 염기서열은 6,506 nucleotides로, 계통분석 결과 CMMoV와 같은 그룹에 속한 것으로 확인되었다.
사와로선인장바이러스(SgCV)는 Tombusviridae 과, Carmovirus 속에 속하는 구형바이러스(~32 nm in diameter)로, 전체 염기서열이 3,879 nucleotides인 단일가닥의 RNA 핵산으로 구성되어 있다(Journal of general virology 78(3), 525-534). 기주식물은 선인장으로만 알려져 있으며, 미국 애리조나주의 변경주선인장(saguaro cactus, Carnegiea gigantea)에서 처음 보고되었고, 선인장에서는 병징이 없으나, 접종된 명아주나 시금치딸기 등에서는 국부적인 퇴록반점, 엽맥퇴록, 모틀 증상을 나타내는 것으로 보고되어 있으며, 즙액 접종 또는 접목에 의해 전염되고, 매개충 전염은 알려져 있지 않다. 국내에서는 접목선인장 대목인 삼각주(Hylocereus trigonus)에서 처음 발생이 확인되었다.
토마토반점위조바이러스(TSWV)는 Tospoviridae 과, Orthotospovirus 속에 속하는 구형바이러스(80 to 100 nm in diameter)로, 세가닥의 RNA 핵산(L, M, S)으로 구성되어 있고, 기주범위가 1000종 이상으로 넓은 기주범위를 가지며, 총채벌레에 의해 전염될 수 있고, 즙액전염도 가능하다. 국내에서는 고추, 토마토 등 가지과 작물에 큰 피해를 주고 있고, 최근에는 화훼, 약용작물 등에서도 발생이 되는 등 기주범위가 확산되고 있다. TSWV는 미국의 부채선인장속(Opuntia sp.)과 게발선인장(Schlumbergera trancata)에서 처음 보고되었고, 증상은 주로 원형반점, 퇴록, 괴사, 기형 등의 증상을 나타낸다(Plant Disease, 75(2), 215-215).
이러한 선인장 감염바이러스를 진단하기 위한 방법 중, 선인장 포텍스바이러스를 동시 진단하기 위한 방법은 이미 연구되어 출원되었으나(등록번호: 10-2175120), 포텍스 바이러스를 제외한 3종의 바이러스(CMMoV, RCNaV, SgCV)와 감염의 우려가 있는 TSWV의 복합감염을 특이적으로 진단해낼 수 있는 특이적 마커 및 이를 이용한 동시진단방법 등은 아직 개발되지 않았기에 이에 대한 연구개발이 필요한 실정이다.
상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 복합감염된 선인장 감염 바이러스를 진단하기 위해 연구 노력한 결과, 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)로 이루어진 선인장 감염 바이러스를 특이적으로 진단할 수 있는 프라이머 쌍을 설계하였고, 이렇게 설계된 본 발명의 프라이머가 상기 바이러스에 대한 우수한 민감도를 가지고 있는 것을 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2으로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4으로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 선인장 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 선인장 감염 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 선인장 감염 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 시료에서 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계, 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 수득한 DNA 또는 RNA를 증폭하는 단계 및 상기 수득한 산물을 분석하여 바이러스 감염 여부를 판정하는 단계를 포함하는 선인장 감염 바이러스 진단 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2으로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4으로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 선인장 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2으로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4으로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 프라이머 쌍을 포함하여 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV) 및 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 중에서 선택된 둘 이상의 감염 여부를 동시에 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 더 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 프라이머 쌍을 포함하여 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV) 중에서 선택된 둘 이상의 감염 여부를 동시에 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 선인장 감염 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 선인장 감염 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료에서 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계, 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 수득한 DNA 또는 RNA를 증폭하는 단계, 및 상기 수득한 산물을 분석하여 바이러스 감염 여부를 판정하는 단계를 포함하는 선인장 감염 바이러스 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 방법은 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV) 및 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 중에서 선택된 둘 이상의 감염 여부를 동시에 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 방법은 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(e, TSWV) 중에서 선택된 둘 이상의 감염 여부를 동시에 진단하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 선인장 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트는 선인장에 발생하는 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)로 이루어진 4종의 바이러스를 정확하고 특이적으로 진단할 수 있으며, 프라이머간의 간섭현상이 적어 높은 민감도로 선인장 감염 바이러스의 감염여부를 정확하고 신속하게 동시에 진단할 수 있다.
본 발명의 진단방법을 통하여 바이러스 진단에 소요되는 비용과 시간을 줄일 수 있어 경제적이며, 바이러스 감염 여부를 조기에 진단할 수 있어 감염으로 인한 농가의 경제적 손실도 방지할 수 있다.
단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 선인장 진단 프라이머를 활용해 RT-PCR을 수행한 결과이다.
도 2는 선인장 바이러스 4종에 대한 Multiplex RT-PCR의 구체적인 방법 및 조건을 나타낸 것이다.
도 3은 상기 도 2에서 수행한 Multiplex RT-PCR의 결과이다.
도 4는 선인장 바이러스 4종 다중진단용 프라이머 조합의 진단한계를 확인하기 위해 바이러스 RNA의 농도를 낮춰가며 RT-PCR을 수행한 결과이다.
본 발명자들은 선인장 감염 바이러스의 복합감염을 진단할 수 있는 방법에 대한 연구를 수행하여 선인장에 발생하는 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)로 이루어진 선인장 감염 바이러스를 특이적으로 진단할 수 있는 프라이머 쌍을 설계하였고, 이렇게 설계된 상기 프라이머의 상기 바이러스에 대한 우수한 민감도를 보이는 것을 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명은 특이적 서열의 프라이머 쌍을 포함하는 선인장 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 진단 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍일 수 있으며, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 4쌍의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 CMMoV, RCNaV, SgCV 및 TSWV를 동시에 높은 효율로 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 "프라이머"란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 식물체 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머라아제 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA/RNA 증폭을 개시할 수 있다.
본 발명에 따른 선인장 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트는 선인장 감염 바이러스에 대해서 종 특이적 RNA 증폭을 유발하기 위해 개발되었다. 종 특이적이라는 의미는 해당 프라이머가 진단 대상이 되는 바이러스의 유전체 서열로부터 특이적인 RT-PCR 산물을 합성할 수 있음을 의미하며, 진단대상이 되는 바이러스 종내의 모든 계통에 대해서 공통적으로 작용해야 하고, 다른 유사 종 또는 식물체 유래의 핵산과의 비특이적 반응은 일어나지 않아야 한다. 본 발명의 프라이머는 식물체 또는 다른 바이러스의 핵산에 의한 비특이적인 산물을 생산하는 일반적인 프라이머와 달리 종 특이적으로서 선인장 감염 바이러스 진단에 사용된다.
상기 선인장에는 다양한 종의 선인장이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)을 비롯한 선인장 감염 바이러스가 감염될 수 있는 모든 선인장 식물체에 적용가능하다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍은 CMMoV로부터 약 809bp의 증폭 산물을 나타내며, 본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍은 RCNaV으로부터 약 640bp의 증폭 산물을 나타내며, 본 발명의 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍은 SgCV로부터 약 294bp의 증폭 산물을 나 타내며, 본 발명의 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍은 TSWV로부터 약 453bp의 증폭 산물을 나타내며, 이를 통해 상기 두 종 이상의 바이러스를 특이적으로 진단할 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 바이러스 중에서 어느 두 개 이상을 동시에 다중으로 진단할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
복수 바이러스의 다중 진단이 가능하기 위해서는 개별 프라이머가 종 특이적인 것은 물론 프라이머 간에 서로 간섭 작용이 일어나지 않아야 하고, 증폭 산물을 구별할 수 있어야 한다. 일례로, 각 프라이머의 증폭 위치가 겹치거나 가깝지 않아 서로 간에 증폭에 영향을 미치지 않고 최종적인 증폭 산물의 크기가 확연하게 차이가 나서 RT-PCR 전기영동 결과로 뚜렷이 구별될 수 있어야 바람직하다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 프라이머 쌍을 포함하여 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV) 및 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 중에서 선택된 둘 이상의 감염 여부를 동시에 진단할 수 있으며, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 더 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 프라이머 쌍을 포함하여 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV) 중에서 선택된 둘 이상의 감염 여부를 동시에 진단할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 다중 진단을 위한 프라이머 세트의 조합은, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 상기 4쌍의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 CMMoV, RCNaV, SgCV 및 TSWV를 동시에 높은 효율로 진단할 수 있게 된다.
본 발명자들은, 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트가 상기 CMMoV, RCNaV, SgCV 및 TSWV를 동시에 높은 효율로 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, CMMoV, RCNaV, SgCV 및 TSWV를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 쌍을 설계한 다음, One-step RT-PCR을 수행하여, 결과를 확인한 결과, 선인장 감염 바이러스 4종 모두를 동시에 진단할 수 있음을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 CMMoV, RCNaV, SgCV 및 TSWV을 진단할 수 있는 본 발명 프라이머 세트의 진단한계를 확인한 결과, 10-의 바이러스 RNA 농도까지도 우수한 진단한계를 가짐을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 실시예를 통해 본 발명의 발명자들은 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 상기 4종의 선인장 감염 바이러스를 단독 또는 동시에 진단할 수 있으며, 우수한 민감도를 가짐을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 선인장 감염 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 선인장 감염 바이러스 진단용 조성물은 바이러스 RNA 증폭 반응, 예를 들어 RT-PCR을 수행하기에 필요한 시약, 폴리머라아제, dNTP 및 2가 금속 양이온 등 통상적인 바이러스 RNA 증폭 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 선인장 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 선인장 감염 바이러스 진단용 키트(kit)를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 상술한 선인장 감염 바이러스 진단용 조성물에 포함되어 제공될 수 있다.
본 발명의 선인장 감염 바이러스 진단용 키트는 증폭 반응(역전사도 포함)을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 상기 시약은 역전사효소, DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 나아가 필요한 경우 RNase 억제제, DEPC수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명의 선인장 감염 바이러스 진단용 키트는 진단용 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 진단용 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 진단 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함될 수 있다. 상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 시료에서 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계(1단계), 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 상기 수득한 DNA 또는 RNA를 증폭하는 단계(2단계), 및 상기 수득한 산물을 분석하여 바이러스 감염 여부를 판정하는 단계(3단계)를 포함하는 선인장 감염 바이러스 진단 방법을 제공한다.
상기 1단계에서 DNA 또는 RNA 수득은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 추출용 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 2단계에서 증폭은 본 발명의 프라이머에 적당한 방법을 사용할 수 있으며, 일례로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR) 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)의 방법에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일례로, RT-PCR을 하는 경우 1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 쌍 중 역방향 프라이머를 프라이머로 하여, 역전사 효소를 이용한 역전사 반응을 통해 cDNA 가닥을 합성한 다음, PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행할 수 있다. PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 가지 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전 변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 50-60℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
상기 3단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABIprism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 2단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 선인장 감염 바이러스 진단용 프라이머 설계
국내 선인장에서 발생이 확인된 3종 바이러스(CMMoV, RCNaV, SgCV)와 감염우려가 있는 TSWV의 동시진단용 프라이머는 기존에 보고된 염기서열을 참조하여 설계를 하였으며, 합성된 프라이머는 대상바이러스에 특이적으로 반응하는 프라이머만을 선발하였다(표 2).
Primer name Sequence (5'-3') Region Product
Size(bp) 		Reference
GenBank No.
CMMoV-F ACTCTGCTGATGTTCACGAATTAC 5458-5481 809 EU043335
CMMoV-R AACCGGATCTTCAACCGGTTTG 6266-6245
RCNaV-F GTCSCAAAATGAAGTGGTCGTT 5720-5741 640 JF729471
RCNaV-R ACACCCACGTTCCATTTAACAG 6359-6338
SCV-F ATGGGGGTAATTGGGTTGTTGT 2410-2421 237 U72332
SCV-R GGATCCTTCCCATACTTAGCGT 2646-2625
SgCV-1F TTTCAATTCCAACCGGGCCTA 2121-2141 294
SgCV-1R CCCATTAGTAGTGCTAGGTGC 2414-2394
TSWV-6F GAGATTCTCAGAATTCCCAGT 2479-2499 453 MF805764
TSWV-6R AGAGCAATCGTGTCAATTTTATTC 2971-2948
상기에서 제작한 프라이머에 대하여 RT-PCR 검정은 곽 등(Kwak, H. R., Kim, M. K., Shin, J. C., Lee, Y. J., Seo, J. K., Lee, H. U., & Choi, H. S. 2014. The current incidence of viral disease in Korean sweet potatoes and development of multiplex RT-PCR assays for simultaneous detection of eight sweet potato viruses. The plant pathology journal, 30(4), 416.)에 의한 방법을 사용하여 검정하였으며, 그 결과는 도 1에 나타냈다.
실시예 2. 선인장 감염 바이러스 다중 진단법 개발
상기에서 실시예 1에서 제작된, 선인장 감염 바이러스 4종(CMMoV, RCNaV, SgCV, TSWV)에 대해 디자인된 특이 진단용 프라이머들을 활용하여 한번의 RT-PCR로 4종의 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 multiplex RT-PCR 방법을 개발하였고, 이렇게 개발한 4종의 선인장 감염 바이러스인 CMMoV, RCNaV, SgCV 및 TSWV를 동시에 다중진단할 수 있는 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.
Virus Primer name Sequence(5'→3') Product size(bp) Primer
Conc.(pmol)
CMMoV CMMoV-F
(서열번호 1)		 ACTCTGCTGATGTTCACGAATTAC 809 32
CMMoV-R
(서열번호 2)		 AACCGGATCTTCAACCGGTTTG
RCNaV RCNaV-F
(서열번호 3)		 GTCSCAAAATGAAGTGGTCGTT 640 32
RCNaV-R
(서열번호 4)		 ACACCCACGTTCCATTTAACAG
SgCV SgCV-1F
(서열번호 5)		 TTTCAATTCCAACCGGGCCTA 294 32
SgCV-1R
(서열번호 6)		 CCCATTAGTAGTGCTAGGTGC
TSWV TSWV-6F
(서열번호 7)		 GAGATTCTCAGAATTCCCAGT 453 32
TSWV-6R
(서열번호 8)		 AGAGCAATCGTGTCAATTTTATTC
선인장 시료는 병징이 있는 시료를 질소로 마쇄한 뒤, 바이러스 게놈 추출 키트 (Total RNA extraction kit, Intron Co.)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 주형으로 도 2에 나타낸 방법 및 조건으로 One-step RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR산물은 1.5% 아가로스겔, 100mV 및 90분의 조건으로 전기영동하여 결과를 확인하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 마커를 활용하여 선인장 감염 바이러스 4종 모두를 동시진단 할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 본 발명 프라이머 세트의 진단한계 확인
선인장 바이러스 다중진단용 프라이머 조합의 바이러스 진단한계를 알아보고자 바이러스의 전체 RNA를 농도별(1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5)로 희석하여 각각 One-step multiplex RT-PCR 수행하였다. 그 결과 본 바이러스 프라이머 조합은 바이러스 농도가 10-3인 경우까지는 진단효과가 있었고, 10-4 이후로는 효과가 감소함을 확인할 수 있었다(도 4).
상기 4종 RT-PCR산물의 염기서열 분석결과, NCBI에 등록된 염기서열과 96~99%의 상동성을 보였다(표 4).
대상
바이러스 		프라이머 산물
크기 		염기서열(5'→3') 비교대상
/상동성
CMMoV CMMoV-F/
CMMoV-R 		809bp TCACGAATTACATACTTGAAGAGTCTCTGACATCAAATATTCTCAAAGTCCCACCATTATCATTTGATAATAACTCTGTTTGTCTGGACCAAGATATTATCATGAGTAAGTTCAACAGTGTGTTGAGTACTGTTGCTGTGCCGCGCAATGTTCTTAAATGCACGACAAATTTTGAAAAGAAAAGATTGAGAAAAGGTAAATGGGTAGGTAATAAGAGTGAGTTTGTTTTGAAAGGGGATACAAATGTAGACCCCATGCGTTACAATGGCGGGTTCTTACACCAACGTGAAGCCGAACACATTTGTGTACCGGACTCAGTCGTGGGTCGAACCGGAAAAATTACTCAATTACTTAACCCAGGCGCAACTTCTCATCTTTCAGACGCAGCAAGCGCGGACACAACTTGCTAATGAACTGCAAGCACAATTAAGATATGGTCCACGGAACGATGTCAGATTTCCCACAGACACGTTCCTTGTTAATACTGCAGTGGGGACATTGGCACCTGCGTGGTTTGCTCTGGCTCAAGCTTGTGATACCAAAGATCGAATCTTTGAAGTAGGTGATAATCGAGGTGTAACAAGTACAGAGACAAAGTTAGCAACGCAACGTGTCGATGATGCGACTATAGCTATTCGTAATGCTATTAGAACTTGTGTAAATATATTAGTTAGTGCTGTAGATATCTATGACCGTACTACTTTCGAGGACGCGACGGGCTGGACGTGGCAAACCTTAGGTGCTACACCCAGTACTTCGTAGTCTCGATTTTCTTTCA EU043335/ 99%
RCNaV RCNaV-F/
RCNaV-R		 640bp AGTGGTCGTTAAAGACGGTACGA-ATGTAACGCCTCATCGTTTAATTGCGAAAGATGCCTTACATCAACGTACAACCGAAAGACT-TCGTTTACCT-GACCAGGTCATGGGTAGATCCCCAGCGTCTGATACAGTTTCTGAGCGATATGCAGACTCAGGCTTTCCAAGCACAGCAGTCTCGCACACAACTTCTGAACGAACTGTCGACGATGGTGGTCTACGGTCCGACCAAATCGGACCGTTTCCCTATAGATACGTACCTTATTAATATCACTAAAGGTGGTCTAAGTGCTTACTGGTTCGGTTTGACTCAGTCTGCGGATACAAAAGATCGCGTTTTCGAAGTTAGTGAAGCACGCGCTGTAACTAACGCTGAGTCTAAGCTGGCAACGCAACGTGTTGACGATGCCACCGTAGCTATAAGAAATGCTATTAAGAGTACTCTTAGTTATTTAATAGCTGGAGAAGATATTTATAGCAGGACGTCATTTGAAGCGGCGCTTGGCTGGATATGGCAGGAAAACCTTCCACCTCCACCTCAAACCGCTGCAAGTGGTAGTTGTACTTAAGGATCTTTCTCAAAGTGTTTTTCCATTCGCTCTGTTAA JF729471
/99%
TSWV TSWV-6F/
TSWV-6R		 453bp TCCCAGTTTCCTCAACAAGTCTGACCCTGATCAAGCTATCAAGCCTTCTGAAGGTCATGTCAGTGGCTCCAATCCTGTCTGAAGTTTTCTTTATGGTAATTTTACCAAAAGTAAAATCACTTTGCTTAATAACCTTCATTATGCTCTGACGATTCTTCAGGAATGTCAGACATGAAATAATGCTCATCTTCTTGATCTGGTCAAGGTTTTCCAGACAAAAAGTCTTGAAGTTGAATGCTACCAGATTCTGATCTTCCTCAAATTCAAGATCTTTGCCTTGTGTCAACAAAGCAACAATGTTTTCCTTAGTGAGCTTAACCTTAGACATGATGATCGTAGAAGTTGTTATATGCTTTGACCGTATGTAATTCAAGGTGCGAAAGTACAACTCTGTATTCCGCAGTCGTTTCTTAGGGTTTTAATGTGATGATTTGTAAGACTGAGTGTTAAGGTTTGAATAAAATTGACACGAATTGC MN064724/99%
SgCV SgCV-1F/
SgCV-1R		 294bp TTTCAATTCCCCACCGGGCCTACCATCAGGTCACAGATAGTGCTAGATACAGTTTTTATCTTGCATTTGGCATTTTGCCGGATGTGCAGGAGGCTGTTGAGCATGAACTGATGAAGATCTGTGACATTGCTGGGTTTGGCCCGGCTGGTAATTGTGACAACCCAACTCTCGAATGGACATTCCAGTAGACAAGGACTCAGTGCAGCCAGCTGGGAAGCGAGGGAAAACCAAGGCTAAGGTGGACGTTGCGAAGAATGCAGTGCATAAACAGGCACCTAGACTTACTAATGGG KY753855
/98%
결론적으로, 상기 조합의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 실시한 결과, 상기 프라이머 세트는 프라이머 간에 간섭작용이 적어 다중 진단에 적합하였으며, 바이러스에 대한 민감도가 우수할 뿐만 아니라 특이적으로 바이러스를 진단할 수 있음을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific primer set for multiple detection of 4 types of cactus infectious virus and detection method using the same <130> PD20-317 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> CMMoV-F <400> 1 actctgctga tgttcacgaa ttac 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> CMMoV-R <400> 2 aaccggatct tcaaccggtt tg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> RCNaV-F <400> 3 gtcscaaaat gaagtggtcg tt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> RCNaV-R <400> 4 acacccacgt tccatttaac ag 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> SgCV-1F <400> 5 tttcaattcc aaccgggcct a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> SgCV-1R <400> 6 cccattagta gtgctaggtg c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> TSWV-6F <400> 7 gagattctca gaattcccag t 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> TSWV-6R <400> 8 agagcaatcg tgtcaatttt attc 24

Claims (9)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2으로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4으로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하며,
    선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사 바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV) 및 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV)의 감염 여부를 동시에 진단하는 것을 특징으로 하는, 선인장 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 더 포함하며, 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)의 감염 여부를 동시에 진단하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 선인장 감염 바이러스 진단용 조성물.
  6. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 선인장 감염 바이러스 진단용 키트.
  7. 시료에서 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계, 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 상기 수득한 DNA 또는 RNA를 증폭하는 단계 및 상기 수득한 산물을 분석하여 바이러스 감염 여부를 판정하는 단계를 포함하는 선인장 감염 바이러스 진단 방법으로서,
    상기 방법은 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV) 및 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV)의 감염 여부를 동시에 진단하는 것을 특징으로 하는 선인장 감염 바이러스 진단 방법.
  8. 삭제
  9. 제 7항에 있어서, 상기 바이러스 감염 여부를 판정하는 단계는 제 2항의 프라이머 세트를 이용하여, 선인장연한모틀바이러스(Cactus mild mottle virus, CMMoV), 선인장괴사바이러스(Rattail cactus necrosis-associated virus, RCNaV), 사와로선인장바이러스(Saguaro cactus virus, SgCV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)의 감염 여부를 동시에 진단하는 것을 특징으로 하는 선인장 감염 바이러스 진단 방법.
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김현희, 삼육대학교 산학협력단 최종보고서, '선인장의 돌발바이러스 분자진단용 multiplex real-time PCR키트 개발 및 무병주 조기선발 시스템 구축' (2011.05.)*

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