KR102054126B1 - 지황 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

지황 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102054126B1
KR102054126B1 KR1020170149921A KR20170149921A KR102054126B1 KR 102054126 B1 KR102054126 B1 KR 102054126B1 KR 1020170149921 A KR1020170149921 A KR 1020170149921A KR 20170149921 A KR20170149921 A KR 20170149921A KR 102054126 B1 KR102054126 B1 KR 102054126B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
virus
primer
represented
primers
Prior art date
Application number
KR1020170149921A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190053733A (ko
Inventor
곽해련
최홍수
김미경
김재덕
권선정
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020170149921A priority Critical patent/KR102054126B1/ko
Publication of KR20190053733A publication Critical patent/KR20190053733A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102054126B1 publication Critical patent/KR102054126B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 지황 감염 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 구체적으로 잠두위조바이러스2(BBWV2), 질경이모자이크포텍스바이러스(PIAMV), 지황모자이크바이러스(ReMV), 토바모바이러스속 서브그룹3(T-sg3)의 바이러스를 단독 또는 다중으로 진단할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 지황 감염 바이러스를 효과적으로 진단할 수 있다.

Description

지황 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법{Primers for multiple detection of the virus in Rehmannia glutinosa and detection method by using the same}
본 발명은 지황 감염 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 구체적으로 잠두위조바이러스2(BBWV2), 질경이모자이크포텍스바이러스(PIAMV), 지황모자이크바이러스(ReMV), 토바모바이러스속바이러스-서브그룹3(T-sg3)를 단독 또는 다중으로 진단할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
지황은(Rhenmannia glutinosa Libosch)은 현삼과에 속하는 다년생 숙근성 초본 식물로서 중국이 원산지로 한국, 일본, 베트남 등의 온대 지역에서 광범위하게 분포되어 있다. 지황은 중국에서 1590년경부터 재배되었고 우리나라에서는 경북 안동과 영양, 전북 정읍을 비롯하여 충북 제천, 단양 등지에서 많이 재배되고 있다. 지황은 전형적인 영양 번식 작물로서, 분근 또는 세근으로 번식되기 때문에 증식율이 낮을 뿐 아니라 번식용 뿌리를 저장하는 동안 병원균에 의한 감염과 발병율이 높다. 특히 7월말부터 9월 초순 사이에 고온 다습한 기후가 계속되어 배수가 잘 되지 않거나, 연작 또는 질소비료의 과용으로 인하여 경엽이 도장하였을 때, 후자리움 속 균에 의한 뿌리썩음병이 많이 발생한다.
지황에 감염하는 바이러스는 전 세계적으로 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2, BBWV2), 질경이모자이크포텍스바이러스(Plantago asiatica mosaic virus, PlAMV), 지황모자이크바이러스(Rehmannia mosaic virus, ReMV), 토바모바이러스속 서브그룹3에 속하는 창질경이모자이크바이러스(Ribgrass mosaic virus, RMV), 유카이모자이크바이러스(Youcai mosaic virus, YoMV) 및 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus, TMV)이 알려져 있으며(표 1 참조), 이들 바이러스들이 대부분 복합 감염되어 피해를 주고 있다. 병징은 주로 잎에서는 퇴록반점, 괴사반점, 엽맥퇴록, 모자이크, 기형 증상 등을 보이며, 식물체가 자라지 못하는 위축 증상이 나타난다(도 1).
No. 바이러스명 약어 그룹(계, 속) 전염
1 잠두위조바이러스2
Broad bean wilt virus 2		 BBWV2 Secoviridae (Fabavirus) 진딧물
(비영속)
2 질경이모자이크포텍스바이러스
Plantago asiatica mosaic virus		 PlAMV Alphaflexiviridae (Potexvirus) 즙액전염
3 지황모자이크바이러스
Rehmannia mosaic virus		 ReMV Virgaviridae (Tobamovirus) 즙액전염
4 창질경이모자이크바이러스
Ribgrass mosaic virus		 RMV Virgaviridae (Tobamovirus) 즙액전염
5 유카이모자이크바이러스
Youcai mosaic virus		 YoMV Virgaviridae (Tobamovirus) 즙액전염
6 담배모자이크바이러스
Tobacco mosaic virus		 TMV Virgaviridae (Tobamovirus) 즙액전염
잠두위조바이러스2(BBWV2)는 세코바이러스과(Secoviridae) 파바바이러스(Fabavirus) 속에 속하며 진딧물에 의해서 비영속적으로 매개된다. BBWV2는 넓은 기주범위를 가지고 있고, 세계적으로 다양한 기주에서 보고되고 있다. 최근에, BBWV2는 한국에서 고추 작물에 감염하는 주요 바이러스중의 하나가 되었고, 고추 작물에서 보다는 그 피해가 적지만 시금치, 완두, 잠두 등의 자연기주에서의 감염도 확인하였다. 대표적인 병징은 잎에서 엽맥퇴록, 얼룩, 모자이크, 반점, 괴사, 위조, 기형 등을 나타낸다. 최근에 국내에서는 마, 익모초, 명월초 등의 약용작물에서 보고되었다.
질경이모자이크포텍스바이러스(PlAMV)는 알파플렉시바이러스과(Alphaflexiviridae) 감자바이러스(Potexvirus)속에 속하며, 입자 모양은 사상형이고, 길이는 490-530nm이며, 게놈은 6.1kb이다. 질경이에서 처음 발견되었으며, 매개충은 알려져 있지 않고 즙액전염으로 전파되는 것으로 알려져 있다. 러시아에서 처음 발견하여 현재 중앙아시아 지역에 주로 발생하는 것으로 보고되어 있다. 한국에서는 2012년 네덜란드에서 수입된 백합에서 처음 발견되었고, 2014년에 수집된 질경이에서 최근 보고되었다 (비특허문헌 1). PlAMV-RG(지황분리주)는 질경이에서 분리된 PlAMV 균주에 대해 약 87%의 유전자 염기서열 상동성을 보이며, 백합으로부터 분리된 PlAMV 균주에 대해서도 약 80%의 낮은 염기서열 상동성을 보였다. PlAMV는 넓은 범위의 숙주를 가지고 있으며 질경이, 앵초, 남천, 낚시제비꽃 및 백합과 같은 다양한 식물로부터 분리되어 왔다.
지황모자이크바이러스(ReMV)는 비르가바이러스과(Virgaviridae) 토바모바이러스(Tobamovirus)속에 속하며, 입자는 약 300nm 길이의 막대형이다. 중국과 대만의 지황에서 보고되었으며 (비특허문헌 2 및 3), 최근에 일본에서는 고추에서 ReMV가 보고되었다. 대표적인 병징은 괴사와 모자이크 병징으로 전체적으로 식물체에서 병징을 보인다.
지황에서 발생 보고된 창질경이모자이크바이러스(RMV)와 유카이모자이크바이러스(YoMV)는 비르가바이러스과 토바모바이러스(Tobamovirus)속의 서브그룹 3에 속한다(비특허문헌 4 및 5). RMV는 창질경이(ribgrass, Plantago lanceolata)와 십자화과, 질경이과에 속하는 몇몇 작물에서 전신 괴사병징을 보이며, 국내에서는 배추에서 처음 보고되었다. 지황에서 분리된 RMV-Korea 66은 유카이모자이크바이러스(Youcai mosaic virus, YoMV)와 9099%의 높은 유전자 염기서열 상동성을 보이나 기주 범위와 병징 등의 생물학적인 차이로 YoMV보다는 RMV에 가깝다(비특허문헌 6). YoMV는 국내에서는 개망초에서 처음 보고되었으며(비특허문헌 7), 지황에서 발생은 중국에서 처음 확인되어 유전자 등록되었다(Genbank No. JX422022).
그러나 이러한 바이러스에 의하여 발생하는 식물병에 직접 작용하는 약제 방제법은 현재까지 개발되어 있지 않은 실정이기 때문에 바이러스에 의한 피해를 감소시키는 가장 효과적인 방법은 상기 바이러스에 대한 저항성을 나타내는 품종을 개발하는 것이지만, 바이러스의 특성상 저항성 품종을 개발하기 위하여는 바이러스 저항성 유전자원이 있어야 하며 저항성 유전자원이 있다고 하여도 저항성이면서 소비자의 기호에 맞는 품종을 육성하는 것은 매우 어려운 일이다. 식물의 바이러스병은 일단 감염되면 농약에 의한 방제가 불가능하기 때문에 상기 바이러스에 의한 감염이 확인되면 감염주는 폐기시켜야 하기 때문에 바이러스에 의한 식물병을 관리하기 위해서는 먼저 식물체에 바이러스가 발생하였는지 여부와, 어떠한 바이러스가 발생하였는지 여부를 정밀하고 신속하게 진단하는 기술이 요구된다 그러나, 바이러스는 크기가 1㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없고, 전자현미경을 필요로 하기 때문에, 육안으로 식물체에 발생한 바이러스를 진단하는 것은 곤란하다. 이에 따라 바이러스를 진단하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 사용되고 있다.
지금까지 바이러스를 진단하기 위하여 ELISA와 같은 혈청학적 진단법이 많이 사용되어왔다. 그러나 혈청학적 진단법은 많은 시료를 일반적인 정밀도에서 진단하는데 사용하는 경우에는 큰 무리가 없었으나, 진단대상 바이러스와 혈청학적 유연관계가 있는 바이러스가 존재할 경우에는 식물체에 발생한 바이러스를 잘못 동정하게 된다거나, 바이러스에 감염된 식물체의 종류에 따라 기주유래 물질이 달라지면서, 이 물질과 비특이적 반응으로 인하여 바이러스를 잘못 진단하게되는 문제가 발생하였다.
최근에는 식물체에 발생하는 바이러스를 정밀진단하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)법이 사용되고 있다. 그러나 RT-PCR법에서 사용하는 프라이머는 일반적으로 바이러스의 유전자 클로닝을 목적으로 설계되기 때문에 종특이적이지 못하고, 식물체 또는 다른 바이러스에 의한 비특이적 산물을 생산하는 경우가 있기 때문에 진단용으로 사용하기에는 부적합한 경우가 많은 우려가 있다. 또한 같은 시료에서 여러 종의 바이러스를 진단하기 위해서는 여러 종류의 프라이머를 사용하여 각각 역전사-중합효소연쇄반응을 행해야하기 때문에 많은 진단 비용과 노동력이 소요된다는 문제점도 있다.
따라서, 국내 지황에서 보고된 바이러스에 대한 신속하고 효과적인 진단 방법이 요망된다.
1. 한국공개특허 제2009-0055178호 2. 한국등록특허 제625019호 3. 한국공개특허 제10-2017-0001071호
1. Lim, S., Igori, D., Zhao, F., Do, Y. S., Cho, I. S., Choi, G. S., & Moon, J. S. (2016). Molecular detection and characterization of a divergent isolate of Plantago asiatica mosaic virus in Plantago asiatica. VirusDisease, 27(3), 307-310. 2. Liao, J. Y., Hu, C. C., Kao, J. L., & Deng, T. C. (2007). Identification of Tobacco mosaic virus infecting Rehmannia glutinosa. Plant Pathology Bulletin, 16(2), 61-69. 3. Zhang, Z. C., Lei, C. Y., Zhang, L. F., Yang, X. X., Chen, R., & Zhang, D. S. (2008). The complete nucleotide sequence of a novel Tobamovirus, Rehmannia mosaic virus. Archives of virology, 153(3), 595-599. 4. Heinze, C., Lesemann, D. E., Ilmberger, N., Willingmann, P., & Adam, G. (2006). The phylogenetic structure of the cluster of tobamovirus species serologically related to ribgrass mosaic virus (RMV) and the sequence of streptocarpus flower break virus (SFBV). Archives of virology, 151(4), 763-774. 5. Zhu, H., Hong, J., Ye, R., Chen, J., Yu, S., & Adams, M. J. (2001). Sequence analysis shows that Ribgrass mosaic virus Shanghai isolate (RMV-Sh) is closely related to Youcai mosaic virus. Archives of virology, 146(6), 1231-1238. 6. Kim, M., Kwak, H. R., Lee, D. K., Ko, S. J., Lee, S. H., Kim, J. S., Park, K. H., Cha, B., & Choi, H. S. (2011). Biological and molecular characterization of Ribgrass mosaic tobamovirus infecting Rehmannia glutinosa. 2011 APS·IPPC Joint Meeting 7. Park, C. Y., Lee, M. A., Lee, S. H., Kim, J. S., & Kim, H. G. (2016). First Report of Youcai mosaic virus in Daisy Fleabane (Erigeron annuus). Plant Disease, 100(6), 1250-1250.
상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 국내 지황에 발생하는 잠두위조바이러스2(BBWV2), 질경이모자이크포텍스바이러스(PIAMV), 지황모자이크바이러스(ReMV) 및 토바모바이러스속-서브그룹3(T-sg3)의 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 설계하고, 상기 프라이머 중에서 민감도가 우수한 프라이머 세트를 선별하여 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 상기 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물을 이용하여 상기 바이러스들을 각각 또는 동시에 검출할 수 있는 바이러스 진단 방법 및 진단 키트를 제공하고자 한다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 지황 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, A그룹) 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍; B그룹) 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍; C그룹) 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 쌍; 및 D그룹) 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 쌍, 중 두 개 이상의 그룹에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하여 두 종 이상의 지황 감염 바이러스를 동시에 다중 진단할 수 있는 지황 감염 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 쌍, 그리고 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 상술한 프라이머 세트를 포함하는 지황 감염 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 상술한 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 어느 하나 이상을 포함하는 지황 감염 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 시료에서 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계, 상기 상술한 프라이머 세트를 이용하여 상기 수득한 DNA 또는 RNA를 증폭하는 단계, 및 상기 수득한 산물을 분석하여 바이러스 감염 여부를 판정하는 단계를 포함하는 지황 감염 바이러스 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 진단 방법에 의해 진단하는 지황 감염 바이러스는 잠두위조바이러스2(BBWV2), 질경이모자이크포텍스바이러스(PlAMV), 지황모자이크바이러스(ReMV), 창질경이모자이크바이러스(RMV) 및 유카이모자이크바이러스(YoMV) 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 지황 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트는 잠두위조바이러스2(BBWV2), 질경이모자이크포텍스바이러스(PIAMV), 지황모자이크바이러스(ReMV), 창질경이모자이크바이러스(RMV) 및 유카이모자이크바이러스(YoMV)를 각각 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 한번에 동시에 진단할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 정확하고 특이적으로 바이러스를 진단할 수 있다. 또한 프라이머 간의 간섭현상이 적어 높은 민감도로 지황 감염 바이러스의 감염여부를 정확하고 신속하게 단독 또는 동시에 진단할 수 있다.
본 발명의 진단방법을 통하여 바이러스 진단에 소요되는 비용과 시간을 줄일 수 있어 경제적이며, 바이러스 감염 여부를 조기에 진단할 수 있어 감염으로 인한 농가의 경제적 손실도 방지할 수 있다.
도 1은 지황 감염 바이러스의 주요 병징을 보여주는 그림이다.
도 2는 BBWV2 진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 검정 결과를 나타낸다.
도 3은 PlAMV 진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 검정 결과를 나타낸다.
도 4는 ReMV 진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 검정 결과를 나타낸다.
도 5는 T-sg3 진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 검정 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 원-스텝 다중 진단 PCR 방법의 핵심 요약도이다.
도 7은 본 발명에서 최종 선발된 프라이머 세트를 이용하여 지황 감염 바이러스를 다중 RT-PCR 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 특이적 서열의 프라이머 쌍을 포함하는 지황 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 진단 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발명자들은 상기 지황 감염 바이러스를 각각 진단하기 위한 프라이머를 설계한 후, 설계된 각각의 프라이머들을 조합별로 실제적인 연전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해 민감도가 우수한 조합을 최종 선발하여 한 번의 RT-PCR로 복수의 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 다중 진단 방법을 완성하게 되었다.
본 발명의 용어 “프라이머”란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3’ hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 식물체 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머라아제 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA/RNA 증폭을 개시할 수 있다.
본 발명에 따른 지황 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트는 지황 감염 바이러스에 대해서 종 특이적 RNA 증폭을 유발하기 위해 개발되었다. 종 특이적이라는 의미는 해당 프라이머가 진단 대상이 되는 바이러스의 유전체 서열로부터 특이적인 RT-PCR 산물을 합성할 수 있음을 의미하며, 진단대상이 되는 바이러스 종 내의 모든 계통에 대해서 공통적으로 작용해야 하고, 다른 유사 종 또는 식물체 유래의 핵산과의 비특이적 반응은 일어나지 않아야 한다. 본 발명의 프라이머는 식물체 또는 다른 바이러스의 핵산에 의한 비특이적인 산물을 생산하는 일반적인 프라이머와 달리 종 특이적으로서 지황 감염 바이러스 진단에 사용된다.
본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 지황 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머들은 국내 지황에서 보고된 바이러스들을 특이적으로 검출하며, 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2, BBWV2), 질경이모자이크포텍스바이러스(Plantago asiatica mosaic virus, PlAMV), 지황모자이크바이러스(Rehmannia mosaic virus, ReMV), 토바모바이러스속-서브그룹3(T-sg3)의 바이러스(구체적으로, 창질경이모자이크바이러스(Ribgrass mosaic virus, RMV) 및 유카이모자이크바이러스(Youcai mosaic virus, YoMV)) 검출에 유용하다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍은 BBWV2로부터 약 370bp의 증폭 산물을 나타내며, 본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍은 BBWV2로부터 약 270bp의 증폭 산물을 나타내며, 본 발명의 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍은 PlAMV으로부터 약 970bp의 증폭 산물을 나타내며, 본 발명의 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍은 PlAMV으로부터 약 545bp의 증폭 산물을 나타내며, 본 발명의 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍은 PlAMV으로부터 약 458bp의 증폭 산물을 나타내며, 본 발명의 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 쌍은 ReMV으로부터 약 611bp의 증폭 산물을 나타내며, 본 발명의 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 쌍은 ReMV으로부터 약 343bp의 증폭 산물을 나타내며, 본 발명의 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 쌍은 RMV 또는 YoMV로부터 약 830bp의 증폭 산물을 나타내며, 본 발명의 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 쌍은 T-sg3로부터 약 958bp의 증폭 산물을 나타내며, 이를 통해 상기 각각의 바이러스를 특이적으로 검출 및 진단할 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 바이러스 중에서 어느 두 개 이상을 동시에 다중으로 진단할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, A그룹) 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍; B그룹) 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍; C그룹) 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 쌍; 및 D그룹) 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 쌍, 중 두 개 이상의 그룹에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하여 두 종 이상의 지황 감염 바이러스를 동시에 다중 진단할 수 있는 지황 감염 진단용 프라이머 세트를 제공한다. 여기서 A그룹은 BBWV2 진단용, B그룹은 PlAMV 진단용, C그룹은 ReMV 진단용, D그룹은 T-sg3(RMV, YoMV) 진단용이다.
복수 바이러스의 다중 진단이 가능하기 위해서는 개별 프라이머가 종 특이적인 것은 물론 프라이머 간에 서로 간섭 작용이 일어나지 않아야 하고, 증폭 산물을 구별할 수 있어야 한다. 일례로, 각 프라이머의 증폭 위치가 겹치거나 가깝지 않아 서로 간에 증폭에 영향을 미치지 않고 최종적인 증폭 산물의 크기가 확연하게 차이가 나서 RT-PCR 전기영동 결과로 뚜렷이 구별될 수 있어야 바람직하다. 바람직하게는 본 발명의 다중 검출을 위한 프라이머 세트의 조합은, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 쌍, 그리고 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 상기 4쌍의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 BBWV2, PlAMV, ReMV, T-sg3를 동시에 높은 효율로 진단할 수 있게 된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는 지황 감염 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 지황 감염 바이러스 조성물은 바이러스 RNA 증폭 반응, 예를 들어 RT-PCR을 수행하기에 필요한 시약, 폴리머라아제, dNTP 및 2가 금속 양이온 등 통상적인 바이러스 RNA 증폭 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 지황 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 지황 감염 바이러스 진단용 키트(kit)를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 상술한 지황 감염 바이러스 진단용 조성물에 포함되어 제공될 수 있다.
본 발명의 지황 감염 바이러스 진단용 키트는 증폭 반응(역전사도 포함)을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 상기 시약은 역전사효소, DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 나아가 필요한 경우 RNase 억제제, DEPC수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명의 지황 감염 바이러스 진단용 키트는 진단용 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 진단용 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함될 수 있다. 상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 시료에서 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계(1단계), 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 상기 수득한 DNA 또는 RNA를 증폭하는 단계(2단계), 및 상기 수득한 산물을 분석하여 바이러스 감염 여부를 판정하는 단계(3단계)를 포함하는 지황 감염 바이러스 진단 방법을 제공한다.
상기 1단계에서 DNA 또는 RNA 수득은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 추출용 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 2단계에서 증폭은 본 발명의 프라이머에 적당한 방법을 사용할 수 있으며, 일례로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)의 방법에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일례로, RT-PCR을 하는 경우 1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 쌍 중 역방향 프라이머를 프라이머로 하여, 역전사 효소를 이용한 역전사 반응을 통해 cDNA 가닥을 합성한 다음, PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행할 수 있다. PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 가지 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전 변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 50-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
상기 3단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 2단계에서 PCR을 수행한다.
PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] BBWV2 진단용 프라이머의 설계 및 선발
BBWV2 진단용 프라이머는 RNA1의 protease cofactor (Co-Pro) 및 RNA2의 large coat protein (LCP)를 대상으로 크기가 370bp, 270bp인 2쌍을 설계하였다 (표 2).
프라이머 명칭 서열번호 위치 서열(5'→3') 예상 크기
BBWV2 1-1u 1 19-40 AAACAAACAGCTTTCGTTCCG 370bp
BBWV2 1R 2 388-370 GCCATCTCATTGGCATGGA
bbwv2 2-2nu 3 2177-2194 CCAGCATTCATGTTTCGC 270bp
bbwv2 2-2nr 4 2446-2424 TAGGCTCCAGCAACATATGCAAT
BBWV2에 단독 감염된 시료를 대상으로 RT-PCR 검정 결과, BBWV2 진단용 특이적 프라이머로 선발하였다(표 3).
레인 시료 번호 사용된 프라이머
1 1 BBWV2 1-1u BBWV2 1R
2 2
3 3
4 1 bbwv2 2-2nu bbwv2 2-2nr
5 2
6 3
상기 표 3의 설계된 BBWV2 프라이머 세트 중에서 특이성이 높은 BBWV2 진단을 위한 프라이머 세트를 선발하였으며, PCR 결과를 도 2에 나타냈다.
[실시예 2] PlAMV 진단용 프라이머의 설계 및 선발
PlAMV 진단용 프라이머는 RNA-dependent RNA polymerase(RdRp), triple gene block protein 3(TGB3) 및 coat protein(CP) 지역을 대상으로 크기가 970bp, 545bp, 483bp인 3쌍을 설계하였다(표 4).
프라이머 명칭 서열번호 위치 서열(5'→3') 예상 크기
PlMAV_up1 5 2343 AACGTCAACAGACATACACGG 970bp
PlAMV_down1 6 992973 TGTAGAAGAACATCTGCATC
PlMAV_up7 7 55545573 GCCTTCGTCACCCTCAGCGG 545bp
PlAMV_down7 8 60986081 CACCAGACTTTCACTGGTT
PlAMV_3race-F 9 56415660 CGGAAGTTYTGCCGCTTCTA 458bp
PlAMV_down7 10 60986081 CACCAGACTTTCACTGGTT
PlAMV에 단독 감염된 시료를 대상으로 RT-PCR 검정 결과, PlAMV 진단용 특이적 프라이머로 선발하였다(표 5).
레인 시료 번호 사용된 프라이머
1 1 PlMAV_up1 PlAMV_down1
2 2
3 1 PlMAV_up7 PlAMV_down7
4 2
5 1 PlAMV_3race-F PlAMV_down7
6 2
상기 표 5의 설계된 PlAMV 프라이머 세트 중에서 특이성이 높은 PlAMV 진단을 위한 프라이머 세트를 선발하였으며, PCR 결과를 도 3에 나타냈다.
[실시예 3] ReMV 진단용 프라이머의 설계 및 선발
ReMV 진단용 프라이머는 replicase(Rep) 지역을 대상으로 크기가 611bp, 343bp인 2쌍을 설계하였다(표 6).
프라이머 명칭 서열번호 위치 서열(5'→3') 예상 크기
ReMV-u1 11 1491-1513 AGTCTCGGGCCAAAAACTGTATG 611bp
ReMV-d1 12 2101-2077 TCCAATGACTCAATTTCCTCGTTCC
ReMV-u2 13 2747-2768 CGGAAAGGCTGCGCGCTGTCAG 343bp
ReMV-d2 14 3089-3068 GATGGTCGCCGCACCACTCACC
ReMV에 단독 감염된 시료를 대상으로 RT-PCR 검정 결과, ReMV 진단용 특이적 프라이머로 선발하였다(표 7).
레인 시료 번호 사용된 프라이머
1 1 ReMV-u1 ReMV-d1
2 2
3 3
4 1 ReMV-u2 ReMV-d2
5 2
6 3
상기 표 7의 설계된 ReMV 프라이머 세트 중에서 특이성이 높은 ReMV 진단을 위한 프라이머 세트를 선발하였으며, PCR 결과를 도 4에 나타냈다.
[실시예 4] Tobamovirus subgroup(T-sg) 3 진단용 프라이머의 설계 및 선발
Tobamovirus subgroup3 진단용 프라이머는 replicase(Rep) 지역을 대상으로 크기가 830bp, 958bp인 2쌍을 설계하였다 (표 8).
프라이머 명칭 서열번호 위치 서열(5'→3') 예상 크기
RMV 3F 15 1523-1540 AGTCTCTGCGATGCCCTG 830bp
RMV 3R 16 2352-2337 GCATCTTCCGCAACWCCCC
RMV 4F 17 2111-2130 ATGATGTCAGCGGTGTACAC 958bp
RMV 4R 18 3068-3045 CTAACGGTAAAGTTATYGGGTTT
RMV에 감염된 시료 대상으로 RT-PCR 검정 결과, 2쌍 모두 Tobamovirus subgroup3 진단용 특이 프라이머로 선발하였다 (표 9).
레인 시료 번호 사용된 프라이머
1 1 RMV 3F RMV 3R
2 2
3 3
4 1 RMV 4F RMV 4R
5 2
6 3
상기 표 5의 설계된 T-sg3 프라이머 세트 중에서 특이성이 높은 T-sg3 진단을 위한 프라이머 세트를 선발하였으며, PCR 결과를 도 5에 나타냈다.
[실시예 5] 지황 바이러스 다중 진단법 개발
BBWV2, PlAMV, ReMV 및 T-sg3에 대해 디자인된 특이 진단용 프라이머들 중 선발하여 한번의 RT-PCR로 5종의 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 multiplex RT-PCR 방법을 개발하였다. 상기 1차로 선발된 BBWV2, PlAMV, ReMV 및 T-sg3 프라미머 결과를 바탕으로 다중 진단을 위한 후보 프라이머로 선정하였다(표 10).
바이러스 프라이머 명칭 서열번호 서열 (5'→3') 위치 예상 크기 농도
BBWV2 bbwv2 2-2nu 3 CCAGCATTCATGTTTCGC 2177-2194 270bp 48pmol
bbwv2 2-2nr 4 TAGGCTCCAGCAACATATGCAAT 2446-2424
PlAMV PlAMV_3race-F 9 CGGAAGTTYTGCCGCTTCTA 56415660 458bp 48pmol
PlAMV_down7 10 CACCAGACTTTCACTGGTT 60986081
ReMV ReMV-u1 11 AGTCTCGGGCCAAAAACTGTATG 1491-1513 611bp 16pmol
ReMV-d1 12 TCCAATGACTCAATTTCCTCGTTCC 2101-2077
T-sg3 RMV 3F 15 AGTCTCTGCGATGCCCTG 1523-1540 830bp 32pmol
RMV 3R 16 GCATCTTCCGCAACWCCCC 2352-2337
지황 시료는 병징이 있는 잎을 액체 질소로 마쇄한 뒤, 바이러스 게놈 추출 키트 (Total RNA extraction kit, Intron Co.)를 이용하여 전체 게놈을 추출하였다. 추출된 게놈을 주형으로 원-스텝(one-step) RT-PCR 하였다 (도 6).
원-스텝(one-step) RT-PCR과정은 추출된 전체 RNA를 주형으로 1 ul 취하고, 3'-프라이머와 5‘-프라이머는 각각 표 10에 기재된 농도로 동량 혼합한 뒤 각각의 혼합물 1 ul, 2x RT-PCR 반응 혼합액 (역전사효소, Taq polymerase, dNTPs, buffer포함) 10 ul, 증류수 7 ul를 넣어 최종적으로 20ul 반응액을 만들어 RT-PCR를 수행하였다. 역전사 반응은 50℃에서 30분, 효소 불활성 단계로 94℃에서 10분 수행하였고, PCR 반응은 [DNA 변성을 위해 94℃에서 20초, 프라이머 바인딩(annealing)을 위해 55℃ 30초, DNA 사슬 신장을 위해 72℃ 1분]을 35회 반복한 후, 최종적으로 DNA 사슬 신장을 위해 72℃에서 10분의 PCR 반응 조건으로 수행하였다.
RT-PCR 산물은 1.5% 아가로스겔, 100mV, 1시간 전기영동하여 확인하고, 결과 사진을 도 7에 나타냈다. 확인 결과, 상기에서 선정된 4개의 프라이머 쌍 각각은 물론(레인 1, 2, 3, 4), 각 쌍을 두 개씩(레인 5, 6, 7, 8, 9, 10), 세 개(레인 11, 12, 13, 14) 및 네 개 모두(레인 15) 조합한 다중 프라이머 조합에서도 확연히 구별되는 결과를 보여 본 발명의 프라이머 쌍들이 복수의 지황 감염 바이러스를 동시에 효과적으로 진단할 수 있는 것을 확인하였다.
상기 다중 진단에 선별된 프라이머의 RT-PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, NCBI에 등록된 염기서열과 96~99%의 상동성을 보였다 (표 11).
대상
바이러스		 프라이머 산물
크기		 염기서열(5'→3') 비교대상
/상동성
BBWV2 bbwv2 2-2nu /bbwv2 2-2nr 270bp
 TCCAGCATTCATTTTCGCAAAGAGCTGGGAACTCTAGCTTTCAAGCAgGGAGAGCGTGTTGCTTATTCTTTTGAGGTCAATTTTGGCAAGCCACAAACTGATGGAgAAGGAGGTGACCTCAACTTTCGCTTCTTCTTATTGTGGTCTCAGCCAATATATGCAATCGGATGTCATTTTAGACTTCACCCTTATGAGTAGTCCTATGATTGGTGGAATTTCTCGATTGCATATGTTGCTGGAGCCTTA X686590
/97%
PlAMV PlAMV_3race-F
/PlAMV_down7		 458bp
 CCGCTTCTACGCCAAGATCATCTGGAACGCCCGCCTGGCACGCAACCTTCCCCCAGCGGGCTTCGCCAGAGCCAACATCAAGTTCGAACACCGCTGGGCCGGCTTCGACTTCTTCGACGGCCTGCTCAACCCCGCCGCACTAGAGCCCCCGGGCGGCCTCTCGCGCACCCCCACCCCAGACGAGGTCGTCGCCAACGAGACCGCCCGCTCCCTCAACCTGTTCGAAGCAAGAGCCAACTCCTCCAACCTCGCCTCGACCTCGACCCAATTCACCCGCGGCCAGCTCTCCAACACAGCCCCACAAGTCCAGTTCCTGCCCGCCCCCTCCGACTAGTCCTGAACCGTGGAAGGACCATAAAATCCACGTATCGCCAAACTTAACCAGCCCTCAACCCGGTGTGTATTTTACCGTTTTCT Z21647 /90%
ReMV ReMV-u1
/ReMV-d1		 611bp
 CAAAACTGTATGTCAACACATATGGGATGAGATCTCATTGGCTTTTGGCAACGCTTTCCCGTCGATTAAAGAAAGACTTTTGAACAAGAAACTGATCAAAGTGGCTGGCGACGCGTTAGAGATTAGGGTGCCTGACCTTTACGTAACTTTCCACGATAGATTGGTGACCGAGTACAAAGCCTCGGTGGATATGCCTGCACTTGACATAAGGAAAAGGATGGAAGAAACTGAAACGATGTACAACGCGCTTTCAGAGTTGTCGGTTCTAAAAGAGTCTGACAAATTCGATGTTGATGTTTTTTCCCAGATGTGCCAAAAATTGGAGGTAGACCCAATGACGGCTGCAAAGGTTATAGTGGCAGTGATGAGTAATGAGAGTGGTCTCACGCTCACGTTTGAACAACCAACAGAAGCTAACGTCGCTTTGGCCTTGCATGATTCAGAGAAGGCTTCAGAAGGTGCACTTGTGGTCACCTCTCGTGATGTAGAAGAGCCCTCCATGAAAGGTTCAATGGCAAGGGGTGAGTTACAATTAGCTGGTCTtACCGGAGACCATCCGGAGTCAACCTATACAAGGAACGAGGAA JX575184
/97%
T-sg3 RMV 3F
/ RMV 3R		 830bp
 CCTGAAGGGGGTTATTCCCTCGGTCAAGGAGACACTTGCGCGCGGTGGTTTCGTTAAACTCGCTGAAGAGAGTTTGGAGATAAAAATTCCAGAGTTATACTGCACTTTTACCGATCGATTGGTACTTCAGTATAAGATGGCTGAAGAGTTTCAATCATGCGACCTGTCAAAACCTTTGGAAGAGTCTGAGAAATACTACAATGCGTTGTCTGAGCTATCAGTGCTCGAAAATCTTGACTCTTTTGATCTGGACGGCTTTAAAGAGTTGTGTCAAAAGAGGAACGTCGACCCTGATGTCGCTGCAAAGGTGGTGGTGGCGATTATGAATAATGAGTTAACGTTACCGTTCAAGAAACCAACGGAAGAGGAAGTTGCCGAGGCGCTTAGTGGAGAAGTGGTGCAGAATGAGGTTTTGAGTTTAAGCAACAACGCACCCTTCCCTTGTGTGAACAATCTAACGGAAGGTTTGGTTCCAGCATGTGGAGTGTGTCCGACAGGTGTTAACTTCGACAGAGTAGATATGGACATATCCGAGTTCCATCTCAAGAGTGTAGATGCAGTAAAGAAAGGGGCTATGATGTCAGCGGTGTATACGGGAAAGATCAAGGTTCAGCAAATGAAGAACTACGTCGATTACCTAAGTGCGTCACTGTCAGCTACAGTCTCAAACCTCTGCAAAGTGCTCAGGGATGTTCATGGTGTTGACCCTGAATCTCAAGAGAAGTCTGGTGTGTGGGATGTGAGAAGAGGACGCTGGTTGTTAAAACCTAACGCAAAATGTCACGCTTGGGG AB812747
/91%
결론적으로, 상기 조합의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 실시한 결과, 상기 프라이머 세트는 프라이머 간에 간섭작용이 적어 다중 진단에 적합하였으며, 바이러스에 대한 민감도가 우수할 뿐만 아니라 특이적으로 바이러스를 검출할 수 있음을 확인하였다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시 예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primers for multiple detection of the virus in Rehmannia glutinosa and detection method by using the same <130> P17-233 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect BBWV2 <400> 1 aaacaaacag ctttcgttcc g 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect BBWV2 <400> 2 gccatctcat tggcatgga 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect BBWV2 <400> 3 ccagcattca tgtttcgc 18 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect BBWV2 <400> 4 taggctccag caacatatgc aat 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect PlMAV <400> 5 aacgtcaaca gacatacacg g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect PlMAV <400> 6 tgtagaagaa catctgcatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect PlMAV <400> 7 gccttcgtca ccctcagcgg 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect PlMAV <400> 8 caccagactt tcactggtt 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect PlMAV <400> 9 cggaagttyt gccgcttcta 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect PlMAV <400> 10 caccagactt tcactggtt 19 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect ReMV <400> 11 agtctcgggc caaaaactgt atg 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect ReMV <400> 12 tccaatgact caatttcctc gttcc 25 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect ReMV <400> 13 cggaaaggct gcgcgctgtc ag 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect ReMV <400> 14 gatggtcgcc gcaccactca cc 22 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect RMV <400> 15 agtctctgcg atgccctg 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect RMV <400> 16 gcatcttccg caacwcccc 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect RMV <400> 17 atgatgtcag cggtgtacac 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers to detect RMV <400> 18 ctaacggtaa agttatyggg ttt 23

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. A그룹) 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍;
    B그룹) 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍;
    C그룹) 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 쌍; 및
    D그룹) 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 쌍 중 두 개 이상의 그룹에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는, 프라이머 세트로서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 쌍, 그리고 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지황 감염 바이러스 진단용 프라이머 세트.
  4. 제3항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 지황 감염 바이러스 진단용 조성물.
  5. 제3항에 따른 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 지황 감염 바이러스 진단용 키트.
  6. 시료에서 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계, 제3항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 상기 수득한 DNA 또는 RNA를 증폭하는 단계, 및 상기 수득한 산물을 분석하여 바이러스 감염 여부를 판정하는 단계를 포함하는 지황 감염 바이러스 진단 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 지황 감염 바이러스는 잠두위조바이러스2(BBWV2), 질경이모자이크포텍스바이러스(PlAMV), 지황모자이크바이러스(ReMV) 및 토바모바이러스속 서브그룹3(T-sg3)의 바이러스에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 지황 감염 바이러스 진단 방법.
KR1020170149921A 2017-11-10 2017-11-10 지황 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 KR102054126B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170149921A KR102054126B1 (ko) 2017-11-10 2017-11-10 지황 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170149921A KR102054126B1 (ko) 2017-11-10 2017-11-10 지황 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190053733A KR20190053733A (ko) 2019-05-20
KR102054126B1 true KR102054126B1 (ko) 2019-12-10

Family

ID=66678956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170149921A KR102054126B1 (ko) 2017-11-10 2017-11-10 지황 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102054126B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101642771B1 (ko) * 2014-06-19 2016-08-10 대한민국 나리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100625019B1 (ko) 2005-05-06 2006-09-20 대한민국 십자화과 작물에 발생하는 순무모자이크바이러스,립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스 진단용프라이머 조합
US20090055178A1 (en) 2007-08-23 2009-02-26 Coon Bradley S System and method of controlling personalized settings in a vehicle
KR101771964B1 (ko) 2015-06-25 2017-08-29 대한민국 배추 감염성 4종 바이러스 복합진단 pcr 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101642771B1 (ko) * 2014-06-19 2016-08-10 대한민국 나리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190053733A (ko) 2019-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101642771B1 (ko) 나리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
KR101985654B1 (ko) 패션프루트 감염 바이러스 4종 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
Zhang et al. Deep sequencing of banana bract mosaic virus from flowering ginger (Alpinia purpurata) and development of an immunocapture RT-LAMP detection assay
KR101546758B1 (ko) 가루이 매개 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
KR101459616B1 (ko) 고구마 바이러스 진단용 프라이머 쌍 및 이를 이용한 진단방법
KR102054126B1 (ko) 지황 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
Li et al. Development of an RT-LAMP assay for the detection of maize yellow mosaic virus in maize
JP6895168B2 (ja) ウイルス診断法
KR102226176B1 (ko) 3종의 마 바이러스 동시검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법
Pavliuk et al. Variability of some isolates of Prunus necrotic ringspot virus and Prune dwarf virus infecting sour and sweet cherry in Ukraine
KR101881206B1 (ko) 마 바이러스 동시 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법
KR102175124B1 (ko) 박과 작물 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
Glasa et al. Plum pox virus
Biswas et al. Multiple and mixed infections with yellow mosaic, leaf crinkle and bud necrosis disease complex in mungbean: a threat to cultivation of mungbean in India.
KR20130080969A (ko) 가지과 작물 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 가지과 작물 바이러스 검출 방법
KR102516117B1 (ko) 선인장 감염 바이러스 4종(CMMoV, RCNaV, SgCV, TSWV) 다중진단용 특이 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법
KR102114203B1 (ko) 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 바이러스 다중 진단 방법
KR101750837B1 (ko) MNSV, SqMV, WMV, 및 CABYV 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
Alishiri et al. Incidence and distribution of fig badnavirus 1 and mulberry badnavirus 1 on mulberry trees in Iran
KR102175120B1 (ko) 선인장 감염 포텍스 바이러스 속 5종 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
Nakahara et al. Sensitive PCR-based detection of Apple chlorotic leaf spot virus heterogenous in apple trees
Mulenga Molecular Characterization of Viruses Infecting Common Bean (Phaseolus Vulgaris L.) and Reaction of Bean Genotypes to Virus Infection
KR20230082939A (ko) 작약 감염 바이러스 4종(trv, cnsv, tswv, cmv)의 다중 진단을 위한 특이 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법
KR20240021362A (ko) 핫페퍼엔도나바이러스 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법
KR20240021363A (ko) 폴레로바이러스 속 바이러스 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant