CN109689886A - 核酸提取和扩增对照及其使用方法 - Google Patents

核酸提取和扩增对照及其使用方法 Download PDF

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Abstract

核酸试剂和使用其的相应方法用于监测和评估核酸提取和扩增反应。

Description

核酸提取和扩增对照及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月26日提交的第62/380,253号美国临时申请和2016年8月26日提交的第62/380,291号美国临时申请于《美国法典》第35章第119条(e)项(35U.S.C.§119(e)of U.S.)下的权益。所述申请的内容通过引用方式完整并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及分子生物学和遗传测定领域，具体地说，涉及核酸试剂及其用于监测和评估核酸提取和扩增反应的相应方法。
发明背景
从细胞或组织样本中提取核酸是各种研究、应用和临床环境中的一个重要过程。例如，生物制药工业使用核酸提取生产药物、疫苗及其他生物制品，以及在生物制药生产中对生物负荷进行检测。在临床环境中，有必要从细胞和组织样品中提取核酸，以提供例如诊断、预后和治疗监测。核酸扩增在许多研究、应用和临床环境中也是一个广泛使用的重要过程。
需要用于评估和监测核酸提取和扩增反应性能的组合物及方法。
发明概述
本文提供了用于扩增含有对照核酸分子样品中的多种核酸靶序列的方法、组合物和试剂盒，所述方法包括：并行进行多个扩增反应，所述多个扩增反应中的每一个包括部分样品和一对扩增引物，用于配置扩增对照核酸分子中相应的靶序列，其中对照核酸分子包含多种不同的靶序列；形成对应于对照核酸分子中至少两种不同靶序列的多种不同扩增产物；并确定扩增反应中至少两种不同扩增产物的存在。
在另一方面，本文提供了用于扩增多种核酸靶序列的方法、组合物和试剂盒，所述多种核酸靶序列包括：将对照核酸分子和试验核酸样品同时分配到多个反应体积中，其中所述对照核酸分子包括多个不同的靶(目标)序列，所述试验核酸样品包括一个或多个试验核酸分子；使所述反应体积经受核酸扩增条件，并使用成对扩增引物扩增所述反应体积中的对照核酸分子的至少两种不同的靶序列，每对扩增引物用于扩增所述对照核酸分子中不同的靶序列；以及检测所述反应体积中至少两种不同的扩增的靶序列的存在。
另一个方面，本文提供了在含有对照核酸分子的样品中扩增多种核酸靶序列的方法、组合物和试剂盒，该方法包括：将样品分配到多个反应体积中，其中该对照核酸分子包含多种不同的靶序列，且其中该反应体积包括至少两对不同的扩增引物，该扩增引物配置成扩增该对照核酸分子中的相应靶序列；在该反应体积中进行扩增反应，并形成与该对照核酸分子中的至少两种不同靶序列相对应的多种不同扩增产物；在扩增反应中确定至少两种不同扩增产物的存在。
另一个方面，本文提供了用于评估多种扩增反应的方法、组合物和试剂盒，该方法包括：将核酸样品的部分分配给位于载体内或其上的各个反应室，其中核酸样品包含一个对照核酸分子，而该对照核酸分子包含多种不同的靶序列；进行多种平行扩增反应并在各反应室中形成对应于对照核酸分子中至少两种不同靶序列的多种不同靶扩增产物，其中每种扩增反应包含一对引物，用于配置扩增该对照核酸分子内存在的相应靶序列，至少两种扩增反应包含扩增引物用于配置扩增不同对照核酸分子内存在的相应靶序列；并量化在至少两个个别反应室中形成的至少两个不同的靶扩增产物。
另一方面，本文提供了包含多种不同扩增靶序列的核酸构建体，其中扩增靶序列包含选自表3的基因的至少20个核苷酸部分或其相应的cDNA。在一些实施方案中，本文提供了包含此类核酸构建体的细胞或其他组合物。
另一方面，本文提供了包含多种不同扩增靶序列的核酸构建体，其中扩增靶序列选自一组包含SEQ ID NO:1-34或其互补序列的序列。在一些实施方案中，本文提供了包含此类核酸构建体的细胞或其他组合物。
在另一方面，本文提供了用于核酸扩增的阵列，包括：载体，其包含位于载体内或载体上的多个反应位点；多个反应位点中的每一个包含：(i)包含多种不同靶序列的对照核酸分子，(ii)被配置成扩增相应靶序列的扩增引物对，和(ii)配置成与扩增引物对中至少一个扩增引物延伸产生的核酸序列杂交的可检测标记的探针。
另一方面，本文提供了用于使用对照样品确认核酸提取过程功效的方法、组合物和试剂盒，所述对照样品包含宿主细胞，例如酵母细胞，所述宿主细胞用含有包含多种不同靶序列的对照核酸分子的质粒转化。在一些实施例中，本文提供的方法包括使用核酸提取程序从转化的宿主细胞中提取核酸样品；使用针对对照核酸分子的多种不同靶序列中至少一个的引物对从宿主细胞中提取的核酸样品进行扩增，以确认从对照样品中提取的核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括使用用于从对照样品中提取核酸的相同核酸提取程序从试验样品中提取核酸样品；使用针对对照样品中检测的靶序列的相同引物对从试验样品中提取的核酸进行扩增，以确认从试验样品中提取的核酸具有可比性。
另一个方面，本文提供了用于确认从包括宿主细胞(例如酵母细胞)的对照样品中提取核酸的方法、组合物和试剂盒，该对照样品用含有包含多种不同靶序列的对照核酸分子的质粒转化。在一些实施方案中，所述方法包括从对照样品中提取核酸样品；对从对照样品中提取的核酸样品进行扩增；确定对照核酸分子的多种不同靶序列中的至少一个是否存在于从对照样品中提取的核酸样品中，从而确认从对照样品中提取核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括使用用于从对照样品中提取核酸的相同核酸提取程序从试验样品中提取核酸样品；使用针对对照样品中检测的靶序列的相同引物对从试验样品中提取的核酸进行扩增，以确认从试验样品中提取的核酸具有可比性。
另一方面，本文提供了用于评价细胞核酸提取效率的对照核酸分子，对照核酸分子包括多种不同的靶序列，其中所述多种不同的靶序列来自至少两个不同的微生物或选自表3的基因和/或其中所述多个不同的靶序列各自包括选自表2(SEQ ID NO:1-34)或其互补序列的不同序列。
另一个方面，本文提供了用于评价试验样品核酸提取的提取对照样品，所述提取对照样品包括用含有包含多种不同靶序列的对照核酸分子的质粒转化的宿主细胞(例如酵母细胞)的集合。在一些实施方案中，所述多种不同的靶序列来自至少两个不同的微生物或选自表3的基因和/或所述多种序列中的至少两个分别包含选自表2(SEQ ID NO:1-34)或其互补序列的不同序列。
另一个方面，本文提供了一种用于对衍生细胞样本的核酸样品进行扩增的方法、组合物和试剂盒，该细胞样本含有用包含对照核酸分子的质粒转化的细胞，其中对照核酸分子包含来自不同基因组或转录组区域的多种不同靶序列。在一些实施方案中，所述方法包括通过从含有细胞的细胞样品中衍生核酸分子来获得衍生核酸样品，所述细胞样品包含用含有对照核酸分子的质粒转化的细胞，其中所述对照核酸分子包含从不同基因组或转录组区域衍生的多种不同靶序列；以及将衍生核酸样品置于足以产生从所述对照核酸分子衍生的一种或多种扩增产物的扩增条件下，其中所述扩增产物中的至少一种包含所述靶序列中的一种。在一些实施方案中，所述方法还包括通过从试验样品衍生核酸分子获得额外的衍生核酸样品，其中所述试验样品衍生自生物有机体并不含对照核酸分子，并且将所述额外的衍生核酸样品置于足以产生一种或多种扩增产物的扩增条件下，所述扩增产物含有与对照核酸分子的靶序列相同或互补的靶核酸序列。
另一方面，本文提供了用于进行核酸提取的方法、组合物和试剂盒，包括：获得细胞制剂，所述细胞制剂包括用对照核酸分子转化的酵母细胞，其中所述对照核酸分子包含来自微生物或微生物组合的不同基因的多种不同靶序列；以及从所述细胞制剂中提取核酸样品。
本文中提供了本发明内容的这些和其它特征。
附图说明
技术人员将理解，以下描述的附图仅用于说明。附图无意以任何方式限制本发明的范围。
图1描绘了使用线性化对照超质DNA作为核酸样品的二路普霍沃尔菌探针测定法(Prevotella bivia TaqMan assay)(见表3)的检测极限和线性动态范围、扩增曲线和平均Ct值的图形结果，如本文所述。如所示(1×103至1×107)，以不同浓度提供核酸样品。
图2描绘了使用线性化对照超级质粒DNA作为核酸样品的十二种不同示例性TaqMan测定法(见表3)的检测极限和线性动态范围的图形结果，如本文所述。如所示(1×102至1×107)，以不同浓度提供核酸样品。
图3A和图3B描绘了使用如本文中提供的非线性化对照超级质粒DNA(图3A)或线性化对照超级质粒DNA(如图3B所示)的34种不同TaqMan测定法(参见表3列表)的平均Ct值的图解结果，如本文所述，作为核酸样品。如所示(2×102至2×106)，在每个反应中以不同浓度提供非线性化和线性化的DNA。
图4描述了使用超级质粒DNA进行的34种不同TaqMan测定法(见表3)的平均Ct值的图形结果，如本文所述，从包含宿主酵母细胞的对照样品中提取，所述宿主酵母细胞用包含多个不同靶序列的控制核酸分子的超质粒(1×106细胞/冻干颗粒)转化。
图5描绘了如本文所提供的对照核酸分子的一个实施方案的说明性实例。在该实施例中，对照核酸序列包括多种靶序列以及与每种靶序列相关联的相应3’和5’基因组序列。在其它实施例(未示出)中，对照核酸分子中不存在侧翼序列，或者核酸分子中仅包含每种靶序列的相应3’或相应5’侧翼序列。
具体实施方式的说明
在一些实施方案中，本发明总体上涉及用作提取和/或扩增对照的组合物以及在核酸提取和/或核酸扩增过程中使用本发明的方法。所提供的对照组合物及其使用方法为其用户提供了监测、评估、排除故障及对照核酸提取和/或扩增工作流程的工具和方法。无论其用作提取对照的一部分和/或用作扩增对照，本文提供的对照核酸分子包含多种不同的靶序列。
所提供的提取和/或扩增对照核酸组合物可用作涉及核酸提取和/或核酸扩增和/或检测工作流程的阳性和/或阴性对照。在一些实施方案中，本文提供的对照组合物和其使用方法可与用于扩增和表征衍生自生物样品中微生物的选定核酸或其各自的cDNA的组合物和方法结合使用。本文所提供的对照组合物及其使用方法可与用于检测和/或评估选定组织和解剖区域的微生物特征的组合物和方法结合使用，例如，用于检测和/或监测阴道、呼吸道和泌尿生殖道微生物群成分和动态。因此，当与生物样品中靶核酸或微生物的一组选定测定的提取过程和/或扩增反应结合使用时，所使用的对照核酸分子包括扩增和/或检测测定法所针对的相同靶序列。在一些实施方案中，对照核酸分子包括测定法所针对的靶序列的子集。在一些实施方案中，对照核酸分子包括额外的靶序列，额外的参考或对照测定法针对的额外靶序列。在一些实施方案中，对照核酸分子包括对照测定法所针对的异种靶序列(与任何生物体没有已知同源性)。
在一些实施方案中，本发布总体上涉及从细胞中提取核酸的方法，所述细胞包括含有多种不同靶序列的对照核酸分子。在一些实施方案中，通过如本文所述平行进行的多个扩增反应来检测和/或评估提取的核酸。在一些实施方案中，对照核酸分子在细胞中。在某些实施方案中，对照核酸分子在微生物细胞中，包括但不限于酵母细胞。因此，在一些实施方案中，本文提供了包含对照核酸分子的细胞，所述对照核酸分子含有多种不同的靶序列。在某些实施方案中，本文提供了包含对照核酸分子的微生物细胞，所述对照核酸分子含有多种不同的靶序列。在一些实施方案中，本文提供了包含对照核酸分子的酵母细胞，所述对照核酸分子包含多种不同的靶序列，所述靶序列衍生自微生物基因或其cDNA。
在一些实施方案中，本发明总体上涉及用于扩增对照核酸分子样品中的多种靶序列的方法，包括在扩增条件下使样品的至少一部分与本文所提及的多种靶特异性引物和聚合酶接触，由此产生至少一个扩增的靶序列。如本文所述，对照核酸分子含有多种不同的靶核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了用于扩增对照核酸分子样品中的多种靶序列的方法，包括在扩增条件下使样品的至少一部分与本文所提及的多种靶特异性引物和聚合酶接触，由此产生至少一种扩增的靶序列，其中每个靶特异性引物以多个单独的反应(例如，作为单重反应)提供。在一些实施方案中，本发明提供了用于扩增对照核酸分子样品中的多种靶序列的方法，包括在扩增条件下使样品的至少一部分与本文所提及的多种靶特异性引物和聚合酶接触，从而产生至少一种扩增的靶序列，其中多个靶特异性引物在单一的组合反应中提供(例如，作为多重反应)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在扩增条件下使样品的至少一部分与本文所提及的多个靶特异性引物和探测组(例如，测定组)以及聚合酶接触，从而产生至少一种扩增的靶序列，并检测至少一种扩增的靶序列的存在。在一些实施方案中，每种测定包括被设计成特异性扩增靶序列的正向引物和反向引物，以及针对由正向引物和反向引物扩增核酸特异性的可检测标记的探针(例如扩增子)。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含对照核酸分子的样品经历多个单独的扩增反应(即，单重反应)，每个单独的反应用一对扩增引物和由引物扩增的靶序列的可检测标记的探针进行，所述扩增引物设计成对对照核酸分子中的至少一部分靶序列具有特异性，所述可检测标记探针对被引物扩增的靶序列具有特异性。多个单独的扩增反应可以在针对扩增引物和检测探针设计的每种靶序列的单独反应中产生单独的扩增产物。多重扩增反应的评估可以通过确定个体(单重反应)扩增反应的靶扩增产物的存在与否和/或通过定量来实现。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括对包含有多种不同靶序列的对照核酸分子的样品进行扩增反应，所述扩增反应包含设计成对对照核酸样品中的多种靶序列特异的引物对的组合(即多重反应)。在一些实施方案中，用至少两对不同的扩增引物和可检测标记的探针进行反应，所述扩增引物设计成对对照核酸分子中的至少两种不同的靶序列具有特异性，所述探针对由不同引物扩增的每种不同的靶序列具有特异性。在一些实施方案中，扩增反应可以为扩增引物和检测探针的组合所设计的每种靶序列产生多种扩增产物。多重扩增反应的评估可以通过确定组合(多重)扩增反应中靶扩增产物的存在与否和/或通过定量来实现。
在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法的检测测定法包括使用寡核苷酸引物和可检测标记的探针来扩增和检测对照核酸特异性靶序列。在一些实施方案中，靶特异性引物和探针组作为单重反应的一部分提供。在其它实施方案中，靶特异性引物和探针组作为多重反应的一部分提供。
在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法的检测测定法涉及使用寡核苷酸引物和可检测的核酸结合部分来扩增和检测对照核酸特异性靶序列。在一些实施方案中，靶特异性引物和可检测的核酸结合部分作为单重反应的一部分提供。在其它实施方案中，靶特异性引物和可检测的核酸结合部分作为多重反应的一部分提供。在一些实施方案中，可检测的核酸结合部分是核酸结合染料。在一些实施方案中，染料是双链DNA结合染料。在一些实施方案中，染料是SYBR Green。
在一些实施方案中，本文提供的组合物、方法和试剂盒包括额外的扩增反应和测定法，其作为额外的参考或对照反应和测定法进行。这些额外的参考或对照反应和测定法可不受限制地用于相对定量应用，以评估生物样品或核酸样品的充分性，使微生物的存在正常化，和/或检测生物或核酸样品中扩增抑制剂的存在。用于这种额外参考或对照测定法的示例性靶核酸包括但不限于原核16S rRNA基因序列、人类RNase P基因序列、异种核酸(XNA)序列和/或添加的外源核酸。
在一些实施方案中，本发明总体上涉及用于在相同测定条件下和/或基本上同时进行多个单重核酸扩增反应的方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，本发明总体上涉及用于在相同测定条件下和/或基本上同时进行多重核酸扩增反应的方法、组合物和试剂盒。
在一些实施方案中，本发明总体上涉及用于检测、监测和评估含有衍生自某些靶微生物的某些靶序列组的对照核酸分子的提取和/或扩增的组合物、方法和试剂盒。在一些实施方案中，对照核酸分子是包含多种靶序列(即，多靶质粒或超级质粒)的质粒的一部分。例如，在本文所述的一些实施方案中，扩增和/或提取对照核酸分子被培养成包含至少两种不同的靶序列，所述靶序列衍生自表1中列出的微生物和/或表3中列出的微生物基因。在其它实施方案中，扩增和/或提取对照核酸分子被培养成包含至少两种不同的靶序列，包括表2中列出的序列。在一些实施方案中，提供了用于检测衍生自表1中列出的微生物和/或表3中列出的微生物基因中至少一种靶序列的组合物和方法。在一些实施方案中，提供了用于检测包含表2所列序列的靶序列的组合物和方法。在一些实施方案中，提供了用于检测衍生自表1中列出的至少两种微生物和/或表3中列出的至少两种微生物基因的至少两种不同靶序列的组合物和方法。在一些实施方案中，提供了用于检测包括表2所列序列的至少两种不同靶序列的组合物和方法。在一些实施方案中，提供了用于检测衍生自表1中列出的微生物选定组或组合和/或表3中列出的微生物基因的不同靶序列的组合物和方法。在一些实施方案中，提供了用于检测不同靶序列的组合物和方法，所述靶序列包括表2中列出的序列的选定组或组合。在一些实施方案中，提供了用于检测衍生自表1中列出的所有微生物和/或表3中列出的微生物基因的不同靶序列的组合物和方法。在一些实施方案中，提供了用于检测不同靶序列的组合物和方法，每种靶序列包括表2中列出的序列之一。
Applied BiosystemsTM TaqManTM测定法是扩增引物对(正向引物和反向引物)和荧光标记探针的组合，用来共同作用于扩增和检测特殊靶核酸。在一些实施方案中，本文中提及的组合物和方法包括微生物特异性和/或基因特异性TaqMan测定法。在一些实施方案中，本文中提及的组合物和方法包括针对阴道、泌尿生殖系统和/或呼吸道微生物群的微生物特异性TaqMan测定法。在一些实施方案中，本文中提及的组合物和方法包括至少一个引物对和探针，这些引物对和探针在表3的Applied BiosystemsTM TaqManTM测定法中提供。在一些实施方案中，方法包括表3中列出的TaqManTM测定法中提供的至少两组不同的引物对和探针。在一些实施方案中，方法包括表3中列出的TaqManTM测定法中提供的不同引物对和探针组的选择组或组合。在一些实施方案中，方法包括在表3中列出的TaqManTM测定法中提供的所有不同组的引物对和探针。
表1-微生物
表2-微生物和扩增子相关序列
表3-微生物、基因和测定数
在一些实施方案中，提供了对照核酸分子，其含有衍生自不同微生物的选定基因组或转录组序列的靶序列。在一些实施方案中，靶序列衍生自细菌、真菌、原生动物和/或病毒的基因组或转录组序列。在一些实施方案中，提供了对照核酸分子，其包含衍生自不同微生物的不同基因组或转录组序列的多种不同靶序列。在一些实施方案中，提供了对照核酸分子，其包含2种至约50种衍生自不同微生物基因的不同靶序列。在某些实施方案中，提供了对照核酸分子，其包含5种至60种、10种至50种、或20种至40种衍生自不同微生物基因的不同靶序列。在一些实施方案中，提供了含有至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种或至少50种衍生自不同微生物基因的不同靶序列的对照核酸分子。
在一些实施方案中，提供了对照核酸分子，其含有衍生自表1所列微生物的不同靶序列。在一些实施方案中，提供了对照核酸分子，其含有衍生自表3中列出的微生物基因的不同靶序列。在一些实施方案中，提供了包含不同靶序列的对照核酸分子，每种靶序列包含表2中列出的不同扩增子相关序列(SEQ ID NO:1-34)或其互补序列。在一些实施方案中，对照核酸分子包括34种不同的靶序列，并且每种不同的靶序列包含表2中列出的序列之一或其互补序列。在某些实施方案中，所提供的对照核酸分子包含至少2种、至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少30种不同的靶序列，每种不同的靶序列包含选自SEQID NO:1-34的序列之一或其互补序列。在一些实施方案中，所提供的对照核酸分子包含约5种至约30种、约10种至约30种、约15至约30种、或约20种至约30种不同的靶序列，每种不同的靶序列包含选自SEQ ID NO:1-34的序列之一或其互补序列。在一些实施方案中，提供的对照核酸分子包含10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种或34种不同的靶序列，每种不同的靶序列包含选自序列组SEQ ID NO:1-34的序列之一或其互补序列。在一些实施方案中，对照核酸分子包含34种不同的靶序列，其中每种不同的靶序列包含选自表2所列序列组的某一序列或其互补序列，以及用于细菌和/或人类DNA一般检测的额外靶序列。在一些实施方案中，额外的靶序列可包括但不限于来自原核生物16S rRNA基因和/或人类RNase P基因序列的靶序列。在一些实施方案中，额外的靶序列可包括异种核酸(XNA)序列。
在一些实施方案中，对照核酸分子中的不同靶序列长度不同。例如，在一些实施方案中，对照核酸分子中的每种不同靶序列的长度为约15个核苷酸至约1000个核苷酸。在一些实施方案中，对照核酸分子中的每种不同靶序列的长度为约20个至约800个、约25个至约600个、约30个至约500个、约40个至约400个、约50个至约300个核苷酸。
在一些实施方案中，对照核酸分子还包含基因组或转录组序列或序列的一部分，其位于不同靶序列的侧翼一侧或两侧。在一些实施方案中，对照核酸分子包含对照核酸分子的至少两种不同靶序列的3’侧翼序列的一部分、5’侧翼序列的一部分或3’和5’侧翼序列的一部分。在一些实施方案中，对照核酸分子包含3’侧翼序列的一部分、5’侧翼序列的一部分或3’和5’侧翼序列的一部分，对应于对照核酸分子的不同基因组或转录组靶序列中的每一种(图5)。在一些实施方案中，对应于每种靶序列侧翼的基因组或转录组区的侧翼序列(如果3’或5’)或序列(如果3’和5’)的长度在5至500个核苷酸之间。在一些实施方案中，对应于每个靶序列侧翼的基因组或转录组区的侧翼序列长度为约10个至400个、约15个至200个、约20个至100个或约25个至50个核苷酸。在一些实施方案中，对照核酸分子包含衍生自不同微生物的选定基因组或转录组序列的多种靶序列，以及它们相应的3’、5’、或3’和5’基因组或转录组侧翼序列(图5)。在一些实施方案中，对照核酸分子包含仅对应于多种不同靶序列的一部分的侧翼序列。例如，在靶核酸分子中只能包括1种、2种、3种、4种、5种、6种、10种、15种、20种、25种或30种等不同靶序列的侧翼序列。在一些实施方案中，对照核酸分子中包括多种不同的靶序列及仅其对应的3’侧翼序列。在一些实施仅其中，对照核酸分子中包括多种不同的靶序列及仅其其对应的5’侧翼序列。在一些实施方案中，对照核酸分子中包括多种不同的靶序列及其对应的3’-和5’-侧翼序列。在一些实施方案中，对照核酸分子中存在多种不同的靶序列以及每种靶序列相应的3’侧翼、5’侧翼、3’和5’侧翼或没有侧翼序列的组合。在一些实施方案中，对照核酸分子不包含任何相应的基因组或转录组侧翼序列。
如本文所述，包含不同靶序列(包括或不包括侧翼序列)的对照核酸分子的长度可以变化。在一些实施方案中，整个对照核酸分子的长度在0.5kb至50kb之间。在一些实施方案中，整个对照核酸分子的长度为约1kb至20kb、约2kb至15kb、约3kb至10kb或约4kb至5kb。在一些实施方案中，对照核酸分子的一部分或全部序列被插入或包含在核酸构建体中，所述核酸构建体包括但不限于载体、质粒或病毒。
在一些实施方案中，提供了用于评估核酸扩增的方法，该方法包括与对照核酸分子和扩增引物对及相应的可检测标记的探针组平行地进行多个扩增反应，其中每个引物/探针组合对对照核酸分子的不同靶序列具有特异性。在一些实施方案中，提供了对对照核酸分子的微生物基因靶序列部分特异的扩增引物对的组合。在一些实施方案中，提供了扩增引物对和相应的可检测标记的探针的组合，其中每个引物/探针组合对对照核酸分子的微生物基因靶序列具有特异性。在一些实施方案中，提供了对对照核酸分子的微生物基因靶序列部分和可检测的核酸结合部分特异的扩增引物对的组合。在一些实施方案中，扩增引物对的组合包括表1中列出的微生物和/或表3中列出的微生物基因中至少一种的至少一个引物对。在一些实施方案中，扩增引物对和相应的可检测标记的探针的组合包括对表1中列出的微生物和/或表3中列出的微生物基因中的至少一种具有特异性的至少一种引物/探针组合。在一些实施方案中，扩增引物对和相应的可检测标记的探针的组合包括表2中列出的至少一种测定法。
在一些实施方案中，提供了用于评估特定方法的核酸提取效率的方法，该方法包括从用包含对照核酸分子的构建体转化的细胞的对照样品中提取核酸样品，对来自对照样品的提取核酸样品进行扩增，并确定是否对照核酸的多种不同靶序列中至少有一种存在于来自对照样品的提取核酸样品中。在一些实施方案中，转化的细胞是转化的微生物细胞。在一些实施方案中，转化的细胞是转化的酵母细胞。在一些实施方案中，转化的细胞以冻干颗粒的形式提供。
当将定量方法应用于基于聚合酶链式反应(PCR)的技术时，荧光探针或其它可检测标记可被纳入到反应中，以提供用于确定靶扩增进展的手段。在一些实施方案中，通过使用荧光探针或其它可检测标记，例如核酸结合部分，可以使反应发出与产生的核酸产物量成相对比例的荧光。因此，当使用PCR时，可以使用对应于对照靶序列的核苷酸序列测定法来确定对照核酸样品的扩增反应和/或提取过程的有效性。在一些实施方案中，荧光探针可以以序列特异性的方式用于检测特异性核酸。在一些实施方案中，可检测标记可以以非序列特异性的方式用于核酸的一般检测。
在一些实施方案中，扩增反应在具有多个反应位点的载体上发生，并且每个反应位点包含一对扩增引物。在一些实施方案中，扩增反应在反应容器中发生，并且每个反应包含一对扩增引物。在一些实施方案中，反应容器还包含至少一种靶特异性寡核苷酸探针，该探针对反应容器中存在的扩增引物对扩增的核酸的一部分具有特异性。在某些实施方案中，反应容器是载体板中的通孔，并且每个通孔包含如本文所述的一对扩增引物和至少一个可检测标记的探针。在一些实施方案中，在加入对照核酸样品之前，在每个反应位点或反应容器中对引物或引物和探针进行干燥处理。
扩增反应容器还可以含有扩增反应混合物的其他组分试剂，例如dNTP(dATP、dCTP、dGTP和/或dTTP)、聚合酶、缓冲液、盐、去污剂、扩增抑制剂、阻断剂和/或消泡剂。因此，在一些实施方案中，向半固体或固体载体提供反应位点或反应容器，其包含扩增引物对以及扩增反应混合物或主混合物。在一些实施方案中，在加入对照核酸样品之前，对反应位点或反应容器中的引物对和反应混合物组合进行干燥处理。在一些实施方案中，向半固体或固体载体提供反应位点或反应容器，其包括对照核酸分子、扩增引物对和可检测标记探针以及扩增反应混合物或主混合物。在一些实施方案中，在加入对照核酸样品之前，对反应位点或反应容器中的引物对、探针和反应混合物组合进行干燥处理。
在一些实施方案中，提供了载体，该载体包括含有对照核酸分子的反应位点或反应容器，以及对表1中列出的微生物和/或表3中列出的微生物基因中至少一种具有特异性的引物或引物对。在一些实施方案中，提供了载体，该载体包括含有对照核酸分子的反应位点或反应容器，以及对表1中列出的微生物和/或表3中列出的微生物基因中至少一种具有特异性的引物或引物对。在一些实施方案中，提供了载体，该载体包括含有对照核酸分子的反应位点或反应容器，以及表3中列出的至少一种测定法。在一些实施方案中，提供了包含多个反应位点或反应容器的载体，其中反应位点或反应容器包含对照核酸分子和对至少两种微生物特异的引物或引物对，以及包含表2所列序列之一或其互补序列的相应靶序列。在一些实施方案中，提供了载体，所述载体包括多个反应位点或反应容器，其中反应位点或反应容器包括对照核酸分子和引物或引物对，所述引物或引物对对所有微生物及其相应的靶序列包括表2中列出的序列之一或其互补序列具有特异性。在一些实施方案中，提供了包含多个反应位点或反应容器的载体，其中反应位点或反应容器包含对照核酸分子和微生物的至少10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种或33种特异的引物或引物对，以及包含表2所列序列之一的相应靶序列或其互补序列。
在一些实施方案中，提供了载体，该载体包括含有对照核酸分子的反应位点或反应容器，以及引物或引物对和可检测标记的探针，每个探针对表1中列出的微生物和/或表3中列出的微生物基因中至少一种具有特异性。在一些实施方案中，提供了载体，该载体包括含有对照核酸分子的反应位点或反应容器、引物或引物对以及可检测标记的探针，每个探针对表3中列出的至少一种微生物基因具有特异性。在一些实施方案中，提供了包含多个反应位点或反应容器的载体，其中反应位点或反应容器包含对照核酸分子和引物或引物对以及可检测标记的探针，每个探针对至少两种微生物和包含表2所列序列之一或其互补序列的相应靶序列具有特异性。在一些实施方案中，提供了包含多个反应位点或反应容器的载体，其中反应位点或反应容器包括对照核酸分子和引物或引物对以及可检测标记的探针，每个探针对所有微生物及其相应的靶序列都具有特异性，所述靶序列包括表2中列出的序列之一或其互补序列。在一些实施方案中，提供了包括多个反应位点或反应容器的载体，其中反应位点或反应容器包括对照核酸分子和引物或引物对以及可检测标记的探针，每个探针对至少10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种或33种微生物和表2列出的序列之一的相应靶序列或其互补序列具有特异性。
本文提供的对照核酸分子可以是DNA或RNA，并且可以包含核酸类似物或其他核酸模拟物。对照核酸分子可以是单链或双链核酸分子，并且可以是任何核酸结构或形状，包括但不限于线性、圆形、超螺旋、缺口圆形。对照核酸分子可以从任何来源获得，并且可以包含任何数量的不同组成成分。对照核酸可以通过本领域已知的方法合成。对照核酸可以在体外合成和扩增，或者可以转化或转染到细胞中并在细胞内扩增。例如，对照核酸可以插入或包含在核酸构建体中，所述核酸构建体包括但不限于载体、质粒或病毒，其能够在宿主细胞如细菌、酵母和真核细胞中复制。在一些实施方案中，对照核酸分子以质粒的形式提供。在一些实施方案中，对照核酸可以在核酸载体内，所述核酸载体能够以多于一种细胞类型复制或将对照核酸从一种细胞类型携带至另一种细胞类型。在一些实施方案中，对照核酸分子以酵母穿梭载体的形式提供。
在一些实施方案中，对照核酸分子可以从许多生物来源获得，包括但不限于病毒、原核生物和真核生物，例如，来自细菌培养物、酵母细胞培养物或真核细胞系。应了解，可以使用所属领域已知的任何一种程序从生物样品中分离对照核酸分子，例如MagMAXTM DNAMulti-Sample Ultra试剂盒(Applied Biosystems，赛默飞费舍尔科技)、MagMAXTMExpress-96Magnetic Particle Processor和KingFisherTM Flex Magnetic ParticleProcessor(赛默飞费舍尔科技)、ABI PrismTM 6100核酸制备站和ABI PrismTM 6700自动核酸工作站(Applied Biosystems，赛默飞费舍尔科技)等。应了解，对照核酸在分析之前可以是线性化的，包括使用诸如机械力、限制性核酸内切酶裂解或本领域已知的任何方法等程序。在一些实施方案中，当扩增和/或测定时，对照核酸可存在于粗裂解物中。
在一些实施方案中，提供了提取对照核酸或包含提取对照核酸的细胞组合物。在一些实施方案中，提取对照核酸分子可用于检测、监测和/或评估来自细胞或其他来源的核酸的提取和/或纯化。提取对照核酸对照需通过核酸提取过程。例如，可在提取过程之前，在细胞内提取对照。在一些实施方案中，提取对照的是微生物细胞，例如作为酵母细胞，包含对照核酸分子。在一些实施方案中，提取对照是用构建体转化的原核细胞，例如质粒或穿梭载体，其包含本文所述的对照核酸分子。在其他实施方案中，提取对照的是包含对照核酸分子的真核细胞。在一些实施方案中，提取对照的是用构建体转化的真核细胞，所述构建体例如质粒或穿梭载体，其包含本文所述的对照核酸分子。在进行裂解和/或核酸提取过程之前，含有对照核酸分子的细胞制剂可以是任何形式，包括但不限于冻干、冷冻、浸没在培养基中、或在液体或粘性培养基中。
在一些实施方案中，通过扩增提取对照核酸分子的多种不同靶序列中的一种或多种来评估核酸提取过程的检测、监测和/或评估。提取对照核酸分子的评估扩增和检测可以通过本文所述的扩增和检测扩增对照核酸分子的方法进行。
为了更清晰、简明地描述并指出本发明的主题，提供以下说明和所附权利要求书中所用特定术语的定义。贯穿本说明书，特定术语的举例说明应该被视为非限制性实例。
除非另外确切地说明，否则如本说明书所使用，词语“一个(a)”或“一(an)”意指至少一个。在本说明书中，除非另外确切地说明，否则单数的使用亦包括其复数。举例来说，但不是作为限制，“一个靶核酸”意指可能存在一个以上靶核酸；举例来说，一个特定靶核酸物质的一或多个拷贝以及两个或两个以上不同的靶核酸物质。术语“和/或”意指在斜线之前和之后的术语可以连在一起或分开。为了说明，但不是作为限制，“X和/或Y”可以意指“X”或“Y”或“X”和“Y”。
应了解，在本发明中讨论的温度、浓度、时间等之前存在暗示的“约(about)”，使得微小并且非实质的偏差在本文本发明内容的范围内。此外，“包括(comprise/comprises/comprising)”、“含有(contain/contains/containing)”和“包含(include/includes/including)”的使用并非旨在限制。应理解，以上一般描述和以下详细描述两者仅是例示性和解释性的区别，且并不限制发明内容。
除非在以上说明书中专门指出，否则在以上说明书中叙述“包含”各种组分的实施方案也涵盖“由”所述组分“组成”或“基本上由”所述组分“组成”；在说明书中叙述“由”各种组分“组成”的实施例也涵盖“包含”所述组分或“基本上由”所述组分“组成”；以及在说明书中叙述“基本上由”各种组分“组成”的实施例也涵盖“由”所述组分“组成”或“包含”所述组分(这种互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。
如本文中所用，术语“扩增(amplification)”、“核酸扩增”或“扩增(amplifying)”是指产生多个核酸模板拷贝或产生多个与核酸模板互补的核酸序列拷贝。所述术语(包括术语“聚合”)还可以指延伸核酸模板(例如，通过聚合)。扩增反应可以是聚合酶介导的延伸反应，例如聚合酶链式反应(PCR)。然而，任何已知扩增反应都可以适用于本文中所述的使用。通常是指靶核酸“指数”增加的术语“扩增”在本文中可以用于描述核酸的所选靶序列数量的线性和指数增加两者。
如本文中所用的术语“扩增子”和“扩增产物”一般是指扩增反应的产物。扩增子可以是双链或单链，并且可以包括通过使双链扩增产物变性获得的分开的组分链。在某些实施方案中，一个扩增循环的扩增子可以充当后一扩增循环中的模板。
术语“退火(annealing)”和“杂交(hybridizing)”包括(但不限于)词根“杂交(hybridize)”和“退火(anneal)”的变体，可互换地使用并且意指一个核酸与另一个核酸的核苷酸碱基配对相互相用，所述相互作用促使形成双螺旋体、三螺旋体或其它更高的有序结构。根据沃森-克里克(Watson-Crick)和胡斯坦(Hoogsteen)型氢键结，初级相互相用通常具有核苷酸碱基特异性，例如A:T、A:U和G:C。在某些实施方案中，碱基堆积和疏水性相互作用也可以促成双螺旋体稳定性。引物和探针退火到互补序列的条件在本领域中是众所周知的，例如在《核酸杂交的实用方法》(NucleicAcidHybridization，APractical Approach)，哈梅斯(Hames)和希金斯(Higgins)编，IRL出版社，华盛顿哥伦比亚特区(Washington,D.C.)(1985)以及维特莫(Wetmur)和戴维森(Davidson)，《分子生物学》(Mol.Biol.)31:349(1968)中所述。
一般来说，所述退火是否进行尤其受以下各因素的影响：引物的互补部分的互补部分和其在靶侧翼序列和/或扩增子中的对应结合位点的长度，或报告探针的对应互补部分和其结合位点的长度；pH；温度；一价和二价阳离子的存在情况；杂交区中G和C核苷酸的比例；培养基的粘度；以及变性剂的存在情况。所述变量影响杂交所需的时间。因此，优选退火条件将取决于特定应用。然而，在无过度实验的情况下，所述条件可以由本领域的普通技术人员常规确定。更为可取的是，选择以下退火条件：允许引物和/或探针选择性地与对应靶侧翼序列或扩增子中的互补序列杂交，但不在第二反应温度下与反应组合物中的不同靶核酸或非靶序列杂交达到任何显著程度。
如本文中所用的术语“或其组合”是指在所述术语前面所列术语的所有排列和组合。举例来说，“A、B、C或其组合”意在包括以下至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定情况下顺序很重要，那么还有BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续在这个实例情况下，明确地包括含有重复的一个或多个项目或术语的组合，如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟练的业内人士将了解，除非另外从上下文显而易见，否则通常不存在对任何组合中的项目或术语的数量限制。
如本文中所用的术语“变性(denaturing/denaturation)”是指其中双链多核苷酸适当时被转化为两条单链多核苷酸或一条单链或实质上单链多核苷酸的任何过程，所述双链多核苷酸包括(但不限于)包含至少一个靶核酸的基因组DNA(gDNA)片段、双链扩增子或包含至少一个双链区段的多核苷酸。使双链多核苷酸变性包括(但不限于)使得双链核酸变成单链或实质上单链的各种热技术和化学技术，例如(但不限于)释放出包含两种寡核苷酸的双链多核苷酸或双螺旋体的两个单独的单链组分。本领域的技术人员将了解，所采用的变性技术一般不是限制性的，除非它实质上干扰扩增反应的后续退火或酶促步骤，或在某些方法中干扰荧光信号的检测。
如本文中所用，术语“Tm”用于指代解链温度。解链温度是一群双链核酸分子变得半解离成单链的温度。
如本文中所用的术语“小沟结合物”是指有时以序列特异性方式嵌入双链DNA小沟中的小分子。一般来讲，小沟结合物是可以采用新月状形状并且因此紧贴地嵌入双螺旋的小沟中，通常转移水的又长又平的分子。小沟结合分子通常包含若干个通过扭转自由的键连接的芳环，例如(但不限于)呋喃、苯或吡咯环。
术语“终点”测量是指其中数据收集仅发生在反应已经停止之后的方法。
术语“实时”和“实时连续”是可互换的并且是指其中数据收集通过定期监测发生在聚合反应过程期间的方法。因此，所述方法将扩增和检测合并成单一步骤。
如本文中所用，术语“Ct”和“循环阈值”是指荧光强度大于背景荧光的时间。其特征在于第一次检测到靶扩增的时间点(或PCR循环)。因此，起始物质中靶DNA的数量越大，荧光信号的显著增加将出现得越快，产生更低的Ct。
如本文中所使用，术语“引物”及其派生物通常指可与靶核酸杂交的任何聚核苷酸。在一些实施方案中，引物也可以用于激活核酸合成。在一些实施方案中，引物是指以合成方式或以生物方式产生的单链寡核苷酸，其在核酸分子的扩增或聚合期间通过核苷酸单体的共价键结延伸。核酸扩增通常是基于通过核酸聚合酶或逆转录酶进行的核酸合成。许多所述聚合酶或逆转录酶需要存在可以经延伸以引发所述核酸合成的引物。引物通常是约11个碱基至35个碱基长，视需要而定，可以使用更短或更长的引物。在某些实施方案中，引物为17个碱基或更长。在某些实施方案中，引物是约17个碱基至25个碱基长。引物可包含标准的、非标准的、衍生的和改性的核苷酸。本领域的技术人员将了解，本文中所提及的寡核苷酸可以用作各种延伸、合成或扩增反应中的一或多种引物。
通常，PCR反应使用一对扩增引物，其包括“上游”或“正向”引物和“下游”或“反向”引物，其限定待扩增的RNA或DNA的区域。第一引物和第二引物可以是正向或反向引物并且在本文中可互换使用，且不是限制性的。
术语“互补性”和“互补的”是可互换的，并且是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常通过反向平行的多核苷酸链或区域中的核苷酸单元之间的氢键形成的。互补的多核苷酸链或区域可以按沃森-克里克方式碱基配对(例如，A与T、A与U、C与G)。100％互补性是指其中一个多核苷酸链或区域的每个核苷酸单元都可以与第二多核苷酸链或区域的每个核苷酸单元发生氢键结的情况。“小于完全互补性”是指其中两个链或两个单元的一些但不是所有核苷酸单元可以彼此发生氢键结的情况。
如本文中所用，术语“反向互补序列”是指根据由沃森-克里克碱基配对所定义的规则和DNA-DNA、RNA-RNA以及RNA-DNA双螺旋的反向平行性质，将退火/碱基配对或实质上退火/碱基配对到第二寡核苷酸的序列。因此，作为实例，RNA序列5’-AAUUUGC的反向互补序列将是5’-GCAAAUU。还可以在反向互补序列中包括替代性碱基配对方案，包括(但不限于)G-U配对。
如本文中所用，术语“探针”是指通过设计或选择，含有允许其在所限定的严格性下特异性地(即，优先地)杂交到靶核酸序列的特异性核苷酸序列的合成的或以生物方式产生的核酸(DNA或RNA)。
在一些实施方案中，本文提供的扩增和/或提取对照核酸，作为放大、检测、分析和/或监测生物样品中的靶标结合使用。
“生物样品”包括细胞、组织切片，例如活检和尸检样品，以及用于组织学目的的冷冻切片，以及由细胞或组织产生的液体或分泌物样品。这类样品包括血液和血液级分或产品(例如血清、血小板、红细胞等)、淋巴、骨髓、痰液、支气管肺泡灌洗液、羊膜液、毛发、皮肤、培养细胞(例如主要培养基、外植体和转化细胞)、大便、尿液等。在靶核酸制备之前，可以新制生物样品，冻结或福马林或多聚甲醛固定的石蜡包埋组织(FFPE)。“活检”是指去除组织样本以进行诊断或预后评估的过程以及组织样本本身。应用的活检技术将取决于待评估的组织类型(例如皮肤、粘膜等)、组织样本的大小和类型以及其他因素。代表性的活检技术包括但不限于切除活组织检查、切口活组织检查、针吸活组织检查和外科活组织检查。
例如，在一些实施方案中，本文提供的扩增和/或提取对照核酸，作为放大、检测、分析和/或监测来自生物或试验样品中的某些靶微生物组的核酸结合使用。在一些实施方案中，生物或试验样品来自阴道(例如，阴道粘膜、阴道区域)、呼吸道、和/或泌尿道，并且包括来自这些解剖部位的细胞、组织和/或流体(例如，呼吸道分泌物、尿分泌物、阴道分泌物和肛门分泌物)。
可以使用拭子、刷子或刮擦工具收集来自皮肤、粘膜或其分泌物的样品。与阴道或泌尿生殖生物样品相容的收集系统和介质兼容是本领域已知的。用于此类样品类型的示例性收集系统和介质包括但不限于ThinPrepTM Pap试验(Hologic Corp.)、BD SurePathTM试验(Becton，Dickinson and Company)、ESwabTM(Copan Diagnostics)、AptimaTM阴道拭子传输介质(STM)(Hologic)和M4TM MicroTest(Remel)、确认环境温度传输系统(AffirmAmbient Temperature Transport System)(Becton，Dickinson and Company)和BDProbeTecTM拭子稀释剂Q(Becton，Dickinson and Company)。
应了解，可以使用所属领域已知的任一程序从生物样品中分离核酸，例如MagMAXTMDNA Multi-Sample Ultra试剂盒(Applied Biosystems，赛默飞费舍尔科技)、MagMAXTMExpress-96Magnetic Particle Processor和KingFisherTM Flex Magnetic ParticleProcessor(赛默飞费舍尔科技)、用于FFPE的RecoverAllTM总核酸分离试剂盒和PureLinkTMFFPE RNA分离试剂盒(赛默飞费舍尔科技的AmbionTM)、ABI PrismTM 6100核酸制备站和ABIPrismTM 6700自动核酸工作站(Applied Biosystems，赛默飞费舍尔科技)等。应了解，来自生物样品的靶核酸可以在分析之前进行切割或剪切，包括使用以下程序：例如机械力、声处理、限制性核酸内切酶裂解或本领域中已知的任何方法。
如本文中所用，术语“模板”可与“靶分子”或“靶核酸”互换，并且是指有待扩增、拷贝或延伸、合成或测序的双链或单链核酸分子。在双链DNA分子的情况下，使其链变性形成第一条和第二条链来对这些分子进行扩增、测序或合成。靶核苷酸序列可包括可与适用于扩增或合成反应的引物在聚合酶延伸之前杂交的核酸序列。与模板的一部分互补的引物在适当条件下杂交并且然后聚合酶(DNA聚合酶或逆转录酶)会合成与所述模板或其一部分互补的核酸分子。根据本发明，新合成的分子的长度可以与初始模板相等或比它短。在新合成的分子的合成或延伸期间的错配并入会产生一个或多个错配的碱基对。因此，合成的分子不必与模板完全互补。模板可以是RNA分子、DNA分子或DNA/RNA混合分子。新合成的分子可以充当后续核酸合成或扩增的模板。
如本文中所用的术语“并入”意指变成DNA或RNA分子或引物的一部分。
如本文所用的术语“核酸结合部分”是指对结合核酸分子如DNA，RNA或DNA/RNA杂交体具有亲和力的分子。
如本文中所用的术语“核酸结合染料”是指对双链多核苷酸具有特异性或至少在与双链多核苷酸结合时显示出比与单链多核苷酸结合时实质上更大的荧光增强的荧光分子。通常，核酸结合染料分子通过插入到多核苷酸的双链区段的碱基对之间与所述双链区段结合，但结合在所述双链区段的大沟或小沟或两者当中。核酸结合染料的非限制性实例包括溴化乙锭；DAPI；赫斯特衍生物(Hoechst derivatives)，包括(但不限于)赫斯特33258和赫斯特33342；插入剂，包含镧系螯合物(例如(但不限于)携带两个荧光四齿β-二酮-Eu3+螯合物(NDI-(BHHCT-Eu3+)2)的萘二酰亚胺衍生物，参看例如野岛(Nojima)等人，《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)增刊第1期105(2001)以及某些不对称花青染料，例如 Gree和
本文中所用的术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换地使用，并且是指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括(但不限于)通过核苷酸间磷酸二酯键键联或核苷酸间类似物以及相关抗衡离子连接的2’-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，所述抗衡离子例如H+、NH4 +、三烷基铵、Mg2+、Na+等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成、完全由核糖核苷酸构成或由其嵌合混合物构成，并且可以包括核苷酸类似物。核苷酸单体单元可以包含本文中所述的核苷酸中的任一个，包括(但不限于)核苷酸和/或核苷酸类似物。多核苷酸的大小通常从几个单体单元到几千个单体核苷酸单元不等，例如5-40，当它们有时在本领域中被称为寡核苷酸时。除非另外指出，否则每当呈现多核苷酸序列时，应了解，核苷酸从左到右是按5’-到-3’的顺序，并且除非另外指出，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。
术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，例如三磷酸酯，其中最常见的酯化位点是连接在戊糖的C-5位置的羟基。
术语“核苷”是指由连接到戊糖(包括2’-脱氧和2’-羟基形式)的1’位置的嘌呤、脱氮嘌呤或嘧啶核苷碱基组成的化合物，所述碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、脱氮腺嘌呤、脱氮鸟苷等。当核苷碱基是嘌呤或7-脱氮嘌呤时，戊糖连接到嘌呤或脱氮嘌呤的9位核碱基，并且当核碱基是嘧啶时，戊糖连接到嘧啶的1位核碱基。
术语“模拟物”包括具有修饰碱基部分、修饰糖部分和/或修饰磷酸酯部分的合成类似物。磷酸酯类似物一般包含其中磷原子呈+5氧化态并且氧原子中的一或多个被例如硫的非氧部分置换的磷酸酯类似物。例示性磷酸酯类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯、二羟硼基磷酸酯，包括相关抗衡离子，例如H+、NH4 +、Na+。例示性碱基类似物包括：2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、C-5-丙炔、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-硫代嘧啶。例示性糖类似物包括：2’修饰或3’修饰，其中2’位或3’位是氢、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基和苯氧基)、叠氮基、氨基或烷基氨基、氟、氯和溴。
如本文所用，术语“超级质粒”是指含有插入片段的质粒(DNA分子)，所述插入片段包含多个兴趣核酸靶序列。在一些实施方案中，核酸靶序列可以是基因组或转录组序列。在一些实施方案中，核酸靶序列可以是异种核酸(XNA)。
本文中所用的术语——“反应器”一般是指根据本发明内容可以在其中发生反应的任何容器、腔室、装置或组合件。在一些实施方案中，反应器可以是微管，例如(但不限于)0.2mL或0.5mL反应管，例如光管(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)或微量离心管，或在分子生物学实验室的惯例中的那类其它容器。在一些实施方案中，反应器包含多孔板(例如48、96或384孔微量滴定板)的孔、在载玻片上的点、TaqManTM ArrayCard中的孔或微流体装置的通道或腔室，包括但不限于低密度阵列或TaqManTMOpenArrayTM实时PCR板的通孔(Applied Biosystems,Thermo Fisher Scientific)。举例来说，但并非作为限制，可以在同一载体上存在多个反应器。例如，OpenArrayTM板是反应板3072通孔。这种板中的每个这样的通孔可以包含单个TaqManTM测定。在一些实施方案中，可以获自例如Caliper或Fluidigm的芯片实验室器件以可以提供反应容器。应认识到，各种反应器可商购，或专门设计成适用于本发明内容。
术语“报告基团”在本文中在广义上使用，并且是指任何可鉴别的标签、标记或部分。
术语“热稳定”当提及酶使用时是指对因热失活具有抗性的酶(例如具有核酸聚合酶活性的多肽)。“热稳定”酶与“热不稳定”聚合酶形成对比，后者可以通过热处理失活。热不稳定蛋白质可以在生理温度下失活，并且可以归类为中间热稳定(在约45℃到约65℃下失活)和热稳定(在大于约65℃下失活)。举例来说，热不稳定T5和T7DNA聚合酶的活性可以通过将所述酶暴露于约90℃的温度持续约30秒完全失活。热稳定聚合酶活性对热失活的抗性大于热不稳定聚合酶。然而，热稳定聚合酶不打算指完全抗热失活的酶；因此，热处理可以使聚合酶活性降低到一定程度。热稳定聚合酶的最佳温度通常还将高于热不稳定DNA聚合酶。
术语“工作浓度”是指在溶液中所用的最佳浓度下或接近所述最佳浓度以便执行特定功能(例如核酸分子的扩增或消化)的试剂浓度。试剂的工作浓度还等效地描述为试剂的“1×浓度”或“1×溶液”(如果试剂在溶液中)。因此，还可以基于工作浓度描述试剂的更高浓度；举例来说，试剂的“2×浓度”或“2×溶液”定义为高达试剂的工作浓度两倍的浓度或溶液；“5×浓度”或“5×溶液”高达工作浓度五倍等。
术语“扩增反应混合物”和/或“主混合物”可以指包含用于扩增靶核酸的各种(一些或所有)试剂的水溶液。所述反应还可以使用固体载体或半固体载体(例如，阵列)来执行。所述反应还可以根据用户需要以单一或多重形式执行。这些反应通常包括酶、水性缓冲液、盐、扩增引物、靶核酸以及核苷三磷酸。在一些实施方案中，扩增反应混合物和/或主混合物可以包括以下各者中的一或多个：例如缓冲液(例如，Tris)、一或多种盐(例如MgCl2、KCl)、甘油、dNTP(dA、dT、dG、dC、dU)、重组BSA(牛血清白蛋白)、染料(例如，ROX惰性参比染料)、一或多种清洁剂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和/或明胶(例如，鱼或牛源)和/或消泡剂。取决于情况而定，所述混合物可以是完全或不完全扩增反应混合物。在一些实施方案中，主混合物在用于扩增反应之前不包括扩增引物。在一些实施方案中，主混合物在用于扩增反应之前不包括靶核酸。在一些实施方案中，在与扩增引物接触之前，将扩增主混合物与靶核酸样品混合。
在一些实施方案中，扩增反应混合物包含扩增引物和主混合物。在一些实施方案中，扩增反应混合物包含扩增引物、可检测标记的探针和主混合物。在一些实施方案中，扩增引物和主混合物或扩增引物、探针和主混合物的反应混合物在储存容器或反应容器中进行干燥。在一些实施方案中，将扩增引物和主混合物或扩增引物、探针和主混合物的反应混合物在储存容器或反应容器中冻干。
在一些实施方案中，本发明总体上涉及从单个核酸来源或样品扩增多个靶特异性序列。例如，在一些实施方案中，单个对照核酸分子可包括RNA，而在其他实施方案中，该单个对照核酸分子可包括DNA。在一些实施方案中，靶特异性引物和引物对是可以扩增核酸分子的特定区域的靶特异性序列。在一些实施方案中，靶特异性引物可以引发RNA的逆转录以产生靶特异性cDNA。在一些实施方案中，靶特异性引物可以扩增基因组DNA或cDNA。在一些实施方案中，选择性扩增所需的DNA量可为约1ng至1微克。在一些实施方案中，选择性扩增一种或多种靶序列所需的DNA量可为约1ng、约5ng或约10ng。在一些实施方案中，选择性扩增靶序列所需的DNA量为约10ng至约200ng。
在一个实施方案中，可以使用本发明所提及的任何一种或多种靶特异性引物扩增含有一种或多种靶序列的样品。在另一个实施方案中，使用本发明所提及的方法和相关组合物和试剂盒获得的扩增的靶序列可以与下游过程相联，例如但不限于核酸测序。例如，一旦已知扩增的靶序列的核酸序列，就可以将该核酸序列与一种或多种参考样品进行比较。可任选地分析扩增程序的输出，例如通过核酸测序，以确定基于靶特异性引物的预期扩增产物是否存在于扩增输出中。在一些实施方案中，可以在测序之前克隆通过选择性扩增产生的扩增子，或者可以直接测序扩增子而无需克隆。可以使用任何合适的DNA测序平台对扩增子进行测序。在一些实施方案中，可以使用Ion PersonalGenome MachineTM(PGMTM)系统或Ion ProtonTM系统(Thermo Fisher Scientific)对扩增子进行测序。
用于扩增靶核酸的方法可以是本领域的技术人员可获得的任何方法。可以采用使核酸靶序列的拷贝倍增的任何体外手段。这些手段包括线性、对数和/或任何其它扩增方法。虽然本发明大体上可以论述PCR作为核酸扩增反应，但是预计本文中描述的改性清洁剂应该是在其它类型的核酸扩增反应中有效的，所述其它类型的核酸扩增反应包括聚合酶介导的扩增反应(例如解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶-聚合酶扩增(RPA)和滚环扩增(RCA))以及连接酶介导的扩增反应(例如连接酶检测反应(LDR)、连接酶链式反应(LCR)和各自的差距版本)两者，以及核酸扩增反应的组合，例如LDR和PCR(参看例如美国专利No.6,797,470)。举例来说，修饰清洁剂可以用于例如各种连接介导的反应中，在所述反应中采用例如连接探针，与PCR引物相反。另外的示例性方法包括聚合酶链反应(PCR；参见，例如，美国专利第4,683,202号；第4,683,195号；第4,965,188号；和/或第5,035,996号)，等温程序(使用一种或多种RNA聚合酶(参见，例如，《专利合作条约》出版(PCT Pub.)第WO 2006/081222号)，链置换(参见，例如，美国专利第RE39007E号)，引物分子的部分破坏(参见，例如，《专利合作条约》出版(PCT Pub.)第WO 2006/087574号))，连接酶链反应(LCR)(参见，例如，Wu等人，《基因组学》(Genomics)4:560-569(1990))，和/或Barany等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88:189-193(1991))，QβRNA复制酶系统(参见，例如，《专利合作条约》出版(PCT Pub.)第WO 1994/016108号)，基于RNA转录的系统(例如，TAS,3SR)，滚环扩增(RCA)(参见，例如，美国专利第5,854,033号；美国专利出版第2004/265897号；Lizardi等人，《自然-遗传学》(Nat.Genet.)19:225-232(1998)；和/或Banér等人，《核酸研究》(Nucleic Acid Res.)，26:5073-5078(1998))和链置换扩增(SDA)(Little等人，《临床化学》(Clin.Chem.)45:777-784(1999))等。这些系统与熟练的业内人士可获得的许多其它系统一起可以适用于聚合和/或扩增如本文中所述使用的靶核酸。
在某些实施方案中，扩增技术包含至少一个扩增循环，例如(但不限于)以下步骤：使双链核酸变性以分离组分链；使引物杂交到靶侧翼序列或扩增子的引物结合位点(或适当时任一者的互补序列)；以及使用DNA聚合酶以模板依赖性方式合成核苷酸链。所述循环可以或可以不重复。在某些实施例中，扩增循环包含多个扩增循环，例如(但不限于)20个扩增循环、25个扩增循环、30个扩增循环、35个扩增循环、40个扩增循环、45个扩增循环或大于45个扩增循环。
在一些实施方案中，扩增包含使用仪器进行热循环，所述仪器例如(但不限于) PCR系统9700、9600、2700或2400热循环仪，Applied ViiATM 7实时PCR系统，Applied 7500快速实时PCR系统，7900HT快速实时PCR系统，实时PCR系统，实时PCR系统，QuantStudioTM 12K Flex实时PCR系统，QuantStudioTM Dx实时PCR系统等(全部来自Thermo Fisher Scientific)。用于所述方法的分光光度热循环仪的其它实例包括但不限于Bio-Rad ICycler IQTM、CepheidSmartCyclerTM II、Corbett Research Rotor-Gene 3000、Idaho TechnologiesR.A.P.I.D.TM、MJ Research Chromo 4TM、Roche Applied Science LightCyclerTM、RocheApplied Science StratageneMx3000PTM和Stratagene Mx4000TM。在某些实施方案中，在扩增反应中产生单链扩增子，例如(但不限于)不对称PCR或A-PCR。
在一些实施方案中，进行一步RT-PCR，其中靶RNA序列的逆转录和所得cDNA的扩增都发生在相同的反应混合物中。在一些实施方案中，反应混合物还包括可检测标记的靶特异性探针，使得扩增的cDNA的检测也发生在相同的反应混合物中。
在某些实施方案中，扩增反应包括在相同测定条件下和/或基本上同时并行进行的多个或多样单重反应。在一些实施方案中，并行进行多个扩增反应形成多种不同的扩增产物。在某些实施方案中，并行进行多个扩增反应可以形成10至10,000种不同的扩增产物。在一些实施方案中，并行进行多个扩增反应可以形成10至1000种不同的扩增产物。在某些实施方案中，并行进行多个扩增反应可以形成10至100种不同的扩增产物或10至50种不同的扩增产物。
在某些实施方案中，扩增反应包含多重扩增，其中使用多个不同引物组同步扩增多种不同靶核酸和/或多个不同扩增产物物质。在某些实施方案中，并行执行多重扩增反应和单重扩增反应，包括多个单重或较低重数反应(例如(但不限于)两重、三重、四重、五重或六重反应)。
如本文所述，用于聚合和/或扩增核酸的例示性方法包括，例如聚合酶介导的延伸反应。举例来说，聚合酶介导的延伸反应可以是聚合酶链式反应(PCR)。在其它实施方案中，核酸扩增反应是多重反应。举例来说，适用于本文所述聚合和/或扩增并且检测核酸的例示性方法可向测定商购买(参看例如美国专利第4,889,818号；第5,079,352号；第5,210,015号；第5,436,134号；第5,487,972号；第5,658,751号；第5,210,015号；第5,487,972号；第5,538,848号；第5,618,711号；第5,677,152号；第5,723,591号；第5,773,258号；第5,789,224号；第5,801,155号；第5,804,375号；第5,876,930号；第5,994,056号；第6,030,787号；第6,084,102号；第6,127,155号；第6,171,785号；第6,214,979号；第6,258,569号；第6,814,934号；第6,821,727号；第7,141,377号；和/或第7,445,900号，所有内容特此以全文引用的方式并入本文)。测定通常通过使用具有5’到3’核酸酶活性的核酸聚合酶、能够杂交到靶多核苷酸的引物和能够相对于所述引物杂交到所述靶多核苷酸3’的寡核苷酸探针，对所述靶多核苷酸执行核酸扩增来进行。寡核苷酸探针通常包括可检测标记(例如，荧光报告分子)和能够猝灭所述报告分子的荧光的猝灭剂分子。通常，可检测标记和猝灭剂分子是单探针的一部分。随着扩增进行，聚合酶消化探针以分离可检测标记与猝灭剂分子。在反应期间监测可检测标记(例如，荧光)，其中标记的检测对应于核酸扩增的发生(例如，信号越高，扩增量越大)。测定的变体(例如，LNATM外加测定)在本领域中已广为人知，并且将适用于本文所述的方法中。
除了5'-核酸酶探针，例如测定中使用的探针，各种探针在本领域中已广为人知，并且适用于在所提供的方法中检测扩增的核酸。示例性探针包括但不限于各种茎环分子信标(例如，美国专利号6,103,476和5,925,517以及Tyagi和Kramer，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)14:303-308(1996))，无茎或线性信标(例如，PCT Pub.第WO99/21881号；美国专利第6,485,901号)PNA Molecular BeaconsTM(例如，美国专利号第6,355,421号和第6,593,091号)，线性PNA信标(例如，Kubista等人，SPIE 4264:53-58(2001))，非FRET探针(例如，美国专利第6,150,097号)，探针(美国专利第6,548,250号)，茎环和双链ScorpionsTM探针(Solinas等人，《核酸研究》(NucleicAcids Research)29:E96(2001)和美国专利第6,589,743号)，凸起环探针(美国专利第6,590,091号)，伪结探针(美国专利第6,589,250号)，环状结构(美国专利第6,383,752号)，MGB EclipseTM探针(斯信生物科技(Epoch Biosciences))，发夹探针(美国专利第6,596,490号)，肽核酸(PNA)点亮探针(Svanvik等人，《分析生物化学》(Anal Biochem)281:26-35(2000))，自组装纳米颗粒探针，描述的二茂铁修饰探针，例如，在美国专利第6,485,901号；Mhlanga等，方法25:463-471(2001)；Whitcombe等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnology)17:804-807(1999)；Isacsson等人，《分子细胞探针》(Molecular CellProbes)14:321-328(2000)；Wolffs等人，《生物技术》(Biotechniques)766:769-771(2001)；Tsourkas等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)30:4208-4215(2002)；Riccelli等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)30:4088-4093(2002)；Zhang等人，《生物化学和生物物理学报》(上海)(Acta Biochimica et Biophysica Sinica(Shanghai)。34:329-332(2002)；Maxwell等人，《美国化学会期刊》(J.Am.Chem.Soc.)124:9606-9612(2002)；Broude等人，《生物科技趋势》(Trends Biotechnol)20:249-56(2002)；Huang等人，《化学研究毒理学》(Chem Res.Toxicol.)15:118-126(2002)；和Yu等人，《美国化学会期刊》(J.Am.Chem.Soc.)14:11155-11161(2001)；(Qiagen)，(French等人，《分子细胞探针》(Mol.Cell.)15:363-374(2001))，置换探针(Li等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)30:e5(2002))，混合探针(HybProbes)(Cardullo等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:8790-8794(1988)),MGBAlert(www.nanogen.com)，Q-PNA(Fiandaca等人，《基因组研究》(Genome Res.)11:609-611(2001))，PlexorTM(Promega)，LUXTM引物(Nazarenko等人，《核酸研究》(Nucleic AcidsRes.)30:e37(2002))，DzyNA引物(Todd等人，《临床化学》(Clin.Chem.)46:625-630(2000))。可检测标记的探针还可以包含猝灭可检测标记的荧光的不可检测的猝灭剂部分，包括例如黑洞猝灭剂(生物研究(Biosearch))、Iowa 猝灭剂(IDT)、QSY猝灭剂(Molecular ProbesTM；Thermo Fisher Scientific)以及二甲氨基偶氮苯甲酰(Dabsyl)和Dabcel磺酸酯/甲酸酯猝灭剂(爱博克)。可检测标记的探针还可以包含两个探针，其中例如荧光团在一个探针上，并且猝灭剂在另一个探针上，其中两个探针在靶上杂交在一起猝灭信号，或其中在靶上杂交通过改变荧光改变信号特征。示例性系统还可包括FRET，水杨酸酯/DTPA配体系统(Oser等人，《德国应用化学》(Angew.Chem.Int.Engl.)29(10):1167(1990))、置换杂交、同源探针和/或在欧洲专利第EP070685号和/或美国专利第6,238,927号中所述的测定法。可检测标记还可以包含荧光素染料与SO3而不是羧酸酯基团的磺酸酯衍生物、荧光素的亚磷酰胺形式、Cy5的亚磷酰胺形式(可购自例如Amersham)。以上引用的所有参考文献特此以全文引用的方式并入本文。
如本文所述，一或多个可检测标记和/或猝灭剂可以连接到一或多个引物和/或探针(例如，可检测标记)。可检测标记可以在游离时或在结合到靶核酸中的一个时发射信号。可检测标记还可以在接近另一种可检测标记时发射信号。可检测标记还可以与猝灭剂分子一起使用，以使得信号仅仅在与猝灭剂分子不足够接近时才可检测。举例来说，在一些实施方案中，测定系统可以引起可检测标记从猝灭分子释放。可以使用若干可检测标记中的任一个来标记在本文中所述方法中所用的引物和探针。如本文所述，在一些实施方案中，可检测标记可以连接到可并入到引物中的探针，或可以按其它方式结合到经扩增靶核酸(例如，可检测核酸结合剂，如插入或非插入染料)。当使用一个以上可检测标记时，每一个的光谱特性应该不同，以使得所述标记可以彼此区分，或以使得可检测标记合起来发射任一可检测标记单独不发射的信号。例示性可检测标记包括例如荧光染料或荧光团(例如，可以通过光激发以发射荧光或磷光的化学基团)、能够猝灭荧光供体染料的荧光信号的“受体染料”等。合适的可检测标记物可以包括，例如，荧光素(例如5-羧基-2，7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羟基色胺(5-HAT)；6-JOE；6-羧基荧光素(6-FAM)；FITC；6-羧基-1，4-二氯-2’，7’-二氯荧光素(TET)；6-羧基-1，4-二氯-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素(HEX)；6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)；Alexa 荧光团(例如，350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750)；BODIPYTM荧光团(例如，492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、FI-神经酰胺、R6G SE、TMR、TMR-X缀合物、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE)、香豆素(例如,7-氨基-4-甲基香豆素、AMC、AMCA、AMCA-S、AMCA-X、ABQ、CPM甲基香豆素、香豆素鬼笔环肽、羟基香豆素、CMFDA、甲氧基香豆素)、钙黄绿素、钙黄绿素AM、钙黄绿素蓝、钙染料(例如，钙深红、钙绿、钙橙、钙荧光白)、层叠蓝、层叠黄；CyTM染料(例如，3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)、青色GFP、环状AMP荧光传感剂(FiCRhR)、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(例如,GFP.EGFP)、蓝色荧光蛋白(例如,BFP、EBFP、EBFP2、蓝铜矿、mKalama1)、青色荧光蛋白(例如ECFP、天蓝色、CyPet)、黄色荧光蛋白(例如YFP、柠檬黄、Venus、YPet)、FRET供体/受体对(例如荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/dabcyl、荧光素/荧光素、 FL、荧光素/QSY7和QSY9)、和LysoSensorTM(例如蓝DND-22、蓝白DPX、黄HCK-123、绿DND-26、红DND-99、LysoSensorTM蓝DND-167、LysoSensorTM绿DND-189、LysoSensorTM绿DND-153、LysoSensorTM黄/蓝DND-160、LysoSensorTM黄/蓝10,000MW葡聚糖)、奥勒冈绿(例如488、488-X、500、514)；罗丹明(例如，110、123、B、B 200、BB、BG、B extra、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、5GLD、6-羧基罗丹明6G、丽丝胺、丽丝胺罗丹明B、毒伞素、鬼笔毒环肽，红、Rhod-2、ROX(6-羧基-X-罗丹明)、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、磺酰罗丹明B can C、磺酰罗丹明G Extra、TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)、四甲基罗丹明(TRITC)、WT)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、VIC和其它标记物，其描述于例如美国专利申请公开第2009/0197254号中(通过全文引用并入本文)，及本领域技术人员已知的其他标记物。如本领域技术人员所知，也可以使用其它可检测标记物(参见例如美国专利第2009/0197254号(以全文引用的方式并入本文))。可以使用这些系统和可检测标记以及许多其它系统和可检测标记中的任一个来检测经扩增靶核酸。
如本文中所用，术语“可检测标记”是指指示扩增的各种信号传导分子中的任一个。在一些实施方案中，反应混合物可包括可检测标记，例如绿色和/或其他DNA结合染料。所述可检测标记可以包含或可以是例如核酸插入剂或非插入剂。如本文中所用，插入剂是能够非共价插入到双链核酸分子的堆叠碱基对之间的试剂或部分。非插入剂是不插入到双链核酸分子中的试剂。核酸结合剂可以直接或间接地产生可检测信号。所述信号可以使用例如荧光和/或吸光度直接地可检测，或使用例如可检测地受与双链核酸的接近性影响的任何合适的部分或配体间接地可检测。如本文中所用，插入剂是能够非共价插入到双链核酸分子的堆叠碱基对之间的试剂或部分。非插入剂酸是合适的，例如与核酸结合剂连接的取代标记部分或结合配体。核酸结合剂在结合到双链核酸时通常必需产生可与当相同试剂在溶液中或结合到单链核酸时所产生的信号相区别的可检测信号。举例来说，例如溴化乙锭的插入剂在插入到双链DNA中时发出的荧光比在结合到单链DNA、RNA或在溶液中时更强烈(例如，美国专利第5,994,056号；第6,171,785号；和/或第6,814,934号)。同样，放线菌素D在结合到单链核酸时在紫外/可见光谱的红色部分中发荧光，并且当结合到双链核酸时在紫外/可见光谱的绿色部分中发荧光。并且在另一个实例中，已经报导了光反应性的补骨脂素4-氨甲基-4-5’，8-三甲基补骨脂素(AMT)在插入到双链DNA中之后展现在长波长下的吸收和荧光减少(约翰逊等人《光化学和光生物学》(Photochem.&Photobiol.)，33:785-791(1981)。举例来说，美国专利第4,257,774号描述了荧光插入剂(例如，乙锭盐、道诺霉素(daunomycin)、麦帕克林(mepacrine)和吖啶橙、4’，6-二脒基-α-苯基吲哚)与DNA的直接结合。非插入剂(例如，如本文中所述的小沟结合物，例如赫斯特33258、偏端霉素(distamycin)、纺锤菌素(netropsin))也可以是适用的。例如，Hoechst 33258(Searle等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)18(13):3753-3762(1990))在增加靶量的情况下展现出有所改变的荧光。
其它DNA结合染料对于本领域的技术人员来说是可获得的并且可以单独或与测定系统的其它试剂和/或组分组合使用。示例性DNA结合染料可包括，例如，吖啶(例如，吖啶橙，吖啶黄)，放线菌素D(Jain等人，《分子生物学杂志》(Mol.Biol.)68:21(1972))，安曲霉素，BOBOTM-1，BOBOTM-3，BO-PROTM-1，色霉素，DAPI(Kapuseinski等人，《酸类研究》(Nucl.Acids Res.)6(112):3519(1979))，道诺霉素，偏端霉素(例如，偏端霉素D)，美国专利第7,387,887号中描述的染料、玫瑰树碱、乙啡锭盐(例如，溴化乙锭)、氟香豆素、荧光嵌入剂，如美国专利第4,257,774号中所述，(Lonza)，Hoechst 33258(Searle和Embrey，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)18:3753-3762(1990))，Hoechst 33342，溴化乙锭，JO-PROTM-1，LIZ染料，LO-PROTM-1，米帕林，光神霉素，NED染料，纺缍菌素，4’，6-二脒基-α苯基吲哚，原黄素，PO-POTM-1，POPOTM-3，PO-PROTM-1，碘化丙锭，钌多吡啶基，S5，Gold， Green I(美国专利第5,436,134号和第5,658,751号)， GreenII， blue， green，Blue，TO- 噻唑橙(Sigma-Aldrich Chemical Co.)，TOTOTM-3，YO--1和-3(分子探针；赛默飞费舍尔科技)等。举例来说， Green I(参看例如美国专利第5,436,134号；第5,658,751号；和/或第6,569,927号)已经用于监测PCR反应。如本领域技术人员所知，其它DNA结合染料也可以是合适的。
适用于本文中提供的方法、组合物和试剂盒中的酶还可以包括具有逆转录酶活性的任何酶。所述酶包括(但不限于)逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、B型肝炎逆转录酶、花椰菜花叶病毒逆转录酶、细菌逆转录酶、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(佐伯(Saiki)等人,《科学》(Science)239:487-491(1988)；美国专利第4,889,818号和第4,965,188号)、Tne DN A聚合酶(WO 96/10640)、Tma DNA聚合酶(美国专利第5,374,553号)以及其突变体、片段、变异体或衍生物(参看例如美国专利第5,948,614号和第6,015,668号，以全文引用的方式并入本文)。如本领域普通技术人员所知，经修饰的逆转录酶和具有逆转录酶活性的DNA聚合酶可以通过本领域中众所周知的重组或基因工程技术获得。突变体逆转录酶或聚合酶可以通过例如定点或随机诱变使编码相关逆转录酶或聚合酶的基因突变来获得。所述突变可以包括点突变、缺失突变和插入突变。在一些实施方案中，使用一或多个点突变(例如，用一或多个不同氨基酸取代一或多个氨基酸)来构造适用于本发明的突变体逆转录酶或聚合酶。逆转录酶或聚合酶的片段还可以通过本领域中众所周知的的重组技术通过缺失突变，或使用多种众所周知的蛋白水解酶中的任一种，通过相关逆转录酶或聚合酶的酶消化来获得。
适用于本文提供方法的具有逆转录酶活性的例示性多肽包括Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶、Rous肉瘤病毒(RSV)逆转录酶、AMV逆转录酶、劳斯相关病毒(RousAssociated Virus；RAV)逆转录酶、成髓细胞瘤相关病毒(Myeloblastosis AssociatedVirus；MAV)逆转录酶和人类免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶和在WO 98/47921中所述的其它多肽以及其衍生物、变异体、片段或突变体及其组合。在其他实施方案中，逆转录酶的RNA酶H活性降低或实质上降低，并且可以选自由以下组成的群组：M-MLV H逆转录酶、RSV H逆转录酶、AMV H逆转录酶、RAV H逆转录酶、MAV H逆转录酶和HIV H逆转录酶以及其衍生物、变异体、片段或突变体及其组合。尤其受关注的逆转录酶包括AMV RT和M-MLV RT，并且可任选RNA酶H活性降低或实质上降低的AMV RT和M-MLV RT(例如，AMV RTαH-/BH+和M-MLV RTH-)。适用于本发明中的逆转录酶包括可购自生命技术公司的SuperScriptTM、SuperScriptTMII、ThermoScriptTM和ThermoScriptTM II，可从InvitrogenTM(Thermo FisherScientific)得到。主要参见WO 98/47921、美国专利第5,244,797号和第5,668,005号，内容通过全文引用并入本文。
适用于本文中提供的方法中的具有逆转录酶活性的多肽可以从InvitrogenTM(Thermo Fisher Scientific)、法玛西亚(新泽西州皮斯卡塔韦)、西格玛(密苏里州圣路易斯)或宝灵曼生物化学品(Boehringer Mannheim Biochemicals)(印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,Ind.))购得。或者，具有逆转录酶活性的多肽可以通过本领域普通技术人员所熟知的用于分离和纯化天然蛋白质的标准程序从其天然病毒或细菌来源中分离(参见霍茨(Houts)等人，《病毒学杂志》(J.Virol.)29:517(1979))。另外，具有逆转录酶活性的多肽可以通过本领域普通技术人员所熟悉的重组DNA技术来制备(参看例如科托维奇(Kotewicz)等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)16:265(1988)；Soltis和Skalka，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)USA 85:3372-3376(1988))。
可用于所发明核酸扩增反应中的核酸聚合酶可以是对所进行反应起作用的任何核酸聚合酶，包括原核生物的、真菌的、病毒的、噬菌体、植物和/或真核生物的核酸聚合酶。本文中所用的术语——“DNA聚合酶”是指使用核酸链作为模板从头合成DNA链的酶。DNA聚合酶使用现存DNA或RNA作为DNA合成模板，并且沿着其所读取的模板链催化脱氧核糖核苷酸的聚合。新合成的DNA链与模板链互补。DNA聚合酶可以向新形成链的3’-羟基端仅添加游离核苷酸。其通过将核苷单磷酸从脱氧核苷三磷酸(dNTP)转移到正在生长的寡核苷酸链的3’-羟基来合成寡核苷酸。这促使新链沿着5’到3’的方向延长。因为DNA聚合酶可以仅添加核苷酸到预先存在的3’-OH基团上，所以为了开始DNA合成反应，DNA聚合酶需要可以向其添加第一核苷酸的引物。合适的引物可以包含RNA或DNA的寡核苷酸或其嵌合体(例如，RNA/DNA嵌合引物)。DNA聚合酶可以是天然存在的DNA聚合酶或具有以上提及的活性的天然酶的变异体。举例来说，其可以包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5’到3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶、具有逆转录酶活性的DNA聚合酶或具有核酸内切酶活性的DNA聚合酶。
根据本发明内容使用的聚合酶可以是可以通常沿着5’到3’的方向从核酸模板合成核酸分子的任何酶。合适的核酸聚合酶还可以包含全酶、全酶的功能性部分、嵌合聚合酶或可以实现核酸分子的合成的任何经修饰聚合酶。在本发明内，DNA聚合酶还可以包括聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒酶和/或多核苷酸磷酸化酶。
本文中所公开的方法中所用的核酸聚合酶可以是嗜温性或嗜热性的。例示性嗜温性DNA聚合酶包括T7DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、克列诺(Klenow)片段DNA聚合酶、DNA聚合酶III等。聚合酶的非限制性实例可以包括T7DNA聚合酶、真核生物的线粒体DNA聚合酶γ、原核生物的DNA聚合酶I、II、III、IV和/或V；真核生物聚合酶α、β、γ、δ、ε、η、ζ、ι和/或κ；大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I；大肠杆菌DNA聚合酶IIIα和/或ε亚单位；大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V；水生栖热菌(T.aquaticus)DNA聚合酶I；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)DNA聚合酶I；广古菌(Euryarchaeota)聚合酶；末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)；酿酒酵母(S.cerevisiae)聚合酶4；跨损伤合成聚合酶；逆转录酶；和/或端粒酶。可以使用的合适的热稳定DNA聚合酶的非限制性实例包括(但不限于)嗜热栖热菌(Thermus thermophilus；Tth)DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermus aquaticus；Taq)DNA聚合酶、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neopolitana；Tne)DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima；Tma)DNA聚合酶、海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis；Tli或VENTTM)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus；Pfu)DNA聚合酶、DEEPVENTTM DNA聚合酶、沃斯火球菌(Pyrococcus woosii；Pwo)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillussterothermophilus；Bst)DNA聚合酶、嗜钙芽孢杆菌(Bacillus caldophilus；Bca)DNA聚合酶、嗜酸热硫化叶菌(Sulfobus acidocaldarius；Sac)DNA聚合酶、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum；Tac)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus；Tfl/Tub)DNA聚合酶、红色栖热菌(Thermus ruber；Tru)DNA聚合酶、布氏栖热菌(Thermus brockianus；DYNAZYMETM)DNA聚合酶、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum；Mth)DNA聚合酶、分枝杆菌(mycobacterium)DNA聚合酶(Mtb、Mlep)以及其突变体和变异体和衍生物(美国专利第5,436,149号；美国专利第4,889,818号；美国专利第4,965,188号；美国专利第5,079,352号；美国专利第5,614,365号；美国专利第5,374,553号；美国专利第5,270,179号；美国专利第5,047,342号；美国专利第5,512,462号；第WO 92/06188号；第WO92/06200号；第WO 96/10640号；Barnes，基因112:29-35(1992)；Lawyer等人，《PCR应用方法》(PCR Meth.Appl.)2:275-287(1993)；Flaman等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)22(15):3259-3260(1994))。根据本发明内容还可以使用RNA聚合酶，例如T3、T5和SP6以及其突变体、变异体和衍生物。一般来讲，可以根据本发明使用任何I型DNA聚合酶，尽管可以使用其它DNA聚合酶，包括(但不限于)III型或家族A、B、C等DNA聚合酶。另外，根据本发明内容可以使用任何经基因工程改造的DNA聚合酶、具有降低的或不显著的3’到5’核酸外切酶活性的任何DNA聚合酶(例如，SuperScriptTM DNA聚合酶)和/或经基因工程改造的DNA聚合酶(例如，具有活性位点突变F667Y或F667Y的等效物(例如，在Tth中)的那些、AmpliTaqTM FS、ThermoSequenaseTM)、AmpliTaqTM Gold、PlatinumTM Taq DNA聚合酶、Therminator I、Therminator II、Therminator III、Therminator Gamma(马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室(New England Biolabs，Beverly，MA))和/或其任何衍生物和片段。实质上缺乏3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的实例包括(但不限于)Taq、Tne(exo-)、Tma(exo-)、Pfu(exo-)、Pwo(exo-)和Tth DNA聚合酶以及其突变体、变异体和衍生物。如本领域技术人员所知，其它核酸聚合酶也可适用。
适用于本文所公开的方法中的DNA聚合酶可以从InvitrogenTM(Thermo FisherScientific)、法玛西亚(Pharmacia)(新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJ))、西格玛(Sigma)(密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))、宝灵曼(Boehringer Mannheim)和NewEngland Biolabs(Beverly，MA)购得。
可以使用检测荧光团的荧光变化的任何试剂或仪器来检测信号。举例来说，可以使用任何分光光度热循环仪执行检测。分光光度热循环仪的实例包括(但不限于)应用生物系统(AB)PRISMTM 7000、AB 7300实时PCR系统、AB 7500实时PCR系统、AB PRISMTM7900HT、拜耳雷德(Bio-Rad)ICycler IQTM、西菲义德(Cepheid) II、科贝特研究(Corbett Research)Rotor-Gene 3000、爱达荷技术(Idaho Technologies)R.A.P.I.D.TM、MJ研究Chromo 4TM、罗氏应用科学(Roche Applied Science)罗氏应用科学斯塔津(Stratagene)Mx3000PTM以及斯塔津Mx4000TM。应注意，新仪器的开发速度很快，并且任何类似仪器都可以用于所述方法。
还提供了包含扩增和/或提取对照核酸和/或细胞组合物的试剂盒以及用于实施本文所述方法的试剂盒。本文所用的术语——“试剂盒”是指一组包装好的相关组分，通常是一或多种化合物或组合物。该试剂盒可包含至少一种扩增对照核酸组合物，还可包含一对寡核苷酸，用于聚合和/或扩增来自对照核酸的至少一种靶序列、一种或多种清洁剂、核酸聚合酶和/或用可检测标记标记的相应的一种或多种探针。该试剂盒可以包含至少一种提取对照核酸组合物和/或含有至少一种提取对照核酸分子的细胞，例如质粒形式，并且还可以包含一对寡核苷酸，用于聚合和/或扩增来自对照核酸分子的至少一种靶序列、一种或多种清洁剂、核酸聚合酶和/或相应的一种或多种标记有可检测标记的探针。该试剂盒还可包括含有用于对照反应的其他预定靶核酸的样品。试剂盒还可以包括一对寡核苷酸，用于聚合和/或扩增来自生物样品的至少一种靶核酸。所述试剂盒还可以选择包括储备溶液、缓冲液、酶、可检测标记或检测所需试剂、管子、膜以及可以用于完成扩增反应的类似物。在一些实施例中，包括多个引物组。在一个实施例中，所述试剂盒可以包括以下中的一或多个：例如缓冲液(例如，Tris)、一或多种盐(例如，KCl)、甘油、dNTP(dA、dT、dG、dC、dU)、重组BSA(牛血清白蛋白)、染料(例如，ROX被动参比染料)、一或多种清洁剂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和/或明胶(例如，鱼或牛源)和/或消泡剂。本领域的技术人员应了解，还涵盖特定系统和试剂盒的其它实施例。
虽然已经就这些示例性实施方案描述了本发明，但是所属领域的技术人员容易理解，这些示例性实施例的许多变化和修改无需过度实验即可实现。所有此类变化和修改均在本说明范围内。可以根据以下实例进一步理解本说明的各个方面，所述实例不应解释为以任何方式限制本说明的范围。
实例
设计TaqManTM测定法组以检测和/或分析阴道和泌尿生殖器样品的微生物群。设计一组此类测定以区分34种不同的微生物，其包括与阴道和泌尿生殖区相关的共生和致病微生物。该组合包括检测表1中列出的细菌、真菌、原生动物和病毒的测定。为了使那些使用该测定组合的人能够更好地对照工作流程中的主要步骤，设计和开发了用于样品制备的提取对照组合物和用于PCR的扩增对照核酸。
实施例1-核酸扩增对照
对于扩增对照核酸分子，设计DNA序列并合成相应的DNA分子以包括所述靶扩增子及其侧翼区域的一部分，用于上述组合中的微生物特异性测定，以及几种对照模板，包括100-200种核苷酸的异种序列和来自人RNase P基因序列的片段。下游线性化的独特限制性位点也被设计到DNA序列中，该DNA序列包含多个靶扩增子及其相应的5’-和3’-侧翼序列中的每一个的一部分。将合成的DNA分子克隆到细菌质粒载体(来自Invitrogen的pMK)中以产生多靶质粒或超级质粒。在该实施例中，超级质粒被设计为包含表3中列出的34种测定组合的靶序列。在将超级质粒转化到大肠杆菌中并随后进行质粒DNA提取后，通过限制酶消化将质粒在独特的限制性位点线性化，并定量质粒制备物。将线性化对照质粒制备物标准化至终浓度为1×105拷贝/微升。
使用预先点样的TaqMan TM OpenArray TM板(Applied Biosystems)与表3中列出的34种不同TaqMan TM测定法的组合比较线性化对照质粒制备物的扩增。每个测定法包括一对扩增引物和具有可检测标记的寡核苷酸TaqManTM探针。TaqManTM扩增引物和探针被设计为针对每种测定法所列出的相应基因具有靶特异性，如表3所示。根据制造商的说明(应用生物系统)，扩增反应在QuantStudioTM 12K Flex实时PCR系统上运行和分析。
在扩增之前，将扩增对照质粒制备物连续稀释6个对数，从每微升102拷贝至每微升107拷贝。对于每个子阵列，根据制造商的说明，通过向2.5微升TaQManTM OpenArray实时PCR主混合物(Thermo Fisher)中添加2.5微升稀释对照质粒制剂来制备PCR反应。使用OpenArray Accufill系统将PCR反应混合物与不同浓度的对照核酸样品加载到OpenArrayTM平板上，并按照制造商的说明在QuantStudioTM 12KFlex系统(Thermo Fisher)上运行。在另一个实例中，扩增对照质粒制备物也连续稀释7个对数，从每微升5×107拷贝到每微升50拷贝，并按所述进行PCR反应。
所有检测的测定法显示检测限(LOD)降至约50–100拷贝，R2的6–7对数线性大于0.99。图1描绘了使用不同浓度的线性化对照DNA质粒样品进行检测的34种测定法之一的数据(P.bivia测定法)。图2描绘了使用线性化对照DNA质粒样品在不同浓度下检测的34种测定法中系列稀释数据。还使用34种测定组合通过将核酸样品一式四份加载到384孔板上来评估线性化对照质粒的扩增。使用线性化对照质粒在OpenArray(图1和图2)和384孔板格式(数据未显示)上检测了每种不同的测定法，从而获得了良好的PCR效率和再现性。
使用超螺旋对照质粒的反应也与使用线性化对照质粒的反应进行比较。如上所述，提取并制备超级质粒DNA(包含针对表3中列出的34种测定法组合的对照核酸分子)。然后，将质粒制剂分成两部分，其中一部分如上所述通过酶消化线性化，而另一部分使用缓冲液和无消化酶模拟消化。线性化和非线性化(超螺旋)超级质粒都被连续稀释到2×102-2×106拷贝/μl，如上所述，对TaQManTM OpenArray平板上使用的34种测定法组合进行两种样品的PCR反应。线性化(图3B)对照质粒的扩增导致与超螺旋(非线性化)对照质粒相比，具有较低Ct值的扩增反应和增加的复制精度(图3A)。在较低的DNA浓度下尤其明显。当在相同浓度下比较时，线性化质粒样品与非线性化质粒样品之间的平均差异为2.5至3Ct。
实施例2——核酸提取对照
对于提取对照，将如上所述合成用于扩增对照的相同对照核酸分子克隆到酵母穿梭载体(来自Invitrogen的pYES2_CT_A307)中，并用得到的含有对照核酸插入物的穿梭载体转化酵母感受态细胞。使转化的酵母细胞生长、灭活、计数并冻干至1×106个细胞/颗粒。根据制造商的说明书(Applied Biosystems and Thermo Scientific，赛默飞费舍尔科技)，使用改良的MagMaxTM DNA Multi-Sample Ultra试剂和KingFisherTM Flex纯化仪器，对用对照核酸分子转化的重组酵母细胞进行核酸提取，不同之处在于提取前还包括使用蛋白酶K的额外细胞裂解步骤。从酵母细胞中提取的核酸经过数字PCR(dPCR)和定量PCR(qPCR)筛选，用表3中列出的TaqManTM测定法评估提取对照超级质粒DNA的回收率。
对于qPCR，将2.5升洗脱的提取对照DNA与2.5升TaQManTMOpenArrayTM实时PCR主混合物混合，然后添加到每个子阵列中，在每个子阵列中发现所有测定法。对于dPCR，基于qPCR的Ct值稀释洗脱的提取对照DNA，以达到200-2000拷贝/μl的最佳最终浓度范围。使用基于FAM的靶特异性测定法和基于VIC的RNaseP或Xeno测定运行双重dPCR。将1ul样品加入到含有主混合物和测定物的16μl dPCR反应中。将dPCR混合物加载到dPCR芯片上，然后进行热循环。热循环后，在QuantStudio 3D数字PCR系统上读取DNA芯片。qPCR测定法Ct值和由dPCR测定的质粒拷贝数都表明，用包含超级质粒的提取对照获得了良好的质粒回收率和再现性(图4)。
序列表
<110>生命科技公司
PAGANI, Ioanna
ZERINGER, Emily
LI, Kelly
HUANG, Boli
<120>核酸提取和扩增对照及方法
其用途
<130> LT01188PCT
<140> 未分配
<141> 2017 年 08 月 25 日
<150> US 62/380,253
<151> 2016 年 08 月 26 日
<150> US 62/380,291
<151> 2016 年 08 月 26 日
<160> 34
<170> 专利版本 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 1
gagcgtgtaa ctgttaaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 2
tttgcataat gaatctga 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 3
aagtgtgatg tttaaatc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 4
gacaagaatg cctctgtc 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 5
gcctgttgaa atcgcaat 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 6
agcgattgaa atttatcc 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 7
ggtgaccttc atcgtgct 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 8
taggctatca attaaatg 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 9
agttgctatc ggttatcg 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 10
agttgctatc ggttatcg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 11
aggtttttta tcatcctt 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 12
gttatatgtt atttgttg 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 13
ggcgtaaagg gcgcgcag 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 14
acgggacgaa cggcaagg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 15
acatctgttc caaaatct 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 16
acttgttggg gatactta 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 17
acttccattc caaatctt 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 18
tgaattcttt gttagaaa 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 19
gaagtaaaac tgtattac 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 20
ggcaacggtg gcttagtg 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 21
gtataaacga gacacact 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 22
gaaacagata cgacgtgg 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 23
gtgaactccg tattgaag 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 24
tttgatgatc ctgacata 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 25
gtggagtttt aactcatt 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 26
aaactgatgg cgattatg 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 27
ccaccacaac ttcagatt 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 28
ttcagggacg cttggcgg 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 29
gtcgaactga tggtggcc 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 30
agatggaaca ccaacact 18
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 31
gtgatacatg gtaagaaa 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 32
gctgctgaat cagtcgaa 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 33
acaggaggtc agtgtctg 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
< 220
<223> 合成的 DNA
<400> 34
cgggatagcg tcttgttg 18
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种扩增多种核酸靶序列的方法，包括：
将对照核酸分子和试验核酸样品分配到多个反应体积中，其中对照核酸分子包括多种不同的靶序列，而试验核酸样品包括一个或多个试验核酸分子；
将反应体积置于核酸扩增条件下，并使用成对扩增引物扩增反应体积中对照核酸分子的至少两种不同的靶序列，每对扩增引物用于扩增对照核酸分子中的不同靶序列；
检测反应体积中至少存在两种不同的扩增靶序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照核酸分子是圆形的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述对照核酸分子是线性的。
4.根据权利要求91所述的方法，还包括将所述对照核酸分子和试验核酸分子从所述试验核酸样品分配到不同的反应体积。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述试验核酸样品还包括两种或多种不同的靶核酸分子，每种靶核酸分子包含不同的靶序列。
6.根据权利要求95所述的方法，还包括使用成对扩增引物扩增反应体积中试验核酸样品的至少两种不同靶序列，每对扩增引物用于扩增靶核酸样品中的不同靶序列。
7.权利要求1-6中任一项的方法，还包括：提供两个不同的含有细胞的细胞样品，第一个细胞样品包括对照核酸分子，第二个样品包括试验核酸分子，试验核酸分子包括与对照核酸分子的靶序列互补或相同的靶序列。
8.权利要求7所述的方法，还包括从第一个细胞样品中提取对照核酸分子并从第二个样品中提取试验核酸分子。
9.根据权利要求91所述的方法，其中至少两种不同的靶序列包含选自SEQ ID NO：1-34的序列。
10.一种用于确认核酸提取过程功效的方法，包括:
使用所述核酸提取程序从用对照核酸分子转化的酵母细胞制剂中提取核酸样品，其中所述对照核酸分子包含多种不同的靶序列；并
对从酵母细胞提取的核酸样品进行PCR，以使用所述程序确认有效提取对照核酸分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该方法还包括在提取之前用对照核酸分子转化酵母细胞的步骤。
12.一种确认从对照样品中提取核酸的方法，包括：
从对照样品中提取核酸样品，其中对照样品包含用对照核酸分子转化的酵母细胞，所述对照核酸分子包含多种不同的靶序列；
对对照样品提取的核酸样品进行PCR检测；
确定从对照样品提取的核酸样品中是否存在多种不同靶序列中的至少一种，以确认核酸提取。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括确认从试验样品中提取核酸，包括：
从试验样品中提取核酸样品；
对从试验样品中提取的核酸样品进行PCR；以及
确定在对照样品中检测的多种不同靶序列中的至少一种是否存在于从试验样品中提取的核酸样品中以确认核酸提取。
14.根据权利要求12所述的方法，所述对照核酸分子是DNA分子。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述对照核酸分子包含至少2种不同的靶序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少2种不同的靶序列衍生自表1中列出的微生物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少2种不同的靶序列各自包括表2中列出的不同序列或其互补序列。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述对照核酸分子包含至少25种不同的靶序列。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述多种不同的靶序列各自衍生自表1中列出的微生物。
20.根据权利要求12所述的方法，其中所述多种不同的靶序列各自包括表2中列出的不同序列或其互补序列。
21.根据权利要求12所述的方法，所述多种不同的靶序列各自衍生自表3中列出的微生物基因。
22.根据权利要求13所述的方法，其中所述PCR是使用至少两个不同的引物组对来自所述对照样品的提取核酸样品和/或来自所述试验样品的提取核酸样品进行的，每个引物组针对所述对照核酸分子的不同靶序列。
23.根据权利要求13所述的方法，其中所述PCR是使用多个不同的引物组对来自所述对照样品的提取核酸样品和/或来自所述试验样品的提取核酸样品进行的，每个所述引物组针对所述对照核酸分子的不同靶序列，每个所述引物组用于单独和个体的反应。
24.根据权利要求12所述的方法，所述PCR为数字PCR或定量PCR。
25.根据权利要求12所述的方法，其中所述对照核酸分子包含多种靶序列及其相应基因组侧翼序列的一部分。
26.根据权利要求25所述的方法，其中相应基因组侧翼序列的部分长度在10至500个碱基之间。
27.根据权利要求25所述的方法，其中相应侧翼序列的部分长度为至少10个碱基。
28.根据权利要求25所述的方法，其中相应的基因组侧翼序列来自多种靶序列中每一个的3’-、5’或3’和5’侧翼区域。
29.根据权利要求12所述的方法，其中所述对照核酸分子还包括独特的限制性位点。
30.根据权利要求29所述的方法，其中在进行PCR之前，通过在独特的限制性位点酶消化将对照核酸线性化。

Claims (152)

1.一种在含有对照核酸分子的样品中扩增多种核酸靶序列的方法，该方法包括：
并行进行多个扩增反应，所述多个扩增反应中的每一个包括样品的一部分和一对扩增引物，所述一对扩增引物被配置为扩增对照核酸分子中的相应靶序列，其中所述对照核酸分子包含多种不同的靶序列；
在对照核酸分子中形成对应于至少两种不同靶序列的多个不同扩增产物；以及
确定扩增反应中至少存在两种不同的扩增产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照核酸分子含有至少十种不同的靶序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述对照核酸分子含有至少20种不同的靶序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述对照核酸分子含有至少30种不同的靶序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照核酸分子含有约20至约50种不同的靶序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种不同的靶序列衍生自不同微生物的基因组或转录组序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中至少两种不同的靶序列包括选自表2中列出的序列组或其互补序列的序列。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种不同的靶序列是衍生自选自表3的任何数量的微生物基因。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述形成包括形成与含表2中列出的来自序列组所选序列互补或相同的核酸序列的一种或多种扩增产物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述形成包括为表2中列出的每个序列形成单独的扩增产物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述形成包括并行形成5至100种不同的扩增产物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述形成包括并行形成以平行的10至50种不同的扩增产物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中至少一对所述扩增引物配置产生扩增相应靶序列，包括含有与所述相应靶核酸序列的一部分互补或相同的核酸序列的引物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个扩增反应中的至少两个各自包含被配置为扩增不同的相应靶序列的一对扩增引物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个扩增反应中的每个扩增反应包含扩增引物，所述扩增引物被配置为扩增包含选自表2中列出的序列组或其互补序列的序列。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个扩增反应中的一个或多个还含有可检测标记的探针，其包括与所述相应靶序列的一部分相同或互补的序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中至少一种扩增反应的所述可检测标记的探针被配置为在5’核酸酶测定法中通过聚合酶进行裂解。
18.根据权利要求16所述的方法，其中至少一种扩增反应的所述可检测标记的探针在其5’末端含有荧光标记，在其3’末端含有猝灭剂。
19.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述可检测标记的探针还含有小沟结合物(MGB)部分。
20.根据权利要求1至19权利要求的任何一项所述的方法，其中至少一个所述扩增反应在载体内或载体上存在的单独的反应位点发生，所述载体含有一个或多个单独的反应位点。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述载体选自多孔板、微流体卡和包含多个通孔反应位点的板。
22.权利要求20或21的方法，其中单个反应位点包括一个或多个扩增引物，并且扩增还包括将一部分样品分配到各个反应位点。
23.根据权利要求21所述的方法，其中在将所述部分样品分配到各个反应位点之前，所述单个反应位点包括含有一对扩增引物和核酸探针的溶液的干燥沉积物，其中所述引物和探针两者都被配置为扩增靶序列，所述靶序列包括选自表2中列出的序列组或其互补序列的序列。
24.如权利要求23所述的方法，其中，在样品的一部分被分配到反应位点之前或之后，单独的反应位点还包括聚合酶和核苷酸。
25.权利要求1的方法，其中对照核酸分子是DNA质粒。
26.权利要求25的方法，其中DNA质粒是线性的。
27.如权利要求1所述的方法，还包括在进行扩增反应之前从细胞制备含有对照核酸分子的样品。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述细胞是微生物细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述酵母细胞是冻干的。
31.一种在含有对照核酸分子的样品中扩增多种核酸靶序列的方法，该方法包括：
将样品分配到多个反应体积中，其中对照核酸分子含有多个不同的靶序列，并且其中反应体积包括至少两对不同的扩增引物，其配置成扩增对照核酸中分子的相应靶序列；
在反应体积中进行扩增反应，并形成对应于对照核酸分子中至少两种不同靶序列的多种不同扩增产物；并
确定扩增反应中至少存在两种不同的扩增产物。
32.一种评估多种扩增反应的方法，包括：
将核酸样品的一部分分配到位于载体内或载体上的各个反应室中，其中所述核酸样品包含对照核酸分子，并且其中所述对照核酸分子包含多个不同的靶序列；
进行多个平行扩增反应并形成多个不同的靶扩增产物，其对应于各个反应室中对照核酸分子中的至少两种不同靶序列，
其中每个扩增反应含有一对扩增引物，其配置成扩增对照核酸分子中存在的相应靶序列，至少两个扩增反应含有扩增引物，其配置成扩增对照核酸分子中存在的不同相应靶序列；并
量化在至少两个单独反应室中形成的至少两种不同的靶扩增产物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法使用一组样品进行，所述样品是对照核酸分子的连续稀释液。
34.根据权利要求33所述的方法，还包括基于来自连续稀释的对照核酸分子的定量靶扩增产物，确定至少一种对照核酸分子靶序列的检测极限。
35.根据权利要求33所述的方法，还包括基于序列稀释的对照核酸分子的量化靶扩增产物，确定对照核酸分子靶序列中的至少一种的动态范围。
36.根据权利要求32所述的方法，其中定量包括任选地实时检测可检测标记的探针与所述扩增产物的杂交。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述对照核酸分子含有至少十种不同的靶序列。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述对照核酸分子含有至少20种不同的靶序列。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述对照核酸分子含有至少30种不同的靶序列。
40.根据权利要求32所述的方法，其中所述对照核酸分子含有约20至约50种不同的靶序列。
41.根据权利要求32所述的方法，其中多种靶序列衍生自不同微生物的基因组序列。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述不同靶序列中的至少两种包括选自表2中列出的序列组或其互补序列的序列。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述不同靶序列中的每一种含有选自表2中列出的序列组或其互补序列的序列。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述形成包括在各个反应室中形成两种或更多种靶扩增产物，每种扩增产物含有与选自表2中列出的序列组的互补或相同的核酸序列。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述形成包括在各个反应室中为表2中列出的每个序列形成靶扩增产物。
46.根据权利要求32所述的方法，其中所述形成包括形成5至100种不同的扩增产物。
47.根据权利要求46的方法，其中形成包括形成10-50种不同的扩增产物。
48.根据权利要求32所述的方法，其中所述多个所述扩增反应中的一个或多个还含有可检测标记的探针，其包括与所述相应靶序列的一部分相同或互补的序列。
49.根据权利要求48所述的方法，其中至少一种扩增反应的所述可检测标记的探针被配置为在5’核酸酶测定法中通过聚合酶进行裂解。
50.根据权利要求48所述的方法，其中至少一种扩增反应的所述可检测标记的探针在其5’末端含有荧光标记，在其3’末端含有猝灭剂。
51.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述可检测标记的探针还含有小沟结合物(MGB)部分。
52.根据权利要求32-50中任一项的方法，其中载体选自多孔板、微流体卡和包括多个通孔反应室的板。
53.根据权利要求52所述的方法，其中在分配之前，各个反应室包括含有一对扩增引物和核酸探针的溶液的干燥沉积物，其中所述引物和探针都配置成扩增靶序列，包括选自表2中列出的序列组或其互补序列的序列。
54.根据权利要求53所述的方法，在样品的一部分分配到反应室之前或之后，其中各个反应室还包括聚合酶和核苷酸。
55.根据权利要求32所述的方法，其中所述对照核酸分子是DNA质粒。
56.根据权利要求55所述的方法，其中DNA质粒是线性的。
57.根据权利要求32所述的方法，还包括在将所述核酸样品的部分分配到各个反应室之前，从细胞中提取所述对照核酸分子以形成所述核酸样品。
58.根据权利要求57的方法，其中细胞是微生物细胞。
59.根据权利要求58的方法，其中细胞是酵母细胞。
60.根据权利要求59的方法，其中酵母细胞是冻干的。
61.包含多种不同扩增靶序列的核酸构建体，其中至少两个扩增靶序列包括选自表2中列出的序列组或其互补序列的序列。
62.包含多种不同扩增靶序列的核酸构建体，其中至少两种扩增靶序列包含选自表3的基因的至少20个核苷酸部分或其相应的cDNA。
63.包含多种不同扩增靶序列的核酸构建体，其中至少两种扩增靶序列衍生自选自表3的至少两种不同的微生物或微生物基因。
64.权利要求61-63中任一项的核酸构建体，其含有至少20种不同的靶序列。
65.权利要求61-63中任一项的核酸构建体，含有约20至约50种不同的靶序列。
66.权利要求61-63中任一项的核酸构建体，其中构建体是质粒。
67.权利要求66中任一项的核酸构建体，其中质粒是线性的。
68.权利要求61-63中任一项的核酸构建体，其中构建体是酵母穿梭载体。
69.一种细胞，其包含权利要求61-63中任一项的核酸构建体。
70.权利要求69的细胞，其中细胞是微生物细胞。
71.权利要求70的细胞，其中微生物细胞是酵母细胞。
72.权利要求71的细胞，其中酵母细胞是冻干的。
73.一种用于核酸扩增的阵列，包括：
载体，其包含位于载体内或载体上的多个反应位点；
多个反应位点中的每一个包含：
(i)含有多种不同靶序列的对照核酸分子，
(ii)扩增引物对，配置为扩增相应的靶序列，及
(iii)可检测标记的探针，其配置成与通过延伸该对的至少一个扩增引物产生的核酸序列杂交。
74.根据权利要求73所述的阵列，其中所述不同靶序列中的至少两种包括选自表2中列出的序列组或其互补序列的序列。
75.根据权利要求73所述的阵列，其中至少两种不同的靶序列包含选自表3的基因或其相应cDNA的至少20个核苷酸部分。
76.根据权利要求73所述的阵列，其中每个反应位点含有一对扩增引物和配置成扩增序列的探针，所述序列包括选自表2中列出的序列组或其互补序列的序列。
77.根据权利要求73所述的阵列，其中所述对照核酸分子含有至少十种不同的靶序列。
78.根据权利要求77所述的阵列，其中所述对照核酸分子含有至少20种不同的靶序列。
79.根据权利要求78所述的阵列，其中所述对照核酸分子含有至少30种不同的靶序列。
80.根据权利要求79所述的阵列，其中所述对照核酸分子含有约20至约50种不同的靶序列。
81.根据权利要求73所述的阵列，其中对照核酸分子是质粒。
82.根据权利要求81所述的阵列，其中质粒是线性的。
83.根据权利要求73所述的阵列，其中至少一个反应位点包括扩增产物。
84.根据权利要求73所述的阵列，其中所述载体包括10-10,000个含有不同扩增产物的反应位点。
85.根据权利要求73所述的阵列，其中所述反应位点中的至少两个各自包含被配置为扩增不同的相应靶序列的一对扩增引物。
86.根据权利要求73所述的阵列，其中至少一个所述反应位点的所述可检测标记的探针被配置为在5’核酸酶测定法中通过聚合酶进行裂解。
87.根据权利要求73所述的阵列，其中至少一个所述反应位点的所述可检测标记的探针在其5’末端含有荧光标记，在其3’末端含有猝灭剂。
88.根据权利要求73所述的阵列，其中所述可检测标记的探针还含有小沟结合部分。
89.根据权利要求73所述的阵列，其中所述载体选自多孔板、微流体卡和包含多个通孔反应位点的板。
90.根据权利要求73所述的阵列，其中所述多个反应位点还包括聚合酶和核苷酸。
91.一种扩增多种核酸靶序列的方法，包括：
将对照核酸分子和试验核酸样品分配到多个反应体积中，其中对照核酸分子包括多种不同的靶序列，并且试验核酸样品包括一个或多个试验核酸分子；
将反应体积置于核酸扩增条件下，并使用扩增引物对扩增反应体积中对照核酸分子的至少两种不同靶序列，每对扩增引物用于扩增对照核酸中的不同靶序列酸分子；
检测反应体积中至少两种不同的扩增靶序列的存在。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述对照核酸分子是环状的。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述对照核酸分子是线性的。
94.根据权利要求91所述的方法，还包括将来自试验核酸样品的对照核酸分子和试验核酸分子分配到不同的反应体积。
95.根据权利要求91所述的方法，其中所述试验核酸样品也包括两种或更多种不同的靶核酸分子，每个包含一种不同的靶序列。
96.权利要求95的方法，还包括使用成对的扩增引物扩增反应体积中试验核酸样品的至少两种不同的靶序列，每对扩增引物用于扩增靶核酸样品中的不同靶序列。
97.根据权利要求91-96中任一项所述的方法，还包括：提供含有细胞的两种不同细胞样品，所述第一细胞样品包括所述对照核酸分子，并且所述第二样品包括含有靶序列的试验核酸分子，其与对照核酸分子的靶序列互补或相同。
98.根据权利要求97所述的方法，还包括提取所述第一细胞样品的对照核酸分子和提取所述第二样品的试验核酸分子。
99.根据权利要求91的方法，其中至少两种不同的靶序列包含选自SEQ ID NO:1-34的序列。
100.根据权利要求1所述的方法，其中所述不同靶序列中的至少两种包含选自SEQ IDNO:1-34的序列。
101.根据根据权利要求31所述的方法，其中所述不同靶序列中的至少两种包含选自SEQ ID NO:1-34的序列。
102.根据权利要求32所述的方法，其中所述不同靶序列中的至少两种包含选自SEQ IDNO:1-34的序列。
103.一种确认核酸提取程序功效的方法，包括：
使用核酸提取程序从用对照核酸分子转化的酵母细胞制备物中提取核酸样品，其中对照核酸分子含有多种不同的靶序列；并
对来自酵母细胞的提取的核酸样品进行PCR，以确认使用所述程序有效提取对照核酸分子。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述方法还包括在提取之前用对照核酸分子转化酵母细胞的步骤。
105.一种确认从对照样品中提取核酸的方法，包括：
从对照样品中提取核酸样品，其中对照样品包含用包含多种不同靶序列的对照核酸分子转化的酵母细胞；
对来自对照样品的提取的核酸样品进行PCR；
确定从对照样品中提取的核酸样品中是否存在多种不同靶序列中的至少一种以确认核酸提取。
106.根据权利要求105所述的方法，还包括确认从试验样品中提取核酸，包括：
从试验样品中提取核酸样品；
对来自试验样品的提取的核酸样品进行PCR；和
确定在对照样品中检测的多种不同靶序列中的至少一种是否存在于从试验样品中提取的核酸样品中以确认核酸提取。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述对照核酸分子是DNA分子。
108.根据权利要求105所述的方法，其中所述对照核酸分子含有至少2种不同的靶序列。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述至少2种不同的靶序列衍生自表1中列出的微生物。
110.根据权利要求108所述的方法，其中所述至少2种不同的靶序列各自包含表2中列出的不同序列或其互补序列。
111.根据权利要求105所述的方法，其中所述对照核酸分子含有至少25种不同的靶序列。
112.根据权利要求105所述的方法，其中所述多种不同的靶序列各自衍生自表1中列出的微生物。
113.根据权利要求105所述的方法，其中所述多种不同的靶序列各自包含表2中列出的不同序列或其互补序列。
114.根据权利要求105所述的方法，其中所述多种不同的靶序列各自衍生自表3中列出的微生物基因。
115.根据权利要求106所述的方法，其中使用至少两种不同的引物组对来自对照样品的提取的核酸样品和/或来自试验样品的提取的核酸样品进行PCR，每个引物组针对对照核酸分子的不同靶序列。
116.根据权利要求106所述的方法，其中使用多个不同的引物组对来自对照样品的提取的核酸样品和/或来自试验样品的提取的核酸样品进行PCR，每个引物组针对对照核酸分子的不同靶序列，每个引物组用于单独和个体的反应。
117.根据权利要求105的方法，其中PCR是数字PCR或定量PCR。
118.根据权利要求105所述的方法，其中所述对照核酸分子含有多种靶序列及其相应的基因组侧翼序列的一部分。
119.根据权利要求118的方法，其中相应的基因组侧翼序列的部分长度为10-500个碱基。
120.根据权利要求118所述的方法，其中所述相应侧翼序列的一部分长度为至少10个碱基。
121.根据权利要求118的方法，其中相应的基因组侧翼序列来自多种靶序列中每一个的3’-，5’或3’和5’侧翼区。
122.根据权利要求105所述的方法，其中所述对照核酸分子还包含独特的限制性位点。
123.根据权利要求122所述的方法，其中在进行PCR之前，通过在独特限制性位点的酶消化使对照核酸线性化。
124.用于评估来自细胞制剂的核酸提取效率的对照核酸分子，所述对照核酸分子包含多种不同的靶序列，其中所述多种不同的靶序列衍生自选自表3的至少两种不同基因。
125.用于评估来自细胞制剂的核酸提取效率的对照核酸分子，所述对照核酸分子包含多种不同的靶序列，其中所述多种不同的靶序列各自包含选自表2或其互补序列的序列。
126.根据权利要求124或125的对照核酸分子，其中对照核酸分子是DNA分子。
127.根据权利要求124或125所述的对照核酸分子，其中所述对照核酸分子含有至少2种不同的靶序列。
128.根据权利要求124或125所述的对照核酸分子，其中所述对照核酸分子含有至少25种不同的靶序列。
129.根据权利要求124或125所述的对照核酸分子，其中对照核酸分子含有多种靶序列及其相应的基因组侧翼序列的一部分。
130.根据权利要求129所述的对照核酸分子，其中相应的基因组侧翼序列的部分长度在10至500个碱基之间。
131.根据权利要求129所述的对照核酸分子，其中相应的基因组侧翼序列的部分长度为至少20个碱基。
132.根据权利要求129所述的对照核酸分子，其中相应的基因组侧翼序列的部分来自多种靶序列的3’-末端、5’-末端或3’-和5’-末端。
133.根据权利要求124或125所述的对照核酸分子，其中所述对照核酸分子还包含独特的限制性位点。
134.根据权利要求124或125的对照核酸分子，其中对照核酸分子是线性的。
135.用于比较评估来自试验样品的核酸提取的提取对照样品，所述提取对照样品包含用包含多种不同靶序列的对照核酸分子转化的酵母细胞制剂。
136.根据权利要求135所述的提取对照样品，其中所述对照核酸分子包含至少两种不同的靶序列。
137.根据权利要求135所述的提取对照样品，其中所述对照核酸分子包含至少25种不同的靶序列。
138.根据权利要求135所述的提取对照样品，其中所述对照核酸分子还包含对应于所述多种不同靶序列中的每一种的5’和/或3’基因组侧翼序列。
139.权利要求135的提取对照样品，其中制备的酵母细胞是冻干的。
140.根据权利要求135所述的提取对照样品，其中所述多种不同的靶序列衍生自选自表3的至少两种不同基因。
141.根据权利要求135所述的提取对照样品，其中所述多种不同的靶序列各自包含表2中列出的序列或其互补序列。
142.一种进行核酸扩增的方法，包括：
通过从含有用对照核酸分子转化的细胞的细胞样品中衍生核酸分子来获得衍生核酸样品，其中对照核酸分子含有多种来自微生物或微生物组合的不同基因的不同靶序列；并
将衍生的核酸样品置于扩增条件下，产生一种或多种衍生自对照核酸分子的扩增产物，其中至少一种扩增产物含有一种靶序列。
143.根据权利要求142的方法，还包括产生两种不同的扩增产物，其含有衍生自基因组或转录组区域的不同靶序列。
144.根据如权利要求142所述的方法，还包括通过从额外的样品中衍生核酸分子来获得额外的衍生的核酸样品，其中所述额外的样品来自生物有机体并且不含有对照核酸分子，并将所述额外的衍生的核酸样品置于扩增条件下，产生一种或多种扩增产物，所述扩增产物含有与对照核酸分子的靶序列相同或互补的靶核酸序列。
145.根据权利要求142所述的方法，其中所述细胞样品是预先冻干的重建细胞样品。
146.根据142的方法，其中微生物或微生物组合选自表1。
147.根据权利要求142的方法，其中微生物或微生物组合的不同基因选自表3。
148.一种进行核酸提取的方法，包括：
获得包含用对照核酸分子转化的含酵母细胞的细胞制剂，其中对照核酸分子含有来自微生物或微生物组合的不同基因的多种不同靶序列；和
从细胞制备物中提取核酸样品。
149.根据权利要求148的方法，其中细胞制剂是冻干细胞制剂。
150.根据权利要求148所述的方法，其中所述微生物或微生物组合选自表1。
151.根据权利要求148所述的方法，其中所述微生物或微生物组合的不同基因选自表3。
152.根据权利要求148所述的方法，其中所述多种不同的靶序列均包含表2所列序列的一种(SEQ ID NO:1-34)。
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