DE69131321T2

DE69131321T2 - Mutationen in der 5'-3'-exonukleaseaktivität thermostabiler dna-polymerasen

Info

Publication number: DE69131321T2
Application number: DE69131321T
Authority: DE
Inventors: Richard Abramson; David Gelfand
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-30
Publication date: 1999-12-16
Anticipated expiration: 2011-10-01
Also published as: AU691374B2; AU663474B2; DE69131321D1; EP0894860A1; JP3227101B2; JPH104985A; AU8668891A; WO1992006200A1; JP3227102B2; JPH104965A; ES2134198T3; AU4086896A; JPH05506364A; EP0894860B1; JP2886842B2; JP2709311B2; EP0550687B1; CA2090614A1; GR3031152T3; ATE181106T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft thermostabile DNA-Polymerasen, die verändert oder mutiert wurden, so daß sie einen 5' nach 3'-Exonucleaseaktivitätswert zeigen, der von dem Wert verschieden ist, der von dem nativen Enzym gezeigt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Mittel zur Isolierung und Herstellung solcher veränderten Polymerasen. Thermostabile DNA-Polymerasen sind bei vielen DNA-Rekombinationstechniken nützlich, insbesondere bei der Nucleinsäureamplifikation durch die Polymerasekettenreaktion (PCR), die selbsterhaltende Sequenzreplikation (3SR) und die DNA-Sequenzierung bei hohen Temperaturen.

Hintergrund des Fachgebiets

Umfangreiche Forschungen wurden über die Isolierung von DNA-Polymerasen aus mesophilen Mikroorganismen, wie E. coli, angestellt. Vgl. zum Beispiel Bessman et al., J. Biol. Chem. 223 (1957), 171-177, und Buttin und Kornberg, J. Biol. Chem. 241 (1966), 5419-5427.
Weniger Untersuchungen wurden über die Isolierung und Reinigung von DNA- Polymerasen aus thermophilen Mikroorganismen durchgeführt, wie Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermus species sps17, Thermus species Z05 und Thermosipho africanus. Die Verwendung von thermostabilen Enzymen, um vorhandene Nucleinsäuresequenzen in Mengen zu amplifizieren, die im Vergleich zu der anfänglich vorhandenen Menge groß sind, wurde in den US-Patenten Nrn. 4,683,195 und 4,683,202 beschrieben, die das PCR-Verfahren beschreiben. Beim PCR-Verfahren, das die Denaturierung der Ziel-DNA, die Hybridisierung der Primer und die Synthese komplementärer Stränge umfaßt, werden Primer, eine Matrize, Nucleosidtriphosphate, die geeigneten Puffer- und Reaktionsbedingungen und eine Polymerase verwendet. Das Verlängerungsprodukt eines jeden Primers wird zur Matrize für die Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz.
Die zwei Patente offenbaren, daß, falls die verwendete Polymerase ein thermostabiles Enzym ist, die Polymerase folglich nicht nach jedem Denaturierungsschritt zugegeben werden muß, da Hitze die Polymeraseaktivität nicht aufhebt.
Das US-Patent Nr. 4,889,818, die Europäische Patentveröffentlichung Nr. 258,017 und die PCT-Veröffentlichung Nr. 89/06691 beschreiben alle die Isolierung und rekombinante Expression einer ~94 kDa großen thermostabilen DNA-Polymerase von Thermus aquaticus und die Verwendung der Polymerase bei der PCR. Obwohl die T. aquaticus-DNA- Polymerase zur Verwendung bei der PCR und anderen DNA-Rekombinationstechniken besonders bevorzugt wird, besteht weiterhin ein Bedarf für andere thermostabile Polymerasen.
Die WO-91/02090 (Anmelder: Promega Corp.), die nur ein älteres Recht ist, beschreibt eine aus Thermus aquaticus gereinigte thermostabile DNA-Polymerase. Diese Polymerase ist ein 80 oder 85 kDa-Abbauprodukt der intakten Polymerase (Molekulargewicht 94 kDa), und es wird berichtet, daß sie im wesentlichen keine 5'-3'-Exonucleaseaktivität besitzt. Für diese Polymerase werden keine Sequenzdaten angegeben.
Die WO-91/09950 (Anmelder: Cetus Corp.), die nur ein älteres Recht ist, beschreibt die Reinigung der Thermus thermophilus-Polymerase und die rekombinante Expression des die Polymerase codierenden Gens in E. coli unter Einbeziehung von Tth-Polymerase-Fragmenten, die das aminoterminale Drittel des nativen Enzyms nicht aufweisen.
Die WO-91/09944, die nur ein älteres Recht ist, betrifft Verfahren zur Replikation und Amplifikation von RNA-Sequenzen durch thermoaktive DNA-Polymerasen. Auf Seite 16, Linien 14 und 15, wird darauf hingewiesen, daß der Austausch der Tth-Aminosäurenummer 46 von Glycin zu Asparaginsäure eine Wirkung auf die 5' → 3'-Exonucleaseaktivität haben kann, wodurch ein neues Enzym bereitgestellt wird.
Lawyer et al. beschrieben in J. Biol. Chem. 264 (1989), 6427-6437, die Isolierung, Charakterisierung und Expression des DNA-Polymerase-Gens aus Thermus aquaticus in E. coli. Die Clonierung von Expressionsvektoren, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Taq- Polymerase-Fragment codiert, das den N-Terminus des nativen Enzyms nicht aufweist, wird ebenfalls offenbart.
Leavitt et al. beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 446-4468, die Struktur-Funktion-Beziehung der T5-DNA-Polymerase zu anderen DNA-Polymerasen, wie T7-Polymerase und E. coli-Polymerase I.
In Cell 59 (1989), 219-228, berichteten Bernad et al. über eine konservierte 3' nach 5'-Exonuclease-aktive Stelle in prokaryontischen und eukaryontischen DNA-Polymerasen.
Kaledin et al. berichteten in Chemical Abstract 93, Nr. 40169p (1989); über die Reinigung eines thermostabilen DNA-Polymerase-Enzyms aus Thermus aquaticus mit einem Molekulargewicht von etwa 60-62.000 Dalton. Für diese Polymerase werden keine Sequenzdaten angegeben.
Chien et al. berichteten in Chemical Abstract 85, Nr. 155559t (1976), über die Reinigung eines thermostabilen DNA-Polymerase-Enzyms aus Thermus aquaticus. Es wird berichtet, daß das Molekulargewicht dieses Enzyms bei der Bestimmung durch Saccharosegradientenzentrifugation 68.000 und bei der Bestimmung durch Gelfiltration 63.000 beträgt. Für diese Polymerase werden keine Sequenzdaten angegeben.

Zusammenfassung der Erfindung

Bei der Erfüllung der Anforderung für andere thermostabile Polymerasen stellten die hier genannten Erfinder fest, daß einige thermostabilen DNA-Polymerasen, wie die aus Thermus aquacticus (Taq) isolierten, eine 5' nach 3'-Exonuclease- oder eine strukturabhängige Einzelstrang-Endonuclease (SDSSE)-aktivität zeigen. Wie nachstehend ausführlicher erläutert wird, ist eine solche 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität bei einem Enzym unerwünscht, das bei der PCR verwendet werden soll, weil es die Menge des erzeugten Produkts begrenzen kann und zum Plateauphänomen bei der normalerweise exponentiellen Anreicherung des Produkts beitragen kann. Außerdem kann die Anwesenheit einer 5' nach 3'- Nucleaseaktivität in einer thermostabilen DNA-Polymerase dazu beitragen, die Fähigkeit zu beeinträchtigen, wirksam lange PCR-Produkte zu erzeugen, die größer als oder gleich 10 kb sind, insbesondere für G+C-reiche Zielmoleküle. Bei Anwendungen auf dem Gebiet der DNA-Sequenzierung und der zyklischen Sequenzierung kann die Anwesenheit einer 5' nach 3'-Nucleaseaktivität zur Reduktion der gewünschten Bandenintensitäten und/oder Erzeugung von falschen oder Hintergrundbanden beitragen. Schließlich kann das Fehlen einer 5' nach 3'-Nucleaseaktivität eine Allelunterscheidung mit größerer Empfindlichkeit in einem kombinierten Polymerase-Ligase-Kettenreaktions (PLCR)-Test erleichtern.
Jedoch kann ein erhöhter oder größerer 5' nach 3'-Exonucleaseaktivitätswert in einer thermostabilen DNA-Polymerase bei einem solchen Enzym erwünscht sein, das in einem homogenen Testsystem gleichzeitig zur Amplifikation und zum Nachweis einer Ziel- Nucleinsäuresequenz verwendet wird. Eine erhöhte 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität ist im allgemeinen definiert durch eine erhöhte Exonucleasespaltungsrate oder eine erhöhte Nicktranslationssyntheserate oder durch die Verdrängung eines größeren Nucleotidfragments vor der Spaltung des Fragments.
Demgemäß wurde die vorliegende Erfindung entwickelt, um die Anforderungen des Stands der Technik durch die Bereitstellung von thermostabilen DNA-Polymerasen, die eine veränderte 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität zeigen, zu erfüllen. Abhängig vom Zweck, für den die thermostabile DNA-Polymerase verwendet wird, kann die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität der Polymerase verändert werden, so daß ein 5' nach 3'-Exonucleaseaktivitätsbereich exprimiert werden kann. Dieser 5' nach 3'-Exonucleaseaktivitätsbereich erstreckt sich von einer erhöhten Aktivität bis zu einem vollständigen Aktivitätsverlust. Obwohl eine erhöhte Aktivität bei bestimmten PCR-Anwendungen nützlich ist, z. B. einem homogenen Test, ist so wenig 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität wie möglich bei DNA-Polymerasen erwünscht, die bei den meisten anderen PCR-Anwendungen verwendet werden.
Es wurde auch festgestellt, daß sowohl die ortsspezifische Mutagenese als auch die Deletionsmutagenese zur gewünschten veränderten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität in den erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen führen kann. Für einige Mutationen, die die Exonucleaseaktivität verändern, wurde gezeigt, daß sie die Prozessivität der DNA- Polymerase verändern. Bei vielen Anwendungen (z. B. der Amplifikation von Zielmolekülen mittlerer Größe in Gegenwart einer großen Menge von genomischer DNA mit hoher Komplexität) kann eine verminderte Prozessivität die Optimierung von PCRs vereinfachen und zu einer erhöhten Spezifität bei einer hohen Enzymkonzentration beitragen. Einige Mutationen, die die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität eliminieren, vermindern die Prozessivität nicht, sondern können die Prozessivität der thermostabilen DNA-Polymerase verbessern, und demgemäß können diese mutierten Enzyme bei anderen Anwendungen bevorzugt werden (z. B. der Erzeugung langer PCR-Produkte). Einige Mutationen, die die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität eliminieren, verbessern im Vergleich zum Wildtyp gleichzeitig die Thermostabilität der mutierten thermostabilen Polymerase, und folglich finden diese mutierten Enzyme zusätzlich Verwendung bei der Amplifikation von G+C-reichen oder anderweitig schwer zu denaturierenden Zielmolekülen.
Bestimmte übereinstimmende Bereiche oder Domänen von thermostabilen DNA- Polymerase-Genomen wurden als bevorzugte Stellen zur Mutagenese, um die 5' nach 3'- Exonuclease des Enzyms zu beeinflussen, identifiziert. Diese Domänen können isoliert und in eine thermostabile DNA-Polymerase insertiert werden, die keine oder eine geringe natürliche 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität aufweist, um ihre Aktivität zu erhöhen. Folglich sind auch Verfahren zur Herstellung von chimären thermostabilen DNA-Polymerasen mit einer veränderten 5' nach 3'-Exonuclease in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt DNA-Sequenzen und Expressionsvektoren bereit, die thermostabile DNA-Polymerasen codieren, die mutiert wurden, um die Expression der 5' nach 3'-Exonuclease zu verändern. Um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern, wird nachstehend eine Reihe von Begriffen definiert.
Die Begriffe "Zelle", "Zellinie" und "Zellkultur" können austauschbar verwendet werden, und alle derartigen Bezeichnungen schließen Nachkommen ein. Folglich schließen die Wörter "Transformanten" oder "transformierte Zellen" die transformierte Primärzelle und Kulturen, die von der Zelle abstammen, unabhängig von der Anzahl der Passagen ein. Alle Nachkommen müssen infolge von beabsichtigten oder unbeabsichtigten Mutationen hinsichtlich des DNA-Gehalts nicht genau identisch sein. Mutierte Nachkommen, die die gleiche Funktionalität aufweisen, wie die, auf die die ursprüngliche transformierte Zelle abgesucht wurde, sind in der Definition von Transformanten eingeschlossen.
Der Begriff "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer funktionell verbundenen codierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryonten geeignet sind, umfassen zum Beispiel einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und eventuell andere Sequenzen. Von eukaryontischen Zellen ist bekannt, daß sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
Der Begriff "Expressionssystem" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die eine gewünschte codierende Sequenz und Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung enthalten, so daß mit diesen Sequenzen transformierte Wirte fähig sind, die codierten Proteine zu produzieren. Zur Herbeiführung der Transformation kann das Expressionssystem in einen Vektor eingeschlossen werden; jedoch kann die gewünschte DNA auch in das Wirtschromosom integriert werden.
Der Begriff "Gen" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die Kontroll- und codierende Sequenzen umfaßt, die zur Herstellung eines gewinnbaren bioaktiven Polypeptids oder Vorläufers davon erforderlich sind. Das Polypeptid kann von einer vollständigen codierenden Sequenz oder von einem Teil der codierenden Sequenz codiert werden, so lange die enzymatische Aktivität beibehalten wird.
Der Begriff "funktionell verbunden" bezieht sich auf die Positionierung der codierenden Sequenz, so daß die Kontrollsequenzen in der Steuerung der Expression des von der codierenden Sequenz codierten Proteins wirksam sind. Folglich bezieht sich der Begriff eine mit Kontrollsequenzen "funktionell verbundene" codierende Sequenz auf eine Anordnung, in der die codierenden Sequenzen unter der Steuerung einer Kontrollsequenz exprimiert werden können.
Der Begriff "Gemisch", so wie er sich auf Gemische bezieht, die thermostabile Polymerasen enthalten, verweist auf eine Auswahl von Stoffen, die eine gewünschte thermostabile Polymerase beinhaltet, die aber auch andere Proteine einschließen kann. Falls die gewünschte thermostabile Polymerase aus rekombinanten Wirtszellen stammt, sind die arideren Proteine üblicherweise solche, die mit dem Wirt assoziiert sind. Wo der Wirt ein Bakterium ist, sind die verunreinigenden Proteine natürlich bakterielle Proteine.
Der Begriff "nichtionische polymere Detergentien" bezieht sich auf oberflächenaktive Mittel, die keine Tonenladung besitzen und die erfindungsgemäß durch die Fähigkeit gekennzeichnet sind, daß sie thermostabile Polymeraseenzyme in einem pH-Bereich von etwa 3,5 bis etwa 9,5, vorzugsweise von 4 bis 8,5, stabilisieren.
Der Begriff "Oligonucleotid", so wie er hier verwendet wird, ist definiert als ein Molekül, das aus zwei oder mehreren Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden, vorzugsweise mehr als drei und üblicherweise mehr als zehn, besteht. Die genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, die wiederum von der endgültigen Funktion oder Verwendung des Oligonucleotids abhängen. Das Oligonucleotid kann synthetisch oder durch Clonieren erhalten werden.
Der Begriff "Primer", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das fähig ist, als Initiationspunkt einer Synthese wirksam zu sein, wenn es unter Bedingungen gebracht wird, bei denen die Primerverlängerung initiiert wird. Ein Oligo nucleotid-"Primer" kann natürlich vorkommen, wie in einem gereinigten Restriktionsspaltprodukt, oder synthetisch hergestellt werden. Die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das zu einem Nucleinsäurestrang komplementär ist, wird in Gegenwart von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem thermostabilen Polymeraseenzym in einem geeigneten Puffer bei einer geeigneten Temperatur eingeleitet. Ein "Puffer" umfaßt Cofaktoren (wie zweiwertige Metallionen) und Salz (um die geeignete Jonenstärke vorzusehen) und wird auf den gewünschten pH-Wert eingestellt.
Ein Primer ist für eine maximale Wirksamkeit bei der Amplifikation einzelsträngig, aber er kann alternativ doppelsträngig sein. Falls er doppelsträngig ist, wird der Primer zuerst behandelt, um seine Stränge zu trennen, bevor er zur Herstellung von Verlängerungsprodukten verwendet wird. Der Primer ist üblicherweise ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muß lang genug sein, um die Synthese der Verlängerungsprodukte in Gegenwart des Polymeraseenzyms zu initiieren. Die genaue Länge eines Primer hängt von vielen Faktoren ab, wie der Herkunft des Primers und dem gewünschten Ergebnis, und die Reaktionstemperatur muß in Abhängigkeit von der Primerlänge und der Nucleotidsequenz eingestellt werden, um die richtige Anelierung des Primers an die Matrize sicherzustellen. In Abhängigkeit von der Komplexität der Zielsequenz enthält ein Oligonucleotidprimer überlicherweise 15 bis 35 Nucleotide. Kurze Primermoleküle erfordern im allgemeinen niedrigere Temperaturen, um ausreichend stabile Komplexe mit der Matrize zu bilden.
Ein Primer wird so gewählt, daß er zu einem Strang einer spezifischen Sequenz der Matrize "im wesentlichen" komplementär ist. Ein Primer muß ausreichend komplementär sein, um mit einem Matrizenstrang zu hybridisieren, damit die Primerverlängerung erfolgt. Eine Primersequenz muß nicht die genaue Sequenz der Matrize widerspiegeln. Zum Beispiel kann ein nichtkomplementäres Nucleotidfragment an das 5'-Ende des Primers gebunden sein, wobei der Rest der Primersequenz zu dem Strang im wesentlichen komplementär ist. Nichtkomplementäre Basen oder längere Sequenzen können in den Primer eingefügt sein, mit der Maßgabe, daß die Primersequenz eine ausreichende Komplementarität zu der Sequenz der Matrize aufweist, um zu hybridisieren und auf diese Weise einen Matrize-Primer-Komplex zur Synthese des Verlängerungsprodukts des Primers bildet.
Die Begriffe "Restriktionsendonucleasen" und "Restriktionsenzyme" beziehen sich auf bakterielle Enzyme, die doppelsträngige DNA an oder nahe einer spezifischen Nucleotidsequenz spalten.
Der Begriff "thermostabiles Polymeraseenzym" bezieht sich auf ein Enzym, das hitzestabil und hitzeresistent ist und die Verknüpfung der Nucleotide in der richtigen Weise katalysiert (ermöglicht), um Primerverlängerungsprodukte herzustellen, die zu einem Matrizennucleinsäurestrang komplementär sind. Im allgemeinen beginnt die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts am 3'-Ende des Primers und schreitet in der 5'-Richtung längs des Matrizenstrangs voran, bis die Synthese beendet ist.
Um das Verständnis der Erfindung weiter zu erleichtern, wird in der Beschreibung auf spezifische thermostabile DNA-Polymerase-Enzyme Bezug genommen, um die allgemeinen Konzepte der Erfindung zu veranschaulichen, und diese Referenzen sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht begrenzen. Die spezifischen Enzyme, auf die häufig Bezug genommen wird, sind nachstehend mit einer allgemeinen Abkürzung, die in der Beschreibung verwendet wird, und ihren jeweiligen Nucleotid- und Aminosäuresequenz-ID- Nummern angegeben.
Wie vorstehend zusammengefaßt, betrifft die vorliegende Erfindung thermostabile DNA-Polymerasen, die eine veränderte 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität im Vergleich zu der Aktivität der nativen Polymerase zeigen. Folglich zeigen die erfindungsgemäßen Polymerasen entweder eine erhöhte 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität oder eine abgeschwächte 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität im Vergleich zu der Aktivität der nativen Polymerase.

Thermostabile DNA-Polymerasen mit einer abgeschwächten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität

DNA-Polymerasen weisen oft mehrere Funktionen auf. Zusätzlich zur Polymerisierung von Nucleotiden katalysiert die E. coli-DNA-Polymerase I (pol I) zum Beispiel die Pyrophosphorolyse von DNA sowie die Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen. Zwei derartige hydrolytische Aktivitäten wurden für pol I charakterisiert; eine ist eine 3' nach 5'- Exonucleaseaktivität und die andere eine 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität. Die zwei Exonucleaseaktivitäten sind mit zwei verschiedenen Domänen des pol I-Moleküls assoziiert. Jedoch unterscheidet sich die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität von pol I von der Aktivität thermostabiler DNA-Polymerasen insofern, als die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität von thermostabilen DNA-Polymerasen strengere strukturelle Anforderungen an das Substrat hat, das sie umsetzt.
Ein geeigneter und empfindlicher Test für die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität von thermostabilen DNA-Polymerasen zieht Nutzen aus der Entdeckung der strukturellen Anforderung für die Aktivität. Ein wichtiges Merkmal der Anordnung des Tests ist ein stromaufwärts angeordneter Oligonucleosidprimer, der die Polymerase zur Exonucleasespaltung einer markierten stromabwärts angeordneten Oligonucleotidsonde in die richtige Lage bringt. Für einen Test auf eine Polymerisierungs-unabhängige Exonucleaseaktivität (d. h. einen in Abwesenheit von Desoxynucleosidtriphosphaten durchgeführten Test) muß die Sonde so positioniert sein, daß der zu der Matrize komplementäre Bereich der Sonde unmittelbar neben dem 3'-Ende des Primers angeordnet ist. Außerdem sollte die Sonde mindestens 1, jedoch vorzugsweise 2-10 oder besonders bevorzugt 3-5 Nucleotide am 5'-Ende der Sonde enthalten, die zu der Matrize nicht komplementär sind. Die Kombination des Primers und der Sonde bei der Anelierung an die Matrize erzeugt eine doppelsträngige Struktur, die einen Einzelstrangbruch mit einer 3'-Hydroxylgruppe 5' des Einzelstrangbruchs und einen verdrängten Einzelstrang 3' des Einzelstrangbruchs enthält. In einer anderen Ausführungsform kann der Test als eine Polymerisierungs-abhängige Reaktion durchgeführt werden, in diesem Fall sollte jedes Desoxynucleosidtriphosphat in einer Konzentration zwischen 1 uM und 2 mM, vorzugsweise zwischen 10 uM und 200 uM, eingeschlossen sein, obwohl eine begrenzte dNTP-Zugabe (und somit ein begrenzter dNTP-Einbau) erforderlich sein kann, so wie sie durch die Matrizensequenz bestimmt wird. Wenn der Test in Gegenwart von dNTPs durchgeführt wird, sind die notwendigen strukturellen Erfordernisse ein stromaufwärts angeordneter Oligonucleotidprimer, um die Synthese des komplementären Strangs der Matrize durch die Polymerase zu steuern, und eine markierte stromabwärts angeordnete Oligonucleotidsonde, mit der die Polymerase beim Prozeß der Verlängerung des stromaufwärts angeordneten Primers in Kontakt kommt. Ein Beispiel eines Polymerisierungs-unabhängigen, thermostabilen DNA-Polymerase-5' nach 3'-Exonucleas-Tests wird nachstehend angegeben.
Die synthetische, 3'-phosphorylierte Oligonucleotidsonde (phosphoryliert, um eine Polymeraseverlängerung auszuschließen) BW33 (GATCGCTGCGCGTAACCACCACAC- CCGCCGCGCp) (SEQ ID NO: 13) (100 pMol) wurde am 5'-Ende mit gamma-[³²P]-ATP (3000 Ci/mMol) und T4-Polynucleotidkinase ³²P-markiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol extrahiert, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation. Die ³²P-markierte Oligonucleotidsonde wurde in 100 ul TE-Puffer erneut gelöst, und nicht eingebautes ATP wurde durch eine Gelfiltrationschromatographie an einer Sephadex G-50-"Spin"- Säule entfernt. Fünf pmol ³²P-markierte BW33-Sonde wurden an 5 umol einzelsträngige M13mp10w-DNA in Gegenwart von 5 umol des synthetischen Oligonucleotidprimers BW37 (GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCA) (SEQ ID NO: 14) in 100 ul Reaktionsvolumen, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl und 3 mM MgCl&sub2;, aneliert. Das Anelierungsgemisch wurde in einer Perkin-Elmer Cetus-DNA-Thermal Cycler-Vorrichtung 5 Minuten auf 95ºC erwärmt, innerhalb von 10 Minuten auf 70ºC gekühlt, bei 70ºC weitere 10 Minuten inkubiert und dann über einen Zeitraum von 30 Minuten auf 25ºC gekühlt. Exonuclease-Reaktionsgemische, enthaltend 10 ul des Anelierungsgemisches, wurden bei 70ºC 1 Minute vorinkubiert. Das thermostabile DNA-Polymerase-Enzym (etwa 0,01 bis 1 Einheit DNA-Polymerase-Aktivität oder 0,0005 bis 0,05 pMol Enzym) wurde in einem 2,5 ul-Volumen zu dem Vorinkubationsreaktionsgemisch gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde bei 70ºC inkubiert. Aliquots (5 ul) wurden nach 1 Minute und 5 Minuten entnommen, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ul 60 mM EDTA gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Homochromatographie analysiert und die Exonucleaseaktivität wurde nach einer Autoradiographie quantitativ bestimmt. Die Chromatographie wurde in einem Homochromatographiegemisch, enthaltend 2% teilweise hydrolysierte Hefe-RNA in 7 M Harnstoff, auf Polygram CEL 300 DEAE-Cellulose-Dünnschichtchromatographieplatten durchgeführt. Die Anwesenheit einer 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität führt zur Bildung kleiner ³²P-markierter Oligomere, die auf der TLC-Platte nach oben wandern und auf dem Autoradiogramm leicht von der nicht abgebauten Sonde unterschieden werden können, die am Startpunkt verharrt.
Die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität der thermostabilen DNA-Polymerasen schneidet 5'-terminale Bereiche doppelsträngiger DNA aus, wobei aufeinanderfolgend 5'-Mono- und -Oligonucleotide freigesetzt werden. Das bevorzugte Substrat für die Exonuclease ist verdrängte einzelsträngige DNA, wobei die Hydrolyse der Phosphodiesterbindung zwischen der verdrängten einzelsträngigen DNA und der doppelhelicalen DNA erfolgt. Die bevorzugte Exonucleasespaltstelle ist eine Phosphodiesterbindung in dem doppelhelicalen Bereich. Folglich kann die Exonucleaseaktivität besser beschrieben werden als eine strukturabhängige einzelsträngige Endonuclease (SDSSE).
Viele thermostabilen Polymerasen zeigen diese 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität, einschließlich der DNA-Polymerasen von Taq, Tma, Tsps17, TZ05, Tth und Taf. Wenn thermostabile Polymerasen, die eine 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität besitzen, beim PCR- Verfahren verwendet werden, wurde eine Vielzahl von unerwünschten Ergebnissen beobachtet, einschließlich einer Begrenzung der Menge des erzeugten Produkts, einer beeinträchtigten Fähigkeit, lange PCR-Produkte zu erzeugen oder Bereiche zu amplifizieren, die eine ausgeprägte Sekundärstruktur enthalten, die Bildung von Schattenbanden oder die Abschwächung der Signalstärke von gewünschten Abbruchbanden während der DNA- Sequenzierung, den Abbau des 5'-Endes von Oligonucleotidprimern im Zusammenhang mit einem doppelsträngigen Primer-Matrize-Komplex, eine Nicktranslationssynthese während einer Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese und den Abbau der RNA-Komponente von RNA: DNA-Hybriden.
Die Begrenzung der Menge des erzeugten PCR-Produkts ist auf ein Plateauphänomen bei der sonst exponentiellen Anreicherung des Produkts zurückzuführen. Ein solches Plateauphänomen tritt zum Teil auf, weil die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität die Hydrolyse oder Spaltung von Phosphodiesterbindungen bewirkt, wenn eine Polymerase mit einer 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität auf eine gabelförmige Struktur in einem PCR-Substrat trifft.
Solche gabelförmigen Strukturen liegen im allgemeinen in bestimmten G- und C- reichen DNA-Matrizen vor. Die Spaltung dieser Phosphodiesterbindungen unter diesen Umständen ist unerwünscht, da sie die Amplifikation bestimmter G- und C-reicher Zielmoleküle durch das PCR-Verfahren verhindert. Außerdem trägt die Spaltung der Phosphodiesterbindung auch zu dem Plateauphänomen bei der Generierung in späteren PCR-Zyklen bei, wenn die Produktstrangkonzentration und die Renaturierungskinetik Substrate mit einer gabelförmigen Struktur zur Folge haben.
Im Zusammenhang mit der DNA-Sequenzierung ist die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität von DNA-Polymerasen wiederum/auch ein Hindernis bei Matrizen mit einer gabelförmigen Struktur, da die Spaltung der Phosphodiesterbindung während den DNA-Verlängerungsreaktionen zu "falschen Stopps" führt. Diese "falschen Stopps" tragen wiederum zu Schattenbanden bei und können unter extremen Umständen das Ausbleiben von genauen und interpretierbaren Sequenzdaten zur Folge haben.
Bei der Verwendung in einem PCR-Verfahren mit einem doppelsträngigen Primer- Matrize-Komplex kann die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität einer DNA-Polymerase den Abbau des 5'-Endes der Oligonucleotidprimer zur Folge haben. Diese Aktivität ist nicht nur bei der PCR unerwünscht, sondern auch bei Sekundärstrang-DNA-Synthese- und Sequenzierungsverfahren.
Während optimal wirksamen, Oligonucleotid-gerichteten Mutageneseverfahren darf die DNA-Polymerase, die verwendet wird, kein Strangverdrängungssynthese- und/oder Nicktranslationsvermögen besitzen. Folglich ist die Anwesenheit einer 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität in einer zur Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese verwendeten Polymerase ebenfalls unerwünscht.
Schließlich beinhaltet die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität von Polymerasen im allgemeinen auch eine inhärente RNase H-Aktivität. Wenn die Polymerase jedoch auch als reverse Transkriptase verwendet werden soll, wie in einem PCR-Verfahren, das ein RNA:DNA-Hybrid einschließt, kann eine solche inhärente RNase H-Aktivität nachteilig sein.
So beinhaltet ein Gesichtspunkt dieser Erfindung die Erzeugung von thermostabilen DNA-Polymerase-Mutanten, die eine stark verminderte, abgeschwächte oder vollständig eliminierte 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität zeigen. Solche mutierten thermostabilen DNA-Polymerasen sind zur Verwendung bei Verfahren wie PCR, Sekundärstrang-cDNA- Synthese, Sequenzierung und Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese besser geeignet und eher wünschenswert.
Die Herstellung von thermostabilen DNA-Polymerase-Mutanten mit einer abgeschwächten oder eliminierten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität kann durch Verfahren wie der ortsspezifischen Mutagenese und der Deletionsmutagenese erreicht werden.
Es wurde zum Beispiel festgestellt, daß eine ortsspezifische Mutation von G zu A an der zweiten Position des Codons für Gly an Position 46 in der Taq-DNA-Polymerase- Aminosäuresequenz (d. h. Mutation von G(137) zu (A) in der DNA-Sequenz) zu einer etwa 1000fachen Reduktion der 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität ohne erkennbare Veränderung der Polymeraseaktivität, Prozessivität oder Verlängerungsrate führt. Diese ortsspezifische Mutation der Taq-DNA-Polymerase-Nucleotidsequenz führt zu einem Aminosäureaustausch von Gly (46) zu Asp.
Glycin 46 der Taq-DNA-Polymerase ist in der Thermus species sps17-DNA-Polymerase konserviert, es befindet sich jedoch an Position 43, und die gleiche Gly-zu-Asp- Mutation hat eine ähnliche Wirkung auf die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität der Tsps17- DNA-Polymerase. Eine solche Mutation des konservierten Gly der Tth (Gly 46)-, TZ05 (Gly 46)-, Tma (Gly 37)- und Taf (Gly 37)-DNA-Polymerasen zu Asp hat auch eine ähnliche abschwächende Wirkung auf die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivitäten solcher Polymerasen.
Tsps17-Gly 43, Tth-Gly 46, TZ05-Gly 46, Tma-Gly 37 und Taf-Gly 37 wurden auch in einer konservierten A(V/T)YG (SEQ ID NO: 15)-Sequenzdomäne identifiziert, und es wird auch erwartet, daß der Austausch des Glycins durch Asparaginsäure innerhalb dieser konservierten Sequenzdomäne einer Polymerase die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität abschwächt. Genauer haben Tsps17-Gly 43, Tth-Gly 46, TZ05-Gly 46 und Taf-Gly 37 die AVYG-Sequenzdomäne gemeinsam, und Tma-Gly 37 findet man in der ATYG-Domäne. Mutationen von Glycin zu Asparaginsäure in anderen thermostabilen DNA-Polymerasen, die die konservierte A(V/T)YG (SEQ ID NO: 15)-Domäne enthalten, können unter Anwendung der gleichen Prinzipien und Verfahren erzielt werden, die zur ortsspezifischen Mutagenese der Taq-Polymerase angewendet wurden. Beispielhaft für solche ortsspezifischen Mutageneseverfahren sind die Beispiele 5 und 8 der am 13. August 1991 eingereichten PCT-Anmeldung Nr. 91/05753.
Eine solche ortsspezifische Mutagenese wird im allgemeinen durch eine ortsspezifische, primergerichtete Mutagenese ausgeführt. Dieses Verfahren ist auf dem Fachgebiet jetzt Standard und wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotidprimers durchgeführt, der zu einer einzelsträngigen Phagen-DNA, die durch Mutagenese verändert werden soll, bis auf eine begrenzte Falschpaarung, die für die gewünschte Mutation steht, komple mentär ist. Kurz zusammengefaßt, wird das synthetische Oligonucleotid als Primer verwendet, um die Synthese eines Strangs zu beeinflussen, der zu dem Phasmid oder Phagen komplementär ist, und die so erhaltene doppelsträngige DNA wird in ein den Phagen unterstützendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Topagar plattiert, der die Plaquebildung einzelner Zellen erlaubt, die den Phagen aufgenommen haben, oder auf für Phasmidvektoren wirkstoffselektive Medien ausplattiert.
Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques den Phagen, der die mutierte Form als Einzelstang aufweist; 50% weisen die ursprüngliche Sequenz auf. Die Plaques werden auf Nitrocellulosfilter übertragen und die "Abdrücke" werden mit dem phosphorylierten synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die die Hybridisierung einer genauen Paarung zuläßt, aber bei der die Falschpaarungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichend sind, um die Hybridisierung zu verhindern. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann ausgewählt und gezüchtet, und die DNA wird gewonnen.
Bei den nachstehend angegebenen Konstruktionen werden die zur Plasmidkonstruktion richtigen Ligierungen bestätigt, indem zuerst die E. coli-Stämme DG98, DG101, DG116 oder andere geeignete Wirte mit dem Ligierungsgemisch transformiert werden. Erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder eine andere Antibiotikaresistenz oder durch die Verwendung von anderen Markern selektiert, abhängig von der Art der Plasmidkonstruktion, wie auf dem Fachgebiet selbstverständlich ist. Plasmide aus den Transformanten werden dann gemäß dem Verfahren von Clewell D. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62 (1969), 1159, präpariert, gegebenenfalls gefolgt von einer Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell D. B., J. Bacteriol. 110 (1972), 667). Die isolierte DNA wird durch eine Restriktionsenzymspaltung analysiert und/oder durch das Didesoxyverfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463, wie weiter von Messing et al., Nuc. Acids Res. 9 (1981), 309, beschrieben wird, oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65 (1980). 499, sequenziert.
Zur Clonierung und Sequenzierung und zur Expression der Konstruktionen unter Kontrolle der meisten lac- oder PL-Promotoren wurden die E. coli-Stämme DG98, DG101 und DG116 als Wirt verwendet. Zur Expression unter Kontrolle des PLNRBS-Promotors kann der E. coli-Stamm K12 MC1000 lambda lysogen, N&sub7;N&sub5;&sub3;cI857 SusP&sub8;&sub0;, ATCC-39531, verwendet werden. Beispielhafte Wirte, welche hier zur Expression der thermostabilen DNA- Polymerasen mit einer veränderten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität verwendet werden, sind E. coli DG116, der bei der ATCC (ATCC-53606) am 7. April 1987 hinterlegt wurde, und E. coli KB2, der bei der ATCC (ATCC-53075) am 29. März 1985 hinterlegt wurde.
Für M13-Phagen-Rekombinanten werden E. coli-Stämme verwendet, die für eine Phageninfektion zugänglich sind, wie der E. coli K12 Stamm DG98. Der DG98-Stamm wurde am 13. Juli 1984 bei der ATCC hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer 39768.
Die Expression in Säugerzellen kann in COS-7-, COS-A2-, CV-1- und Mäusezellen und die Expression auf Basis von Insektenzellen kann in Spodoptera frugipeida durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen werden im allgemeinen aus dem E. coli-Stamm DG116 gereinigt, der die Merkmale von Plasmid pLSG33 enthält. Die Hauptmerkmale sind ein temperaturregulierter Promotor (λ PL-Promotor), ein temperaturregulierter Plasmidvektor, ein positives retroregulatorisches Element (PRE) (vgl. US- 4,666,848, erteilt am 19. Mai 1987) und eine modifizierte Form eines thermostabilen DNA- Polymerase-Gens. Wie auf Seite 46 der Beschreibung des US-Patents mit der Anmeldungsnummer 455,967 beschrieben ist, wurde pLSG33 durch die Ligierung des NdeI-BamHI- Restriktionsfragments von pLSG24 in den Expressionsvektor pDG178 hergestellt. Die so erhaltenen Plasmide sind Ampicillin-resistent und zur Expression von 5' nach 3'-Exonuclease-defizienten Formen der erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen fähig. Der Anzuchtkolben für einen 10 Liter-Fermentationsansatz enthält Trypton (20 g/l), Hefeextrakt (10 g/l), NaCl (10 g/l) und 0,005% Ampicillin. Der Anzuchtkolben wird mit Kolonien von einer Agarplatte beimpft, oder es kann eine tiefgefrorene Glycerin-Stammkultur verwendet werden. Das Impfmaterial wird bis zu einem OD-Wert (A&sub6;&sub8;&sub0;) zwischen 0,5 und 1 angezogen. Das Volumen der Impfkultur, mit der die Fermentation beimpft wird, wird so berechnet, daß die Endkonzentration der Bakterien 1 mg Trockengewicht/Liter beträgt. Das 10 Liter-Wachstumsmedium enthielt 25 mM KH&sub2;PO&sub4;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 4 mM Natriumcitrat, 0,4 mM FeCl&sub2;, 0,04 mM ZnCl&sub2;, 0,03 mM CoCl&sub2;, 0,03 mM CuCl&sub2; und 0,03 mM H&sub3;BO&sub3;. Die folgenden sterilen Komponenten werden zugegeben: 4 mM MgSO&sub4;, 20 g/l Glucose, 20 mg/l Thiamin-HCl und 50 mg/l Ampicillin. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,8 eingestellt und während der Fermentation durch Zugabe von NH&sub4;OH kontrolliert. Glucose wird während der Fermentation durch die Kopplung an die NH&sub4;OH-Zugabe fortwährend zugegeben. Die Schaumbildung wird gegebenenfalls durch die Zugabe von Polypropylenglykol als schaumhemmendes Mittel reguliert. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wird bei 40% gehalten.
Die Fermentation wird beimpft, wie vorstehend beschrieben, und die Kultur wird bei 30ºC gezüchtet, bis eine optische Dichte von 21 (A&sub6;&sub8;&sub0;) erreicht ist. Die Temperatur wird dann auf 37ºC erhöht, um die Synthese der gewünschten Polymerase zu induzieren. Die Züchtung wird für 8 Stunden nach der Induktion fortgesetzt, und die Zellen werden dann durch Konzentration unter Anwendung der Kreuzstromfiltration gefolgt von einer Zentrifugation geerntet. Die so erhaltene Zellpaste wird bei -70ºC eingefroren und ergibt etwa 500 g Zellpaste. Soweit nicht anders angegeben, werden alle Reinigungsschritte bei 4ºC durchgeführt.
Ein Teil des eingefrorenen (-70ºC) E. coli K12-Stamms DG116, der das Plasmid pLSG33 aufgenommen hat, oder ein anderer geeigneter Wirt, wie vorstehend beschrieben, wird über Nacht auf -20ºC erwärmt. Zu dem Zellpellet werden die folgenden Reagentien gegeben: 1 Volumenteil 2 · TE (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM EDTA), 1 mg/ml Leupeptin und 144 mM PMSF (in Dimethylformamid). Die Endkonzentration von Leupeptin betrug 1 ug/ml und für PMSF 2,4 mM. Vorzugsweise beinhaltet der TE-Puffer Dithiothreit (DTT), um eine Endkonzentration von 1 mM DTT bereitzustellen. Das Gemisch wird bei geringer Geschwindigkeit in einem Mischgerät homogenisiert. Alle Glasgeräte werden vor der Verwendung gebacken, und die bei der Aufreinigung verwendeten Lösungen werden, falls möglich, vor der Verwendung autoklaviert. Die Zellen werden durch einen zweimaligen Durchgang über einen Mikroverflüssiger bei 10.000 psi lysiert.
Das Lysat wird mit 1 · TE, enthaltend 1 mM DTT, bis zu einem Endvolumen von 5,5 · Zell-Feuchtmasse verdünnt. Leupeptin wird bis zu 1 ug/ml zugegeben und PMSF wird bis zu 2,4 mM zugegeben. Das Endvolumen (Fraktion I) beträgt etwa 1540 ml.
Ammoniumsulfat wird allmählich bis zu 0,2 M (26,4 g/l) zugegeben und das Lysat gerührt. Nach der Zugabe von Ammoniumsulfat bildet sich ein Präzipitat, das vor dem nachstehend beschriebenen Polyethylenimin (PEI)-Präzipitationsschritt entfernt wird. Das Ammoniumsulfatpräzipitat wird durch eine 20-minütige Zentrifugation der Suspension bei 15.000- 20.000 · g in einem JA-14-Rotor entfernt. Der Überstand wird dekantiert und zurückbehalten. Der Ammoniumsulfatüberstand wird auf einer Heizplatte gerührt, bis der Überstand eine Temperatur von 75ºC erreicht, und wird dann in ein 77ºC warmes Bad gestellt und dort unter gelegentlichem Rühren 15 Minuten belassen. Der Überstand wird dann in einem Eisbad auf 20ºC gekühlt und ein 10 ml-Aliquot wird zur PEI-Titration entnommen.
Eine PEI-Titration und Agarosegelelektrophorese werden angewendet, um zu bestimmen, daß 0,3% PEI (im Handel erhältlich von BDH als Polymin P) 90% der makromolekularen DNA und RNA ausfällt, d. h. es ist keine DNA-Bande auf einem Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel nach der Behandlung mit PEI sichtbar. Das PEI wird langsam unter Rühren bis zu 0,3% aus einer 10%igen Stammlösung zugegeben. Der PEI-behandelte Überstand wird bei 10.000 Upm (17.000 · g) 20 Minuten in einem JA-14-Rotor zentrifugiert. Dei Überstand wird dekantiert und zurückbehalten. Das Volumen (Fraktion II) beträgt etwa 1340 ml.
Die Fraktion II wird auf eine 2,6 · 13,3 cm (71 ml) große Phenylsepharose CL-4B (Pharmacia-LKB)-Säule nach dem Äquilibrieren mit 6 bis 10 Säulenvolumina TE, enthaltend 0,2 M Ammoniumsulfat, geladen. Die Fraktion II wird dann mit einer linearen Durchflußrate von 10 cm/Std. geladen. Die Durchflußrate beträgt 0,9 ml/min. Die Säule wird mit 3 Säulenvolumina des Äquilibrierungspuffers und dann mit 2 Säulenvolumina TE gewaschen, um kontaminierende Nicht-DNA-Polymerase-Proteine zu entfernen. Die rekombinante thermostabile DNA-Polymerase wird mit 4 Säulenvolumina 2,5 M Harnstoff in TE, enthaltend 20% Ethylenglykol, eluiert. Die die DNA-Polymerase enthaltenden Fraktionen werden mittels optischer Absorption (A&sub2;&sub8;&sub0;), einem DNA-Polymerase-Aktivitätstest und einer SDS-PAGE gemäß Standardverfahren identifiziert. Peakfraktionen werden vereinigt und durch eine 0,2 Mikron-Vakuumsterilfiltrationsvorrichtung gefiltert. Das Volumen (Fraktion III) beträgt etwa 195 ml. Das Harz wird gemäß den Empfehlungen des Herstellers äquilibriert und recycelt.
Eine 2,6 · 1,75 cm (93 ml) große Heparin-Sepharose C1-6B-Säule (Pharmacia- LKB) wird mit 6-10 Säulenvolumina 0,05 M KCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA und 0,2% Tween 20 bei 1 Säulenvolumen/Stunde äquilibriert. Vorzugsweise enthält der Puffer 1 mM DTT. Die Säule wird mit 3 Säulenvolumina des Äquilibrierungspuffers gewaschen. Die gewünschte erfindungsgemäße thermostabile DNA-Polymerase wird mit 10 Säulenvolumina eines linearen Gradienten eines 50-750 mM KCl-Gradienten in dem gleichen Puffer eluiert. Fraktionen (1/10 Säulenvolumen) werden in sterilen Röhrchen gesammelt, und die die gewünschte thermostabile DNA-Polymerase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt (Fraktion IV, Volumen 177 ml).
Die Fraktion IV wird auf einer Amicon YM30-Membran auf 10 ml konzentriert. Zum Pufferaustausch wird 5mal eine Dialfiltration mit 2,5 · Aufbewahrungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM KCl, 0,25 mM EDTA, 2,5 mM DTT und 0,5% Tween 20) durchgeführt, indem die Konzentrationsvorrichtung jedesmal auf 20 ml aufgefüllt und die Volumina auf je 10 ml konzentriert werden. Die Konzentrationsvorrichtung wird entleert und mit 10 ml 2,5 · Aufbewahrungspuffer gespült, der mit dem Konzentrat vereinigt wird, wobei Fraktion V erhalten wird.
Eine Anionenaustauscherchiomatographie wird verwendet, um restliche DNA zu entfernen. Das Verfahren wird unter einem biologischen Sicherheits-Abzug durchgeführt, und es werden Steriltechniken angewendet. Eine Waters Sep-Pak plus QMA-Patrone mit einer sterilen 0,2 Mikron-Einmal-Spritzenfiltereinheit wird mit 30 ml 2,5 · Aufbewahrungspuffer unter Verwendung einer Spritze mit einer Rate von etwa 5 Tropfen pro Sekunde äquilibriert. Unter Verwendung einer Einmalspritze wird die Fraktion V über die Patrone mit etwa 1 Tropfen/Sekunde geleitet und in einem sterilen Röhrchen gesammelt. Die Patrone wird mit 5 ml 2,5 · Aufbewahrungspuffer gespült und im Luftstrom getrocknet. Das Eluat wird 1,5 · mit 80%igem Glycerin verdünnt und bei -20ºC aufbewahrt. Der so erhaltene letzte Fraktion IV-Pool enthält die aktive thermostabile DNA-Polymerase mit einer veränderten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität.
Zusätzlich zur ortsspezifische Mutagenese einer Nucleotidsequenz können auch Deletionsmutageneseverfahren angewendet werden, um die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität einer thermostabilen DNA-Polymerase abzuschwächen. Ein Beispiel einer solchen Deletionsmutation ist die Deletion aller aminoterminalen Aminosäuren bis zu und einschließlich des Glycinrests in der konservierten A(V/T)YG (SEQ ID NO: 15)-Domäne von thermostabilen DNA-Polymerasen.
Dem Fachmann ist bekannt, daß, wenn eine solche Deletionsmutante in rekombinanten Wirtszellen exprimiert werden soll, ein Methionin-Codon üblicherweise am 5'-Ende der codierenden Sequenz eingebaut wird, so daß in den vorstehenden Beispielen der Gattung Thermus die aminoterminale Sequenz des deletionsmutierten Proteins MET-ALA wäre.
Die bevorzugten Verfahren zur Durchführung von Deletionsmutationen schließen die Verwendung bekannter Restriktionsstellen in der Nucleotidsequenz der thermostabilen DNA-Polymerase ein. Nach der Identifizierung der einzelnen Aminosäure oder Aminosäuren, die deletiert werden soll(en), wird eine Restriktionsstelle identifiziert, die bei der Spaltung die Spaltung der Ziel-DNA-Sequenz an einer Position oder in geringem Maße 3' distal zu der Position bewirkt, die der zu deletierenden Aminosäure oder Domäne entspricht, aber Domänen beibehält, die andere Eigenschaften der Polymerase codieren, die erwünscht sind.
Alternativ können Restriktionsstellen an beiden Seiten (5' oder 3') der Sequenz, die die Zielaminosäure oder -domäne codiert, verwendet werden, um die Sequenz zu spalten. Jedoch ist dann eine Ligierung der zwei erwünschten Teile der Sequenz erforderlich. Diese Ligierung kann unter Anwendung von Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Fachgebiet Standard sind und in Beispiel 7 der PCT-Anmeldung Nr. 91/05753, eingereicht am 13. August 1991, veranschaulicht werden.
Ein anderes Verfahren zur Durchführung einer Deletionsmutation der thermostabilen DNA-Polymerase ist die Anwendung des PCR-Mutageneseverfahrens. Bei diesem Verfahren werden Primer hergestellt, die eine Restriktionsstellendomäne und gegebenenfalls ein Methionin-Codon beinhalten, falls ein solches Codon nicht bereits vorhanden ist. Auf diese Weise kann das Produkt der PCR mit diesem Primer mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten werden, um die Domäne zu entfernen, die die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität des Enzyms codiert. Dann werden die restlichen Teile des Produkts miteinander ligiert, um die codierende Sequenz für eine thermostabile DNA-Polymerase herzustellen, die keine 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität besitzt. Solche codierenden Sequenzen können als Expressionsvektoren in geeigneten Wirtszellen verwendet werden, um die gewünschte thermostabile DNA-Polymerase herzustellen, die keine 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität besitzt.
Es wurde auch festgestellt, daß, zusätzlich zu den Taq-DNA-Polymerase-Mutanten mit einer verminderten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität, eine verkürzte Tma-DNA-Polymerase mit einer verminderten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität durch Rekombinationsverfahren hergestellt werden kann, auch wenn die vollständige codierende Sequenz des Tma- DNA-Polymerase-Gens in einem Expressionsvektor in E. coli vorhanden ist. Eine solche verkürzte Tma-DNA-Polymerase wird durch eine von dem Methionin-Codon an Position 140 ausgehende Translation hergestellt. Außerdem können rekombinante Mittel verwendet werden, um eine verkürzte Polymerase herzustellen, die dem Protein entspricht, das durch Initiation der Translation an dem Methionin-Codon an Position 284 der Tma odierenden Sequenz hergestellt wird.
Die Tma-DNA-Polymerase, die die Aminosäuren 1 bis 139 (etwa 86 kDa) nicht aufweist, und die Tma-DNA-Polymerase, die die Aminosäuren 1 bis 283 (etwa 70 kDa) nicht aufweist, behalten ihre Polymeraseaktivität bei, aber besitzen eine abgeschwächte 5' nach 3'- Exonucleaseaktivität. Ein zusätzlicher Vorteil der 70 kDa großen Tma-DNA-Polymerase ist, daß sie wesentlich thermostabiler als die native Tma-Polymerase ist.
Auf diese Weise wurde festgestellt, daß für die Aktivität nicht die ganze Sequenz des intakten Tma-DNA-Polymerase I-Enzyms erforderlich ist. Teile der Tma-DNA-Polymerase I-codierenden Sequenz können bei DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden, um ein biologisch aktives Genprodukt mit einer DNA-Polymerase-Aktivität herzustellen.
Außerdem stellt die Verfügbarkeit von DNA, die die Tma-DNA-Polymerase- Sequenz codiert, die Möglichkeit bereit, die codierende Sequenz zu modifizieren, um Mutein (mutierte Protein)-Formen zu erzeugen, die auch eine DNA-Polymerase-Aktivität, aber mit einer abgeschwächten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität besitzen. Der amino(N)-terminale Teil der Tma-DNA-Polymerase ist für die Polymeraseaktivität nicht erforderlich, sondern codiert vielmehr die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität des Proteins.
Somit kann man unter Anwendung der DNA-Rekombinantionsmethodik etwa bis zu einem Drittel der N-terminalen codierenden Sequenz des Tma-Gens deletieren, clonieren und ein Genprodukt exprimieren, das in Polymerasetests völlig aktiv ist, aber in Abhängigkeit vom Umfang der Deletion keine 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität besitzt. Da bestimmte N-terminal verkürzte Formen der Polymerase aktiv sind, können die zur Expression dieser Polymerasen verwendeten Genkonstrukte die entsprechend verkürzten Formen der codierenden Sequenz einschließen.
Zusätzlich zu den N-terminalen Deletionen können einzelne Aminosäurereste in der Peptidkette der Tma-DNA-Polymerase oder anderen thermostabilen DNA-Polymerasen durch Oxidation, Reduktion oder eine andere Derivation modifiziert werden, und das Protein kann gespalten werden, um Fragmente zu erhalten, die die Polymeraseaktivität beibehalten, aber eine abgeschwächte 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität besitzen. Modifikationen der Primärstruktur der die Tma-DNA-Polymerase codierenden Sequenz oder der codierenden Sequenzen anderer thermostabiler DNA-Polymerasen durch Deletion, Addition oder Umlagerung, um die Aminosäuren zu verändern, die in die thermostabile DNA-Polymerase während der Translation der mRNA, die von dieser codierenden Sequenz hergestellt wurde, eingebaut werden, können durchgeführt werden, ohne die DNA-Polymerase-Aktivität des Proteins bei hohen Temperaturen zu zerstören.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von thermostabilen DNA-Polymerasen, die neue Eigenschaften besitzen, wie eine verminderte oder erhöhte 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität, ist ein "domain-shuffling"-Verfahren zur Konstruktion von "thermostabilen chimären DNA-Polymerasen". Zum Beispiel würde die Substitution der die Tma-DNA-Poly merase codierenden Sequenz, umfassend die Codons von etwa 291 bis etwa 484, durch die Codons 289-422 der Taq-DNA-Polymerase I eine neue thermostabile DNA-Polymerase ergeben, die die 5' nach 3'-Exonucleasedomäne der Taq-DNA-Polymerase (1-289), die 3' nach 5'-Exonucleasedomäne der Tma-DNA-Polymerase (291-484) und die DNA-Polymerase-Domäne der Taq-DNA-Polymerase (423-832) enthält. Alternativ können die 5' nach 3'-Exonucleasedomäne und die 3' nach 5'-Exonucleasedomänen der Tma-DNA-Polymerase (ca. Codons 1-484) mit den DNA-Polymerase (dNTP-Bindungs- und Primer/Matrize-Bindungsdomänen)-Bereichen der Taq-DNA-Polymerase (ca. Codons 423-832) verknüpft werden.
Es ist offensichtlich, daß die Donatoren und Empfänger für die Erzeugung einer "thermostabilen chimären DNA-Polymerase" durch das "domain-shuffling"-Verfahren nicht auf Taq- und Tma-DNA-Polymerasen begrenzt sein müssen. Andere thermostabile Polymerasen stellen vergleichbare Domänen wie Taq- und Tma-DNA-Polymerasen bereit. Außerdem kann die 5' nach 3'-Exonucleasedomäne von einer thermostabilen DNA-Polymerase mit einer veränderten 5' nach 3'-Nucleaseaktivität abgeleitet werden. Zum Beispiel kann die 1- 289-5' nach 3'-Nucleasedomäne der Taq-DNA-Polymerase von einer mutierten Form des Taq-Polymerase-Gens abgeleitet werden, in der Gly (46) zu Asp mutiert ist. In ähnlicher Weise können die 5' nach 3'-Nuclease- und 3' nach 5'-Nucleasedomänen der Tma-DNA- Polymerase eine 5' nach 3'-Exonuclease-defiziente Domäne codieren und als ein DNA- Fragment, das die Aminosäuren 1 bis 484 von Tma codiert, wobei Gly (37) zu Asp mutiert ist, oder alternativ als ein verkürztes DNA-Fragment, das Met 140 bis Aminosäure 484 codiert, wiedergewonnen werden.
Obwohl jedes einer Vielzahl von Verfahren zur Erzeugung von DNA-Polymerase codierenden Sequenzen (die neue Eigenschaften besitzen) angewendet werden kann, verwendet ein bevorzugtes Verfahren die "überlappende" PCR. Bei diesem Verfahren wird die gewünschte Verbindungssequenz in die PCR-Primer integriert (in ihre 5'-Enden). Nach der ersten Amplifikation der einzelnen Domänen werden die verschiedenen Produkte verdünnt (ca. 100- bis 1000fach) und vereinigt, denaturiert, aneliert, verlängert und dann werden die endgültigen Vorwärts- und Rückwärtsprimer für eine ansonsten Standard-PCR zugegeben.
Dem Fachmann ist bekannt, daß die vorstehenden thermostabilen DNA-Polymerasen mit einer abgeschwächten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität am einfachsten durch DNA-Rekombinationsverfahren konstruiert werden. Wenn man die Herstellung eines der erfindungsgemäßen mutierten Enzyme mit einer abgeschwächten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität oder eines Derivats oder Homologs solcher Enzyme wünscht, beinhaltet die Herstellung einer rekombinanten Form des Enzyms üblicherweise die Konstruktion eines Expressionsvektors, die Transformation einer Wirtszelle mit dem Vektor und die Züchtung der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression zulassen.
Zur Konstruktion des Expressionsvektors wird eine DNA-Sequenz erhalten, die das reife (hier verwendet, um alle Chimären oder Muteine einzuschließen) Enzym oder ein Fusionsprodukt der mutierten Polymerase mit einer zusätzlichen Sequenz, die die Aktivität nicht zerstört, oder mit einer zusätzlichen Sequenz, die unter kontrollierten Bedingungen spaltbar ist (z. B. durch die Behandlung mit einer Peptidase), wobei ein aktives Protein erhalten wird, codiert. Die codierende Sequenz wird dann in funktionelle Verknüpfung mit geeigneten Kontrollsequenzen in einem Expressionsvektor gebracht. Der Vektor kann so konstruiert sein, daß er sich in der Wirtszelle autonom repliziert oder in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert. Der Vektor wird zur Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet, und der transformierte Wirt wird unter Bedingungen gezüchtet, die zur Expression der rekombinanten Polymerase geeignet sind.
Jeder der vorstehenden Schritte kann auf vielfältige Weise durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die gewünschte codierende Sequenz aus genomischen Fragmenten gewonnen und direkt in geeigneten Wirten verwendet werden. Die Konstruktion von Expressionsvektoren, die in einer Vielzahl von Wirten verwendet werden können, wird unter Verwendung von geeigneten Replicons und Kontrollsequenzen durchgeführt, wie nachstehend allgemein angegeben ist. Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschten codierenden und Kontrollsequenzen enthalten, umfaßt Standardligierungs- und Restriktionsverfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, modifiziert und in der gewünschten Form religiert. Geeignete Restriktionsstellen können, falls nicht normalerweise vorhanden, an die Enden der codierenden Sequenz angehängt werden, um die Konstruktion eines Expressionsvektors zu vereinfachen, wie nachstehend veranschaulicht wird.
Die ortsspezifische DNA-Spaltung wird durch die Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym (oder -enzymen) unter Bedingungen durchgeführt, die im allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannt sind und von den Herstellern der im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben werden. Vgl. z. B. New England Biolabs, Produktkatalog. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid- oder eine andere DNA durch eine Einheit Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung gespalten; in den nachstehenden Beispielen wird im allgemeinen ein Überschuß des Restriktionsenzyms verwendet, um die vollständige Spaltung der DNA sicherzustellen. Inkubationszeiträume von etwa einer bis zwei Stunden bei etwa 37ºC sind üblich, obwohl Veränderungen tolerierbar sind. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt; an diese Extraktion kann sich eine Etherextraktion und die Gewinnung der DNA aus wäßrigen Fraktionen durch Präzipitation mit Ethanol anschließen. Gegebenenfalls kann eine Größenauftrennung der gespalteten Fragmente durch eine Polyacrylamidgel- oder Agarosegelelektrophorese unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt werden. Vgl. z. B. Methods in Enzymology 65 (1980), 499- 560.
Restriktionsgespaltene Fragmente mit einzelsträngigen, "überhängenden" Enden können durch die Behandlung mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) unter Verwendung von Inkubationszeiträumen von etwa 15 bis 25 Minuten bei 20ºC bis 25ºC in 50 mM Tris- HCl, pH 7,6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 5 bis 10 uM dNTPs in glatte Enden (doppelsträngige Enden) überführt werden. Das Klenow-Fragment füllt 5' überhängende Enden auf, aber entfernt überhängende 3'-Einzelstränge, auch wenn die vier dNTPs vorhanden sind. Gegebenenfalls kann eine selektive Reparatur durchgeführt werden, indem nur eines der oder ausgewählte dNTPs innerhalb der durch die Natur der überhängenden Enden vorgegebenen Begrenzungen bereitgestellt wird. Nach der Behandlung mit dem Klenow-Fragment wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und ethanolgefällt. Vergleichbare Ergebnisse können unter Verwendung der S1-Nuclease erzielt werden, da eine Behandlung mit S1-Nuclease unter geeigneten Bedingungen die Hydrolyse jeglicher einzelsträngiger Teile einer Nucleinsäure zur Folge hat.
Synthetische Oligonucleotide können unter Anwendung des Triesterverfahrens von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), 3185-3191, oder von automatisierten Syntheseverfahren hergestellt werden. Die Phosphorylierung von Einzelsträngen vor der Anelierung oder zur Markierung wird unter Verwendung eines Überschusses, z. B. etwa 10 Einheiten, von Polynucleotidkinase für 0,5 uM Substrat in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit (DTT) und 1 bis 2 uM ATP durchgeführt. Falls die Phosphorylierung zum Markieren der Sonde dient, enthält das ATP eine hochspezifische γ-³²P- Aktivität.
Die Ligierungen werden in 15-30 ul Volumina mit den folgenden üblichen Bedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 33 ug/ml BSA, 10 mM bis 50 mM NaCl und entweder 40 uM ATP und 0,01 bis 0,02 (Weiss)-Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0ºC (zur Ligierung von Fragmenten mit komplementären einzelsträngigen Enden) oder 1 mM ATP und 0,3 bis 0,6 Einheiten T4- DNA-Ligase bei 14ºC (zur Ligierung "glatter Enden"). Intermolekulare Ligierungen von Fragmenten mit komplementären Enden werden üblicherweise mit DNA-Gesamtkonzentrationen von 33-100 ug/ml (Enden-Endkonzentration 5 bis 100 nM) durchgeführt. Intermolekulare Ligierungen glatter Enden (üblicherweise gegebenenfalls unter Verwendung eines 20- bis 30fachen molaren Überschusses von Linkem) werden bei einer Enden-Gesamtkonzentration von 1 uM durchgeführt.
Bei der Vektorkonstruktion wird das Vektorfragment üblicherweise mit alkalischer Phosphatase aus Bakterien oder Kälberdarm (BAP oder CIAP) behandelt, um die 5'-Phosphatgruppe zu entfernen und eine Religierung und Rekonstruktion des Vektors zu verhindern. Die BAP- und CIAP-Spaltbedingungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, und veröffentlichte Protokolle sind den im Handel erhältlichen BAP- und CIAP-Enzymen üblicherweise beigefügt. Zur Gewinnung der Nucleinsäurefragmente wird die Präparation mit Phenol-Chloroform extrahiert und ethanolgefällt, um die Phosphatase zu entfernen und die DNA zu reinigen. Alternativ kann die Religierung unerwünschter Vektorfragmente durch eine Restriktionsenzymspaltung vor oder nach der Ligierung verhindert werden, falls geeignete Restriktionsstellen verfügbar sind.
Für Teile von Vektoren oder codierenden Sequenzen, für die Sequenzmodifikationen erforderlich sind, ist eine Vielzahl von ortsspezifischen, primergerichteten Mutageneseverfahren verfügbar. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) kann verwendet werden, um eine ortsspezifische Mutagenese durchzuführen. Bei einem anderen Verfahren, das auf dem Fachgebiet jetzt Standard ist, wird ein synthetisches Oligonucleotid, das die gewünschte Mutation codiert, als Primer verwendet, um die Synthese einer komplementären Nucleinsäuresequenz eines einzelsträngigen Vektors, wie pBS13+, zu steuern, der als Matrize zur Konstruktion des Verlängerungsprodukts des mutagenisierenden Primers dient. Die durch Mutagenese verändert DNA wird in ein Wirtsbakterium transformiert, und Kulturen der transformierten Bakterien werden ausplattiert und identifiziert. Die Identifizierung modifizierter Vektoren kann den Transfer der DNA ausgewählter Transformanten auf einen Nitrocellulosefilter oder eine andere Membran einschließen und die "Abdrücke" werden mit einem phosphorylierten synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die die Hybridisierung einer genauen Paarung mit der modifizierten Sequenz erlaubt, aber die Hybridisierung mit dem ursprünglichen Strang verhindert. Transformanten, die DNA enthalten, die mit der Sonde hybridisiert, werden dann gezüchtet und dienen als Reservoir für die modifizierte DNA.
Bei den nachstehend angegebenen Konstruktionen werden die korrekten Ligierungen bestätigt, indem zuerst der E. coli-Stamm DG101 oder ein anderer geeigneter Wirt mit dem Ligierungsgemisch transformiert wird. Erfolgreiche Transformanten werden durch eine Ampicillin-, Tetracyclin- oder eine andere Antibiotikaresistenz oder Empfindlichkeit oder durch die Verwendung anderer Marker, abhängig von Art der Plasmidkonstruktion, selektiert, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Plasmide aus den Transformanten werden dann gemäß dem Verfahren von Clewell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62 (1969), 1159, präpariert, gegebenenfalls gefolgt von einer Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell, J. Bakteriol. 110 (1972), 667). Ein anderes Verfahren zum Erhalt von Plasmid- DNA wird als "Base-Säure"-Extraktionsverfahren auf Seite 11 der Bethesda Research Laboratories-Veröffentlichung Focus, Bd. 5, Nummer 2, beschrieben, und hochreine Plasmid-DNA kann erhalten werden, indem die Schritte 12 bis 17 des Protokolls durch eine CsCl/Ethidiumbromid-Ultrazentrifugation der DNA ersetzt werden. Die isolierte DNA wird durch Restriktionsenzymspaltung analysiert und/oder durch das Didesoxyverfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463, wie weiter von Messing et al., Nuc. Acids Res. 9 (1981), 309, beschrieben wird, oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65 (1980), 499, sequenziert.
Die Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsverfahren hängen vom Typ der zur Expression des Gens verwendeten Wirtszelle ab. Im allgemeinen werden Prokaryonten-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzellen als Wirte verwendet. Prokaryontische Wirte sind für die Herstellung rekombinanter Proteine im allgemeinen am effizientesten und geeignetsten und werden deshalb zur Expression der erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen bevorzugt.
Der am häufigsten zur Expression rekombinanter Proteine verwendete Prokaryont ist E. coli. Zur Clonierung und Sequenzierung und zur Expression von Konstruktionen unter Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren kann der E. coli K12-Stamm MM294, erhalten vom E. coli Genetic Stock Center unter GCSC #6135, als Wirt verwendet werden. Für Expressionsvektoren mit der PLNRBS-Kontrollsequenz kann der E. coli K12-Stamm MC1000 lambda lysogen, N&sub7;N&sub5;&sub3;cI&sub8;&sub5;&sub7; SusP&sub8;&sub0;, ATCC-39531, verwendet werden. E. coli DG116, der bei der ATCC (ATCC-53606) am 7. April 1987 hinterlegt wurde, und E. coli KB2, der bei der ATCC (ATCC-53075) am 29. März 1985 hinterlegt wurde, sind ebenfalls nützliche Wirtszellen. Für M13-Phagen-Rekombinanten werden E. coli-Stämme verwendet, die für eine Phageninfektion empfänglich sind, wie der E. coli K12-Stamm DG98. Der DG98-Stamm wurde bei der ATCC (ATCC-39768) am 13. Juli 1984 hinterlegt.
Es können jedoch auch andere mikrobielle Stämme außer E. coli wie Bacilli, zum Beispiel Bacillus subtilis, verschiedene Arten von Pseudomonas und andere Bakterienstämme, zur rekombinanten Expression der erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen verwendet werden. In solchen prokaryontischen Systemen werden üblicherweise Plasmidvektoren verwendet, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen enthalten, die vom Wirt oder einer mit dem Wirt kompatiblen Art stammen.
Zum Beispiel wird E. coli üblicherweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322 transformiert, wie von Bolivar et al., Gene 2 (1977), 95, beschrieben. Das Plasmid pBR322 enthält Gene für eine Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz. Diese Wirkstoffresistenzmarker können bei der Konstruktion des gewünschten Vektors entweder beibehalten oder zerstört werden und so beim Nachweis der Anwesenheit einer gewünschten Rekombinante behilflich sein. Häufig verwendete prokaryontische Kontrollsequenzen, d. h. ein Promotor zur Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit einer Ribosomenbindungsstellensequenz, beinhalten die β-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose (lac)-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198 (1977), 1056), das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980), 4057) und den Lambda- abgeleiteten PL-Promotor (Shimatake et al., Nature 292 (1981), 128) und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (NRBS). Eine bewegliche Kontrollsystem-Kassette wird im US-Patent Nr. 4,711,845, erteilt am 8. Dezember 1987, angegeben. Diese Kassette umfaßt einen PL- Promotor, der mit der Ness-Sequenz funktionell verknüpft ist, die wiederum stromaufwärts einer dritten DNA-Sequenz mit mindestens einer Restriktionsstelle positioniert ist, die die Spaltung innerhalb von 6 bp 3' von der NRBS-Sequenz erlaubt. Ebenfalls nützlich ist das von Chang et al. in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 196,864, veröffentlicht am 8. Oktober 1986, beschriebene Phosphatase A (phoA)-System. Es kann jedoch jedes verfügbare Promotorsystem, das mit Prokaryonten vereinbar ist, zur Konstruktion eines Expressionsvektors für die erfindungsgemäße modifizierte thermostabile DNA-Polymerase verwendet werden.
Zusätzlich zu Bakterien können auch eukaryontische Mikroorganismen wie Hefe als rekombinante Wirtszellen verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe, werden am häufigsten verwendet, obwohl eine Reihe von anderen Stämmen allgemein zugänglich sind. Während Vektoren, die den 2 Mikron-Replikationsursprung verwenden, üblich sind (Broach, Meth. Enz. 101 (1983), 307), sind andere zur Expression in Hefe geeignete Plasmidvektoren bekannt (vgl. zum Beispiel Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Tschempe et al., Gene 10 (1980), 157; und Clarke et al., Meth. Enz. 101 (1983), 300). Kontrollsequenzen für Hefevektoren umfassen Promotoren für die Synthese von glycolytischen Enzymen (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968), 149; Holland et al., Biotechnology 17 (1978), 4900; und Holland et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 1385). Weitere auf dem Fachgebiet bekannte Promotoren schließen den Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 2073) und solche für andere glycolytische Enzyme, wie Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Andere Promotoren, die den weiteren Vorteil aufweisen, daß die Transkription durch Wachstumsbedingungen reguliert wird, sind die Promotorbereiche für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziierte, abbauende Enzyme und für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortliche Enzyme (Holland, a. a. O.).
Terminatorsequenzen können auch verwendet werden, um die Expression zu verstärken, wenn sie am 3'-Ende der codierenden Sequenz eingebaut werden. Solche Terminatoren findet man im 3'-nicht-translatierten Bereich, der den codierenden Sequenzen in von Hefe stammenden Genen folgt. Jeder Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, einen Replikationsursprung und andere Kontrollsequenzen enthält, ist zur Verwendung bei der Konstruktion von Hefe-Expressionsvektoren für die erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen geeignet.
Die Nucleotidsequenzen, die die erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen codieren, können auch in eukaryontischen Wirtszellkulturen exprimiert werden, die von mehrzelligen Organismen abgeleitet sind. Vgl. zum Beispiel Tissue Culture, Academic Press, Cruz und Patterson, Herausgeber (1973). Nützliche Wirtszellinien umfassen COS-7, COS-A2, CV-1, Maus-Zellen, wie die Maus-Myelome N51 und VERO, HeLa-Zellen und Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO). Expressionsvektoren für solche Zellen schließen üblicherweise Promotoren und Kontrollsequenzen, die mit Säugerzellen kompatibel sind, wie zum Beispiel die üblicherweise verwendeten frühen und späten Promotoren aus dem Simianvirus 40 (SV40) (Fiers et al., Nature 273 (1978), 113) oder andere virale Promotoren, wie solche, die von Polyoma stammen, Adenovirus 2, Rinderpapillomavirus (BPV) oder Vogel-Sarkomviren, oder Immunglobulin-Promotoren und Hitzeschock-Promotoren ein. Ein System zur Expression von DNA in Säugersystemen unter Verwendung eines BPV-Vektorsystems wird im US-Patent Nr. 4,419,446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems wird im US-Patent Nr. 4,601,978 beschrieben. Allgemeine Aspekte von Säugerzellwirtssystem-Transformationen wurden von Axel, US-Patent Nr. 4,399,216, beschrieben. "Enhancer"-Bereiche sind ebenfalls bei der Optimierung der Expression wichtig; diese sind im allgemeinen Sequenzen, die stromaufwärts des Promotorbereichs vorkommen. Replikationsursprünge können gegebenenfalls aus viralen Quellen erhalten werden. Jedoch ist die Integration in das Chromosom ein üblicher Mechanismus zur DNA-Replikation in Eukaryonten.
Pflanzenzellen können auch als Wirte verwendet werden, und Kontrollsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 561) stehen zur Verfügung. Expressionssysteme unter Verwendung von Insektenzellen, die die von Baculoviren bereitgestellten Kontrollsysteme verwenden, wurden ebenfalls beschrieben (Miller et al., Genetic Engineering (Setlow et al., Hrsg., Plenum Publishing) 8 (1986), 277). Die Expression auf Basis von Insektenzellen kann in Spodoptera frugipeida durchgeführt werden. Diese Systeme können auch verwendet werden, um erfindungsgemäße rekombinante thermostabile Polymerasen herzustellen.
In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Anwendung von für solche Zellen geeigneten Standardverfahren durchgeführt. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie von Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 2110, beschrieben, wird für Prokaryonten oder andere Zellen verwendet, die feste Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens (Shaw et al., Gene 23 (1983), 315) wird für bestimmte Pflanzenzellen verwendet. Für Säugerzellen wird das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und von der Eb, Virology 52 (1978), 546, bevorzugt. Transformationen in Hefe werden gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130 (1977), 946, und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 3829, durchgeführt.
Nachdem die gewünschte thermostabile DNA-Polymerase mit einer veränderten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität in einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert wurde, kann die Reinigung des Proteins wünschenswert sein. Obgleich eine Vielzahl von Reinigungsverfahren zur Reinigung der erfindungsgemäßen thermostabilen Polymerasen angewendet werden kann, können weniger Schritte erforderlich sein, um ein Enzympräparat von gleicher Reinheit zu gewinnen. Da E. coli-Wirtsproteine hitzeempfindlich sind, können die erfindungsgemäßen rekombinanten thermostabilen DNA-Polymerasen durch Hitzeinaktivierung des Rohlysats in großem Maß angereichert werden. Dieser Schritt wird in Gegenwart einer ausreichenden Menge eines Salzes (üblicherweise 0,2-0,3 M Ammoniumsulfat) durchgeführt, um die Dissoziation der thermostabilen DNA-Polymerase von der Wirt-DNA sicherzustellen und die ionischen Wechselwirkungen der thermostabilen DNA-Polymerase mit anderen Zelllysatproteinen zu verringern.
Außerdem begünstigt die Gegenwart von 0,3 M Ammoniumsulfat die hydrophobe Wechselwirkung mit einer Phenylsepharose-Säule. Die Hydrophobohromatographie ist ein Trennverfahren, bei dem Stoffe auf Grundlage unterschiedlicher Stärken der hydrophoben Wechselwirkung mit einem ungeladenen Bettmaterial mit hydrophoben Gruppen getrennt werden. Üblicherweise wird die Säule zuerst unter Bedingungen äquilibriert, die hydrophobe Bindungen begünstigen, wie eine hohe Jonenstärke. Ein absteigender Salzgradient kann dann zur Elution der Probe verwendet werden.
Erfindungsgemäß wird ein wäßriges Gemisch (enthaltend die rekombinante thermostabile DNA-Polymerase mit einer veränderten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität) auf eine Säule geladen, die ein relativ stark hydrophobes Gel enthält, wie Phenylsepharose (hergestellt von Pharmacia) oder Phenyl-TSK (hergestellt von Toyo Soda). Um die hydrophobe Wechselwirkung mit einer Phenylsepharose-Säule zu begünstigen, wird ein Lösungsmittel verwendet, das zum Beispiel mehr als oder gleich 0,3 M Ammoniumsulfat, wobei 0,3 M bevorzugt werden, oder mehr als oder gleich 0,5 M NaCl enthält. Die Säule und die Probe werden auf 0,3 M Ammoniumsulfat in 50 mM Tris (pH 7,5) und 1,0 mM EDTA ("TE")-Puffer eingestellt, der auch 0,5 mM DTT enthält, und die Probe wird auf die Säule aufgetragen. Die Säule wird mit dem 0,3 M Ammoniumsulfat-Puffer gewaschen. Das Enzym kann dann mit Lösungsmitteln eluiert werden, die die hydrophoben Wechselwirkungen abschwächen, wie absteigende Salzgradienten, Ethylen- oder Propylenglykol oder Harnstoff.
Für eine dauerhafte Stabilität können die erfindungsgemäßen thermostabilen DNA- Polymerase-Enzyme in einem Puffer aufbewahrt werden, der ein oder mehrere nichtionische polymere Detergentien enthält. Solche Detergentien sind im allgemeinen jene, die ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 100 bis 250.000 Dalton, vorzugsweise etwa 4.000 bis 200.000 Dalton, aufweisen und das Enzym bei einem pH-Wert von etwa 3,5 bis etwa 9,5, vorzugsweise von etwa 4 bis 8,5, stabilisieren. Beispiele solcher Detergentien umfassen jene, die auf den Seiten 295-298 von McCutcheon's Emulsifiers & Detergents, Nordamerika- Ausgabe (1983), veröffentlicht von der McCutcheon Division of MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA), angegeben werden.
Vorzugsweise sind die Detergentien ausgewählt aus ethoxylierten Fettalkoholethern und Laurylethern, ethoxylierten Alkylphenolen, Octylphenoxypolyethoxyethanolverbindungen, modifizierten oxyethylierten und/oder oxypropylierten geradkettigen Alkoholen, Polyethylenglykolmonooleatverbindungen, Polysorbatverbindungen und phenolischen Fettalkoholethern. Besonders bevorzugt werden Tween 20, ein polyoxyethyliertes (20)-Sorbitmonolaurat von ICI Americas Inc., Wilmington, DE, und Iconol NP-40, ein ethoxyliertes Alkylphenol (Nonyl) von BASF Wyandotte Corp., Parsippany, NJ.
Die erfindungsgemäßen thermostabilen Enzyme können für jeden Zweck verwendet werden, für den eine derartige Enzymaktivität notwendig oder erwünscht ist.
Die DNA-Sequenzierung durch das Didesoxynucleotidverfahren von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) wurde in den letzten Jahren erheblich verfeinert, einschließlich der Entwicklung neuer Vektoren (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119), Basenanaloga (Mills et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 2232-2235 und Barr et al., Biotechniques 4 (1986), 428-432), Enzyme (Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 4763-4771 und Innis M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 9436-9940) und Geräte zur Teilautomatisierung der DNA-Sequenzanalyse (Smith et al., Nature 321 (1986), 674-679; Prober et al., Science 238 (1987), 336-341 und Ansorge et al., Nuc. Acids Res. 15 (1987), 4593-4602). Das grundlegende Didesoxysequenzierungsverfahren beinhaltet (i) die Anelierung eines Oligonucleotidprimers an eine geeignete einzel- oder denaturierte doppelsträngige DNA-Matrize; (ii) Verlängerung des Primers mit einer DNA-Polymerase in vier getrennten Reaktionen, wobei jede ein α-markiertes dNTP oder ddNTP (alternativ kann ein markierter Primer verwendet werden), ein Gemisch aus unmarkierten dNTPs und einem Kettenabbruch-Didesoxynucleotid-5'-triphosphat (ddNTP) enthält; (iii) Auflösen der vier Sätze von Reaktionsprodukten auf einem hoch auflösenden Polyacrylamid-Harnstoff-Gel und (iv) die Entwicklung eines autoradiographischen Abbildes des Gels, das untersucht werden kann, um die DNA-Sequenz abzuleiten. Alternativ können fluoreszenzmarkierte Primer oder Nucleotide verwendet werden, um die Reaktionsprodukte zu identifizieren. Bekannte Didesoxysequenzierungsverfahren verwenden eine DNA-Polymerase, wie das Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I, reverse Transkriptase, Taq-DNA-Polymerase oder eine modifizierte T7-DNA-Polymerase.
Die Einführung von im Handel erhältlichen Kits hat das Fachgebiet sehr vereinfacht, wodurch die DNA-Sequenzierung zu einem Routineverfahren für jedes Labor gemacht wurde. Jedoch besteht auf dem Fachgebiet noch immer ein Bedarf für Sequenzierungsprotokolle, die gut mit Nucleinsäuren funktionieren, die eine Sekundärstruktur wie Palindrom-Haarnadelschleifen enthalten, und bei G+C-reicher DNA. Einzelsträngige DNAs können eine Sekundärstruktur ausbilden, wie eine Haarnadelschleife, die das Didesoxysequenzierungsprotokoll nennenswert beeinträchtigen kann, sowohl durch falsche Termination bei der Verlängerungsreaktion als auch, im Falle eines Enzyms mit einer 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität, durch Spaltung des Matrizenstrangs an der Verbindungsstelle der Haarnadelstruktur. Da eine hohe Temperatur die Sekundärstruktur destabilisiert, führt die Möglichkeit, die Verlängerungsreaktion bei einer hohen Temperatur, d. h. 70-75ºC, mit einer thermostabilen DNA-Polymerase durchzuführen, zu einer signifikanten Verbesserung bei der Sequenzierung von DNA, die eine solche Sekundärstruktur enthält. Jedoch beseitigen Temperaturen, die mit einer Polymerase-Verlängerung vereinbar sind, nicht alle Sekundärstrukturen. Eine 5' nach 3'-Exonuclease-defiziente, thermostabile DNA-Polymerase würde auf dem Fachgebiet eine weitere Verbesserung darstellen, da die Polymerase durch die Haarnadelstrukur in einer Strangverdrängungsreaktion hindurch synthetisieren könnte, anstatt die Matrize zu spalten, was eine falsche Termination, d. h. ein Verlängerungsstartfragment, zur Folge hat.
Als Alternative zur grundlegenden Didesoxysequenzierung ist die zyklische Didesoxysequenzierung eine lineare asymmetrische Amplifikation von Zielsequenzen in Gegenwart von Didesoxy-Kettenterminatoren. Ein einziger Zyklus erzeugt eine Familie von Verlängerungsprodukten aller möglichen Längen. Nach der Denaturierung des Verlängerungsreaktionsprodukts an der DNA-Matrize finden mehrere Zyklen der Primeranelierung und Primerverlängerung in Gegenwart von Didesoxy-Terminatoren statt. Das Verfahren ist von der PCR insofern verschieden, als nur ein Primer verwendet wird, das Wachstum der Sequenzierungsreaktionsprodukte in jedem Zyklus linear ist und die Amplifikationsprodukte hinsichtlich der Länge heterogen sind und nicht als Matrize für die nächste Reaktion dienen. Die zyklische Didesoxysequenzierung ist ein Verfahren, das Vorteile für Labore, die automatische DNA-Sequenzierungsgeräte verwenden, und für andere Labore mit einem hohen Sequenzierungsdurchsatz bereitstellt. Durch die Empfindlichkeit des Verfahrens und der erhöhten Menge des erzeugten Signals ist es möglich, genomische DNA ohne Clonierung direkt zu sequenzieren. Protokolle für die zyklische Sequenzierung sind an einzel- und doppelsträngige Matrizen angepaßt, einschließlich genomische, clonierte und PCR-amplifizierte Matrizen.
Thermostabile DNA-Polymerasen weisen bei der zyklischen Sequenzierung mehrere Vorteile auf: sie tolerieren die stringenten Anelierungstemperaturen, die zur spezifischen Hybridisierung des Primers an genomische Zielmoleküle erforderlich sind, sowie die mutiplen Zyklen der Denaturierung bei hoher Temperatur, die in jedem Zyklus erfolgt. Die Durchführung der Verlängerungsreaktion bei hohen Temperaturen, d. h. 70-75ºC, führt zu einer signifikanten Verbesserung der Sequenzierungsergebnisse mit DNA, die Sekundärstrukturen enthält, die auf die Destabilisierung der Sekundärstruktur zurückzuführen ist. Jedoch beseitigen solche Temperaturen nicht alle Sekundärstrukturen. Eine 5' nach 3'-Exonuclease-defiziente, thermostabile DNA-Polymerase würde eine weitere Verbesserung auf dem Fachgebiet darstellen, da die Polymerase durch die Haarnadelstruktur hindurch in einer Strangverdrängungsreaktion synthetisieren könnte, anstatt die Matrize zu spalten und eine falsche Termination zu erzeugen. Zusätzlich weist die zyklische Sequenzierung, so wie die PCR, den Nachteil des Phänomens der Produktstrangrenaturierung auf. Im Fall einer thermostabilen DNA-Polymerase, die eine 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität besitzt, führt die Verlängerung eines Primers in einem doppelsträngigen Bereich, der durch die Produktstrangrenaturierung erzeugt wurde, zur Spaltung des renaturierten komplementären Produktstrangs. Der gespaltene Strang ist kürzer und erscheint so als falsche Termination. Zusätzlich wird das richtige zuvor synthetisierte Terminationssignal abgeschwächt. Eine thermostabile DNA- Polymerase, die bezüglich der 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität defizient ist, würde das Fachgebiet insofern verbessern, als solche Verlängerungsproduktfragmente nicht gebildet werden. Eine Variation der zyklischen Sequenzierung beinhaltet die gleichzeitige Bildung von Sequenzierungsleitern für jeden Strang einer doppelsträngigen Matrize, während ein gewisser Amplifikationsgrad beibehalten wird (Ruano und Kidd, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2815-2819). Dieses Verfahren einer gekoppelten Amplifikation und Sequenzierung würde in einer ähnlichen Weise wie eine ins Stocken geratene zyklische Sequenzierung von der Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase profitieren, die bezüglich der 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität defizient ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform katalysieren die Enzyme, bei denen die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität vermindert oder eliminiert wurde, die als PCR bekannte Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion und, wie vorstehend angegeben, mit der resultierenden Wirkung, daß eine bessere Ausbeute des gewünschten Produkts bereitgestellt wird, als mit den jeweiligen nativen Enzymen erzielt wird, die höhere 5' nach 3'-Exonucleaseaktivitätswerte aufweisen. Die verbesserten Ausbeuten sind das Ergebnis der Unfähigkeit, das bereits synthetisierte Produkt abzubauen, was sonst durch die 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität bewirkt wird. Dieses Verfahren zum Amplifizieren von Nucleinsäuresequenzen wird in den US-Patenten Nrn. 4,683,202 und 4,865,11 offenbart und beansprucht. Das PCR- Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren beinhaltet die Amplifikation von mindestens einer spezifischen Nucleinsäuresequenz, die in einer Nucleinsäure oder einem Gemisch von Nucleinsäuren enthalten ist, und es erzeugt in der üblichsten Ausführungsform doppelsträngige DNA. Von verbesserten Ausbeuten abgesehen, zeigen thermostabile DNA-Polymerasen mit einer abgeschwächten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität eine verbesserte Fähigkeit zur Erzeugung längere PCR-Produkte, eine verbesserte Fähigkeit zur Herstellung von Produkten von G+C-reichen Matrizen und eine verbesserte Fähigkeit zur Erzeugung von PCR-Produkten und DNA-Sequenzierungsleitern von Matrizen mit einer stark ausgeprägten Sekundärstruktur.
Zur Erleichterung der Diskussion setzt das nachstehend angegebene Protokoll voraus, daß die spezifische Sequenz, die amplifiziert werden soll, in einer doppelsträngigen Nucleinsäure enthalten ist. Jedoch ist das Verfahren in gleicher Weise beim Amplifizieren einer einzelsträngigen Nucleinsäure wie mRNA nützlich, obgleich gemäß der bevorzugten Ausführungsform das Endprodukt noch doppelsträngige DNA ist. Bei der Amplifikation einer einzelsträngigen Nucleinsäure beinhaltet der erste Schritt die Synthese eines komplementären Strangs (für diesen Zweck kann einer der zwei Amplifikationsprimer verwendet werden), und die folgenden Schritte verlaufen wie bei dem nachstehend beschriebenen doppelsträngigen Amplifikationsverfahren.
Dieses Amplifikationsverfahren umfaßt die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen eines jeden Nucleinsäurestrangs mit vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und zwei Oligonucleotidprimern für jede spezifische Sequenz, die amplifiziert werden soll, wobei jeder Primer so gewählt ist, daß er zu den verschiedenen Strängen der spezifischen Sequenz im wesentlichen komplementär ist, so daß das von einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt, wenn es von seinem Komplementärstrang getrennt wird, als Matrize zur Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers dienen kann, wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur erfolgt, die die Hybridisierung eines jeden Primers mit einem komplementären Nucleinsäurestrang erlaubt;
(b) Inkontaktbringen eines jeden Nucleinsäurestrangs, zur gleichen Zeit wie oder nach Schritt (a), mit einer erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerase, die die Verknüpfung der Nucleosidtriphosphate ermöglicht, um Primerverlängerungsprodukte herzustellen, die zu jedem Strang der spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementär sind;
(c) Halten des Gemisches aus Schritt (b) bei einer wirksamen Temperatur während eines wirksamen Zeitraums, um die Aktivität des Enzyms zu fördern und um für jede verschiedene Sequenz, die amplifiziert werden soll, ein Verlängerungsprodukt eines jeden Primers zu synthetisieren, das zu jeder Nucleinsäurestrangmatrize komplementär ist, wobei die Temperatur nicht so hoch ist, so daß jedes Verlängerungsprodukt von der komplementären Strangmatrize getrennt wird;
(d) Erwärmen des Gemisches aus Schritt (c) für einen wirksamen Zeitraum und bei einer wirksamen Temperatur, um die Primerverlängerungsprodukte von den Matrizen zu trennen, an denen sie synthetisiert wurden, um einzelsträngige Moleküle herzustellen, wobei die Temperatur nicht so hoch ist, daß das Enzym irreversibel denaturiert wird;
(e) Kühlen des Gemisches aus Schritt (d) für einen wirksamen Zeitraum und bei einer wirksamen Temperatur, um die Hybridisierung eines Primers an jedes der in Schritt (d) hergestellten einzelsträngigen Moleküle zu begünstigen; und
(f) Halten des Gemisches aus Schritt (e) bei einer wirksamen Temperatur für einen wirksamen Zeitraum, um die Aktivität des Enzyms zu fördern und um für jede verschiedene Sequenz, die amplifiziert werden soll, ein Verlängerungsprodukt eines jeden Primers zu synthetisieren, das zu jeder in Schritt (d) hergestellten Nucleinsäurematrize komplementär ist, wobei die Temperatur aber nicht so hoch ist, daß jedes Verlängerungsprodukt von der komplementären Strangmatrize getrennt wird.
Die wirksamen Zeiträume und Temperaturen in den Schritten (e) und (f) können übereinstimmen, so daß die Schritte (e) und (f) gleichzeitig durchgeführt werden können. Die Schritte (d)-(f) werden wiederholt, bis der gewünschte Amplifikationsgrad erhalten wird.
Das Amplifikationsverfahren ist nicht nur zur Herstellung von großen Mengen einer spezifischen Nucleinsäuresequenz mit bekannter Sequenz nützlich, sondern auch zur Herstellung von Nucleinsäuresequenzen, von denen bekannt ist, daß sie existieren, aber die nicht vollständig spezifiziert sind. Es muß nur eine ausreichende Zahl von Basen an beiden Enden der Sequenz in hinreichenden Einzelheiten bekannt sein, so daß zwei Oligonucleotidprimer hergestellt werden können, die mit verschiedenen Strängen der gewünschten Sequenz an relativen Positionen entlang der Sequenz hybridisieren können, so daß ein von einem Primer synthetisiertes Verlängerungsprodukt, wenn es von der Matrize (Komplementärstrang) getrennt wird, als Matrize für die Verlängerung des anderen Primers zu einer Nucleinsäuresequenz definierter Länge dienen kann. Je größer die Kenntnisse über die Basen an beiden Enden der Sequenz sind, desto größer kann die Spezifität der Primer für die Ziel- Nucleinsäuresequenz und die Wirksamkeit des Verfahrens und die Spezifität der Reaktion sein.
In jedem Fall muß eine erste Kopie der zu amplifizierenden Sequenz zur Verfügung stehen, obwohl die Sequenz nicht rein oder ein einzelnes Molekül sein muß. Im allgemeinen beinhaltet das Amplifikationsverfahren eine Kettenreaktion zur Herstellung von mindestens einer spezifischen Nucleinsäuresequenz in exponentiellen Mengen, relativ zu der Anzahl der damit verbundenen Reaktionsschritte, vorausgesetzt daß (a) die Enden der erforderlichen Sequenz in hinreichenden Einzelheiten bekannt sind, so daß Oligonucleotide synthetisiert werden können, die mit ihnen hybridisieren, und (b) daß eine kleine Menge der Sequenz zur Verfügung steht, um die Kettenreaktion zu initiieren. Das Produkt der Kettenreaktion ist ein einzelner Nucleinsäuredoppelstrang mit Enden, die den 5'-Enden der spezifischen verwendeten Primer entsprechen.
Jede Nucleinsäuresequenz, in gereinigter oder ungereinigter Form, kann als Ausgangsnucleinsäure(n) verwendet werden, mit der Maßgabe, daß sie die spezifische Nucleinsäuresequenz, die man zu amplifizieren wünscht, enthält, oder von der erwartet wird, daß sie diese Sequenz enthält. Die zu amplifizierende Nucleinsäure kann aus einer beliebigen Quelle erhalten werden, zum Beispiel aus Plasmiden, wie pBR322, aus clonierter DNA oder RNA oder aus natürlicher DNA oder RNA aus einer beliebigen Quelle, einschließlich Bakterien, Hefe, Viren, Organellen und höhere Organismen wie Pflanzen und Tiere. Die DNA oder RNA kann aus Blut, Gewebematerial wie Chorionzotten oder Amnionzellen durch eine Vielzahl von Verfahren extrahiert werden. Vgl. z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 280- 281. So kann das Verfahren zum Beispiel DNA oder RNA, einschließlich Boten-RNA, verwenden, wobei die DNA oder RNA einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann. Zusätzlich kann ein DNA-RNA-Hybrid verwendet werden, das einen Strang von jeder Molekülart enthält. Ein Gemisch aus jeder dieser Nucleinsäuren kann ebenfalls verwendet werden, ebenso wie aus einer vorhergehenden Amplifikationsreaktion (unter Verwendung der gleichen oder verschiedener Primer) hergestellte Nucleinsäuren. Die spezifische Nucleinsäure, die amplifiziert werden soll, kann nur eine Fraktion eines großen Moleküls sein oder kann zuerst als ein einzelnes Molekül vorliegen, so daß die spezifische Sequenz aus der gesamten Nucleinsäure besteht.
Die zu amplifizierende Sequenz muß anfangs nicht in einer reinen Form vorliegen; die Sequenz kann eine kleine Fraktion eines komplexen Gemisches sein, wie z. B. ein Teil des β-Globingens, das in der gesamten menschlichen DNA enthalten ist (wie bei Saiki et al., Science 230 (1985), 1530-1534, veranschaulicht), oder als Teil einer Nucleinsäuresequenz, die auf einen bestimmten Mikroorganismus zurückzuführen ist, wobei der Organismus nur eine sehr kleine Fraktion einer bestimmten biologischen Probe ausmachen kann. Die Zellen können nach der Suspension in einem hypotonischen Puffer und einer Wärmebehandlung bei etwa 90ºC-100ºC, bis die Zellyse und Dispersion intrazellulärer Komponenten erfolgt (im allgemeinen 1 bis 15 Minuten), direkt in das Amplifikationsverfahren eingesetzt werden. Nach dem Erwärmungsschritt können die Amplifikationsreagentien direkt zu den lysierten Zellen gegeben werden. Die Ausgangs-Nucleinsäuresequenz kann mehr als eine gewünschte spezifische Nucleinsäuresequenz enthalten. Das Amplifikationsverfahren ist nicht nur zur Herstellung von großen Mengen einer spezifischen Nucleinsäuresequenz nützlich, sondern auch zur gleichzeitigen Amplifikation mehr als einer unterschiedlichen spezifischen Nucleinsäuresequenz, die sich auf den gleichen oder auf unterschiedlichen Nucleinsäuremolekülen befinden.
Primer spielen beim PCR-Verfahren eine Schlüsselrolle. Das Wort "Primer", so wie es in der Beschreibung des Amplifikationsverfahrens verwendet wird, kann sich auf mehr als einen Primer beziehen, besonders in dem Fall, bei dem im Hinblick auf die Information über die terminale(n) Sequenz(en) des zu amplifizierenden Fragments einige Unklarheit besteht, oder wenn das in der PCT-Anmeldung Nr. 91/05753, eingereicht am 13. August 1991, beschriebene Verfahren mittels degenerierten Primern angewendet wird. Zum Beispiel kann in dem Fall, wenn eine Nucleinsäuresequenz aus einer Proteinsequenzinformation abgeleitet ist, eine Auswahl von Primern, die Sequenzen enthalten, die alle möglichen Codonvariationen, basierend auf der Degeneration des genetischen Codes, repräsentieren, für jeden Strang verwendet werden. Ein Primer von dieser Auswahl ist zu einem Teil der gewünschten Sequenz, die amplifiziert werden soll, hinreichend homolog, um zur Amplifikation nützlich zu sein.
Zusätzlich kann mehr als eine spezifische Nucleinsäuresequenz von der ersten Nucleinsäure oder einem Gemisch von Nucleinsäuren amplifiziert werden, so lange die geeignete Anzahl unterschiedlicher Oligonucleotidprimer verwendet wird. Zum Beispiel werden, falls zwei unterschiedliche spezifische Nucleinsäuresequenzen hergestellt werden sollen, vier Primer verwendet. Zwei der Primer sind für eine der spezifischen Nucleinsäuresequenzen spezifisch und die anderen zwei Primer sind für die zweite spezifische Nucleinsäuresequenz spezifisch. Auf diese Weise kann jede der beiden unterschiedlichen spezifischen Sequenzen durch das vorliegende Verfahren exponentiell hergestellt werden.
Eine Sequenz innerhalb einer bestimmten Sequenz kann nach einer bestimmten Anzahl von Amplifikationszyklen durch Zugabe eines Satzes von Primern, die zu innerhalb der Sequenz angeordneten Sequenzen (d. h. Sequenzen, die nicht an den Enden angeordnet sind) der zu amplifizierenden Sequenz komplementär sind nach mindestens einem Amplifikationszyklus amplifiziert werden, um eine größere Spezifität bei der Reaktion zu erhalten Solche Primer können bei jedem beliebigen Schritt zugegeben werden und ergeben ein kürzeres amplifiziertes Fragment. Alternativ kann ein längeres Fragment hergestellt werden durch die Verwendung von Primern mit nicht-komplementären Enden, die aber eine gewisse Überlappung mit den Primern aufweisen, die zuvor bei der Amplifikation verwendet wurden.
Primer spielen auch eine Schlüsselrolle, wenn das Amplifikationsverfahren zur in vitro-Mutagenese angewendet wird. Das Produkt einer Amplifikationsreaktion, bei der die verwendeten Primer zu der ursprünglichen Matrize nicht völlig komplementär sind, enthält die Sequenz des Primers anstatt der Matrize, wodurch eine in vitro-Mutation eingeführt wird. In weiteren Zyklen wird diese Mutation mit unverminderter Wirksamkeit amplifiziert, da kein weiteres falschgepaartes Starten erforderlich ist. Das Verfahren zur Herstellung einer veränderten DNA-Sequenz, wie vorstehend beschrieben, kann mit der veränderten DNA unter Verwendung anderer Primer wiederholt werden, um weitere Sequenzveränderungen zu induzieren. Auf diese Weise kann schrittweise eine Reihe von mutierten Sequenzen hergestellt werden, wobei jede neue Addition zu der Reihe sich von der letzten geringfügig, aber von der ursprünglichen DNA-Quellsequenz in zunehmenden Maße unterscheidet.
Da der Primer als Teil seiner Sequenz eine nicht-komplementäre Sequenz enthalten kann, mit der Maßgabe, daß ein hinreichender Anteil des Primers eine Sequenz enthält, die zu dem zu amplifizierenden Strang komplementär ist, können viele andere Vorteile erzielt werden. Zum Beispiel kann eine Nucleotidsequenz, die zu der Matrizensequenz nicht komplementär ist (wie z. B. ein Promotor, ein Linker, eine codierende Sequenz, etc.), an das 5'-Ende eines oder beider Primer gebunden sein und so an das Produkt des Amplifikationsverfahrens angehängt werden. Nachdem der Verlängerungsprimer zugegeben wurde, werden genügend Zyklen durchgeführt, um die gewünschte Menge der neuen Matrize zu erhalten, die die nicht-komplementäre Nucleotidinsertion enthält. Dies erlaubt die Herstellung großer Mengen der zusammengesetzten Fragmente innerhalb eines verhältnismäßig kurzen Zeitraums (z. B. zwei Stunden oder weniger) unter Anwendung eines einfachen Verfahrens.
Oligonucleotidprimer können unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden wie zum Beispiel die vorstehend beschriebenen Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren oder automatisierte Ausführungsformen davon. In solchen automatisierten Ausführungsformen werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsstoffe verwendet, die synthetisiert werden können, wie von Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1862, beschrieben wurde. Ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden an einem modifizierten festen Träger wird im US-Patent Nr. 4,458,066 beschrieben. Man kann auch einen Primer verwenden, der aus einer biologischen Quelle isoliert wurde (wie ein Restriktionsendonuclease-Spaltprodukt).
Gleichgültig welche Primer verwendet werden, muß das Reaktionsgemisch jedoch eine Matrize enthalten, damit eine PCR stattfindet, da die spezifische Nucleinsäuresequenz unter Verwendung einer Nucleinsäure hergestellt wird, die diese Sequenz als Matrize enthält. Der erste Schritt beinhaltet das Inkontaktbringen eines jeden Nucleinsäurestrangs mit vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und zwei Oligonucleotidprimern für jede spezifische Nucleinsäuresequenz, die amplifiziert oder nachgewiesen werden soll. Wenn die zu amplifizierenden oder nachzuweisenden Nucleinsäuren DNA-Moleküle sind, sind die Nucleosidtriphosphate üblicherweise dATP, dCTP, dGTP und dTTP, obwohl auch verschiedene Nucleotidderivate bei dem Verfahren verwendet werden können. Wenn zum Beispiel die PCR zum Nachweis einer bekannten Sequenz in einer Probe unbekannter Sequenzen verwendet wird, wird dTTP oft durch dUTP ersetzt, um die Verunreinigung zwischen Proben zu vermindern, wie in der PCT-Anmeldung Nr. 91/05210, eingereicht am 23. Juli 1991, gelehrt wird.
Die Konzentration der Nucleosidtriphosphate kann sehr variieren. Üblicherweise beträgt die Konzentration 50 bis 200 uM für jedes dNTP in dem Puffer zur Amplifikation, und MgCl&sub2; liegt in dem Puffer in einer Menge von 1 bis 3 mM vor, um die Polymerase zu aktivieren und die Spezifität der Reaktion zu erhöhen. Jedoch können dNTP-Konzentrationen von 1 bis 20 uM für einige Anwendungen bevorzugt werden, wie der DNA-Sequenzierung oder der Erzeugung radioaktiv markierter Sonden mit einer hohen spezifischen Aktivität.
Die Nucleinsäurestränge der Zielnucleinsäure dienen als Matrizen für die Synthese von zusätzlichen Nucleinsäuresträngen, die Verlängerungsprodukte der Primer sind. Diese Synthese kann unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens durchgeführt werden, wird im allgemeinen aber in einer gepufferten wäßrigen Lösung, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 bis 9, besonders bevorzugt etwa 8, durchgeführt. Um die Synthese zu vereinfachen, wird ein molarer Überschuß der zwei Oligonucleotidprimer zu dem Puffer gegeben, der die Matrizenstränge enthält. Aus praktischen Gründen ist die zugegebene Menge des Primers im allgemeinen in einem molaren Überschuß im Vergleich zu der Menge des komplementären Strangs (Matrize), wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch von komplizierten langkettigen Nucleinsäuresträngen enthalten ist. Ein hoher molarer Überschuß wird bevorzugt, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu verbessern. Demgemäß werden Primer : Matrize-Verhältnisse von mindestens 1000 : 1 oder größer im allgemeinen für clonierte DNA-Matrizen verwendet, und Primer : Matrize-Verhältnisse von etwa 10&sup8; : 1 oder größer werden im allgemeinen zur Amplifikation von komplexen genomischen Proben verwendet.
Das Gemisch aus Matrize, Primern und Nucleosidtriphosphaten wird dann behandelt, je nachdem, ob die zu amplifizierenden oder nachzuweisenden Nucleinsäuren doppel- oder einzelsträngig sind. Wenn die Nucleinsäuren einzelsträngig sind, muß kein Denaturierungsschritt vor dem ersten Verlängerungszyklus angewendet werden und das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur gehalten, die die Hybridisierung des Primers an seine Ziel (Matrizen-)-sequenz begünstigt. Ein solche Temperatur ist im allgemeinen etwa 35ºC bis 65ºC oder höher, vorzugsweise etwa 37ºC bis 60ºC für einen wirksamen Zeitraum, im allgemeinen einige wenige Sekunden bis fünf Minuten, vorzugsweise 30 Sekunden bis eine Minute. Für 5' nach 3'-Exonuclease-mutierte thermostabile DNA-Polymerasen kann eine Hybridisierungstemperatur von 35ºC bis 70ºC verwendet werden. Primer, die eine Länge von 15 Nucleotiden oder länger aufweisen, werden verwendet, um die Spezifität der Primer-Hybridisierung zu erhöhen. Kürzere Primer erfordern niedrigere Hybridisierungstemperaturen.
Der Komplementärstrang zu den ursprünglich einzelsträngigen Nucleinsäuren kann synthetisiert werden durch Zugabe der erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerase in Gegenwart des geeigneten Puffers, dNTPs und eines oder mehrerer Oligonucleotidprimer. Falls ein geeigneter einzelner Primer zugegeben wird, ist das Primerverlängerungsprodukt zu der einzelsträngigen Nucleinsäure komplementär und hybridisiert mit dem Nucleinsäurestrang in einem Doppelstrang von Strängen gleicher oder unterschiedlicher Länge (abhängig davon, wo der Primer mit der Matrize hybridisiert), der dann in Einzelstränge getrennt werden kann, wie vorstehend beschrieben, um zwei einzelne, getrennte, komplementäre Stränge herzustellen. Dann wird ein zweiter Primer zugegeben, so daß nachfolgende Zyklen der Primerverlängerung unter Verwendung von sowohl der ursprünglichen einzelsträngigen Nucleinsäure als auch dem Verlängerungsprodukt des ersten Primers als Matrizen stattfinden. Alternativ können zwei oder mehrere geeignete Primer (einer davon initiiert die Synthese unter Verwendung des Verlängerungsprodukts des anderen Primers als Matrize) zu der einzelsträngigen Nucleinsäure gegeben und die Reaktion durchgeführt werden.
Falls die Nucleinsäure zwei Stränge enthält, wie im Falle der Amplifikation eines doppelsträngigen Zielmoleküls oder bei der zweiten zyklischen Amplifikation eines einzelsträngigen Zielmoleküls, müssen die Nucleinsäurestränge getrennt werden, bevor die Primer hybridisiert werden. Diese Strangtrennung kann durch jedes geeignete Denaturierungsverfahren einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel erreicht werden. Ein bevorzugtes physikalisches Verfahren zur Trennung der Nucleinsäurestränge beinhaltet das Erhitzen der Nucleinsäure bis zur vollständigen (> 99%) Denaturierung. Die Hitzedenaturierung beinhaltet üblicherweise Temperaturen im Bereich von etwa 80ºC bis 105ºC für Zeiträume, die im allgemeinen im Bereich von etwa wenigen Sekunden bis Minuten liegen, abhängig von der Zusammensetzung und der Größe der Nucleinsäure. Vorzugsweise beträgt die wirksame Denaturierungstemperatur 90ºC-100ºC für wenige Sekunden bis 1 Minute. Die Strangtrennung kann auch durch ein Enzym aus der als Helicasen bekannten Klasse von Enzymen oder das Enzym RecA induziert werden, das eine Helicaseaktivität besitzt und von dem bekannt ist, daß es in Gegenwart von ATP DNA denaturiert. Die zum Trennen der Stränge der Nucleinsäuren mit Helicasen geeigneten Reaktionsbedingungen werden beschrieben von Kuhn Hoffmann-Berling, CSH-Quantitative Biology 43 (1978), 63, und Verfahren zur Verwendung von RecA werden bei Radding, Ann. Rev. Genetics 16 (1982), 405-437, besprochen. Die Denaturierung erzeugt zwei getrennte komplementäre Stränge von gleicher oder unterschiedlicher Länge.
Falls die doppelsträngige Nucleinsäure durch Hitze denaturiert wird, läßt man das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur abkühlen, die die Hybridisierung eines jeden Primers mit der komplementäre Ziel (Matrizen)-sequenz begünstigt. Diese Temperatur beträgt üblicherweise in Abhängigkeit von den Reagentien etwa 35ºC bis 65ºC oder mehr, vorzugsweise 37ºC bis 60ºC. Die Hybridisierungstemperatur wird für einen wirksamen Zeitraum beibehalten, im allgemeinen einige wenige Sekunden bis Minuten und vorzugsweise 10 Sekunden bis 1 Minute. Unter praktischen Gesichtspunkten wird die Temperatur einfach von 95ºC auf 37ºC erniedrigt, und die Hybridisierung erfolgt bei einer Temperatur innerhalb dieses Bereichs.
Ob die Nucleinsäure einzel- oder doppelsträngig ist, die erfindungsgemäße thermostabile DNA-Polymerase kann vor oder während des Denaturierungsschritts zugegeben werden oder wenn die Temperatur auf den die Hybridisierung begünstigenden Bereich gesunken ist oder in diesem liegt. Obwohl die Thermostabilität der erfindungsgemäßen Polymerasen es erlaubt, solche Polymerasen dem Reaktionsgemisch zu jedem Zeitpunkt zuzugeben, kann man die unspezifische Amplifikation durch Zugabe der Polymerase zu dem Reaktionsgemisch zu einem Zeitpunkt, zu dem das Gemisch nicht unter die stringente Hybridisierungstemperatur abgekühlt ist, wesentlich hemmen. Nach der Hybridisierung wird das Reaktionsgemisch dann auf eine Temperatur erwärmt oder bei einer Temperatur gehalten, bei der die Aktivität des Enzyms gefördert oder optimiert wird, d. h., eine Temperatur, die ausreichend ist, um die Aktivität des Enzyms zu erhöhen, um die Synthese der Primerverlängerungsprodukte von dem hybridisierten Primer und der Matrize zu erleichtern. Die Temperatur muß schließlich ausreichend sein, um ein Verlängerungsprodukt eines jeden Primers zu synthetisieren, das zu jeder Nucleinsäurematrize komplementär ist, aber nicht so hoch, daß jedes Verlängerungsprodukt von seiner komplementären Matrize denaturiert wird (d. h. die Temperatur beträgt im allgemeinen weniger als etwa 80ºC-90ºC).
Abhängig von der (den) verwendeten Nucleinsäure(n) liegt die übliche für diese Synthesereaktion wirksame Temperatur im allgemeinen im Bereich von etwa 40ºC bis 80ºC, vorzugsweise 50ºC bis 75ºC. Die Temperatur liegt stärker bevorzugt im Bereich von etwa 65ºC bis 75ºC für die erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen. Der für diese Synthese erforderliche Zeitraum kann im Bereich von etwa 10 Sekunden bis mehrere Minuten oder mehr liegen, hauptsächlich abhängig von der Temperatur, der Länge der Nucleinsäure, dem Enzym und der Komplexität des Nucleinsäuregemisches. Der Verlängerungszeitraum beträgt üblicherweise 30 Sekunden bis wenige Minuten. Falls die Nuclein säure länger ist, ist im allgemeinen ein längerer Zeitraum zur komplementären Strangsynthese erforderlich.
Der neu synthetisierte Strang und der komplementäre Nucleinsäurestrang bilden ein doppelsträngiges Molekül, das in den nachfolgenden Schritten des Amplifikationsverfahrens verwendet wird. Im nächsten Schritt werden die Stränge des doppelsträngigen Moleküls durch Hitzedenaturierung bei einer Temperatur und für einen Zeitraum, die bzw. der zur Denaturierung des Moleküls wirksam ist, getrennt, aber nicht bei einer Temperatur und für einen Zeitraum, die so hoch ist bzw. der so lang ist, daß das thermostabile Enzym vollständig und irreversibel denaturiert oder inaktiviert wird. Nach dieser Denaturierung der Matrize wird die Temperatur auf einen Wert erniedrigt, der die Hybridisierung des Primers mit dem im vorherigen Schritt hergestellten komplementären einzelsträngigen Molekül (Matrize) begünstigt, wie vorstehend beschrieben.
Nach diesem Hybridisierungsschritt oder gleichzeitig mit dem Hybridisierungsschritt wird die Temperatur auf eine Temperatur eingestellt, die in der Förderung der Aktivität des thermostabilen Enzyms wirksam ist, um die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts unter Verwendung von sowohl der neu synthetisierten als auch der ursprünglichen Stränge als Matrize zu ermöglichen. Die Temperatur darf wiederum nicht so hoch sein, daß das Verlängerungsprodukt von seiner Matrize getrennt (denaturiert) wird, wie vorstehend beschrieben. Die Hybridisierung kann während dieses Schritts erfolgen, so daß der vorherige Abkühlungsschritt nach der Denaturierung nicht erforderlich ist. In einem solchen Fall, d. h. unter Verwendung von gleichzeitig durchgeführten Schritten, ist der bevorzugte Temperaturbereich 50ºC bis 70ºC.
Die an einem Zyklus der Strangtrennung, Hybridisierung und Verlängerungsproduktsynthese beteiligten Erwärmungs- und Abkühlungsschritte können so oft wie nötig wiederholt werden, um die gewünschte Menge der spezifischen Nucleinsäuresequenz herzustellen. Die einzige Begrenzung ist die vorhandene Menge der Primer, des thermostabilen Enzyms und der Nucleosidtriphosphate. Üblicherweise werden 15 bis 30 Zyklen beendet. Für den diagnostischen Nachweis amplifizierter DNA hängt die Zahl der Zyklen von der Art der Probe, der anfänglichen Zielmolekülkonzentration in der Probe und der Empfindlichkeit des nach der Amplifikation angewendeten Nachweisverfahrens ab. Für eine bestimmte Nachweisempfindlichkeit sind weniger Zyklen erforderlich, falls die zu amplifizierende Probe rein ist und die anfängliche Zielmolekülkonzentration hoch ist. Falls die Probe ein komplexes Gemisch von Nucleinsäuren ist und die anfängliche Zielmolekülkonzentration gering ist, sind mehr Zyklen erforderlich, um das Signal für den Nachweis ausreichend zu amplifizieren. Im allgemeinen wird das Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis etwa 15mal wiederholt. Wenn die Amplifikation angewendet wird, um Sequenzen zu erzeugen, die mit markierten sequenzspezifischen Sonden nachgewiesen werden sollen und wenn menschliche genomische DNA das Zielmolekül der Amplifikation ist, wird das Verfahren 15- bis 30mal wiederholt, um die Sequenz ausreichend zu amplifizieren, so daß ein deutlich nachweisbares Signal erzeugt wird, d. h. so daß kein Hintergrundrauschen den Nachweis stört.
Es müssen keine zusätzlichen Nucleotide, Primer oder zusätzliches thetmostabiles Enzym nach der ersten Zugabe zugegeben werden, mit der Maßgabe, daß kein Schlüsselreagens aufgebraucht wurde und daß das Enzym nicht denaturiert oder irreversibel inaktiviert wurde, in diesem Fall müßte zusätzliche Polymerase oder ein anderes Reagens zugegeben werden, damit die Reaktion fortschreitet. Nachdem die geeignete Zahl an Zyklen beendet wurde, um die gewünschte Menge der spezifischen Nucleinsäuresequenz herzustellen, kann die Reaktion in der üblichen Weise zum Stillstand gebracht werden, z. B. durch Inaktivieren des Enzyms durch Zugabe von EDTA, Phenol, SDS oder CHCl&sub3; oder durch Trennen der Komponenten der Reaktion.
Das Amplifikationsverfahren kann kontinuierlich durchgeführt werden. In einer Ausführungsform eines automatisierten Verfahrens kann das Reaktionsgemisch einem Temperaturwechsel unterworfen werden, so daß die Temperatur programmiert wird, um sie bei einem bestimmten Wert für einen bestimmten Zeitraum zu regulieren. Ein solches Gerät für diesen Zweck ist die zur Steuerung der Amplifikationsreaktion von Perkin-Elmer Cetus Instruments entwickelte und vertriebene automatische Vorrichtung. Ausführliche Anleitungen zur Durchführung einer PCR mit der Vorrichtung sind mit dem Erwerb der Vorrichtung erhältlich.
Die erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen mit einer veränderten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität sind bei verschiedenen Verfahren sehr nützlich, für die eine Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz durch PCR geeignet ist. Das Amplifikationsverfahren kann angewendet werden, um eine bestimmte Nucleinsäuresequenz zur Insertion in einen geeigneten Expressionsvektor zu clonieren, wie im US-Patent Nr. 4,800,159 beschrieben. Der Vektor kann zur Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus verwendet werden, um das Genprodukt der Sequenz durch Standardverfahren der DNA-Rekombinationstechnik herzustellen. Eine solche Clonierung kann die direkte Ligierung in einen Vektor unter Verwendung einer Ligierung glatter Enden oder die Verwendung von Restriktions enzymen zur Spaltung von Stellen, die in den Primern enthalten sind, einschließen. Andere für die erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen geeigneten Verfahren schließen die in den US-Patenten Nrn. 4,683,195 und 4,683,202 und in den Europäischen Patentveröffentlichungen Nrn. 229,701; 237,362 und 258,017 beschriebenen Verfahren ein. Das erfindungsgemäße Enzym ist außerdem nützlich bei der asymmetrischen PCR (vgl. Gyllensten und Erlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 7652-7656; der inversen PCR (Ochman et al., Genetics 120 (1988), 621) und zur DNA-Sequenzierung (vgl. Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 9436-9440 und McConloque et al., Nuc. Acids Res. 16 (20) (1988), 9869); zur Zufallsamplifikation von cDNA-Enden (RACE), zur Zufallsprimer-PCR, die angewendet wird, um eine Reihe von DNA-Fragmenten zu amplifizieren, und für PCR-Verfahren mit einseitiger Spezifität, wie die Anker-PCR und Ligierungs-vermittelte Anker-PCR, wie von Loh E. in Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2 (1991), 11-19, beschrieben wird.
Ein weiteres Verfahren, bei dem eine 5' nach 3'-Exonuclease-defiziente, thermostabile DNA-Polymerase nützlich wäre, ist ein als Polymerase-Ligase-Kettenreaktion (PLCR) bezeichnetes Verfahren. Wie seine Bezeichnung nahelegt, vereinigt dieses Verfahren Merkmale der PCR mit Merkmalen der Ligasekettenreaktion (LCR).
Die PLCR wurde zum Teil als ein Verfahren zur Erhöhung der Spezifität der allelspezifischen PCR entwickelt, bei der die geringen Konzentrationen der verwendeten dNTPs (~1 uM) das Ausmaß der Amplifikation begrenzen. Bei der PLCR wird die DNA denaturiert, und vier komplementäre, jedoch nicht benachbarte Oligonucleotidprimer werden zusammen mit dNTPs, einer thermostabilen DNA-Polymerase und einer thermostabilen Ligase zugegeben.
Die Primer lagern sich an die Ziel-DNA in einer nicht-benachbarten Weise an und die thermostabile DNA-Polymerase bewirkt die Addition geeigneter dNTPs an das 3'-Ende des stromabwärts angeordneten Primers, um die Lücke zwischen den nicht-benachbarten Primern aufzufüllen und auf diese Weise die Primer in Nachbarschaft zueinander zu bringen. Die thermostabile Ligase ligiert dann die zwei benachbarten Oligonucleotidprimer.
Jedoch verringert die Anwesenheit einer 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität in der thermostabilen DNA-Polymerase die Wahrscheinlichkeit erheblich, daß die Lücke zwischen den zwei Primern geschlossen wird, da eine solche Aktivität bewirkt, daß Nucleotide oder kleine Oligonucleotide aus dem 5'-Ende des stromabwärts angeordneten Primers ausgeschnitten werden, wodurch die Ligierung der Primer verhindert wird. Daher wäre eine thermostabile DNA-Polymerase mit einer abgeschwächten oder eliminierten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität bei der PLCR besonders nützlich.
Kurz zusammengefaßt, sind die erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerasen, die mutiert wurden, so daß sie eine verminderte, abgeschwächte oder eliminierte 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität besitzen, für die gleichen Verfahren und Techniken nützlich wie ihre jeweiligen nicht-mutierten Polymerasen, außer für Verfahren und Techniken, für die eine 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität erforderlich ist, wie das nachstehend erläuterte homogene Testverfahren. Außerdem haben die erfindungsgemäßen mutierten DNA-Polymerasen häufig eine wirksamere Leistungsfähigkeit der Verfahren und Techniken auf Grund der Verminderung oder Eliminierung der inhärenten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität zur Folge.
Spezifische thermostabile DNA-Polymerasen mit einer abgeschwächten 5' nach 3'- Exonucleaseaktivität schließen die folgenden mutierten Formen von Taq-, Tma-, Tsps17-, TZ05-, Tth- und Taf-Polymerasen ein. In der nachstehenden Tabelle und in der Beschreibung sind Deletionsmutationen in den durchnumerierten Nucleotiden oder Aminosäuren inbegriffen, die die Deletion definieren.

Beispiel 1

Herstellung einer 5' nach 3'-Exonuclease-Mutante der Taq-DNA-Polymerase durch Zufallsmutagenese-PCR der bekannten 5' nach 3'-Exonucleasedomäne

Herstellung einer Insertion

Das Plasmid pLSGl2 wurde als Matrize zur PCR verwendet. Dieses Plasmid ist eine HindIII-Minus-Version von pLSGS, worin die Nucleotide 616-621 des Taq-Polymerase- Gens von SEQ ID NO: 1 von AAGCTT zu AAGCTG verändert wurden. Dieser Austausch entfernt die HindIII-Erkennungssequenz innerhalb des Taq-Polymerase-Gens, ohne die codierte Proteinsequenz zu verändern.
Unter Verwendung der Oligonucleotide MK61 (AGGACTACAACTGCCACA- CACC) (SEQ ID NO: 21) und RA01 (CGAGGCGCGCCAGCCCCAGGAGATCTACCAG- CTCCTTG) (SEQ ID NO: 22) als Primer und pLSG12 als Matrize wurde eine PCR durchgeführt, um ein 384 bp-Fragment zu amplifizieren, das das ATG-Startcodon des Taq-Polymerase-Gens sowie zusätzlich 331 bp der codierenden Sequenz stromabwärts des ATG-Startcodons enthält.
Eine 100 ul-PCR wurde für 25 Zyklen unter Verwendung der folgenden Mengen der folgenden Agentien und Reaktantien durchgeführt:
50 umol Primer MK61 (SEQ ID NO: 21);
50 umol Primer RA01 (SEQ ID NO: 22);
50 gMjedes dNTP;
10 mM Tris-HCl, pH 8,3;
50 mM KCl;
1,5 mM MgCl&sub2;;
75,6 pg pLSGl2;
2,5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase.
Das beschriebene PCR-Reaktionsgemisch wurde in eine Perkin-Elmer Cetus Thermocycler-Vorrichtung gesetzt und dem folgenden Profil unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde zuerst über einen Zeitraum von 1 Minute und 45 Sekunden auf 98ºC erwärmt und bei 98ºC 25 Sekunden gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde dann innerhalb eines Zeitraums von 45 Sekunden auf 55ºC gekühlt und bei dieser Temperatur 20 Sekunden gehalten. Schließlich wurde das Gemisch innerhalb von 45 Sekunden auf 72ºC erwärmt und bei 72ºC 30 Sekunden gehalten. Eine letzte 5-minütige Verlängerung erfolgte bei 72ºC.
Das PCR-Produkt wurde dann unter Anwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, mit Chloroform extrahiert und mit Isopropanol präzipitiert.
Eine 300 ng-Probe des PCR-Produkts wurde mit 20 E HindIII (in 30 ul Reaktionsvolumen) 2 Stunden bei 37ºC gespalten. Dann wurde eine weitere Spaltung mit 8 E BssHII für einen Zeitraum von 2 Stunden bei 50ºC durchgeführt. Diese Reihe von Spaltungen ergab ein 330 bp-Fragment zum Clonieren.
Ein Vektor wurde durch Umsetzen von 5,3 ug pLSG12 mit 20 E HindIII (in 40 ul) 2 Stunden bei 37ºC hergestellt. An diese Spaltung schloß sich die Zugabe von 12 E BssHII und eine 2-stündige Inkubation bei 50ºC an.
Der Vektor wurde durch die Behandlung mit CIAP (alkalische Phosphatase aus Kälberdarm), genauer 0,04 E CIAP 30 Minuten bei 30ºC, dephosphoryliert. Dann wurden 4 ul 500 mM EGTA zu der Vektorpräparation zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und die Phosphatase wurde durch eine 45-minütige Inkubation bei 65ºC inaktiviert.
225 ng des vorstehend beschriebenen, mit Phosphatase behandelten Vektors wurden in einem 1 : 1-Molverhältnis mit 10 ng der PCR-abgeleiteten Insertion ligiert.
Dann wurden DG 116-Zellen mit 1/5 des Ligierungsgemisches transformiert, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden bei 30ºC selektiert.
Geeignete Kolonien wurden über Nacht bei 30ºC bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,7 gezüchtet. Die die PL-Vektoren enthaltenden Zellen wurden bei 37ºC in einem Schüttelwasserbad für 4, 9 oder 20 Stunden induziert, die Präparationen wurden mit Ultraschall behandelt und bei 75ºC in Gegenwart von 0,2 M Ammoniumsulfat wärmebehandelt. Schließlich wurden die Extrakte auf Polymeraseaktivität und 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität getestet.
Die 5' nach 3'-Exanucleaseaktivität wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen 5' nach 3'-Exonuclease-Tests quantitativ bestimmt. Genauer wurde die synthetische, 3'-phosphorylierte Oligonucleotidsonde (phosphoryliert, um eine Polymeraseverlängerung auszuschließen) BW33 (GATCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCp) (SEQ ID NO: 13) (100 umol) am 5'-Ende mit gamma-[³²P]-ATP (3000 Ci/mmol) und T4- Polynucleotidkinase ³²P-markiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol:Chloroform: Isoamylalkohol extrahiert, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation. Die ³²P-markierte Oligonucleotidsonde wurde in 100 ul TE-Puffer erneut gelöst und nicht eingehautes ATP wurde durch eine Gelfiltrationschromatographie an einer Sephadex G-50-Spinsäule entfernt. Fünf pmol ³²P-markierte BW33-Sonde wurden an 5 pmol einzelsträngige M13mp10w-DNA in Gegenwart von 5 umol des synthetischen Oligonucleotidprimers BW37 (GCGCTAGGG- CGCTGGCAAGTGTAGCGGTCA) (SEQ ID NO: 14) in einem 100 ul-Reaktionsvolumen, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl und 3 mM MgCl&sub2;, angelagert. Das Anlagerungsgemisch wurde in einer Perkin-Elmer Cetus-DNA-Thermal Cycler-Vorrichtung 5 Minuten auf 95ºC erwärmt, über 10 Minuten auf 70ºC gekühlt, bei 70ºC weitere 10 Minuten inkubiert und dann über einen Zeitraum von 30 Minuten auf 25ºC gekühlt. Exonuclease-Reaktionen, enthaltend 10 ul des Anlagerungsgemisches, wurden bei 70ºC 1 Minute vorinkubiert. Die erfindungsgemäßen thermostabilen DNA-Polymerase-Präparationen (etwa 0,3 E Enzymaktivität) wurden in einem 2,5 ul-Volumen zu dem Vorinkubationsreaktionsgemisch gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde bei 70ºC inkubiert. Aliquots (5 ul) wurden nach 1 Minute und 5 Minuten entnommen, und die Reaktion durch die Zugabe von 1 ul 60 mM EDTA gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Homochromatographie analysiert und die Exonucleaseaktivität wurde nach einer Autoradiographie quantitativ bestimmt. Die Chromatographie wurde in einem Homochromatographiegemisch, enthaltend 2% teilweise hydrolysierte Hefe-RNA in 7 M Harnstoff an Polygram CEL 300 DEAE-Cellulose-Dünnschichtchromatographieplatten durchgeführt. Die Anwesenheit einer 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität führte zur Bildung kleiner ³²P-markierter Oligomere, die auf der TLC-Platte nach oben wanderten und auf dem Autoradiogramm leicht von der nicht abgebauten Sonde zu unterscheiden waren, die an der ursprünglichen Stelle verharrte.
Der Clon 3-2 wies einen erwarteten Polymeraseaktivitätswert, aber eine kaum nachweisbare 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität auf. Dies entspricht einer Verminderung der 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität um mehr als das 1000fache im Vergleich zu der in der nativen Taq-DNA-Polymerase vorhandenen Aktivität.
Dieser Clon wurde dann sequenziert und es wurde festgestellt, daß G(137) in der DNA-Sequenz zu A mutiert war. Diese Mutation hatte eine Gly (46)-zu-Asp-Mutation in der Aminosäuresequenz der Taq-DNA-Polymerase zur Folge, auf diese Weise wurde eine erfindungsgemäße thermostabile DNA-Polymerase mit einer erheblich abgeschwächten 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität erhalten.
Das gewonnene Protein wurde gemäß dem Taq-DNA-Polymerase-Protokoll gereinigt.

Beispiel 2

Expression der verkürzten Tma-DNA-Polymerasen MET-ASP21 und MET-GLU74

Um die Translationsinitiation an dem Asparaginsäure-Codon an Position 21 der das Tma-DNA-Polymerase-Gen codierenden Sequenz zu bewirken, wird ein Methionin-Codon vor dem Codon eingeführt, und der Bereich von der ersten NcoI-Stelle bis zu diesem eingeführten Methionin-Codon wird deletiert. Ähnlich wie in Beispiel 4 schließt das Deletionsverfahren eine PCR mit dem gleichen vorstehend beschriebenen, stromabwärts angeordneten Primer (FL69) und einem stromaufwärts angeordneten Primer (FL66) ein, der konstruiert wurde, um eine NcoI-Stelle und ein Methionin-Codon einzubauen, um ein 570 Basenpaar- Produkt zu erhalten.
Das amplifizierte Produkt wurde mit einem Centricon-100-Mikrokonzentrationsgerät konzentriert, um überschüssige Primer und Puffer zu entfernen. Das Produkt wurde in einem Speed Vac-Konzentrationsgerät konzentriert und dann in dem Spaltungsgemisch resuspendiert. Das amplifizierte Produkt wurde mit NcoI und XbaI gespalten. In ähnlicher Weise wurde pTma12-1, pTma13 oder pTma19-RBS mit den gleichen zwei Restriktionsenzymen gespalten, und das gespaltene amplifizierte Fragment wird mit dem gespaltenen Expressionsvektor ligiert. Das so erhaltene Konstrukt weist eine Deletion von der NcoI-Stelle stromaufwärts des Startcodons der nativen Tma codierenden Sequenz bis zu dem neuen stromaufwärts des Asparaginsäure-Codons an Position 21 der nativen Tma codierenden Sequenz eingeführten Methionin-Codon auf.
In ähnlicher Weise wurde eine Deletionsmutante erzeugt, so daß die Translationsinitiation bei Glu74 beginnt, dem Glutaminsäure-Codon an Position 74 der nativen Tmacodierenden Sequenz. Ein stromaufwärts angeordneter Primer (FL67) wird konstruiert, um ein Methionin-Codon und eine NcoI-Stelle vor Glu74 einzuführen. Der stromabwärts angeordnete Primer und das verwendete Clonierungsprotokoll entsprechen dem vorstehend für das MET-ASP21-Konstrukt beschriebenen.
Die in diesem Beispiel verwendeten stromaufwärts angeordneten Primersequenzen sind nachstehend und im Abschnitt Sequenzprotokoll aufgeführt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: Gelfand, David H.
Abramson, Richard D.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG:
5' nach 3'-Exonucleasemutationen thermostabiler DNA-Polymerasen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 38
(iv) POSTADRESSE:
(A) ADRESSE: Cetus Corporation
(B) STRASSE: 1400 Fifty-third Street
(C) STADT: Emeryville
(D) STAAT: California
(F) POSTLEITZAHL: 94608
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: WordPerfect 5.0
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: WO
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-590,490
(B) EINREICHUNGSDATUM: 28. September 1990
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-590,466
(B) EINREICHUNGSDATUM: 28. September 1990
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-590,213
(B) EINREICHUNGSDATUM: 28. September 1990
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-523,394
(B) EINREICHUNGSDATUM: 15. Mai 1990
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-143,441
(B) EINREICHUNGSDATUM: 12. Januar 1988
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-063,509
(B) EINREICHUNGSDATUM: 17. Juni 1987
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-899,241
(B) EINREICHUNGSDATUM: 22. August 1986
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-746,121
(B) EINREICHUNGSDATUM: 15. August 1991
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: WO PCT/US90/07641
(B) EINREICHUNGSDATUM: 21. Dezember 1990
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-585,471
(B) EINREICHUNGSDATUM: 20. September 1990
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-455,611
(B) EINREICHUNGSDATUM: 22. Dezember 1989
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-609,157
(B) EINREICHUNGSDATUM: 2. November 1990
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US-557,517
(B) EINREICHUNGSDATUM: 24. Juli 1990
(viii) ANWALT/BEVOLLMÄCHTIGUNGS-INFORMATION:
(A) NAME: Sias Ph. D., Stacey R.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 32,630
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: Fall Nr. 2580
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: 415-420-3300
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2499 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Thermus aquaticus
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..2496 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 832 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2682 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Thermotoga maritima
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...2679 (xi) SEQIJENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 893 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2493 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Thermus species sps17
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...2490 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 830 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2505 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Thermus species Z05
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...2502 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 834 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2505 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Thermus thermophilus
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...2502 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 834 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2679 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Thermosipho africanus
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...2676 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 892 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Nucleotide
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA-Sonde BW33
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
GATCGCTCCG CCTAACCACC ACACCCCCCC CGC 33
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Nucleotide
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA-Primer BW37
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
GCGCTAGCGC GCCGCAACT CTAGCCGTCA 30
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Ja
(iv) ANTISENSE: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..4
(D) ANDERE INFORMATION: /Marker-Xaa
/Anmerkung = "Xaa = Val oder Th" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 21
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22 Nucleotide
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA-Primer MK61
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
AGGACTACAA CTGCCACACA CC 22
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 38 Nucleotide
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA-Primer RA01
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
CGnGCCCCCC CAGCCCCACC AGATCTACCA GCTCCTTC 38
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 31 Nucleotide
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA-Primer FL66
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
CTATGCCATC GATAGATCCC TTTCTACTTC C 31
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 31 Nucleotide
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA-Primer FL67
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
CAAGCCCATG GAAACTTACA AGCCTCAAAC A 31

Claims

1. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante, die eine abgeschwächte 5' nach 3'-Exonucleaseaktivität im Vergleich zu der Aktivität ihrer nativen thermostabilen DNA-Polymerase besitzt, wobei die native thermostabile DNA-Polymerase die konservierte Aminosäuresequenzdomäne A(X)YG umfaßt, in der X der Rest V oder T ist (SEQ ID No. 15), dadurch gekennzeichnet, daß der Glycinrest (G) in der konservierten Aminosäuresequenz A(X)YG von SEQ ID No. 15 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist.

2. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Glycinrest (G) in der konservierten Aminosäuresequenz A(X)YG von SEQ ID NO. 15 durch den Aminosäurerest Asparaginsäure (D) ersetzt ist.

3. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante nach Anspruch 1 oder 2, wobei die natürlich vorkommende thermostabile DNA-Polymerase eine Thermus aquaticus-Polymerase, Thermotoga maritima-Polymerase, Thermus thermophilus-Polymerase oder Thermosipho africanus-Polymerase ist.

4. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante mit der Sequenz der Aminosäurereste 1-832 von SEQ ID No. 2, worin jedoch der Glycinrest (G) an der Position 46 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, vorzugsweise durch den Aminosäurerest Asparaginsäure (D).

5. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante mit der Sequenz der Aminosäurereste 1-893 von SEQ ID No. 4, worin jedoch der Glycinrest (G) an der Position 37 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, vorzugsweise durch den Aminosäurerest Asparaginsäure (D).

6. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante mit der Sequenz der Aminosäurereste 1-830 von SEQ ID No. 6, worin jedoch der Glycinrest (G) an der Position 43 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, vorzugsweise durch den Aminosäurerest Asparaginsäure (D).

7. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante mit der Sequenz der Aminosäurereste 1-834 von SEQ ID No. 8, worin jedoch der Glycinrest (G) an der Position 46 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, vorzugsweise durch den Aminosäurerest Asparaginsäure (D).

8. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante mit der Sequenz der Aminosäurereste 1-834 von SEQ ID No. 10, worin jedoch der Glycinrest (G) an der Position 46 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, vorzugsweise durch den Aminosäurerest Asparaginsäure (D).

9. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante mit der Sequenz der Aminosäurereste 1-892 von SEQ ID No. 12, worin jedoch der Glycinrest (G) an der Position 37 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, vorzugsweise durch den Aminosäurerest Asparaginsäure (D).

10. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in der zusätzlich die 3' nach 5'- Exonucleasedomäne oder die Polymerase (dNTP-Bindungs- und Primer/Matrizenbindungs)-Domäne durch die entsprechende Domäne einer anderen thermostabilen DNA-Polymerase ersetzt ist.

11. DNA, die eine thermostabile DNA-Polymerase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 10 codiert.

12. DNA nach Anspruch 11, die durch ortsspezifische Mutagenese einer DNA erhalten wird, die eine natürlich vorkommende thermostabile DNA-Polymerase codiert.

13. Rekombinanter DNA-Vektor, der eine DNA nach Anspruch 11 oder 12 umfaßt.

14. Rekombinante Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA- Vektor nach Anspruch 13 transformiert ist.

15. Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen DNA-Polymerase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Züchtung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Vektor transformiert ist, der eine die thermostabile DNA-Polymerase-Mutante codierende DNA-Sequenz umfaßt, und

(b) Isolierung der in der Wirtszelle produzierten thermostabilen DNA-Polymerase-Mutante aus der Kultur.

16. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante, die durch ein Verfahren nach Anspruch 15 hergestellt wird.

17. Thermostabile DNA-Polymerase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 16, die durch Oxidation oder Reduktion modifiziert ist.

18. Stabilisiertes Präparat, das eine thermostabile DNA-Polymerase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 16 oder eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase-Mutante nach Anspruch 17 in einem ein oder mehrere nichtionische polymere Detergentien enthaltenden Puffer umfaßt.

19. Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 16 oder einer modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase-Mutante nach Anspruch 17 oder einem stabilisierten Präparat nach Anspruch 18 zur Amplifikation oder Sequenzierung einer Nucleinsäure.

20. Kit zur DNA-Sequenzierung, umfassend eine thermostabile DNA-Polymerase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 16 oder eine modifizierte thermostabile DNA- Polymerase-Mutante nach Anspruch 17 oder ein stabilisiertes Präparat nach Anspruch 18 und ein oder mehrere weitere zur Sequenzierung einer Nucleinsäure nützliche Reagentien, ausgewählt aus einem Primer, Nucleotidtriphosphatvorläufern (dNTPs) und einem Nucleotidtriphosphatvorläufer zur Kettentermination, wie einem Didesoxynucleotid- 5'-triphosphat (ddNTP).

21. Kit zur Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz, umfassend eine thermostabile DNA-Polymerase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 16 oder eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase-Mutante nach Anspruch 17 oder ein stabilisiertes Präparat nach Anspruch 18 und ein oder mehrere weitere zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion nützliche Reagentien, ausgewählt aus Oligonucleotidprimern, einem Satz von Nucleosidtriphosphatvorläufern und einer Oligonucleotidsonde.