CN116601308A - 使用大斯托克斯位移荧光染料进行多重实时pcr的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明允许通过使用由大斯托克斯位移(LSS)荧光染料制成的荧光PCR探针来扩展普通PCR设备的多重能力。采用这种方法，不需要对仪器中的硬件或软件组件进行改动。
Description
技术领域
本发明涉及用于聚合酶链式反应(PCR)的方法，特别地涉及用于使用大斯托克斯位移荧光染料进行多重实时PCR的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)已成为生物医学研究、疾病监测和诊断中普遍存在的工具。通过PCR进行的核酸序列的扩增描述于美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188中。现在，PCR在本领域中是众所周知的，并且已经在科学文献中进行了广泛的描述。参见PCRApplications，((1999)Innis等人编辑，Academic Press，San Diego)、PCR Strategies，((1995)Innis等人编辑，Academic Press，San Diego)；PCR Protocols，((1990)Innis等人编辑，Academic Press，San Diego)以及PCR Technology，((1989)Erlich编，StocktonPress，New York)。“实时”PCR测定能够同时对靶序列的起始量进行扩增和检测和/或定量。利用DNA聚合酶的5′至3′核酸酶活性的基本TaqMan实时PCR测定描述于Holland等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88：7276-7280和美国专利号5,210,015中。在美国专利公开号20100143901A1中已描述了不具有核酸酶活性的实时PCR(无核酸酶测定)。在美国专利号5,538,848中描述了荧光探针在实时PCR中的使用。
带有荧光探针的典型的实时PCR方案包括使用对每个靶序列具有特异性的带标记的探针。优选地，探针标记有一个或多个荧光部分，该一个或多个荧光部分在特定波长下吸收和发射光。在与靶序列或其扩增子杂交后，由于探针杂交或水解，探针表现出可检测的荧光发射变化。
然而，实时测定的主要挑战仍然是在单管中分析许多靶标的能力。在医学和诊断学的几乎每个领域，目标基因座的数量都在迅速增加。例如，在法医DNA鉴定、病原微生物检测、多基因座遗传病筛查和多基因表达研究等中，必须对多个基因座进行分析。
在大多数的当前方法中，多重测定的能力受到检测仪器的限制。具体而言，在同一反应中多个探针的使用需要使用不同的荧光标记。为了同时检测多个探针，仪器必须能够区分每个探针发出的光信号。市场上大多数的当前技术都不允许在同一反应容器中检测到四至七个以上的不同波长。因此，每个靶标使用一个独特地带标记的探针，在同一容器中最多只能检测到四至七个不同的靶标。实际上，至少一个靶标通常是对照核酸。因此，实际上，在同一管中最多只能检测到三至六个实验靶标。由于光谱带宽的限制，荧光染料的使用也受到限制，其中在可见光谱内没有明显的重叠干扰的只有约六种或七种染料可以适用。因此，除非在扩增和检测策略上进行了根本性改变，否则多重测定的能力将无法跟上临床需求。
PCR后解链测定提供了另外的多重实时扩增反应的能力。参见美国专利公开号20070072211A1。在解链测定中，扩增的核酸通过其独特的解链鉴定进行鉴别。解链测定包括确定双链靶标的解链温度(解链点)或带标记的探针与靶标之间的双链体。如美国专利号5,871,908中所述，为了使用带荧光标记的探针来确定解链温度，靶核酸与探针之间的双链体在受控的温度程序中逐渐加热(或冷却)。双链体的解离改变了相互作用的荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的距离。如美国专利号6，174,670所述，相互作用的荧光团可以与不同的探针分子共轭。可替代地，一个荧光团可以与探针共轭，而另一个荧光团可以插入到核酸双链体中，如美国专利号5,871,908所述。作为另一种替代方法，荧光团可以与单个探针寡核苷酸共轭。当双链体解链后，由于荧光团和猝灭剂此时在单链探针中聚在一起，荧光被猝灭。
通过测量相关的荧光变化来监测核酸双链体的解链。荧光变化可以在称为“解链鉴定”的图上表示。由于不同的探针-靶双链体可被设计在不同的温度解链(或再退火)，因此每个探针都会产生独特的解链鉴定。设计合理的探针将具有明显区别于同一测定中其他探针的解链温度的解链温度。许多现有的软件工具可实现设计考虑到这些目标的用于同管多重测定的探针。例如，Visual OMPTM软件(DNA Software，Inc.，密歇根州安娜堡)可实现确定不同反应条件下核酸双链体的解链温度。
使用荧光检测和随后的扩增后解链测定的多重PCR方法描述于美国专利号6,472,156。通过这种方法可检测的靶标数量是可检测波长的数量和可分辨解链鉴定的数量的乘积。因此在颜色检测中增加解链测定使检测多个靶标的能力向前迈进了一步。
扩增后解链测定最常用于定性目的，即鉴别靶核酸，参见美国专利号6,174,670；6,427,156；和5,871,908。已知通过求解链曲线函数的微分得到解链峰。Ririe等人(“Product differentiation by analysis of DNA melting curves during thepolymerase chain reaction,”(1997)Anal.Biochem.245：154-160)观察到，微分有助于解决产物混合物产生的解链曲线。微分后，混合物中各成分产生的解链峰变得容易区分。先前也已知，扩增后的解链信号，即解链峰，与样品中核酸的量成比例。例如，美国专利号6,245,514教导了使用双链体插入染料进行扩增后解链测定，以产生衍生解链峰，并且然后使用专用软件求该峰的积分。积分提供了关于扩增效率和扩增核酸的相对量的信息。
在实践中，希望超越定性测定，并且能够对同一样品中的多个靶标进行定量。参见例如Sparano等人“Development of the 21-gene assay and its application inclinical practice and clinical trials，”J.Clin.Oncol.(2008)26(5)：721-728。对靶标数量的定量能力在临床应用中很有用，诸如确定患者血清中的病毒载量、测量响应于药物疗法的基因的表达水平或者确定肿瘤的分子标记以预测其对治疗的反应。
在实时PCR测定中，带标记的探针产生的信号可以用来估计输入靶核酸的量。输入越多，荧光信号越早越过预定的阈值(Ct)。因此，技术人员可以通过比较样品彼此之间或样品与已知核酸量的对照样品来确定靶核酸的相对或绝对量。然而，现有方法在同时定量多个靶标的能力上存在局限性。与多靶标的定性检测一样，限制因素是光谱可分辨荧光团的可用性。如前所述，最先进的荧光标记技术无法从同一管中的六个或七个以上不同的带荧光标记的探针中获得不同的信号。因此，需要一种截然不同的实验方法以允许在实时PCR期间扩增和检测许多核酸靶标。
基于商业荧光的自动化聚合酶链式反应(PCR)装置可以通过从不同颜色的荧光团区分光来检测单个反应容器中的多个靶标(多重测定)。染料的选择通过最小化它们的光谱重叠来表征。集合中的每个荧光团在吸收最大值或附近被光激发，并且在荧光最大值或附近检测到发射光(荧光)。通过光学滤波器限制激发和发射的波长(带)范围，可以区分单个荧光团。激发带和同时检测到的发射带的特定组合定义了光学通道，每个通道允许鉴别一个PCR靶标。可实现的光学通道的最大数量取决于许多相互关联的因素，诸如可用光谱范围、激发光强度、荧光团亮度、荧光团光谱宽度、滤波器带宽和检测因子灵敏度。最先进的基于荧光检测技术的PCR装置每个激发和发射途径使用四至六个光学滤波器。因此，利用标准荧光团，可以区分四至六个PCR靶标。本发明允许使用大斯托克斯位移(LSS)荧光染料制成的荧光PCR探针扩展普通PCR装置的多重测定能力。采用这种方法，不需要对仪器中的硬件或软件组件进行改动。
发明内容
本发明涉及在聚合酶链式反应(PCR)期间使用具有大斯托克斯位移(LSS)的荧光染料用于增加单个反应容器中可同时检测的靶标的数量(多重)，并在所附权利要求中定义。虽然LSS染料已被用于分子成像、细胞成像、组织成像以及作为PCR反应中的对照参考染料，但尚未用于扩大实时PCR中用于荧光信号检测的PCR仪器的多重测定容量这一特定目的。
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中至少两种靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：(a)在单个反应容器中使疑似含有所述至少两种靶核酸序列的所述样品与以下项接触：i.具有与第一靶核酸序列的每条链互补的核苷酸序列的第一对寡核苷酸引物，和具有与第二靶核酸序列的每条链互补的核苷酸序列的第二对寡核苷酸引物；ii第一寡核苷酸探针，其包含与第一靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列并且在由第一对寡核苷酸引物界定的第一靶核酸序列内退火，其中所述第一寡核苷酸探针标记有能够产生可检测信号的大斯托克斯位移(LSS)荧光染料以及能够猝灭由LSS荧光染料产生的可检测信号的第一猝灭剂部分，其中LSS荧光染料通过核酸酶敏感的切割位点与第一猝灭剂部分分离；iii第二寡核苷酸探针，其包含与第二靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列并且在由第二对寡核苷酸引物界定的第二靶核酸序列内退火，其中所述第二寡核苷酸探针标记有能够产生可检测信号的小斯托克斯位移(SSS)荧光染料以及能够猝灭由SSS荧光染料产生的可检测信号的第二猝灭剂部分，其中SSS荧光染料通过核酸酶敏感的切割位点与第二猝灭剂部分分离；并且其中SSS荧光染料具有与第一寡核苷酸探针上的LSS荧光染料的吸收峰最大值显著不同的吸收峰最大值和与第一寡核苷酸探针上的LSS荧光染料的发射峰最大值相似的发射峰最大值，其中显著差异在波长方面为至少80纳米；(b)使用具有5`至3`核酸酶活性的核酸聚合酶通过聚合酶链式反应(PCR)扩增第一靶核酸序列和第二靶核酸序列，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，核酸聚合酶的5`至3`核酸酶活性允许：从第一寡核苷酸探针上的第一猝灭部分切割和分离LSS荧光染料，以及从第二寡核苷酸探针上的第二猝灭部分切割和分离SSS荧光染料；(c)通过在LSS荧光染料的吸收峰最大值的波长处或附近激发来测量来自LSS荧光染料的可检测信号，并且通过在SSS荧光染料的吸收峰的波长处或附近激发来测量来自SSS荧光染料的可检测信号；(d)在多个PCR循环中重复步骤(b)和(c)，以从第一靶核酸序列和第二靶核酸序列产生期望数量的扩增产物；(e)从自LSS荧光染料检测到的信号检测第一靶核酸序列的存在，以及从自SSS荧光染料检测到的信号检测第二靶核酸序列的存在。
在一个实施例中，第二寡核苷酸探针上的SSS荧光染料具有与第一寡核苷酸探针上的LSS荧光染料的发射峰最大值显著不同的发射峰最大值和与第一寡核苷酸探针上的LSS荧光染料的吸收峰最大值相似的吸收峰最大值，其中显著差异在波长方面为至少80纳米。在另一个实施例中，LSS荧光染料的吸收峰最大值与SSS荧光染料的吸收峰最大值之间的差异在波长方面为大于80纳米。在又另一个实施例中，差异在波长方面为大于100纳米。在另一个实施例中，LSS荧光染料的发射峰最大值与SSS荧光染料的发射峰最大值之间的差异在波长方面为大于80纳米。在又另一个实施例中，差异在波长方面为大于100纳米。
在一个实施例中，LSS荧光染料选自由以下项组成的组：ALEXA FLUOR 430、ATTO430LS、ATTO 490LS、ATTO 390LS、CASCADE YELLOW、CF350、CHROMEO 494、CYTO 500LSS、CYTO510LSS、CYTO 514LSS、CYTO 520LSS、DAPOXYL、DY 480XL、DY 481XL、DY 485XL、DY 510XL、DY511XL、DY 520XL、DY 521XL、DY 601XL、DY 350XL、DY 360XL、DY 370XL、DY 375XL、DY380XL、DY 395XL、DY 396XL、DYLIGHT 515-LS、DYLIGHT 485-LS、DYLIGHT510-LS、DYLIGHT521-LS、FURA 2、INDO 1、KROME ORANGE、LUB 04、LUCIFER YELLOW、NBD X、NILE RED、PULSAR650、PYMPO、STAR 440SXP、STAR 470SXP、STAR 520SXP、VIOGREEN、CF 350、SETAU 405和PACIFIC ORANGE。在另一个实施例中，LSS荧光染料为DY396XL。在又另一个实施例中，LSS荧光染料为CHROMEO 494。在另一个实施例中，LSS荧光染料为ATTO 490LS。
在一个实施例中，LSS荧光染料具有在最高达100℃的温度保持稳定的荧光信号强度。在一个实施例中，LSS荧光染料为ATTO 490LS。在另一个实施例中，第一寡核苷酸探针、第二寡核苷酸探针或第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针两者是与TAGS技术兼容的带标签的探针。
在另一个实施例中，本发明的方法是在单个反应容器中进行的，该反应容器是包括以下的小管：(i)具有开口的近端，通过该开口可引入样品；(ii)远端；以及(iii)至少以下：含有至少一种核酸提取试剂的第一区段、远离第一区段且含有洗涤试剂的第二区段，以及远离第二区段且含有一种或多种扩增试剂的第三区段，所述区段中的每个：(A)由小管限定；(B)至少部分地通过由小管的相对壁部分彼此粘结而形成的液密性密封部而流体隔离，使得：(1)通过对部分地通过密封部流体隔离的区段施加流体压力来破坏密封部；以及(2)密封部能够在小管的相对壁部分被粘结的地方被夹紧，而不破坏密封部，以防止密封部通过对部分地通过密封部流体隔离的区段施加流体压力而被破坏；(C)可膨胀以接收从另一个区段排出的流体的体积；并且可压缩以在如此压缩时基本上不含流体；(iv)用于封闭开口的盖子，该盖子含有与小管流体连通的腔室，并且该盖子允许气体自由逸出但将所有液体体积和感染原保留在管中；(v)固定小管的近端和远端的刚性框架；以及(vi)一体式小管张紧机构或小管与框架的附接部，其将小管充分拉紧，以便于小管的压缩和变平。
附图说明
图1.六色PCR仪的通道分配矩阵。关于如何通过新的激发和发射滤波器组合将六色PCR仪的传统光学通道扩展至二十一个可能的检测通道的概念表述。激发和发射滤波器的中心波长以纳米为单位。激发和发射的描述符号为UV(u)、蓝色(b)、绿色(g)、黄色(a)、红色(r)、IR、(i)。通过组合一个激发和一个发射滤波器来创建光学通道。例如，用于紫外激发和绿光发射的双字母通道描述符号为“ug”。浅灰色强调的通道对应于标准的短斯托克斯位移(SSS)荧光团可以获得的常规通道。白色区域对应于当前可用的LSS染料可获得的通道。深灰色强调的通道可通过共振电子转移(RET)探针获得。
图2.六色PCR仪(分析仪)的吸收(左)和发射光谱(右)。展示了四种标准SSS荧光染料和一种LSS染料(Chromeo 494)的光谱。光谱归一化为任意吸收和荧光单位(AU/FU)。光学滤波器覆盖的波长区域表示为水平线。Chromeo 494(虚线)的激发/发射最大值在494nm/628nm处，其可以被蓝光激发并且在黄色和/或红色发射滤波器(ba和/或br通道)中检测。
图3.六色PCR仪(分析仪)的吸收(左)和发射光谱(右)。展示了四种标准SSS荧光染料和一种LSS染料(Dy396XL)的光谱。光谱归一化为任意吸收和荧光单位(AU/FU)。光学滤波器覆盖的波长区域表示为水平线。Dy396XL(虚线)的激发/发射最大值在392nm/572nm处，其可以被紫外光激发并且在绿色发射滤波器(ug通道)中检测。
图4.CT/NG/TV/MG测试中六个TaqMan探针的实时PCR生长曲线，靶标输入为3×LoD水平。通过将四种SSS染料与两种LSS染料(Chromeo494和Dy395XL)结合，实现了在/>分析仪中的多重测定。将生长曲线的基线归一化为零进行比较。
图5.标记有Dy395XL或Dy396XL的MGPB探针在5通道 CT/NG/MG测试中的统计分析。由于MG-Dy395XL与MG-Dy396XL探针之间的基线差异，根据基线比值对基线较高的探针的性能(Ct、振幅和Kexp)归一化。
图6.标记有Dy395XL或Dy396XL的MGPC探针在5通道 CT/NG/MG测试中的统计分析。由于MG-Dy395XL与MG-Dy396XL探针之间的基线差异，根据基线比值对基线较高的探针的性能(Ct、振幅和Kexp)归一化。
图7.分析仪样品管(包括小管)的示例性实施例。图7A为前视图。图7B为位于分析仪内的样品管的横断面视图。
图8.分析仪样品管(包括小管)的另一个示例性实施例。图8A是横断面视图。图8B是样品管的透视图。
图9.五色PCR仪的光学通道分配矩阵。关于如何通过新的激发和发射滤波器组合扩展五色PCR仪的传统光学通道的概念表述。激发和发射滤波器的中心波长以纳米为单位。对角线区域(浅灰色)上的光学通道可以通过标准的短斯托克位移(SSS)荧光团获得。深灰色区域对应于LSS染料获得的光学通道。在一个实施例中，用LSS染料通过在495nm处激发并在645nm处检测(ATTO 490LS染料)检测靶标。在另一个实施例中，用LSS染料通过在435nm处激发并在580nm处检测(RLS染料)检测靶标。白色区域对应于LSS染料或共振电子转移(RET)探针在概念上可获得的其他通道。
图10.五色PCR仪(和/>x800分析仪)的吸收(左)和发射光谱(右)。展示了五种标准SSS荧光染料和一种LSS染料ATTO 490LS的光谱，其可以通过在495nm处激发和在645nm处检测来检测。光谱归一化为任意吸收和荧光单位(AU/FU)。光学滤波器覆盖的波长区域表示为水平线。
图11.五色PCR仪(和/>x800分析仪)的吸收(左)和发射光谱(右)。展示了五种标准荧光染料和一种LSS染料(RLS)的光谱，其可以通过在435nm处激发和在580nm处检测来检测。光谱归一化为任意吸收和荧光单位(AU/FU)。光学滤波器覆盖的波长区域表示为水平线。
图12.实时PCR生长曲线证明了基于LSS染料的扩展光学多重测定与基于温度的多重测定的相容性。特征实例显示ATTO 490LS光学通道(495nm/645nm)中三个靶标跨三个热通道(TC)的单独检测。TC1基于带有ATTO 490LS的标准TaqMan探针，并且在58℃荧光读数。TC2和TC2基于带有ATTO 490LS的带标签的探针设计，分别在80℃和91℃产生靶标荧光信号。靶标浓度为1000cp/反应，在所有样品中均有靶标存在。每个热通道的PCR生长曲线在预期的阳性PCR信号处用星号标记。对于较高的热通道，在不存在靶标的情况下，轻微的向上或向下的斜率是由荧光染料的非优化热校正因子引起的。在480分析仪上生成数据。
图13.实时PCR生长曲线证明了基于LSS染料的扩展光学多重测定与基于温度的多重测定的相容性。特征实例显示RLS光学通道(435 nm/580nm)中三个靶标跨三个热通道(TC)的单独检测。TC1基于带有RLS染料的标准TaqMan探针，并且在58℃荧光读数。TC2和TC2基于带有RLS染料的带标签的探针设计，分别在80℃和91℃产生靶标荧光信号。除无模板对照(NTC)外，各靶标浓度均为1000cp/反应。对于较高的热通道，在不存在靶标的情况下，轻微的向上或向下的斜率是由荧光染料的非优化热校正因子引起的。在480分析仪上生成数据。
具体实施方式
定义
本文所用的术语“样品”包括包含核酸的任何标本或培养物(例如微生物学培养物)。术语“样品”还旨在包括生物学样品和环境样品两者。样品可包括合成来源的标本。生物学样品包括全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊髓液、脊髓液、灌洗液(例如，支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳朵、关节镜)、活检样品、尿液、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗液、母乳、乳房液、胚胎细胞和胎儿细胞。在优选实施例中，生物学样品是血液，且更优选是血浆。如本文所用，术语“血液”涵盖全血或血液的任何级分，诸如常规定义的血清和血浆。血浆是指对用抗凝血剂处理过的血液进行离心产生的全血级分。血清是指血液样品凝结后残留的流体的水状部分。环境样品包括环境材料，诸如表面物质、土壤、水和工业样品，以及从食品和奶制品加工仪器、设备、装备、器皿、一次性和非一次性物品中获得的样品。这些实例不应解释为限制适用于本发明的同一样品类型。
本文所用的术语“靶标”或“靶核酸”是指待检测或测量其存在或待研究其功能、相互作用或特性的任何分子。因此，靶标实质上包括任何存在可检测的探针(例如寡核苷酸探针)或测定的分子，或者可以由本领域技术人员生产。例如，靶标可以是生物分子，诸如核酸分子、多肽、脂质或碳水化合物，其能够与可检测的探针(例如抗体)结合或以其他方式接触，其中可检测的探针还包含能够被本发明的方法检测的核酸。如本文所用，“可检测探针”是指能够与目标靶生物分子杂交或退火并允许靶生物分子进行特异性检测的任何分子或试剂。在本发明的一个方面，靶标是核酸，并且可检测的探针是寡核苷酸。在整个本公开中，术语“核酸”和“核酸分子”可以互换使用。该术语是指寡核苷酸、oligo、多核苷酸、脱氧核糖核苷酸(DNA)、基因组DNA、线粒体DNA(mtDNA)、互补DNA(cDNA)、细菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、siRNA、催化性RNA、克隆、质粒、M13、P1、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、扩增的核酸、扩增子、PCR产物和其他类型的扩增的核酸、RNA/DNA杂交体和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些都可以是单链或双链形式，并且除非另有限制，否则将涵盖可以以相似方式起作用的天然核苷酸的已知类似物作为天然存在的核苷酸及它们的组合和/或混合物。因此，术语“核苷酸”是指天然存在的和经修饰的/非天然存在的核苷酸，包括存在于多核酸或寡核苷酸内的核苷三磷酸、核苷二磷酸和核苷单磷酸以及单磷酸单体。核苷酸也可以是核糖核苷酸；2′-脱氧核苷酸；或2′，3′-脱氧核苷酸以及本领域众所周知的大量的其他核苷酸模拟物。模拟物包括链终止核苷酸，诸如3′-O-甲基、卤代碱基或糖取代；替代性糖结构，包括非糖、烷基环结构；替代性碱基，包括肌苷；脱氮杂修饰的；chi和/或psi，经接头修饰；经大量标记修饰的；磷酸二酯修饰或替代，包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼烷磷酸酯、酰胺、酯、醚；和/或基本或完全的核苷酸间替代，包括诸如可光解的硝基苯基部分的裂解键。
可以定量或定性地测出靶标的存在与否。靶标可以以多种不同形式出现，包括例如简单或复杂的混合物，或以基本上纯化的形式出现。例如，靶标可以是含有其他成分的样品的一部分，也可以是样品的唯一或主要成分。因此，靶标可以是整个细胞或组织、细胞或组织提取物、其分馏的裂解物或基本上纯化的分子的成分。靶标也可以具有已知或未知的序列或结构。
术语“扩增反应”是指用于扩增核酸靶序列的拷贝的任何体外方式。
“扩增”是指将溶液提交至足以允许扩增的条件的步骤。扩增反应的成分可包括但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。术语“扩增”通常是指靶核酸中的“指数”增加。然而，本文所用的“扩增”还可以指核酸的选择性靶序列数目的线性增加，但是不同于一次性、单一引物延伸步骤。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是指以几何级数由此扩增靶双链DNA的特定区段或子序列的方法。PCR对于本领域技术人员是众所周知的；参见，例如美国专利号4,683,195和4,683,202；以及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Innis等人编，1990。
如本文所用，“寡核苷酸”是指通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或经修饰的核苷单体的线性寡聚物。寡核苷酸包括能够与靶核酸特异性结合的脱氧核糖核苷、核糖核苷、其端基异构体形式、肽核酸(PNA)等。通常，单体通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成寡核苷酸，其大小范围从几个单体单元，例如3-4个，到几十个单体单元，例如40-60个。每当寡核苷酸由字母序列表示时，诸如“ATGCCTG”，应理解的是核苷酸从左至右为5′-3′顺序，并且除非另有说明，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷，以及“U”表示核糖核苷尿苷。通常，寡核苷酸包含四个天然的脱氧核苷酸；然而，它们也可以包含核糖核苷或非天然的核苷酸类似物，如上所述。当酶对活性具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物要求时，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，那么为该寡核苷酸或多核苷酸底物选择合适的组合物是本领域普通技术人员所熟知的。
如本文所用，“寡核苷酸引物”或简称为“引物”是指与靶核酸模板上的序列杂交并促进检测寡核苷酸探针的多核苷酸序列。在本发明的扩增实施例中，寡核苷酸引物用作核酸合成的起始点。在非扩增实施例中，寡核苷酸引物可用于产生能够被裂解剂裂解的结构。引物可以具有各种长度，并且通常长度小于50个核苷酸，例如长度为12-25个核苷酸。可以基于本领域技术人员已知的原理来设计用于PCR的引物的长度和序列。
如本文所用，术语“寡核苷酸探针”是指能够与目标靶核酸杂交或退火并允许靶核酸进行特异性检测的多核苷酸序列。
“报告部分”或“报告分子”是赋予可检测信号的分子。例如，可检测的表型可以是比色、荧光或发光的。荧光报告部分的实例包括例如荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、JA270(Roche Molecular Systems)、花菁染料(例如CY3.5、CY5或CY5.5)等。
“猝灭剂部分”或“猝灭剂分子”是能够猝灭来自报告部分的可检测信号的分子。与荧光报告因子一起使用的猝灭剂部分的实例包括例如所谓的黑暗猝灭剂，诸如Black Hole猝灭剂(BHQ-1或BHQ-2)(LGC BioSearch Technologies)或Iowa Black(Integrated DNATechnologies)；以及利用荧光共振能量转移(FRET)的荧光基团，诸如上文提到的花菁染料。
“错配的核苷酸”或“错配”是指在一个或多个位置处与靶序列不互补的核苷酸。寡核苷酸探针可以具有至少一个错配，但是也可以具有2、3、4、5、6或7个或更多个错配的核苷酸。
如本文所用，术语“多态性”是指等位基团变体。多态性可包括单核苷酸多态性(SNP)以及简单的序列长度多态性。多态性可以归因于一个等位基因与另一个等位基因相比的一个或多个核苷酸取代，或者可以归因于本领域已知的插入或缺失、重复、倒位和其他改变。
本文所用的术语“修饰”是指寡核苷酸探针在分子水平上的改变(例如，碱基部分、糖部分或磷酸主链)。核苷修饰包括但不限于裂解阻断剂或裂解诱导剂的引入、小沟结合剂的引入、同位素富集、同位素贫化、氘的引入和卤素修饰。核苷修饰还可包括增加杂交严格性或增加寡核苷酸探针的解链温度的部分。例如，可以用连接2′和4′碳的额外桥来修饰核苷酸分子，从而产生对核酸酶裂解有抗性的锁核酸(LNA)核苷酸(如Imanishi等人在美国专利号6,268,490以及Wengel等人的美国专利号6,794,499中所述)。寡核苷酸探针和猝灭寡核苷酸分子的标签部分的组合物仅受它们形成稳定双链体的能力的限制。因此，这些寡核苷酸可以包含DNA、L-DNA、RNA、L-RNA、LNA、L-LNA、PNA(肽核酸，如Nielsen等人，美国专利号5,539,082中所述)、BNA(桥接核酸，例如2′,4′-BNA(NC)[2′-O,4′-C-氨基亚甲基桥接的核酸]，如Rahman等人，J.Am.Chem.Soc.2008；130(14)：4886-96上所述)、L-BNA等(其中“L-XXX”是指核酸糖单元的L对映体)或核苷酸碱基、糖、或磷酸二酯主链上的任何其他已知的变化和修饰。
核苷修饰的其他实例包括在寡核苷酸的糖部分中引入的各种2′取代，诸如卤代、烷氧基和烯丙氧基基团。已有证据表明2′-取代的-2′-脱氧腺苷多核苷酸类似于双链RNA而不是DNA。Ikehara等人，(Nucleic Acids Res.，1978，5，3315)已表明，聚A、聚I或聚C中与其互补序列进行双链体化的2′-氟取代基比核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸聚双链体明显更稳定，其通过标准解链测定确定。Inoue等人，(Nucleic Acids Res.，1987，15，6131)已描述了在每个核的核苷酸上含有2′-OMe(O-甲基)取代基的混合寡核苷酸序列的合成。混合的2′-OMe取代的寡核苷酸与其RNA互补序列杂交的强度与RNA-RNA双链体一样强，而RNA-RNA双链体比同一序列的RNA-DNA异源双链体明显更强。在糖的2′位处的取代的实例包括F、CN、CF3、OCF3、OMe、OCN、O-烷基、S-烷基、SMe、SO2Me、ONO2、NO2、NH3、NH2、NH--烷基、OCH3＝CH2和OCCH。
关于一个分子与另一分子诸如靶多核苷酸的探针的结合的术语“特异性的”或“特异性”是指两个分子之间的识别、接触和稳定的复合物的形成，以及该分子与其他分子的实质上较少的识别、接触或复合物的形成。如本文所用，术语“退火”是指两个分子之间稳定的复合物的形成。特别地，“退火”可以指互补寡核苷酸之间形成稳定的双链复合物。
如果探针的至少一个区域与核酸序列的互补序列的至少一个区域具有基本的序列同一性，则该探针对核酸序列“能够退火”。“基本的序列同一性”是至少约80％，优选至少约85％，更优选至少约90％、95％或99％，以及最优选100％的序列同一性。为了确定DNA序列和RNA序列的序列同一性，通常将U和T视为相同的核苷酸。例如，包含序列ATCAGC的探针能够与包含序列GCUGAU的靶RNA序列杂交。
如本文所用，术语“裂解剂”是指能够裂解寡核苷酸探针以产生片段的任何方式，包括但不限于酶。对于其中不发生扩增的方法，裂解剂可仅用于裂解、降解或以其他方式分离寡核苷酸探针的第二部分或其片段。裂解剂可以是酶。裂解剂可以是天然的、合成的、未经修饰的或经修饰的。
对于其中发生扩增的方法，裂解剂优选是具有合成(或聚合)活性和核酸酶活性的酶。此类酶通常是核酸扩增酶。核酸扩增酶的实例是核酸聚合酶，诸如水生栖热菌(Thermusaquaticus)(Taq)DNA聚合酶或大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I。该酶可以是天然存在的、未经修饰的或经修饰的。
“核酸聚合酶”是指催化核苷酸并入核酸的酶。示例性的核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒酶等。
“耐热DNA聚合酶”是指在升高的温度达到选择的时间段时，是稳定的(即，抵抗分解或变性)并保留足够的催化活性的DNA聚合酶。例如，当在升高的温度下达到使双链核酸变性所需的时间时，耐热DNA聚合酶保留足够的活性以进行后续的引物延伸反应。核酸变性所需的加热条件是本领域中众所周知的，并且在美国专利号4,683，202和4,683，195中举例说明。如本文所用，耐热聚合酶通常适用于温度循环反应，诸如聚合酶链式反应(“PCR”)。耐热的核酸聚合酶的实例包括水生栖热菌(Thernus aquaticus)Taq DNA聚合酶、栖热菌属(Thermus)物种Z05聚合酶、黄栖热菌(Thermusflavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)聚合酶(诸如TMA-25和TMA-30聚合酶)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶等。
“经修饰的”聚合酶是指其中至少一个单体不同于参考序列的聚合酶，诸如天然或野生型形式的聚合酶或另一种经修饰的形式的聚合酶。此类经修饰的聚合酶如例如美国专利公开号20110294168A1和20140178911A1所述。示例性修饰包括单体插入、缺失和取代。经修饰的聚合酶还包括嵌合聚合酶，其具有衍生自两个或更多个亲本的可鉴定的成分序列(例如，结构性或功能性结构域等)。在经修饰的聚合酶的定义内还包括包含参考序列的化学修饰的那些。经修饰的聚合酶的实例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329AE678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640GS671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46EE678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔZ05聚合酶、ΔZ05-Gold聚合酶、ΔZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、E678GTMA-30聚合酶等。
术语“5′至3′核酸酶活性”或“5′-3′核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成有关，由此从核酸链的5′端去除核苷酸，例如大肠杆菌DNA聚合酶I具有此活性，而Klenow片段则没有。一些具有5′至3′核酸酶活性的酶是5′至3′核酸外切酶。此类5′至3′核酸外切酶的实例包括来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的核酸外切酶、来自脾脏的磷酸二酯酶、λ核酸外切酶、来自酵母的核酸外切酶II、来自酵母的核酸外切酶V以及来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的核酸外切酶。
本发明的各个方面基于核酸聚合酶的特殊性质。核酸聚合酶可具有多种活性，其中包括5′至3′核酸酶活性，由此核酸聚合酶可从退火至其较大的、互补的多核苷酸的寡核苷酸中裂解单核苷酸或小的寡核苷酸。为了有效地进行裂解，上游的寡核苷酸也必须退火至相同的更大的多核苷酸。
可以通过“测定”或“5′-核酸酶测定”来执行利用5′至3′核酸酶活性的靶核酸的检测，如美国专利号5,210,015；5,487,972；和5,804,375；以及Holland等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7276-7280中所述。在/>测定中，在扩增反应期间存在在扩增区域内杂交的带标记的检测探针。探针经修饰以防止探针充当DNA合成的引物。使用具有5′至3′核酸外切酶活性的DNA聚合酶来执行扩增。在扩增的每个合成步骤期间，与从延伸的引物的下游的靶核酸杂交的任何探针都被DNA聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性降解。因此，新靶标链的合成也导致探针的降解，并且降解产物的积累提供了靶序列合成的量度。
任何适合用于检测降解产物的方法都可以用于5’核酸酶测定中。通常，检测探针标记有两种荧光染料，其中一种(“猝灭剂”或“猝灭部分”)能够猝灭另一种染料(“报告因子”或“报告部分”)的荧光。染料附接在探针上，通常报告因子或检测因子染料附接在5′末端，猝灭染料附接在内部位点，使得当探针处于未杂交状态时发生猝灭，并且使得DNA聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性对探针的裂解发生在两种染料之间。扩增导致探针在染料之间的裂解，伴随着猝灭的消除和从最初猝灭的染料中观察到的荧光的增加。通过测量反应荧光的增加来监测降解产物的积累。美国专利号5,491,063和5,571,673描述了检测伴随扩增发生的探针降解的可替代方法。
用于检测靶核酸的5′核酸酶测定可以采用具有5′至3′核酸外切酶活性的任何聚合酶。在一些实施例中，具有5′-核酸酶活性的聚合酶是耐热的和热活性的核酸聚合酶。此类耐热聚合酶包括但不限于来自真细菌属栖热菌属(Thermus)、栖热袍菌属(Thermatoga)和栖热腔菌属(Thermosipho)等多种种属的天然和重组形式的聚合酶及其嵌合形式。例如，可用于本发明方法的栖热菌属(Thermus)种属聚合酶包括水生栖热菌(Thermusaquaticus)(Taq)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、栖热菌属(Thermus)种属Z05(Z05)DNA聚合酶和栖热菌属(Thermus)种属sps17(sps17)DNA聚合酶(例如，描述于美国专利号5,405,774；5,352,600；5,079,352；4,889,818；5,466,591；5,618,711；5,674,738和5,795,762)。可用于本发明方法中的栖热袍菌属(Thermatoga)聚合酶包括，例如，海栖热袍菌(Thermotoga maritima)DNA聚合酶和那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DNA聚合酶，而可以使用的栖热腔菌(Thermosipho)聚合酶的实例是非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)DNA聚合酶。在具有公开号WO 92/06200的国际专利申请号PCT/US91/07035中公开了海栖热袍菌和非洲栖热腔菌DNA聚合酶的序列。那不勒斯栖热袍菌的序列可在国际专利公开号WO 97/09451中找到。
在5′核酸酶测定中，扩增检测通常与扩增同时进行(即“实时”)。在一些实施例中，扩增检测是定量的，并且扩增检测是实时的。在一些实施例中，扩增检测是定性的(例如，靶核酸的存在或不存在的端点检测)。在一些实施例中，扩增检测是在扩增之后。在一些实施例中，扩增检测是定性的，并且扩增检测是在扩增之后。
术语“带标签的探针”或“带标签的寡核苷酸探针”是指基于DNA探针结构的寡核苷酸探针，该结构允许通过测量不同温度的荧光来区分同一光学通道中的多个靶标，并且与“TAGS(温度辅助信号的产生)”技术相关，该技术公开于美国专利公开号2018/0073064并且通过引用以其全文并入本文。通过设计带标签的探针，在不同的解链温度(Tm)下，将标签部分与其各自的猝灭寡核苷酸分子杂交，可以实现仅使用一个报告部分(例如一种荧光染料)的多重PCR测定。可以使用具有低Tm标签猝灭的寡核苷酸双链体的第一个带标签的探针通过测量在其Tm温度或以上的第一温度的计算的荧光值来检测第一个靶核酸。可以使用具有高Tm标签猝灭的寡核苷酸双链体的第二个带标签的探针通过测量在其Tm温度或以上的并且高于第一温度的第二温度的计算的荧光值来检测第二个目标。因此，给定染料的每个光学通道可以在不同的“热通道”中读取，这些“热通道”代表在不同温度的荧光测量。
斯托克斯位移和大斯托克斯位移染料
荧光染料的斯托克斯位移被定义为同一电子跃迁的吸收峰最大值和发射峰最大值之间的波长、频率或能量差。绝大多数小分子荧光团表现出10-25nm量级的斯托克斯位移，并且通常小于80nm(本文称为“小斯托克斯位移”(SSS)染料)。SSS染料包括PCR测定中使用的常规荧光染料，诸如FAM、HEX、CFR610和Quasar670。具有显著较大斯托克斯位移的荧光团被宽泛地称为“大斯托克斯位移”(LSS)染料、“高斯托克斯位移”染料或“超级斯托克斯(MegaStokes)”染料。术语没有很好的定义，但斯托克斯位移>80nm的染料通常用形容词“大”或“高”创造，而术语“超级”似乎普遍用于斯托克斯位移显著超过100nm的染料。文献中讨论了两种光物理机制来解释大斯托克斯位移的发生。分子几何型机制是基于荧光团在激发态的构象弛豫以及由此引起的溶剂偶极的重布置。斯托克斯位移随着基态和激发态的(平衡的)分子几何结构与偶极矩之间的差异的增大而增大。电子型机制的大斯托克斯位移荧光归因于激发态的分子内电荷转移(ICT)。
小斯托克斯位移荧光团的常见问题是荧光的内部猝灭。这种自猝灭是由激发和发射的光谱重叠引起的，并且尤其在高荧光团浓度下普遍存在。LSS染料具有更好的分离的光谱带，这最大限度地减少了光子的重吸收。荧光团在其主要激发峰之外的激发存在非零概率。因此，来自一种染料的荧光不可避免地导致多个发射通道中检测到的总光。这种光谱“串色(cross-talk)”或“渗漏(bleed-through)”可以在一定程度上通过使用预定的校正因子进行计算补偿。此外，激发光的散射增加了邻近通道的背景荧光。LSS染料允许减少甚至避免来自其他荧光团的串色和散射。在许多荧光团产生强烈背景信号的实验环境中，LSS染料尤其有用。LSS染料的大光谱分离允许对激发光进行更有效的过滤，从而增强靶标检测的灵敏度。LSS染料可以从以前无法获得的光学通道中获得荧光数据。通过宽光谱分离促进，并且当与标准荧光团组合使用时，LSS染料允许增加荧光PCR装置的多重测定能力。这样，LSS标记允许对已建立的四至六色仪器执行另外的通道。原则上，可以由六色仪器的滤波器组合组成21个通道(图1)。然而，在实际应用中，通道数量受限于具有足够大斯托克斯位移的LSS染料的商业可用性。基于目前市场上可商购的LSS染料的斯托克斯位移为150nm，可以实现的九个另外的通道(图1，白色通道)。浅灰色强调了标准染料的通道，而深灰色表示目前不可用的合适的LSS染料的通道。相反，共振电子转移(RET)探针产生大的“虚拟”斯托克斯位移，并且也可以用来获得这些通道。
可商购的LSS染料的实例包括但不限于以下：ALEXA FLUOR 430、ATTO 430LS、ATTO490LS、ATTO 390LS、CASCADE YELLOW、CF350、CHROMEO 494、CYTO 500LSS、CYTO 510LSS、CYTO 514LSS、CYTO 520LSS、DAPOXYL、DY 480XL、DY 481XL、DY 485XL、DY 510XL、DY 511XL、DY 520XL、DY 521XL、DY 601XL、DY 350XL、DY 360XL、DY 370XL、DY 375XL、DY 380XL、DY395XL、DY 396XL、DYLIGHT 515-LS、DYLIGHT 485-LS、DYLIGHT 510-LS、DYLIGHT 521-LS、FURA 2、INDO 1、KROME ORANGE、LUB 04、LUCIFER YELLOW、NBD X、NILE RED、PULSAR 650、PYMPO、STAR 440SXP、STAR 470SXP、STAR 520SXP、VIOGREEN、CF 350、SETAU 405和PACIFICORANGE。
尽管有上述好处，但斯托克斯位移的增加是有代价的；与标准荧光团相比，LSS染料具有较低的荧光量子产率。当荧光团的亮度被定义为摩尔消光系数和荧光量子产率的乘积时，LSS染料的亮度也较低。另一个方面是LSS染料的标准荧光团的40至50nm峰宽可以增加一倍或两倍。尽管如此，出于多重测定的目的，LSS染料优越的光谱分离超过亮度降低和更大的峰宽。
LIAT，多区段小管PCR系统
本公开还描述了多区段小管PCR装置、耗材以及使用此类设备和耗材处理样品的方法。这种系统的实例是PCR系统(加利福尼亚普莱森顿Roche MolecularSystems)。
The系统由/>管和/>分析仪(仪器)组成。该测定使用一次性/>管，管中盛有样品制剂和实时PCR试剂，并且便于样品制备和实时PCR过程。管含有所有按试剂使用顺序预先分装在管区段中的所有所需单位剂量试剂，用易碎密封部隔开。
分析仪实现了生物学样品中靶序列的样品制备、核酸扩增、检测和定量的自动化和集成化。/>分析仪执行来自临床样品的所有测定步骤，并自动报告测定结果。在测试过程期间，分析仪的多个样品处理致动器压缩/>管，选择性地从管区段中释放试剂，将样品从一个区段移动到另一个区段，并且控制反应体积、温度和时间，以进行样品制备、核酸提取、靶标富集、抑制剂去除、核酸洗脱和实时PCR。嵌入式微处理器控制和协调这些致动器的动作，以在封闭的/>管中进行所有需要的测定过程。为了运行该测定，用户将样品装入/>管，并将装好的/>管放入/>分析仪。分析仪将进行样品制备、实时PCR、结果计算和报告。所有过程均由测定脚本控制。
控制热循环鉴定的测定脚本部分如下表1所示。在本实施例中，从第6周期开始的每个周期在58℃和高温下从FAM标记读取荧光读数。本领域技术人员将认识到表1中描述的参数可以根据需要改变，例如温度、持续时间和循环次数都可以根据需要改变。
表1：
在一些实施例中，分区段的小管为接收、储存、处理和/或分析生物学样品提供了方便的容器。在某些实施例中，分区段的小管便于包括多个处理步骤的样品处理方案。在某些实施例中，可以在样品小管中收集样品，并且然后将小管置于分析仪中；然后，分析仪可以操纵小管及其内容物来处理样品。
在一个实施例中，柔性小管可以通过可断裂的密封部分区段成隔室。单个区段可含有用于处理样品的各种试剂和缓冲液。分析仪中的夹具和致动器可以以不同的组合和不同的时间对小管施加、保持和/或释放力，以引导流体的运动并且使可断裂密封部破裂。这种可断裂密封部的破裂可产生内小管表面，该表面对流体流动基本上没有阻碍。在一些实施例中，随着处理的进行，生物学样品的流动可被引导朝向小管的远端，而废弃物的流动可被迫向相反的方向移动，朝向小管的最初输入样品的开口。该样品进口可以通过带有锁紧机构的盖子任选地永久密封，并且废弃物室可位于盖子内以接收废弃物进行储存。该方法的显著优点是经处理的样品不会与未处理的样品接触过的表面接触。因此，在未处理的样品中存在的可能涂覆在小管壁上的痕量反应抑制剂不太可能污染经处理的样品。
在一些实施例中，小管可以是可膨胀的，使得能够将来自多个区段中的每个区段的流体体积接收到一个区段中；这可以允许样品和试剂在一个区段中经历某些处理步骤，从而获得更简单的机械结构用于进行测定。使用可膨胀的小管的实施例的另一个好处是，相同的小管结构可用于将不同体积的试剂封装到区段内，从而允许根据要进行的测定以不同的方式封装相同的小管。
参考图7A至7B和图8A至8B，透明的柔性小管10能够被构造成多个区段，诸如16、110、120、130、140、150、160、170、180和/或190，并且通过压缩被基本上压平。在实施例中，小管可具有至少两个区段。柔性小管可以提供：在大约2℃与105℃之间的操作功能，与样品、靶标和试剂的相容性，低气体渗透率，最小的荧光特性和/或在反复压缩和弯曲循环期间的弹性恢复能力。小管可以由多种材料制成，其实例包括但不限于聚烯烃(诸如聚丙烯或聚乙烯)、聚氯酯、聚烯烃共聚物和/或其他提供合适特性的材料。小管的特性，诸如透明度、润湿特性、表面光滑度、表面电荷和热弹性等，都可影响小管的性能。这些特性可以通过诸如接种、等离子体处理、添加添加剂和辐照等此类示例性方法来改善。在一些实施例中，可以在塑料中添加一种添加剂材料以改善选择的特性。例如，可以添加助滑添加剂，诸如芥酸酰胺和/或油酸酰胺；在一些实施例中，可以添加一种所谓的“抗阻塞”添加剂。添加剂在塑料中的浓度范围为约0.01％至约5.0％。
小管可以通过诸如挤出、注塑成型和吹塑成型等多种合适的方法制造。在一个实施例中，小管被不断挤压。制造小管的可替代技术包括例如铸造、挤压或吹膜，上述膜可以通过二次处理操作形成合适的小管。小管壁材料可包括多层，通过共挤压或薄膜层合的方式。例如，针对高生物相容性选择内层，针对低气体渗透性选择外层。作为进一步的实例，内层可容易地形成可断裂密封部14(图8A至8B)，诸如可剥离密封部，而外层可具有弹性和高度不渗透性。例如，小管可具有在为0.03mm至约0.8mm，优选地0.03mm至约0.5mm的壁厚度，在施加大约一个大气压的外部压力下，小管可以基本上变平。
参考图8A，在某些实施例中，样品小管10的区段由可断裂密封部14限定，以流体隔离相邻区段。这种密封特征可以用于分离，例如，将干试剂从液体试剂中分离，直到两者可以重构以进行特定测定，或者用于分离化学活性物质，直到反应达到预期。在小管10的区域中，可以形成可断裂密封部14，在这个区域中，相对的壁已经基本上连接在一起，但没有连接的如此强烈，以防止壁在没有明显破坏小管或以前密封的表面的情况下随后被剥落。这种密封部可称为“可剥离”密封部。在一些实施例中，可剥离的密封部可以是与小管轴线正交的环带。小管长度可在约0.5mm至5mm的范围，或约1mm至约3mm，最优选约lmm。该密封部优选跨越小管的整个宽度，从而对区段进行密封。在一些实施例中，密封环带可在高度或形状上发生变化和/或以与小管轴线横向的角度取向；此类变化可以改变外皮特性。
通过在期望可剥离密封部的位置对小管施加受控量的能量，可以在小管的相对的壁之间创建可断裂密封部14，其处于可剥离密封部的形式。例如，温控密封部头可以在特定的时间间隔内以特定的压力将小管压在固定的砧上。可以选择不同的温度、压力和时间组合，以形成期望尺寸和剥离强度的密封部。可以通过例如以下递送能量，例如，通过将温控的密封部头维持在105℃和140℃之间的恒定温度来加热聚丙烯管材料；能够在递送3与100个大气压力之间的精确压力至期望密封区域的致动器；以及驱动致动器的排序到1到30秒之间的特定循环时间的控制系统。使用这种方法，在聚丙烯小管中制造了令人满意的密封部，在承受大约1个大气压的内压时，可以剥离打开。将密封能量传递到小管的可替代技术包括RF和超声焊接。
在其他实施例中，可使用可替代的小管材料和材料的共混物来优化可剥离密封部性能。例如，可以将两种不同熔融温度的聚丙烯聚合物以某比例进行共混，从而优化其组成和熔融特性，形成可剥离的密封部。参考图7B，除了或代替可断裂密封部14，柔性小管还进一步具有一个或多个压力门194，通过对柔性小管的区段施加受控的力，使其在测试运行期间能够可逆地打开和封闭。
滤波器可以嵌入到小管区段中。在优选的实施例种，滤纸可以通过堆叠多层柔性滤纸材料形成。直接接触样品的滤纸的最上层可具有选择过滤的孔径；滤纸的最底层可包括孔径大得多的材料，在过滤期间施加压力时为最上层提供支撑结构。在该优选的实施例中，滤纸可以折叠以形成袋，其开口端边缘牢固地附接在小管壁上。带滤纸的区段可以能够通过压缩小管的外部而被基本上变平。
在示例性实施例中，一种或多种试剂可以作为干物质和/或作为液体溶液储存在小管区段中。在试剂可以以干形式存储的实施例中，液体溶液可以储存在相邻的区段中，以便于试剂溶液的重构。典型试剂的实例包括裂解试剂、洗脱缓冲液、洗涤缓冲液、DNA酶抑制剂、RNA酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、螯合剂、中和试剂、离液序列高的盐溶液、洗涤剂、表面活性剂、抗凝剂、萌发液、异丙醇、乙醇溶液、抗体、核酸探针、肽核酸探针和硫代磷酸酯核酸探针。在实施例中，其中试剂中的一种是离液序列高的盐溶液，优选的成分是异氰酸胍盐或盐酸胍盐或其组合。在一些实施例中，试剂可储存在小管中的顺序相对于输入样品的开口的顺序反映了试剂可以在使用管的方法中使用的顺序。在一些实施例中，试剂包括能够与样品的预选成分特异性结合的物质。例如，物质可以与核酸特异性结合，或者核酸探针可以与具有特定碱基序列的核酸特异性结合。
在其他实施例中，固相底物可以包含在小管区段内，并且用于捕获样品的一个或多个选择的成分(如果这种成分存在于样品中)，诸如靶微生物或核酸。捕获可以帮助富集靶成分并且从样品中去除反应抑制剂。底物可以是在定义的化学和温度条件下捕获靶细胞、病毒粒子、核酸或其他选择的成分的固相材料，并且可以在不同的化学和温度条件下释放成分。
在一些实施例中，可以在底物上涂覆试剂。可涂覆的试剂的实例为受体、配体、抗体、抗原、核酸探针、肽核酸探针、硫代磷酸核酸探针、噬菌体、二氧化硅、离液序列高的盐、蛋白酶、DNA酶、RNA酶、DNA酶抑制剂、RNA酶抑制剂和萌发液。在一些实施例中，底物可以储存在小管的干区段，而在另一些实施例中，底物可以储存浸入在液体中。在一些实施例中，试剂相对于底物和样品输入的开口储存在小管中的顺序反映了在使用设备的方法中可以使用的试剂和底物的顺序。
底物可以为：珠、垫、滤纸、片、和/或小管壁表面的部分或收集工具。在底物为多个珠的实施例中，珠可以是：二氧化硅珠、磁珠、二氧化硅磁珠、玻璃珠、硝酸纤维素胶体珠和磁化硝酸纤维素胶体珠。在一些珠可以是顺磁性的实施例中，珠可以被磁场捕获。例如，在美国专利号5,705,628；5,898,071；和6,534,262中描述了可允许核酸分子选择性吸附到官能团涂覆的表面的试剂的实例。通过控制溶液的离子强度和聚亚烷基二醇的浓度来选择性地将核酸沉淀并可逆地吸附到固相表面来完成分离。
当这些固相表面为顺磁性微粒时，已吸附靶核酸分子的磁珠可以在保留核酸但不保留其他分子的条件下被洗涤。通过该过程分离的核酸分子适用于：毛细管电泳、核苷酸测序、逆转录、克隆、转染、转导、哺乳动物细胞显微注射、基因疗法方案、RNA探针的体外合成、cDNA文库构建、聚合酶链式反应(PCR)扩增。有几家公司提供了基于磁珠的纯化系统，诸如QIAGEN′s MagAttractTM、Cortex Biochem′s MagaZorbTM、Roche AppliedScience′s MagNAPure LCTM和Silica from Merck&Co。所有这些产物都使用带负电的粒子并且操纵缓冲液条件来选择性地将多种核酸结合到珠上，并在水相缓冲液中洗涤珠和洗脱珠。这些公司使用的很多产品都使用了离液序列高的盐来帮助核酸沉淀到磁珠上。实例描述于美国专利号4,427,580；4,483,920；和5,234,809。
在一些实施例中，底物可以是垫。在另一个实施例中，底物垫可以包括纸张、具有不同疏水特性的交替层纸张、玻璃纤维滤纸或具有确定孔径的聚碳酸酯滤纸。在一些实施例中，垫可以是用于覆盖垫表面选定部分的滤纸或不透水片，该滤纸具有预定的孔径。这种过滤装置可用于从全血和/或其他样品中分离白细胞和红细胞(或其他粒子，诸如病毒或微生物)。垫可以安装在小管壁上和/或样品收集工具上。在一些实施例中，垫可以用试剂溶液浸泡，而在另一些实施例中，垫可以用干试剂涂覆。
优选的示例性实施例可包括2个或多个小管区段110、120、130、140、150、160、170、180和/或190的线性布置(图7B)。线性布置便于将样品和产生的废弃物和靶标以受控的方式通过管移动。原始的生物学样品可以通过小管第一区段110(图7B)的第一开口12(图8B)输入。此后，来自经处理的样品的废弃物可向第一开口回移，而靶标则被推向相反的一端，从而最大限度地减少可能附着在小管壁上的反应抑制剂对靶标的污染，并将靶标限制在小管的干净的区段，其中可含有适合靶标进一步操作的试剂。一些实施例可使用至少三个区段，每个区段含有至少一种试剂。在一些实施例中，这些区段可按照以下顺序含有试剂：第二区段中的试剂可以是裂解试剂、稀释或洗涤缓冲液或底物；第三区段中的试剂可以是底物、裂解试剂、洗涤缓冲液或中和试剂；第四区段中的试剂可以是洗涤缓冲液、悬浮缓冲液、洗脱试剂或核酸扩增和检测试剂。在一些实施例中，三个区段可能是连续排列的，而在另一些实施例中，这三个区段可被中间的另外的一个或多个区段经由可断裂密封部隔开。
在一些实施例中，可加入压力门194(图7B)，选择性地封闭和打开位于小管远端的第二开口，以便从小管中收集测试期间产生的产物，用于在小管外进一步处理。在一些实施例中，这第二开口可位于由两个压力门194和196限定的区段198中，以储存来自样品处理区段的产品。在一些实施例中，可以提供可断裂密封部和压力门的组合，用于将小管内容物转移到第二开口。
在一些实施例中，用于在样品输入后封闭管的闭管装置可包括盖子20(图7B)和/或夹具310。可以使用在盖子和柔性小管的第一开口之间的接口或承接部52以确保牢固密封的密封部。在示例性实施例中，该接口可以是螺纹的，并且可以包括盖子上的锥形特征部62和/或适当的刚性管架50，这样，当固定在一起时，可以接合螺纹部64以连接在管架与盖子之间的锥形特征部62以提供适当的锁闭。在本示例性实施例中，盖子可需要1/2至1个完全旋转以完全从管固定物上拆卸或附接。可以选择接头中螺距和锥角的组合，既便于制造，又能提供反馈阻力，告知用户已经创建了有效的密封。在其他实施例中，盖子锁紧装置可包括盖子与管固定物之间的搭扣、压扣和/或其他类型的“拧锁”机构以及使得盖子永久性地附接在小管上的类似的布置，诸如通过铰接或系紧盖子。
盖子20和管架50均可采用合适的注塑模塑料诸如聚丙烯制成。管架50可以依次通过永久的、密封的密封部固定在柔性管上。盖子的外部部分可以用脊或手柄覆盖以便于其操作。此外，盖子20可包括用于附加样品鉴别标志或标记的区域。作为进一步的备选方案，盖子可以通过将柔性管开口压缩在盖子上的凸起上的压配合或套管直接附接在第一开口柔性管上，以形成密封的密封部。管盖与管固定物之间的锁闭可以通过键控或引导，使得集成在盖中的收集工具36或特征部可以相对于管明确定向，以便于样品处理和柔性小管的变平。此外，盖子可以加入诸如棘轮或类似的安全机构等特征，以防止盖子安装到柔性管的开口后被移除。
某些实施例中用于封闭小管的盖子20可含有腔室22，这是通过使盖体基本上中空而形成的。在一些实施例中，空心部分从盖体顶部延伸到盖体底部的孔口。为了形成腔室，可以通过将盖紧固在盖体上来封闭腔体的顶部。盖可与盖体作为同一件制造。盖可以加入通气孔26，或可进一步加入粘贴的微生物屏障、滤纸或当暴露于液体或特定温度时膨胀以封闭通气孔的材料。腔室底部可由可断裂的隔膜或阀门保持开放或封闭。空心腔室可进一步加入柔性膜或隔膜24。这种柔性隔膜可以使用浸渍成型、液体注射硅胶成型、吹塑成型和/或适用于创建薄弹性结构的其他方法来制造。柔性隔膜可以插入盖体腔室22组装体中，以便在管盖就位后，有效地将管内部分与外界环境隔离。可以将柔性隔膜设计为，在没有外部施加的压力的情况下，其固有的硬度确保它处于优选的、已知的变形状态。作为另一个实施例，柔性隔膜可以用塞代替。在示例性实施例中，高度约为30mm、直径为14mm的盖体可以由合适的热塑性塑料注塑而成，并且含有具有至少500uL可用体积的内腔。盖体中的腔室可适于用于有用的用途，诸如盛有或分配试剂，作为盛有废弃液的贮液器，作为整体收集工具的回收空间，或其组合。
盖子20可具有整体的收集工具30(图8B)，诸如拭子、毛细管、液体滴管、接种环、注射器、吸收垫、镊子、勺子或签子，以便于液体和固体样品的收集及其插入小管中。收集工具可设计为收集预定量的材料并将其存入管中。试剂可储存在收集工具本身上。例如，收集工具可包括浸有干盐的拭子，当拭子被水合时，会将拭子中的盐悬浮到溶液中。此外，可以设计收集工具和盖子，使收集工具部分在将样品沉积到小管后收缩到盖体中，使小管区段基本上不受影响。
盖子20中的腔室22可以用来储存试剂。为了做到这一点，例如，腔室的底部可被可断裂的隔膜或阀门(未显示)封闭，这样当盖子被挤压时，隔膜破裂释放试剂。这样的特征将是有用的，例如，如果盖子与收集工具诸如拭子或签子一体地形成。在这种情况下，从盖子腔室中释放出来的试剂可以用来将收集工具上的样品洗至管区段或用来裂解收集工具上含有的样品。也可以通过打开可断裂的隔膜，使用压缩柔性管区段产生的压力，迫使流体从管向上进入盖子腔室，从盖子腔室释放试剂。盖子中的腔室可用于储存来自小管内处理的废弃液。在另一个实施例中，腔室的底可以保持开放，这样当连接到柔性小管的第一开口时，小管与腔室之间就形成了流体通道。随着流体进入盖子腔室，其内部含有的柔性隔膜24可以从初始位置向上移动，以容纳新流体的流入。可以通过在盖体盖上加入通气孔26来便于隔膜运动。
参考图7B，当流体转移到盖子腔室后，分析仪中的夹具310或致动器312可以起到压缩小管的作用，并且有效地将盖子腔室容积从小管区段中密封。作为可替代的实施例，盖子腔室可以加入压力门或止回阀(未显示)，以禁止流体从盖子腔室回流到管区段。作为进一步的替代方案，柔性隔膜可以省略，盖子腔室盖包括微生物屏障，以允许所含气体自由逸出，但将所有液体体积和感染原保留在管中。作为进一步的替代方案，可将柔性隔膜替换为轴向向上移动的塞，以容纳从管区段转移到盖子腔室的另外流体体积。在盖子腔室内容纳流体废弃物的其他方法可以很容易地设想，而不脱离本公开的范围。
通过约束至少小管的近端和远端，可以提供基本上刚性框架50(图7A)来保持柔性小管10适当地拉紧。在示例性实施例中，可以提供第一约束来永久地将小管附接和密封在管的第一开口周围的框架上。该密封部可以通过使用热和/或超声源将柔性小管焊接到框架来制造。可替代地，密封部可以如下制造：使用乙烯-醋酸乙烯酯热熔粘接剂接头，或通过使用UV固化环氧树脂或其他粘接剂制造接头。在另一个实施例中，小管可机械密封或与框架嵌合成型。可以提供第二约束以附接和密封小管到框架的底。在第二约束的示例性实施例中，小管的这一端可以通过热和/或超声焊接技术密封并附接到刚性框架上。可替代的，这种接头和密封部也可以使用粘合剂或机械方法形成。在可替代的实施例中，第二个密封部可以类似于第一个密封部，基本上是开放的，以便从第二开口通至柔性小管的内容物。最优化的是将小管和框架材料联合制造。例如，框架可以用熔融点比较细的小管低的聚丙烯制成，以确保跨一个或多个焊接区熔融更均匀。为了便于小管与框架之间的焊接，接头区域可以是锥形的或其他形状的，以包括导能器或其他常用的特征增强焊接性能。在示例性实施例中，刚性框架可以由任何合适的塑料通过注塑成型制成，其尺寸约为150mm高，25mm宽。
刚性框架50可以加入多个特征以便于柔性小管的压缩和变平。例如，在示例性实施例中，柔性小管10可仅被限制在其两个轴向末端，以允许最大的径向自由度，以避免因其被压缩而阻碍小管的径向运动。在另一个实施例中，可以通过在框架中靠近管的第一开口包括缓冲区来便于压缩。该缓冲区可便于柔性小管从小管区段基本压缩的形状转变为第一开口处基本上开放的形状。便于柔性管压缩的刚性框架的其他有用特征可包括一体式小管张紧机构。在示例性实施例中，这种张紧机构可以通过以下来制造：将诸如悬臂或叶型弹簧的特征部直接模塑到刚性框架中，以在其与框架的附接点中的一个处拉紧小管。
刚性框架50便于管鉴别、操作、样品装载以及与管盖子的连接。例如，框架可以提供另外的区域，通过贴在其上的标记或文字80来鉴别管。框架的塑料材料可以与盖子材料进行颜色编码，以帮助鉴别设备及其功能。框架可加入特殊功能，诸如厚度变化，或引导其进入接收仪器中的方向或在制造期间的图例。框架可以与套筒90或外包装连接，以覆盖或保护柔性小管免受意外操作损坏、光暴露和/或热暴露。刚性框架的主体还可以提供方便的结构来固定管。框架可具有一体式收集工具32，诸如导流板或铲子，便于样品收集到设备中。框架的样品接收端还可加入锥形或漏斗形的内表面，以引导收集的样品进入柔性管。
在一些实施例中，设想了通过使用前文所述设备从生物学样品中提取核酸的方法。在某些实施例中，这种测试中事件的顺序可包括：1)可用收集工具收集生物学样品，2)可以通过小管中的第一开口将收集的样品放入柔性小管中，该小管可包括可含有测试期间所需试剂的多个区段，3)可将至少一种底物设定在受控的温度和/或其他条件下，以在设定的孵育期捕获靶生物体或核酸，4)通过将液体转移到废弃物贮液器中可以除去未处理的样品中未与底物结合的生物体或分子，5)废弃物可以储存在废弃物贮液器中，可以通过压靠在小管上的夹具和/或致动器与靶标隔离，6)可添加从小管的另一区段释放的洗涤缓冲液，以去除反应抑制剂，7)可以在受控的温度孵育后添加来自另一区段的洗脱试剂以释放与底物结合的靶标，以及8)可以通过本领域技术人员熟知的技术检测或通过小管中的第二开口收集核酸。在示例性实施例中，样品的流动可随着测试的进行，从第一开口朝向小管的远端，而废弃物的流动可朝向小管的封闭样品输入开口，在小管的盖子中的废弃物室接收废弃物进行储存。因此，避免了经处理的样品与未处理的样品接触过的反应容器表面之间的不期望的接触，从而防止由于未处理的样品中存在的并可能涂覆在反应容器的壁上的痕量反应抑制剂而导致的反应抑制。
一些实施例可包括使用试管1(图7A至7B)，将柔性小管10分为多个区段，诸如区段16、110、120、130、140、150、160、170、180和/或190，这些区段可能横跨小管的纵轴，其中可含有试剂，诸如试剂210、221、222、230、240、250、260、270、280和/或290；以及使用分析仪，其可具有多个致动器，诸如致动器312、322、332、342、352、362、372、382和/或392，夹具，诸如夹具310、320、330、340、350、360、370、380和/或390，以及模块，例如314、344和/或394(为简便起见未对其他编号)；与致动器和夹具相对，对样品进行处理。这些致动器、夹具和/或模块的各种组合可用于有效地封闭小管，从而隔离流体。在示例性实施例中，致动器或模块中的至少一者可具有热控制元件来控制用于样品处理的小管区段的温度。样品处理设备可进一步具有至少一个能够对区段施加磁场的磁场源430。样品处理设备可进一步具有检测装置492，诸如光度计或CCD，以监测小管内反应发生或完成。
管和分析仪的组合使用可以实现许多样品处理操作。收集样品，诸如血液、唾液、血清、粪便、组织活检、大便或其他固体或液体样品，可使用可加入盖子20的样本收集工具30或管架50上的特征部32来完成。在收集到适量的样品后，可以将盖子放在管的第一开口上，以封闭管并将样品沉积到第一区段。在该步骤之后，收集工具中含有的样品可以通过压缩盖子的部分而用盖子内分离的腔室中含有的试剂洗掉或重悬。然后将管装入分析仪中进行进一步处理。鉴别特征部，诸如条形码或RF标签，可以出现在管上，以分析仪和/或用户可以读取的格式指定样品的身份。
通过对柔性小管施加压力以不可逆地分离小管壁的结合面来打开小管区段的可断裂密封部。致动器可以用来施加所需的压力来压缩含有流体的小管区段，以打开可断裂密封部。在由A和B两个可断裂密封部分隔的区段的实施例中，当对区段施加压力使密封部A断裂时，分析器可通过用致动器或夹具物理保护密封部B区域来优先断裂密封部A，以防止密封部B断裂。可替代地，密封部A可通过以精确的方式对与密封部A相邻的区段施加压力而优先打开，使得；密封部A通过相邻段产生的压力首先打开；密封部A断裂后，由于附加的合并的区段容积，两区段之间的压力大幅下降；合并的区段的压力降低不足以使密封部B断裂。该方法可以在不使用保护致动器和/或夹具的情况下每次打开一个可断裂密封部。作为进一步的替代方案，密封部A的粘附性可以不如密封部B，使得密封部A可以在比密封部B更低的压力下断裂。
流体从一个区段移动到另一个区段的过程可包括，例如，在第一个区段的一端释放夹具，在第一个区段的另一端压缩夹具，释放第二个区段的致动器，并且压缩在第一个区段的致动器将液体从第一区段移动到第二区段。可替代地，在第二区段释放致动器后，夹具可以省略或打开。
位于相邻区段中的至少一种为液体的两种物质混合的过程可以通过以下完成：释放两区段之间的夹具，通过打开第二区段的可断裂密封部移动第一区段中含有的液体；并交替压缩第二区段和第一区段，使液体在区段之间流动。
搅动可以通过用致动器交替压缩和解压小管区段进行，而致动器侧翼的两个夹具都在压缩小管。在另一个实施例中，搅动可以通过在至少两个区段之间交替移动液体来实现。
在实施例中，当小管区段中可含有体积超过方案所需体积的液体时，可以通过以下方式执行调节区段中液体体积的过程：压缩小管区段以减小管壁之间的间隙，使区段的容积达到期望水平，并且允许超过的液体流向相邻的区段，通过区段末端的夹具或相邻的致动器；用夹具或致动器封闭小管区段，得到经调整的小管区段内剩余液体体积。
去除气泡的过程可包括搅动含有气泡的液体的区段。除去气泡的另一过程可包括在封闭第二区段的同时搅动含有液体的第一区段；打开第二段并且将液体从第一区段移动到第二区段；搅动第二区段并且调整第二致动器的位置，使液-气界面向在第二区段上端附近或上方移动，然后夹紧第二区段上端，以形成完全充液的无气泡区段。
稀释过程可通过使用液体运动过程进行，其中区段中的一个包括稀释剂，另一个包括待稀释物质。
将分别储存在不同小管区段或亚区段中的干组分和液体组分重构试剂的过程可包括压缩含有液体成分的小管区段或亚区段以打开连接到干试剂区段的可断裂密封部，将液体移入干试剂区段或亚区段，并使用混合过程将干试剂和液体成分混合。
区段内容物的孵育可以通过以下实现：设置相应的致动器和/或模块温度并且对区段施加压力，以保证小管壁与致动器与模块之间有足够的表面接触，并使小管区段内容物与周围的致动器和/或模块温度基本上相同。孵育可以在所有的处理条件下进行，只要所有包括的区段的温度都按要求设定。
孵育的快速升温可以通过以下实现：在第一温度孵育第一区段中的流体并为紧邻第一区段的第二区段设置第二温度，在第一温度完成孵育后，将液体从第一区段快速移动到第二区段并在第二温度孵育。
通过用中央定位的致动器及其侧翼夹具(如果有的话)压缩小管，以形成具有间隙为约1至约500μm、优选地为约5至500μm通过区段的薄层流道来进行流驱动通过流道过程。相邻的致动器在与流道液体连通的相邻区段上轻轻压缩，以产生偏移的内压，以保证薄层流道的间隙基本上均匀。两个侧翼致动器可以在各自的区段上交替压缩和释放小管上的压力，以产生在受控的流速下的流动。可加入可选的流量、压力和/或力传感器用于实现流动行为的闭环控制。流道过程可用于洗涤、提高底物结合效率和检测。
磁珠固定和重悬过程可用于从样品液中分离珠。磁源430产生的磁场(图7B)可以施加在含有磁珠悬浮液230的区段130上，以将珠捕获并固定到管壁。在捕获期间可使用搅动过程。在另一个实施例中，可以在施加磁场的区段上形成流道，在流动下捕获磁珠，以增加捕获效率。为了重悬固定的珠，可以关闭或移除磁场，并采用搅动或流道过程进行重悬。
从底物中去除残留碎片和反应抑制剂的洗涤过程可使用三个基本步骤进行：首先，致动器可以压缩含有底物(诸如固定的珠或片)的区段，以基本上去除该区段中的液体。其次，使用类似于将试剂从干组分和液体组分中重构的过程，可以将洗涤缓冲液移至该区段。对于基于珠的底物，可以使用珠重悬过程，然后在小管壁上再捕获珠。第三，在混合或搅动过程后，致动器可以压缩区段以去除来自区段的使用的洗涤液。在另一个实施例中，可以在含有底物的区段中形成流道，该底物可以是固定的珠或片。具有层流特性的单向流动洗涤是通过带底物的流道产生的。最后，所有的致动器和夹具(如果有的话)可封闭以基本上去除来自区段的所有液体。在另一个实施例中，可以采用基于稀释的洗涤和基于层流的洗涤相结合的方法以进一步提高洗涤效率。
裂解可以通过在设定温度加热样品或通过使用热和化学试剂的组合来破坏开放的细胞膜、细胞壁或未包被的病毒颗粒来实现。在另一个实施例中，裂解可以使用化学试剂，诸如蛋白酶K和离液序列高的盐溶液来实现。化学试剂可以储存在更多的小管区段中的一个，并使用上述过程与样品组合。在一些实施例中，可以结合诸如化学细胞裂解、机械研磨和加热等多个过程来分解固体样品，例如从活检中收集的组织，以最大限度地提高性能。
通过使用底物可以实现对靶微生物的捕获。在实施例中，底物表面可涂覆有至少一种结合试剂，诸如针对靶生物体表面的抗原、受体或配体的抗体、配体或受体(ASA)、核酸(NA)、肽核酸(PNA)和硫代磷酸(PT)核酸探针，以捕获与探针或靶生物体互补的特异性核酸靶序列。在另一个实施例中，表面可以经选择具有或涂覆以形成带静电(EC)的表面，诸如二氧化硅或离子交换树脂涂覆的表面，以可逆地基本上仅捕获核酸。在一些实施例中，底物可以干形式预装在小管区段或亚区段中，并且液体结合缓冲液可装在另一区段中。通过使用上述过程可以重构底物和缓冲液。
在一些实施例中，在与底物孵育之前，可使用来自相邻区段的试剂来稀释样品。在一些实施例中，在裂解微生物之前，可以将靶生物体捕获到底物上；而在其他实施例中，可以在靶标捕获步骤之前进行裂解步骤。在优选的实施例中，在搅动中孵育底物可以在期望温度进行，例如，在4℃进行活细菌捕获，或在室温进行病毒捕获。捕获之后可以通过洗涤过程去除小管区段中样品的残余物和不需要的成分。
在一些实施例中，磁珠可用作捕获靶标的底物，并且磁珠固定和重悬过程可以用来将磁珠与样品液体分离。在底物可以是垫或片的其他实施例中，底物可加入收集工具和/或可在区段中小管壁上粘附。
洗脱可以通过加热和/或将底物在升高温度在小管区段中的溶液中孵育而实现。洗脱的优选温度从50℃至95℃。在另一个实施例中，洗脱可通过改变底物悬浮或嵌入的溶液的pH来实现。例如，在示例性实施例中，洗液的pH可以在4与5.5之间，洗脱缓冲液的pH可以在8与9之间。
孢子萌发过程可以通过将含有细菌孢子的样品与萌发溶液混合，并在合适的条件下孵育混合物来进行。萌发液中可含有以下的至少一种：L-丙氨酸、肌苷、L-苯丙氨酸、和/或L-脯氨酸以及一些富集的生长介质，以允许从孢子中释放出来的前营养细胞的部分生长。萌发的优选孵育温度范围为20℃至37℃。通过在底物涂覆抗孢子抗体，可以从同时含有活孢子和/或死孢子的样品中选择性富集营养细胞。活的孢子可以从底物中释放出多个营养细胞，这些营养细胞可以被进一步处理以检测细菌物种的核酸序列特性。在一些实施例中，萌发液可吸收于垫中。
在某些实施例中，从生物学样品中提取的核酸可通过使用至少一种方法对核酸进行扩增来进一步处理，这些方法来自由以下组成的组：聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)和链置换扩增反应(SDA)。在一些实施例中，从生物体中提取的核酸可以是核糖核酸(RNA)，其过程可包括使用诸如Tth聚合酶和Taq聚合酶或逆转录酶和Taq聚合酶的组合进行偶联逆转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)。带切口环状核酸探针可以使用T4DNA连接酶或AmpligaseTM进行环化并引导核酸，诸如DNA或RNA靶标，然后通过体外筛选过程后检测封闭环状探针的形成。这种检测可以通过PCR、TMA、RCA、LCR、NASBA或SDAR使用本领域熟知的酶进行。在示例性实施例中，通过使用带荧光标记的核酸探针或DNA嵌入染料以及分子分析仪中的光度计或电荷耦合装置，可以实时检测核酸的扩增，以检测核酸扩增期间荧光的增加。这些带荧光标记的探针使用本领域技术人员众所周知的检测方案(即TaqManTM、molecular beaconsTM、荧光共振能量转移(FRET)探针、ScorpionTM探针)，并且通常使用荧光猝灭以及的猝灭的释放从一个报告因子到另一个报告因子或荧光能量转移来检测特异性核酸的合成或存在。
使用传感器492(图7B)(诸如光度计、光谱仪、CCD)连接到模块(诸如模块490)，可实现对来自小管区段的信号的实时检测。在示例性实施例中，可通过致动器392在小管区段190上施加压力以适当定义小管区段的形状。信号的格式可以是某一波长的光的强度，诸如荧光灯、光谱和/或图像，诸如细胞的图像或人造元素，诸如量子点。对于荧光检测，可以使用来自光学系统的光的激发来照射反应，并且发射光可通过光度计检测。为了检测多个具有特定波长的信号，不同波长的信号可以通过专用的检测通道或光谱仪进行串联或并联检测。
公开的装置和方法可广泛应用于医药、农业、环境监测以及许多其他生物学样品测试应用的实践。从外科医生切除的肿瘤周围的组织活检样品中分离的核酸可用于检测癌前组织。在这些应用中，抑癌基因和原癌基因中的热点突变可以使用本领域技术人员熟知的基因分型技术来检测。癌前组织通常具有体细胞突变，其通过以下容易地鉴别：将用活检样品的基因分型测试的结果与患者基因分型进行比较，使用全血作为核酸来源。从白细胞中分离的核酸可用于使用本领域技术人员熟知的基因分型技术检测遗传变异和种系突变。此类突变的实例包括美国医学遗传学学会和美国妇产科医师学会推荐用于产前诊断的大约25个已知的CFTR基因突变体。遗传变体的实例是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶中的高频等位基因，其影响对治疗药物的敏感性，如抗疟药伯氨喹。
具有临床相关性的遗传变异的另一个实例是与病理条件风险增加有关的等位基因(如因子V Leiden等位基因)和静脉血栓形成风险增加有关的等位基因。从细菌中分离的核酸可用于检测基因编码序列，以评估菌株的致病性。此类基因的实例是例如炭疽芽胞杆菌PXO1质粒上的致死因子、保护性抗原A和水肿因子基因以及炭疽芽胞杆菌PXO2质粒上的荚膜抗原A、B和C。这些序列的存在使得研究者可以区分炭疽芽孢杆菌与无害的粪便细菌。从RNA病毒中分离的核酸可用于检测基因编码序列，以检测病毒的存在与否，或对病毒进行定量以指导感染个体的治疗。
此类测定的特别重要的用途是检测人类免疫缺陷病毒(HIV)，以指导抗逆转录病毒疗法。从DNA病毒中分离的核酸可用于检测基因编码序列，以检测血液中病毒的存在与否，然后再用于制造血液衍生产品。在血液样品池中检测乙型肝炎病毒是施用本领域众所周知的技术的众所周知的实例。磨碎牛肉中维罗毒素大肠杆菌的存在是该设备潜在农业用途的好的实例。在表面检测诺瓦克病毒是公共卫生环境监测应用的实例。
一些实施例可包括使用试管1，将柔性装置10分为多个区段，诸如区段16、110、120、130、140、150、160、170、180和/或190，这些区段可能横跨设备的纵轴，其中可含有试剂，诸如试剂210、221、222、230、240、250、260、270、280和/或290；以及使用分析仪，其可具有多个抗压构件，诸如致动器312、322、332、342、352、362、372、382和/或392，夹具，诸如夹具310、320、330、340、350、360、370、380和/或390，以及模块，例如314、344和/或394(为简便起见未对其他编号)；与致动器和夹具相对，对样品进行处理。这些致动器、夹具和/或模块的各种组合可用于有效地封闭装置，从而隔离流体。在示例性实施例中，致动器或模块中的至少一者可具有热控制元件来控制用于样品处理的装置区段的温度。样品处理设备可进一步具有至少一个能够对区段施加磁场的磁场源430。样品处理设备可进一步具有检测装置492，诸如光度计或CCD，以监测设备内反应发生或完成。
通过用中央定位的致动器及其侧翼夹具(如果有的话)压缩装置，，以形成具有的间隙为约1至约500μm、优选为约5至500μm通过每个区段的流道来通过流道驱动流体。相邻的致动器在与流道液体连通的相邻区段上轻轻压缩，以产生偏移的内压，以保证流道的间隙基本上均匀。两个侧翼致动器可以在各自的区段上交替压缩和释放装置上的压力，以产生在受控的流速下的流动。可加入可选的流量、压力和/或力传感器用于实现流动行为的闭环控制。流道过程可用于洗涤、提高底物结合效率和检测。
颗粒的固定和重悬过程可用于从样品液中分离颗粒。磁源产生的磁场可以施加在含有磁性颗粒悬浮液的区段上，以将颗粒捕获并固定到管壁。在捕获期间可使用搅动过程。在另一个实施例中，可以在施加磁场的区段中形成流道，在流动中捕获磁性颗粒，以增加捕获效率。为了重悬固定的颗粒，可以关闭或移除磁场，并采用搅动或流道方法进行重悬。
本发明的实施例将进一步在以下实例中描述，这些实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实例
实例1：大斯托克斯位移荧光染料
通过为系统开发用于性传播感染(STI)的面板，证实了使用LSS染料的多重PCR的概念。由可商购的LSS染料(Dy396XL“超级斯托克斯”染料(德国耶拿Dyomics，GmbH)和Chromeo 494染料(美国加利福尼亚州卡尔斯班Active Motif))制备了两种荧光PCR探针(TaqMan探针)。图2总结了四种标准荧光染料和Dy396XL (392 nm/572nm)的激发和发射光谱，它们可以在紫外通道激发，并且在绿色通道读出。同样地，图3总结了与Chromeo 494染料(494 nm/628nm)类似的设置，其可以被来自蓝色通道的光激发，并且在黄色和/或红色通道读出。
实例2：用LSS染料在Liat系统上进行多重PCR
随着LSS染料(Dy395XL和Chromeo494)的引入，系统上的多重测定水平从四个检测通道(bb、gg、aa、rr)提高到六个检测通道(加入ug和br)。表2提供了6通道CT/NG/TV/MG测试的实例。使用LSS染料(Dy395XL和Chromeo494)分别标记MG和NG探针。图4总结了/>CT/NG/TV/MG测试中六个TaqMan探针的实时PCR生长曲线。
表2：
| 靶标 | 荧光染料 | 检测通道 |
| 生殖支原体(Mycoplasma genitalium)(MG) | Dy395XL | ug |
| 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(CT) | FAM | bb |
| 阴道毛滴身(Trichomonas vaginalis)(CT) | Chromeo494 | br |
| 内部处理对照(IC) | HEX | gg |
| 淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)(NG)靶标1 | CFR610 | aa |
| 淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)(NG)靶标2 | Quasar670 | rr |
在6个通道CT/NG/TV/MG测试中，证实了四个常规通道(FAM、HEX、CFR610和Quasar670)与ug和br通道(分别为Dy395XL和Chromeo494)组合的可行性(表3)。串色校正后，没有观察到无相应的靶标的信号。
表3：
实例3：Dy395XL和Dy396XL的比较
对LSS染料的功能性和可制造性的进一步评估显示，Dy395XL的荧光强度很弱(ε＝20,600M-1cm-1)，并且与DNA的偶联由于在水溶性有机溶剂中的极低溶解度和纯化问题而无法按比例增加。具有较高消光系数(ε＝26,600M-1em-1)的Dy395XL类似物Dy396XL显示了与DNA偶联的可行性可制造性。图5至6显示了各自标记有Dy395XL或Dy396XL的两个MG探针的性能比较。MG-Dy396XL探针的基线比MG-Dy395XL探针的基线高1.5至2.5倍。统计分析表明，MG-Dy396XL探针在Ct和振幅方面的性能优于MG-Dy395XL探针(更早的Ct和更高的振幅)。MG-Dy396XL探针的较高的Kexp值(对数生长期的斜率)也表明MG-Dy396XL探针具有更稳健的生长曲线。
实例4：使用LSS染料和TAGS技术的多重PCR在480分析仪上的实验设置
下面的实例表明，LSS染料扩展光学多重测定的概念可以与其他多重测定方法相结合。使用TAGS(温度辅助信号的产生)技术的PCR基于DNA探针结构，该结构允许通过测量不同温度的荧光来区分同一光学通道中的多个靶标(如公开于美国专利公开号2018/0073064并且通过引用以其全文并入本文)。基于TAGS的热多重测定技术可以与光学多重测定技术配对，条件是LSS染料具有在最高100℃的温度保持稳定的荧光信号强度。
构建了使用TAGS技术模型系统具有三个热通道(TC)的多重PCR，以实现更高阶的多重测定。对于TC1，使用含有5′-荧光团和内部BHQ-2猝灭剂的标准TaqMan探针，而TC2和TC3使用带标签的TAGS探针。带标签的探针由靶特异性DNA序列、携带5’-BHQ-2荧光猝灭剂和共价结合的“R-标签”序列组成，它们对于各自的热通道和光学通道是特异性的。R-标签序列携带荧光染料并且由具有确定解链点的非天然L-DNA至另一条携带第二个3’-BHQ-2荧光猝灭剂(猝灭寡核苷酸，“Q-标签”)的互补L-DNA链组成。TC2和TC3的带标签的探针仅在L-DNA区段的长度上存在差异。
通过在固相DNA合成期间引入氨基修饰并用染料的原位活化羧酸进行合成后标记，制备了含有LSS染料的常规TaqMan探针和带标签的TAGS探针(公开于美国专利公开号2020/0017895并且通过引用以其全文并入本文)。将寡核苷酸用反相色谱法纯化，使用三乙铵乙酸酯缓冲液和乙腈。最终带标签的探针通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。
选择了两种具有热稳定性荧光的LSS染料来证明与TAGS技术的相容性；这两种染料为可商购的ATTO 490LS染料(德国锡根ATTO-TEC GmbH)和称为RLS的另一种专用染料。在和/>x800系统上，ATTO 490LS(496nm/661nm)可以在FAM激发通道(495nm)激发，在LCR发射通道(645nm)读出。RLS染料(468nm/553nm)可以被来自COU激发通道(435nm)的光激发，并在HEX发射通道(580nm)读出。图9中给出了5色/>480和/>x800分析仪上五种标准染料(COU、FAM、HEX、LCR、Cy5.5)和两种LSS染料通道(ATTO 490LS和RLS)的光学通道分配矩阵。五种标准荧光染料与ATTO 490LS和RLS染料组后的激发和发射光谱的概览分别示于图10和图11。
实例5：使用Atto490LS染料和TAGS技术的多重PCR
在该实例中，在LSS光学通道中进行了具有热多重测定和检测的PCR反应。分支探针与猝灭寡核苷酸以1：20摩尔比孵育。在50μL反应物中，混合物通常被循环使用，其含有60mM三羟甲基甲基甘氨酸、120mM乙酸钾、5.4％DMSO、0.027％叠氮化钠、3％甘油、0.02％Tween 20，43.9μM EDTA、0.2U/μL UNG、400μL dATP、400μM CTP、400μM dGTP、800μM dUTP、3.3mM乙酸锰、0.9U Z05酶、800nM Q-标签、400nM的每种引物和40nM的分支探针。类似于典型PCR扩增反应的循环条件显示于下表4。
表4：
图12显示了ATTO 490LS通道跨三个热通道中的实时PCR生长曲线。在480分析仪上生成数据。TC1基于带有ATTO 490LS染料的标准TaqMan探针，并且在58℃荧光读数。TC2和TC3基于带有ATTO 490LS染料的带标签的TAGS探针设计，分别在80℃和91℃产生荧光读数。在八个单独的PCR反应(样品A至H)中测试了跨三个热通道的所有可能的靶标组合。每个热通道的生长曲线在预期的阳性PCR信号处用星号标记。如预期的，信号只在靶标存在的样品中获得。无相应靶标的样品中未观察到信号。对于较高的热通道，在不存在靶标的情况下，轻微的正或负斜率是由荧光染料的非优化热串色校正引起的。靶标的浓度为1000cp/反应。
实例6：使用RLS染料和TAGS技术的多重PCR
除了在不同的LSS通道中使用专用的LSS染料(称为RLS)进行荧光检测外，还进行了与实例5中描述的实验类似的实验。如前所述，信号只在靶标存在的地方获得。值得注意的是，ATTO 490LS和RLS占用两个不同的LSS通道。标准光学通道与LSS染料通道之间的串色可以忽略不计，表明ATTO 490LS和RLS可以同时使用。图13显示了相应的实时PCR生产曲线。
结论：
上面的实例表明，通过引入LSS染料，和/>x800系统的多重测定水平可以从五个常规检测通道(COU、FAM、HEX、LCR、Cy5.5)提高到至少七个检测通道(加入ATTO 490LS和RLS)。通过结合使用LSS染料的多重测定和使用本文所述的三个温度通道的TAGS多重测定，可以实现21个单个靶标的检测。
原则上，如果染料的荧光特性与仪器的光学滤波器相匹配，高阶光学多重测定可以兼容任何基于荧光的PCR平台。这样，不需要对仪器硬件进行改动。通过上述概念在Liat和/>480(可直接转移到/>x800系统中)两种不同PCR系统上的成功应用，也表明了光学多重测定技术的平台独立性。/>
Claims (18)
1.一种用于检测样品中至少两种靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在单个反应容器中使疑似含有所述至少两种靶核酸序列的所述样品与以下项接触：
i.具有与第一靶核酸序列的每条链互补的核苷酸序列的第一对寡核苷酸引物，和具有与第二靶核酸序列的每条链互补的核苷酸序列的第二对寡核苷酸引物；
ii第一寡核苷酸探针，其包含与所述第一靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列并且在由所述第一对寡核苷酸引物界定的所述第一靶核酸序列内退火，其中所述第一寡核苷酸探针标记有能够产生可检测信号的大斯托克斯位移(LSS)荧光染料以及能够猝灭由所述LSS荧光染料产生的所述可检测信号的第一猝灭剂部分，其中所述LSS荧光染料通过核酸酶敏感的切割位点与所述第一猝灭剂部分分离；
iii第二寡核苷酸探针，其包含与所述第二靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列并且在由所述第二对寡核苷酸引物界定的所述第二靶核酸序列内退火，其中所述第二寡核苷酸探针标记有能够产生可检测信号的小斯托克斯位移(SSS)荧光染料以及能够猝灭由所述SSS荧光染料产生的所述可检测信号的第二猝灭剂部分，其中所述SSS荧光染料通过核酸酶敏感的切割位点与所述第二猝灭剂部分分离，并且其中所述SSS荧光染料具有与所述第一寡核苷酸探针上的所述LSS荧光染料的吸收峰最大值显著不同的吸收峰最大值和与所述第一寡核苷酸探针上的所述LSS荧光染料的发射峰最大值相似的发射峰最大值，其中显著差异在波长方面为至少80纳米；
(b)使用具有5`至3`核酸酶活性的核酸聚合酶通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述第一靶核酸序列和第二靶核酸序列，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，所述核酸聚合酶的所述5`至3`核酸酶活性允许：从所述第一寡核苷酸探针上的第一猝灭部分切割和分离所述LSS荧光染料，以及从所述第二寡核苷酸探针上的第二猝灭部分切割和分离所述SSS荧光染料；
(c)通过在所述LSS荧光染料的所述吸收峰最大值的波长处或附近激发来测量来自所述LSS荧光染料的所述可检测信号，并且通过在所述SSS荧光染料的吸收峰的波长处或附近激发来测量来自所述SSS荧光染料的所述可检测信号；
(d)在多个PCR循环中重复步骤(b)和(c)，以从所述第一靶核酸序列和第二靶核酸序列产生期望数量的扩增产物；
(e)从自所述LSS荧光染料检测到的信号检测所述第一靶核酸序列的存在，以及从自所述SSS荧光染料检测到的信号检测所述第二靶核酸序列的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述LSS荧光染料的所述吸收峰最大值与所述SSS荧光染料的所述吸收峰最大值之间的差异在波长方面为大于80纳米。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述LSS荧光染料的所述吸收峰最大值与所述SSS荧光染料的所述吸收峰最大值之间的差异在波长方面为大于100纳米。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述LSS荧光染料选自由以下项组成的组：ALEXA FLUOR 430、ATTO 430LS、ATTO 490LS、ATTO 390LS、CASCADE YELLOW、CF350、CHROMEO 494、CYTO 500LSS、CYTO 510LSS、CYTO 514LSS、CYTO 520 LSS、DAPOXYL、DY480XL、DY 481XL、DY 485XL、DY 510XL、DY 511XL、DY 520XL、DY 521XL、DY 601XL、DY350XL、DY 360XL、DY 370XL、DY 375XL、DY 380XL、DY 395XL、DY 396XL、DYLIGHT 515-LS、DYLIGHT 485-LS、DYLIGHT 510-LS、DYLIGHT 521-LS、FURA 2、INDO 1、KROME ORANGE、LUB04、LUCIFER YELLOW、NBD X、NILE RED、PULSAR 650、PYMPO、STAR 440SXP、STAR 470SXP、STAR 520SXP、VIOGREEN、CF 350、SETAU 405和PACIFIC ORANGE。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述LSS荧光染料选自DY 396XL或CHROMEO 494。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述LSS荧光染料具有在最高达100℃的温度保持稳定的荧光信号强度。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述LSS荧光染料为ATTO 490LS。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸探针、所述第二寡核苷酸探针或所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针两者为与TAGS技术兼容的带标签的探针。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述反应容器为小管，其包括
(i)具有开口的近端，通过所述开口可引入样品；
(ii)远端；以及
(iii)至少以下：含有至少一种核酸提取试剂的第一区段、远离所述第一区段且含有洗涤试剂的第二区段，以及远离所述第二区段且含有一种或多种扩增试剂的第三区段，所述区段中的每个：
(A)由所述小管限定；
(B)至少部分地通过由所述小管的相对壁部分彼此粘结而形成的液密性密封部而流体隔离，使得：
(1)通过对部分地通过所述密封部流体隔离的区段施加流体压力来破坏所述密封部；以及
(2)所述密封部能够在所述小管的所述相对壁部分被粘结的地方被夹紧，而不破坏所述密封部，以防止所述密封部通过对部分地通过所述密封部流体隔离的区段施加流体压力而被破坏；
(C)可膨胀以接收从另一区段排出的流体的体积；并且可压缩以在如此压缩时基本上不含流体；
(iv)用于封闭所述开口的盖子，所述盖子含有与所述小管流体连通的腔室，并且所述盖子允许气体自由逸出但将所有液体体积和感染原保留在管中；
(v)固定所述小管的近端和远端的刚性框架；以及
(vi)一体式小管张紧机构或所述小管与框架的附接部，其将所述小管充分拉紧，以促进所述小管的压缩和变平。
10.一种用于检测样品中至少两种靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在单个反应容器中使疑似含有所述至少两种靶核酸序列的所述样品与以下项接触：
i.具有与第一靶核酸序列的每条链互补的核苷酸序列的第一对寡核苷酸引物，和具有与第二靶核酸序列的每条链互补的核苷酸序列的第二对寡核苷酸引物；
ii第一寡核苷酸探针，其包含与所述第一靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列并且在由所述第一对寡核苷酸引物界定的所述第一靶核酸序列内退火，其中所述第一寡核苷酸探针标记有能够产生可检测信号的大斯托克斯位移(LSS)荧光染料以及能够猝灭由所述LSS荧光染料产生的所述可检测信号的第一猝灭剂部分，其中所述LSS荧光染料通过核酸酶敏感的切割位点与所述第一猝灭剂部分分离；
iii第二寡核苷酸探针，其包含与所述第二靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列并且在由所述第二对寡核苷酸引物界定的所述第二靶核酸序列内退火，其中所述第二寡核苷酸探针标记有能够产生可检测信号的小斯托克斯位移(SSS)荧光染料以及能够猝灭由所述SSS荧光染料产生的所述可检测信号的第二猝灭剂部分，其中所述SSS荧光染料通过核酸酶敏感的切割位点与所述第二猝灭剂部分分离，并且其中所述SSS荧光染料具有与所述第一寡核苷酸探针上的所述LSS荧光染料的发射峰最大值显著不同的发射峰最大值和与所述第一寡核苷酸探针上的所述LSS荧光染料的吸收峰最大值相似的吸收峰最大值，其中显著差异在波长方面为至少80纳米；
(b)使用具有5、至3、核酸酶活性的核酸聚合酶通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述第一靶核酸序列和第二靶核酸序列，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，所述核酸聚合酶的所述5`至3`核酸酶活性允许：从所述第一寡核苷酸探针上的第一猝灭部分切割和分离所述LSS荧光染料，以及从所述第二寡核苷酸探针上的第二猝灭部分切割和分离所述SSS荧光染料；
(c)通过在所述LSS荧光染料的所述吸收峰最大值的波长处或附近激发来测量来自所述LSS荧光染料的所述可检测信号，并且通过在所述SSS荧光染料的吸收峰的波长处或附近激发来测量来自所述SSS荧光染料的所述可检测信号；
(d)在多个PCR循环中重复步骤(b)和(c)，以从所述第一靶核酸序列和第二靶核酸序列产生期望数量的扩增产物；
(e)从自所述LSS荧光染料检测到的信号检测所述第一靶核酸序列的存在，以及从自所述SSS荧光染料检测到的信号检测所述第二靶核酸序列的存在。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述LSS荧光染料的所述发射峰最大值与所述SSS荧光染料的所述发射峰最大值之间的差异在波长方面为大于80纳米。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述LSS荧光染料的所述发射峰最大值与所述SSS荧光染料的所述发射峰最大值之间的差异在波长方面为大于100纳米。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述LSS荧光染料选自由以下项组成的组：ALEXA FLUOR 430、ATTO 430LS、ATTO 490LS、ATTO 390LS、CASCADE YELLOW、CF350、CHROMEO 494、CYTO 500LSS、CYTO 510LSS、CYTO 514LSS、CYTO 520LSS、DAPOXYL、DY 480XL、DY 481XL、DY 485XL、DY 510XL、DY 511XL、DY 520XL、DY 521XL、DY 601XL、DY 350XL、DY360XL、DY 370XL、DY 375XL、DY380XL、DY 395XL、DY 396XL、DYLIGHT 515-LS、DYLIGHT 485-LS、DYLIGHT 510-LS、DYLIGHT 521-LS、FURA 2、INDO 1、KROME ORANGE、LUB 04、LUCIFERYELLOW、NBD X、NILE RED、PULSAR 650、PYMPO、STAR 440SXP、STAR 470SXP、STAR 520SXP、VIOGREEN、CF 350、SETAU 405和PACIFIC ORANGE。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述LSS荧光染料为DY 396XL或CHROMEO 494。
15.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述LSS荧光染料具有在最高达100℃的温度保持稳定的荧光信号强度。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述LSS荧光染料为ATTO 490LS。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸探针、所述第二寡核苷酸探针或所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针两者为与TAGS技术兼容的带标签的探针。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，其中所述反应容器为小管，其包括
(i)具有开口的近端，通过所述开口可引入样品；
(ii)远端；以及
(iii)至少以下：含有至少一种核酸提取试剂的第一区段、远离所述第一区段且含有洗涤试剂的第二区段，以及远离所述第二区段且含有一种或多种扩增试剂的第三区段，所述区段中的每个：
(A)由所述小管限定；
(B)至少部分地通过由所述小管的相对壁部分彼此粘结而形成的液密性密封部而流体隔离，使得：
(1)通过对部分地通过所述密封部流体隔离的区段施加流体压力来破坏所述密封部；以及
(2)所述密封部能够在所述小管的所述相对壁部分被粘结的地方被夹紧，而不破坏所述密封部，以防止所述密封部通过对部分地通过所述密封部流体隔离的区段施加流体压力而被破坏；
(C)可膨胀以接收从另一区段排出的流体的体积；并且可压缩以在如此压缩时基本上不含流体；
(iv)用于封闭所述开口的盖子，所述盖子含有与所述小管流体连通的腔室，并且所述盖子允许气体自由逸出但将所有液体体积和感染原保留在管中；
(v)固定所述小管的近端和远端的刚性框架；以及
(vi)一体式小管张紧机构或所述小管与框架的附接部，其将所述小管充分拉紧，以促进所述小管的压缩和变平。
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