CN113817723B - 一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途 - Google Patents
一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113817723B CN113817723B CN202111145944.4A CN202111145944A CN113817723B CN 113817723 B CN113817723 B CN 113817723B CN 202111145944 A CN202111145944 A CN 202111145944A CN 113817723 B CN113817723 B CN 113817723B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- polynucleotide
- standard
- methylated
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
Abstract
一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途,多核苷酸含有的碱基对长度为50~300bp。本发明首次制备了无需打断的标准品,解决了商业化甲基化pUC19标准品单独打断后回收率低、转化率低、无法质控的问题。
Description
技术领域
本发明涉及甲基化测序技术领域,具体涉及一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途。
背景技术
早在1925年,在DNA双螺旋结构鉴定之前,DNA甲基化修饰就已经被发现。DNA甲基化修饰最主要的形式是5mC(5-甲基胞嘧啶)及其衍生修饰,被认为是DNA的“第五种碱基”。DNA甲基化在基因调控、遗传印迹、衰老、炎症、肿瘤等生理病理过程中发挥着重要作用。最近研究表明,cell-free DNA(以下简称cfDNA)甲基化特征是肿瘤早期筛查的重要标志物。
重亚硫酸盐可将胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U),在随后的PCR过程中,采用U耐受的聚合酶,将U识别为胸腺嘧啶(T),实现C->T的转化,从而达到将未修饰C和甲基化修饰C分开的目的。全基因组重亚硫酸盐(whole genome bisulfite sequencing,WGBS),将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(约95%的C会被转化为T),可覆盖全基因组70~99%的胞嘧啶,实现全基因组水平单碱基分辨率甲基化检测。全基因组重亚硫酸盐测序也是甲基化检测的一个“金标准”。但是重亚硫酸盐处理会使DNA大量降解,需要较高的DNA投入量,对于DNA含量较少的样本不友善,例如血浆游离DNA。另外重亚硫酸盐是将未甲基化的胞嘧啶转化成T,而未甲基化的胞嘧啶占基因组所有胞嘧啶的95%以上,因此,使用重亚硫酸盐处理后构建的二代测序文库,碱基平衡性差(A、T碱基总数占比>80%),测序时需要添加 15%的噬菌体PhiX DNA平衡,造成测序数据大量浪费。最后WGBS产生的数据测序质量差,而且比对到基因组时需要使用特殊的软件(例如Bismark),比对率较差,通常只有70%左右,进一步造成数据的浪费。
已公开的中国专利《全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库及构建》(公开号CN110 820050 A)表明,在一定条件下,甲基化C可以被十-十一易位(Ten-ElevenTranslocation, TET)酶转为羧基化C,通过有机硼烷(包括但不限于吡啶硼烷)可以将羧基化的C转化成二氢尿嘧啶,经过测序,可以识别为T,进而区分甲基化C与未甲基化C。基于此原理发明的全基因组甲基化非亚硫酸盐文库构建技术,有效解决了文库复杂度低和测序数据深度低的缺陷,同时可实现在多种二代测序平台的甲基化检测。
公开号为CN 110820050 A的中国专利提及将gDNA混合甲基化pUC19内参后打断,再进行非重亚硫酸盐测序,用甲基化pUC19作为阳参,来质控整个流程的转化率情况。但是这种质控方法并不适用于cfDNA样本,因为cfDNA长度通常只有140~160bp,在二代测序过程中无需打断,需要单独打断甲基化pUC19参考品之后,再与cfDNA混合。
另一方面,市面上商业化的5mC甲基化DNA标准品浓度较低且价格非常昂贵,例如美国ZYMO公司销售的5mC甲基化pUC19标准品,其浓度只有1ng/μL,每管总量只有20ng,售价上千元,而且在使用打断仪(covaris)单独进行打断时,损失严重,通常打断后的回收率只有约1~10%,回收浓度低至0.01ng/μL,低于市面常见的安捷伦2100和Qsep100等DN A片段分析仪的检测范围,所以打断后的片段分布通常不能知晓,无法确认打断是否正常。除了回收率低和无法质控片段大小的弊端,甲基化pUC19单独打断后,添加到cfDNA中,经过非重亚硫酸盐测序方法检测,其5mC到T的转化率较低,通常只有约65%,而且比对到 pUC19的reads转化率随5’-3’方向递减,说明单独打断过程造成了该标准品某种变化,导致其无法被完全转化,因此无法作为cfDNA样本的质控品。
发明内容
根据第一方面,在一实施例中,提供一种多核苷酸,所述多核苷酸含有的碱基对长度为 50~500bp。
根据第二方面,在一实施例中,提供一种标准品,所述标准品包含第一方面所述多核苷酸。
根据第三方面,在一实施例中,提供一种试剂盒,所述试剂盒含有第二方面的标准品,或第一方面所述多核苷酸。
根据第四方面,在一实施例中,提供第一方面所述多核苷酸,或第二方面所述标准品,或第三方面所述试剂盒在免亚硫酸氢盐甲基化检测中的用途。
依据上述实施例的一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途,本发明首次制备了无需打断的多核苷酸标准品,解决了商业化甲基化pUC19标准品单独打断后回收率低、转化率低、无法质控、无法作为cfDNA阳性标准品的问题。
附图说明
图1为打断后的甲基化pUC19作为cfDNA的阳性标准品,TaqI-v2酶切和NGS生信分析检测5mC到T的转化率结果图;
图2A、图2B为pUC19-mapped reads位点CpG转化率结果图;
图3为140~160bp甲基化DNA作为cfDNA的阳性标准品,TaqI-v2酶切和NGS生信分析检测5mC到T的转化率结果图;
图4为140~160bp甲基化DNA制备效果酶切鉴定结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中,很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下,本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述,这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没,而对于本领域技术人员而言,详细描述这些相关操作并不是必要的,他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外,说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时,方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此,说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例,并不意味着是必须的顺序,除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身,例如“第一”、“第二”等,仅用于区分所描述的对象,不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接,”如无特别说明,均包括直接和间接连接(联接)。
本文中,DNA上胞嘧啶的化学结构示意如下:
本文中,DNA上5-甲基胞嘧啶(5mC)的化学结构示意如下:
本文中,“CpG”是“-C-磷酸-G-”的缩写,即胞嘧啶和鸟嘌呤由仅一个磷酸分开;磷酸将任意两个核苷在DNA中连接在一起。“CpG”记法用于将此线性序列与胞嘧啶和鸟嘌呤的CG碱基对区分开来。CpG二核苷酸中的胞嘧啶可经甲基化以形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。基因启动子内CpG位点的甲基化能导致其沉默,这是在许多人癌症中发现的一种特征(例如肿瘤抑制基因的沉默)。相反,CpG位点的低甲基化与癌细胞内癌基因的过表达有关。
根据第一方面,在一实施例中,提供一种多核苷酸,多核苷酸含有的碱基对长度为50~5 00bp,即50~500个碱基对,优选为50~350bp,更优选为100~300bp,更优选为140~160bp,即140~160个碱基对。在一实施例中,该多核苷酸可作为无需打断的样本甲基化测序时的标准品,例如,包括但不限于cfDNA样本。
在一实施例中,该多核苷酸可以作为5mC甲基化标准品,无需打断,大小约为140~160 bp,可以直接按照比例添加到cfDNA中,经过非重亚硫酸盐测序方法,5mC到T的转化率符合预期,达到97%以上,能较准确地质控cfDNA样本的转化情况,同时与市售标准品相比,具有成本低廉、操作便捷、方便质控等等优点。该多核苷酸可以通过人工合成等方式获得。
在一实施例中,多核苷酸含有至少一个CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点,即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)。
在一实施例中,所述多核苷酸的其中一条单链至少5个CpG位点。多核苷酸为双向互补的完整双链,
多核苷酸中的CpG位点可以是低密度的,也可以是高密度的,也即是说,相邻的CpG位点之间可以不间隔其他碱基,也可以间隔至少一个其他碱基,间隔碱基的数量不受限制。
在一实施例中,多核苷酸的其中一条单链含有5~20个CpG位点。此处仅仅是示例性列举,多核苷酸含有的CpG位点数不受限制。
在一实施例中,多核苷酸的其中一条单链含有7~13个CpG位点。多核苷酸为双向互补的完整双链,因此,双链多核苷酸含有的CpG位点为14~26个。
在一实施例中,多核苷酸含有至少一个酶切位点。
在一实施例中,多核苷酸含有至少两个酶切位点。
在一实施例中,多核苷酸含有两个酶切位点。
在一实施例中,酶切位点包括限制性核酸内酶酶切位点。
在一实施例中,限制性核酸内切酶包括I类酶、Ⅱ类酶中的至少一种。酶切位点主要用于评估甲基化标准品的甲基化水平。
根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子,限制性核酸内切酶可分为两大类,即I类酶和Ⅱ类酶。I类酶分子量较大;I类酶包括但不限于从大肠杆菌中发现的EcoK、Eco B等等。Ⅱ类酶分子量通常小于105道尔顿;反应只需Mg2+;在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点,因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后,可产生特异性的酶解片断,这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。II类酶包括但不限于TaqI、HpaII、EcoRI、BamHI、HindⅡ、HindⅢ等。
限制性核酸内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一侧(如E coRI、BamHI、Hind等),因而可形成粘性末端,另一些Ⅱ类酶如AluI、BsuRI、BalI、HalⅢ、HPaI、SmaI等,切割位点在回文序列中间,形成平整末端。
AluI的切割位点如下:
5'-AG^C T-3'
3'-T C^G A-5'。
在一实施例中,TaqI酶的酶切位点为TCGA。TaqI酶的功能具体可参见网址:https://ww w.uniprot.org/uniprot/P14386。
在一实施例中,HpaII酶的酶切位点为CCGG。
在一实施例中,多核苷酸为双链DNA。
在一实施例中,多核苷酸与待测样本不同源。例如,如果待测样本为人源DNA,那么标准品为非人源DNA。
在一实施例中,多核苷酸为非人源的多核苷酸,换言之,多核苷酸与人类基因组不同源。
在一实施例中,可以在NCBI中使用blastn对核苷酸序列进行比对,比对物种限定为ho mo spain,选择“Somewhat similar sequences”比对模式,结果显示无人源序列能匹配,则可判断该核苷酸序列为非人源序列。
在一实施例中,多核苷酸中含有未甲基化的胞嘧啶残基。当多核苷酸作为阴性参考品时,多核苷酸中不含有任何甲基化的胞嘧啶残基。
在一实施例中,多核苷酸中几乎不含有5-甲基胞嘧啶残基。
在一实施例中,多核苷酸中含有5-甲基胞嘧啶残基。
在一实施例中,多核苷酸中至少部分胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶残基。
在一实施例中,多核苷酸中几乎所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶残基,即几乎不含有未甲基化的胞嘧啶残基。
在一实施例中,多核苷酸中CpG位点的胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶残基。5-甲基胞嘧啶残基亦称甲基化胞嘧啶残基。
在一实施例中,多核苷酸中CpG位点的甲基化率>95%。甲基化率是指含有甲基化胞嘧啶残基的CpG位点数量占CpG位点总数量的百分比。
在一实施例中,可以将多核苷酸中的部分序列甲基化,作为甲基化的标准品,另一部分序列不甲基化,作为非甲基化的标准品。
在一实施例中,通常可以使用CpG甲基转移酶,使得多核苷酸中的胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。CpG甲基转移酶可在5’-CpG-3’背景下对未甲基化或半甲基化双链DNA中的所有胞嘧啶核苷酸碱基部分的C5位进行甲基化。CpG甲基转移酶可以从市场上购买得到。
根据第二方面,在一实施例中,提供一种标准品,标准品包含第一方面多核苷酸。在一实施例中,该标准品可以作为甲基化测序文库构建的阳性参考品(亦称阳性标准品)或阴性参考品(亦称阴性标准品)。
在一实施例中,标准品中,部分核苷酸序列中的胞嘧啶为未甲基化的胞嘧啶,另一部分核苷酸序列中的胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。含有未甲基化胞嘧啶的核苷酸序列即为未甲基化的标准品,亦称阴性标准品;含有5-甲基胞嘧啶的核苷酸序列为甲基化的标准品,亦称阳性标准品。
在一实施例中,标准品中,每一条核苷酸序列含有至少一个CpG位点。
在一实施例中,标准品中,每一条核苷酸序列含有7~13个CpG位点。
在一实施例中,标准品中,含有未甲基化胞嘧啶的核苷酸序列数与含有5-甲基胞嘧啶的核苷酸序列数之比为1:1。
在一实施例中,标准品中,含有未甲基化胞嘧啶的核苷酸质量与含有5-甲基胞嘧啶的核苷酸质量之比为1:1。
根据第三方面,在一实施例中,提供一种试剂盒,试剂盒含有第二方面的标准品。该试剂盒可以用于甲基化测序文库构建时的质控。
根据第四方面,在一实施例中,提供第一方面多核苷酸,或第二方面标准品,或第三方面试剂盒在免亚硫酸氢盐甲基化检测中的用途。免亚硫酸氢盐甲基化检测亦称非重亚硫酸盐甲基化检测。在一实施例中,具体可以是非重亚硫酸盐cell-free DNA甲基化检测。
根据第五方面,在一实施例中,提供一种甲基化核苷酸序列的制备方法,包括,将含有未甲基化胞嘧啶的核苷酸序列与CpG甲基转移酶接触,获得含有5-甲基胞嘧啶的核苷酸序列。
在一实施例中,提供一种用于非重亚硫酸盐cell-free DNA甲基化检测的标准品制备方法及其文库构建方法,包括如下步骤:
步骤A:设计10条长度为140~160bp DNA序列,与人源DNA完全不同源(通常在NCBI中使用blastn比对判断不同源)。每条序列含有7~13个CpG位点、1个TaqI酶切位点(TCGA)及1个HpaII酶切位点(CCGG)。设计扩增上述10条序列的引物对。
步骤B:合成步骤A中的10条序列,并且克隆到pUC57质粒中。合成步骤A中的引物对。
步骤C:扩增140~160bp DNA,其中5条序列使用甲基化转移酶M.SssI对此混合片段进行甲基化,获得140~160bp的甲基化DNA标准品,称为140~160bp甲基化DNA(sequence1~5共含有54个甲基化的CpG位点),并用HpaII酶切鉴定甲基化水平。剩余5条序列直接混合,获得140~160bp的非甲基化DNA标准品,称为140~160bp非甲基化DNA (含有45个非甲基化的CpG位点)。甲基化DNA标准品主要是指核苷酸序列中CpG位点的胞嘧啶在甲基化转移酶M.SssI作用下被5-甲基化后的DNA标准品。“甲基化DNA”亦称“m ethylated DNA”、“甲基化DNA标准品”。“非甲基化DNA”亦称“unmethylated DNA”、“非甲基化 DNA标准品”。
步骤D:取50ng人源cfDNA,添加适当比例的140~160bp甲基化DNA标准品和14 0~160bp非甲基化DNA标准品。
步骤E:对上步DNA进行末端修复和加A。
步骤F:使用连接酶连接修复-加A产物和接头以及分子条形码,得到加接头的dsDNA (双链脱氧核糖核酸)。
步骤G:对上述加接头DNA片段进行TET酶(包括但不限于mTET2酶)氧化,得到 TET酶氧化后的DNA片段。
步骤H:获得所述TET酶处理的DNA,再进行有机硼烷(包括但不限于吡啶硼烷)还原处理,得有机硼烷还原产物。
步骤I:以有机硼烷处理后的DNA为模板,进行PCR扩增,完成文库构建。
步骤J:对于构建好的文库,使用Taq酶进行PCR扩增,获得外源性甲基化标准品,对PCR扩增产物进行TaqI-V2酶切,并使用凝胶电泳验证转化效率,满足转化要求的文库进行上机检测。
在一实施例中,所述步骤G中涉及的TET酶可以是任意的TET家族酶,包括但不限于TET1、TET2、TET3等等。
在一实施例中,所述步骤G中,TET酶反应液组成如下:50mM HEPES(pH=6.0)、100mM NaCl、1mMα-酮戊二酸盐(即α-ketoglutate,亦称α-KG)、2mM抗坏血酸(as corbateacid)、1.2mM ATP、1mM二硫苏糖醇(DTT)、100μM Fe(NH4)2(SO4)2。缓冲体系可以为HEPES(pH4.6~7.5)盐溶液。α-酮戊二酸盐和Fe(NH4)2(SO4)2盐为TET酶的辅酶。
在一实施例中,所述步骤H中有机硼烷可以为吡啶硼烷,还原体系组成如下:35μLD NA、600mM醋酸钠(pH=4.3)缓冲液和1M吡啶硼烷。
在一实施例中,所述步骤I中的PCR反应,需要特定的扩增酶,可以为热启动DNA 聚合酶。
在一实施例中,所述步骤J中,所述文库的上机检测可以是二代测序,依据步骤F中使用的接头和index,可采用相应的Illumina平台或者MGI、Gene+Seq平台进行。
在一实施例中,所述步骤J中的Taq酶PCR扩增反应体系包含Taq酶、甲基化标准品的引物、步骤I中的文库DNA、Taq酶反应缓冲液。
在一实施例中,所述步骤J中,所述TaqI-v2酶切反应体系包含甲基化标准品的PCR产物、TaqI-V2酶、TaqI-V2酶缓冲液。
在一实施例中,所述步骤J中,所述凝胶电泳按照常规的dsDNA电泳条件进行。
在一实施例中,所述步骤E、F、G、H、I完成后,还包括纯化步骤。步骤E、F、G、 I之后的纯化具体可采用磁珠纯化,磁珠包括但不限于Axygen磁珠。步骤H完成后的纯化可采用柱纯化。
在一实施例中,在cfDNA的非重亚硫酸氢盐测序中,本发明提供的标准品无需打断,直接添加140~160bp甲基化DNA和140~160bp非甲基化DNA,有效解决了常规甲基化标准品打断回收率低,打断片段无法质控的问题。
在一实施例中,140~160bp甲基化DNA添加到cfDNA中,5mC到T的转化率达到9 8%以上;而甲基化pUC19单独打断后添加到cfDNA中,转化率只有65%。140~160bp甲基化DNA能使转化率显著提升。
实施例1
本实施例中,如无特别说明,使用的磁珠均为Axygen纯化磁珠,货号:MAG-PCR-CL-250。
本实施例中,如无特别说明,使用的TET酶购自NEB公司。
本实施例中,如无特别说明,使用的TE Buffer(亦称TE缓冲液)购自Invitrogen,货号12090015。组成如下:10mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA。
一、140~160bp甲基化DNA标准品制备。
1、设计10条长度为140~160bp DNA序列(sequence1、sequence2、sequence3、sequence4、sequence5、sequence6、sequence7、sequence8、sequence9、sequence10),每条序列包含7~13个CpG位点。设计扩增上述10条序列的引物对(sequence1-F/R、sequence2-F/R、sequence3-F/R、sequence4-F/R、sequence5-F/R、sequence6-F/R、sequence7-F/R、sequence8- F/R、sequence9-F/R、sequence10-F/R)。
sequence1:
ATATCTGATGATGCAAATTCCCTACCGGATCATTGACTTATGACATAGGCGGGAATT TTGCATCGCATCTGTTCAAGGGACGAGCATATGTACACTGCTGCATGCCCAACCTGGA CGTTCGAGACATCATGCGGCACGAAGGCCAGAAAGACAGTATTGAAC(SEQ ID NO. 1)。
sequence2:
GTGATGTACAATGCACTTTCAGAGTTATCCGGTGTTAAGGGAGTCTGACAAATTCGATGTTGATGTTTTTTCCCAGATGTGCCAATCTTTGGAAGTTGACCCAATGACGGCAGCGAAGGTTATAGTCGCGGTCATGAGCAATGAGAGCGGTCTGACTCTCACATTTGAAC(S EQ ID NO.2)。
sequence3:
TAGCTGGTCTTGCTGGAGATCATCCGGTCGATCGTCCGTACGAACGAACGAGCGA ACGAACGAACGTTCGTTAGAGTTTCATATGGCAAGGCAGATTGTTAATTGTAAGCAGA TGAGCTTGTGTACAGGGTCGGATTAAAGTTCAGCAAATGAAAAAC(SEQ ID NO.3)。
sequence4:
GAGTAGCTGTCAGCTCTGAGTCTGTTGTTATGTAACTCAGAACTCATTCCGAACGA TGCGCTTCGAACGGACCGCAGCGCAACGAAACGTCACGTTACGACTGCAGGTTGTTC TTGTCCCGGAGAGTTCGGCTGTGGGAAAACCAAAG(SEQ ID NO.4)。
Sequence5:
GACCCTGAGGAACTCATCAAGGAAGTCGAGGAAGTCCGGACAGCAAAAGAAAT TGACCGCGCGTAACTAAGGCCAGAACGCGCGCGCAGAAGGGGTTCAAACGCGCGTC ACAACCTTCATAGAGGCAAGGCACGTAAAGCACACAAAGCTAAGC(SEQ ID NO.5)。
Sequence6:
TTGCATCTGGTATCAAAGAAAGAGCGGGGACCGGTCACGACGTTCATTGGAAAC ACTGTGATCATTGCTGCATGTTTGGCCTCGATGCTTCCGATGGAGAAAATAATCAAAGG AGCCTTTTGCGGTGACGATAGTCTGCTGTACTTTCCAAAGG(SEQ ID NO.6)。
Sequence7:
TTATATGCCCAATGGCACACTATACGCTGCAAATCCGGCGAATAGTGAGAACTTGG CGAGAGAACAACCTCGAACGCCGCAAGGACAAGAGAGGGCGGCGTGGCATAGACGA AAGGAAAAGGTTAAAGCCAAGAAACTCGCC GCACTTGAACAGGCACTAGCCAACA(S EQ ID NO.7)。
sequence8:
ACTGGAAGAGGCACTAAATGAACACGATTAACATCCGGCTAAGAACGACTTCTCT GACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTT AGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGT(SEQ ID NO.8)。
sequence9:
TGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCCGGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCT CTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCA T(SEQ ID NO.9)。
sequence10:
GTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCCGGGGTGT CGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATC ATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGC(SEQ ID NO.10)。
下划线标记的碱基为CpG位点。
引物序列如下:
表1
2、合成上述10条标准品序列,并且克隆到pUC57质粒中,获得质粒干粉。合成扩增10条序列的引物对。合成工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
3、质粒和引物干粉用TE缓冲液溶解后,置于-20℃环境中保存。
4、140~160bp DNA扩增。
配制如下扩增反应体系:
表2
组分 | 单反应体积(μL) |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 25 |
F-引物 | 1 |
R-引物 | 1 |
模板 | 1 |
NF水 | 22 |
总体积 | 50 |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix购自Roche,货号:07958927001。体系中F-引物、R-引物的浓度各自为15μM,模板浓度为1ng/μl。
NF水是指无核酸酶水(Nuclease-Free Water,生产商:Promega,货号P1197)。
每种质粒和对应引物为一个扩增反应体系,总共10个扩增反应体系。
PCR上机程序见下表:
表3
5、使用预制琼脂糖凝胶电泳系统(Thermo Fisher,型号E-Gel)回收140~160bpDN A。分别取22.5μL扩增产物,加入2.5μL 10×DNA Loading Buffer,使用E-gel回收140~1 60bp目标片段,并使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(货号:Q32854),用Qubit 4Fluorometer(货号:Q33238)进行定量检测,检测得到产物浓度约50ng/μL。
6、取等质量的sequence1、sequence2、sequence3、sequence4、sequence5混合,标记为 sequence-(1/2/3/4/5)。随后取1μg DNA,进行如下甲基化实验。
7、甲基化反应
配制如下甲基化反应体系:
表4
组分 | 体积或质量 |
NEBufferTM2(10x) | 5μL |
Diluted SAM | 5μL |
M.SssI | 2μL |
H<sub>2</sub>O | 补足至50μL |
sequence-(1/2/3/4/5)DNA | 1μg |
总体积 | 50μL |
NEBufferTM 2为M.SssI自带的缓冲液。
Diluted SAM购自NEB公司,货号:B9003S。
M.SssI购自NEB公司,货号:M0226S。
反应条件:37℃反应1h。产物即为甲基化sequence-(1/2/3/4/5)DNA,标记为“140~16 0bp甲基化DNA”。-20℃保存。
8、HpaII酶切鉴定
表5
HpaII购自NEB公司,货号:R0171L。自带CutSmart缓冲液。
9、电泳检测HapII酶切产物
取适当体积反应液进行琼脂糖凝胶电泳,检测结果如图4所示,甲基化sequence(1/2/ 3/4/5)不能被HpaII切割,在150bp左右只有1条带;非甲基化sequence(1/2/3/4/5)能被 HpaII切割,在150bp左右存在2条带。
10、140~160bp非甲基化DNA标准品制备
取等量sequence6、sequence7、sequence8、Sequence9、sequence10 DNA混匀,混合D NA样品标记为“140~160bp非甲基化DNA,”按照使用量分装,-20℃保存。
二、cfDNA非重亚硫酸盐测序。
1、取5例人源cfDNA样本,每例样本50ng,每例样本分别添加0.5%(甲基化DNA 标准品的质量为样本质量的0.5%)140~160bp甲基化DNA标准品以及0.5%(非甲基化D NA标准品的质量为样本质量的0.5%)的140~160bp非甲基化DNA标准品。
同样取5例cfDNA样品各50ng,每例样本分别添加0.5%打断后甲基化pUC19和0.5%打断后的非甲基化lambda DNA(Unmethylated Lambda DNA,Promega,D1521),获得混合有标准品的cfDNA。
分别取5例人源细胞gDNA,每例样品质量为100ng,添加质量为gDNA质量的0.5%的甲基化pUC19和质量为gDNA质量的0.5%的lambda DNA,使用covris打断仪打断,打断后产物主峰在300bp左右。取50ng打断后的混合DNA,甲基化检测步骤同cfDNA。
甲基化pUC19购自Zymo research,货号D5017。
甲基化pUC19、非甲基化lambda DNA、gDNA与puc19及lambda DNA混合样品的打断是使用Covaris LE220-Plus打断仪,打断条件为20%功率,40s间隔打断4次。
2、末端修复和加“A”
2.1按下表配制末端修复和加“A”反应体系。
表6
末端修复&加A-缓冲液、末端修复&加A-酶混合物均为购自NEB的NEBNext末端修复/加dA尾模块中的试剂,货号E7442L。
修复反应条件如下:
表7
步骤 | 温度 | 时间 |
末端修复 | 20℃ | 30min |
加A | 65℃ | 30min |
HOLD | 4℃ | ∞ |
注:热盖温度为85℃。
2.2连接反应
按下表配制连接反应体系。
表8
组分 | 体积 |
末端修复&加A产物 | 60μL |
接头储液(15μM) | 3μL |
PCR级水 | 16μL |
连接增强液 | 1μL |
DNA连接酶预混液 | 30μL |
总体积 | 110μL |
连接增强液、DNA连接酶预混液均为购自NEB的NEBNext末端修复/加dA尾模块中自带的组分。
接头(带Index)购自华大智造,MGIEasy DNA Adapters-96(Plate)kit,货号:100000 5282。
孵育条件:20℃,时间30min。
2.3连接后纯化
配制如下纯化反应体系:
表9
组分 | 体积 |
接头连接产物 | 110μL |
磁珠 | 88μL |
总体积 | 198μL |
纯化步骤如下:
2.31震荡混匀,离心。
2.32室温孵育5~10min,使DNA与磁珠结合。
2.33将EP管置于磁力架2min,溶液澄清。
2.34吸去上清。
2.35加入200μL 80%V/V乙醇。
2.36静置30s。
2.37吸掉乙醇。
2.38室温下或37℃挥干乙醇,磁珠没有明显的发亮或干裂。
2.39加入22μL无酶水洗脱DNA。
3、TET酶氧化反应
3.1冰上配置如下TET酶氧化反应体系:
表10
反应混合物 | 体积 | 终浓度 |
接头连接的DNA | 20μL | - |
TET氧化缓冲液(pH为6) | 15μL | 1X |
1.5mM Fe(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub> | 3.33μL | 100μM |
TET酶 | 4μL | - |
无酶水 | 补足至50μL | - |
总体积 | 50μL | - |
3.2反应条件:37℃,80min。
3.3加入1μL蛋白酶K(0.8U,购自NEB,产品名称:Proteinase K,货号:P8107S) 到氧化反应体系中,50℃孵育1h。
3.4产物加入1.8X磁珠。
3.5震荡混匀,离心。
3.6室温孵育5~10min,使DNA与磁珠结合。
3.7将EP管置于磁力架2min,溶液澄清。
3.8吸去上清。
3.9加入200μL的80%V/V乙醇。
3.10静置30s。
3.11吸掉乙醇。
3.12室温下挥发乙醇,磁珠没有明显的发亮或干裂。
3.13使用37μL无酶水洗脱。
4、吡啶硼烷还原反应
4.1配置如下还原反应体系
表11
反应混合物 | 体积 |
3M醋酸钠(pH=4.3) | 10μL |
10M吡啶硼烷 | 5μL |
DNA | 35μL |
吡啶硼烷购自Alfa Aesar,产品名称:Pyridine borane,货号:L13178.09。
4.2反应条件:37℃,1200rpm孵育16h。
4.3采用离心柱(本实施例具体为Zymo-IC spin column)纯化DNA。洗脱体积25μL。
5、文库扩增
5.1配制如下PCR扩增反应体系:
表12
组分 | 体积 |
KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(2×) | 25μL |
MGI的引物 | 2.5μL |
吡啶硼烷处理的DNA | 22.5μL |
总体积 | 50μL |
所用的引物依据所用平台和使用的接头而确定。推荐体系中的引物最终浓度为0.5~2μ M,本实施例中具体为0.75μM。
5.2反应条件如下:
表13
5.3获得上述PCR反应的产物后,用0.9X Axygen磁珠纯化,纯化反应体系如下表所示。
表14
组分 | 体积 |
上步扩增产物 | 50μL |
Axygen磁珠 | 45μL |
总体积 | 95μL |
纯化步骤如下:
5.31震荡混匀,离心。
5.32室温孵育5-10min,使DNA与磁珠结合。
5.33将EP管置于磁力架2min,溶液澄清。
5.34吸去上清。
5.35加入200μL 80%乙醇。
5.36静置30s。
5.37吸掉乙醇。
5.38室温下或37℃挥干乙醇,磁珠没有明显的发亮或干裂。
5.39加入25μL TE缓冲液洗脱文库DNA。并使用life Qubit HS检测浓度。使用全自动核酸分析系统(台湾光鼎,型号:QSEP 100)检测文库片段分布。
6、转化率验证
6.1 140-160bp甲基化DNA Taq酶扩增反应
取0.5μL步骤5得到的纯化后PCR产物(含有140~160bp甲基化DNA标准品的样品),进行PCR扩增。用TE缓冲液配制如下对照组:1ng/μL 140~160bp DNA非甲基化DNA(sequence1/2/3/4/5,即5种非甲基化DNA的混合物),取0.5μL作为对照组。
表15
PCR扩增条件如下:
表16
6.2甲基化pUC19 DNA Taq酶扩增反应
取0.5μL步骤5得到的纯化后PCR产物(含有甲基化pUC19 DNA标准品的样品),进行PCR扩增。配制如下对照组:1ng/μL非甲基化pUC19 DNA,取0.5μL作为对照组。
表17
试剂 | 体积 | 终浓度 |
PCR产物DNA模板 | 0.5μL | |
10X Taq缓冲液 | 2.5μL | 1X |
dNTP[10mM each] | 0.5μL | 0.2mM |
pUC19-F[10μM] | 0.5μL | 0.2μM |
pUC19_R[10μM] | 0.5μL | 0.2μM |
Taq DNA 聚合酶 | 0.125μL | 0.625U |
无酶水 | 20.375 | |
总体积 | 25μL |
PCR扩增条件如下:
表18
6.3取15μLPCR扩增产物,进行TaqI-V2酶切反应,配置如下反应体系:
表19
试剂 | 体积 | 终浓度 |
161bp PCR产物 | 15μL | - |
10X CutSmart缓冲液 | 2.5μL | 1X |
TaqI-V2 | 0.5μL | 10U |
无酶水 | 7μL | NA |
总体积 | 25μL | - |
TaqI-V2购自NEB,货号R0149L。
反应条件:65℃孵育0.5~1h(本实施例具体为1h)。
6.4取步骤6.3的10μL酶切产物和步骤6.2的PCR产物,加入6X荧光黄、3%琼脂糖凝胶进行电泳。图3(A)的电泳结果显示,140~160bp甲基化DNA转化成功文库扩增产物,酶切后仅能看到一条带(162bp),未发生转化的阴性对照,可见清晰的两条带(43bp和119bp),未经酶切的PCR产物仅可见一条带。理论上,甲基化pUC19如果转化成功,文库扩增产物酶切后仅能看到一条带(216bp),未发生转化的阴性对照,可见清晰的两条带(39bp和176 bp),未经酶切的PCR产物仅可见一条带。
使用Image J软件计算最终5mC到T的转化效率。
140~160bp转化率计算方法如下:162bp峰面积/(162bp峰面积+119bp峰面积)。
pUC19转化率计算方法如下:216bp峰面积/(216bp峰面积+176bp峰面积)。
如图1(A)所示,cfDNA与打断后甲基化pUC19标准品混合样本中,甲基化pUC19转化后的扩增产物,酶切后可见216bp、176bp和39bp三条带,说明转化不完全;如图1(B) 所示,经过Image J计算,平均转化率为73.85%。而如图3(A)所示,cfDNA与140~160b p甲基化DNA标准品混合样本中,140~160bp甲基化DNA转化后的扩增产物,酶切后仅可见162bp条带,说明转化完全;如图3(B)所示,经过Image J计算,平均转化率高达99. 01%。
7、测序和生信分析鉴定转化率
每个样品使用MGI T7平台PE150模式测序90G,参照公开号为CN111755072A的中国专利《一种同时检测甲基化水平、基因组变异和插入片段的方法及装置》(具体参照该专利说明书第56~61段,即步骤S2、S3、S4)的方法计算140~160bp甲基化DNA转化率或甲基化pUC19转化率。
如图1(B)所示,经过NGS测序分析,cfDNA与打断后甲基化pUC19标准品混合样本中,甲基化pUC19的平均转化率仅为65.58%。分析mapped reads位点CpG转化率,结果如图2B所示,发现pUC19单独打断,转化率沿reads 5’到3’方向逐渐降低,而细胞gDNA与 pUC19混合后打断,转化率沿reads方向比较平稳,转化率约为95%(见图2A)。所以商业化的pUC19不能被单独打断,因此也不能作为cfDNA的阳性标准品。
如图3(B)所示,经过NGS测序分析,cfDNA与140~160bp甲基化DNA标准品混合样本中,140~160bp甲基化DNA的平均转化率高达98.02%,可以很好地作为cfDNA的阳性标准品。
在一实施例中,本发明首次制备了无需打断的标准品,解决了商业化甲基化pUC19标准品打断后回收率低,打断后无法质控的问题。
在一实施例中,140~160bp甲基化DNA添加到cfDNA中,5mC到T的转化率达到98%以上,而现有的标准品(例如甲基化pUC19)单独打断后添加到cfDNA中,转化率只有65%。因此,本发明提供的140~160bp甲基化DNA能使转化率显著提升。
在一实施例中,商业化甲基化pUC19单独打断后,存在无法完全转化,无法作为流程质控品的问题。而本发明的标准品转化率高,符合预期,可作为cfDNA样本的质控品。
在一实施例中,与商业化标准品相比,本发明的标准品成本低廉,使用方便,更加适合实际检测流程使用。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述,只是用于帮助理解本发明,并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员,依据本发明的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳吉因加医学检验实验室
<120> 一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途
<130> 21I32165
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atatctgatg atgcaaattc cctaccggat cattgactta tgacataggc gggaattttg 60
catcgcatct gttcaaggga cgagcatatg tacactgctg catgcccaac ctggacgttc 120
gagacatcat gcggcacgaa ggccagaaag acagtattga ac 162
<210> 2
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tagctggtct tgctggagat catccggtcg atcgtccgta cgaacgaacg agcgaacgaa 60
cgaacgttcg ttagagtttc atatggcaag gcagattgtt aattgtaagc agatgagctt 120
gtgtacaggg tcggattaaa gttcagcaaa tgaaaaac 158
<210> 3
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tagctggtct tgctggagat catccggtcg atcgtccgta cgaacgaacg agcgaacgaa 60
cgaacgttcg ttagagtttc atatggcaag gcagattgtt aattgtaagc agatgagctt 120
gtgtacaggg tcggattaaa gttcagcaaa tgaaaaac 158
<210> 4
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagtagctgt cagctctgag tctgttgtta tgtaactcag aactcattcc gaacgatgcg 60
cttcgaacgg accgcagcgc aacgaaacgt cacgttacga ctgcaggttg ttcttgtccc 120
ggagagttcg gctgtgggaa aaccaaag 148
<210> 5
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaccctgagg aactcatcaa ggaagtcgag gaagtccgga cagcaaaaga aattgaccgc 60
gcgtaactaa ggccagaacg cgcgcgcaga aggggttcaa acgcgcgtca caaccttcat 120
agaggcaagg cacgtaaagc acacaaagct aagc 154
<210> 6
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttgcatctgg tatcaaagaa agagcgggga ccggtcacga cgttcattgg aaacactgtg 60
atcattgctg catgtttggc ctcgatgctt ccgatggaga aaataatcaa aggagccttt 120
tgcggtgacg atagtctgct gtactttcca aagg 154
<210> 7
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttatatgccc aatggcacac tatacgctgc aaatccggcg aatagtgaga acttggcgag 60
agaacaacct cgaacgccgc aaggacaaga gagggcggcg tggcatagac gaaaggaaaa 120
ggttaaagcc aagaaactcg ccgcacttga acaggcacta gccaaca 167
<210> 8
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
actggaagag gcactaaatg aacacgatta acatccggct aagaacgact tctctgacat 60
cgaactggct gctatcccgt tcaacactct ggctgaccat tacggtgagc gtttagctcg 120
cgaacagttg gcccttgagc atgagt 146
<210> 9
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgaccttgaa gctaagcact tcaagaaaaa cgttgaggaa caactcaaca agccggcgta 60
gggcacgtct acaagaaagc atttatgcaa gttgtcgagg ctgacatgct ctctaagggt 120
ctactcggtg gcgaggcgtg gtcttcgtgg cataaggaag actctattca t 171
<210> 10
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtaaggaagg ttactactgg ctgaaaatcc acggtgcaaa ctgtgccggg gtgtcgataa 60
ggttccgttc cctgagcgca tcaagttcat tgaggaaaac cacgagaaca tcatggcttg 120
cgctaagtct ccactggaga acacttggtg ggctgagc 158
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atatctgatg atgcaaattc ccta 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gttcaatact gtctttctgg cctt 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtgatgtaca atgcactttc agagt 25
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gttcaaatgt gagagtcaga ccg 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tagctggtct tgctggagat c 21
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gtttttcatt tgctgaactt taatc 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gagtagctgt cagctctgag tctg 24
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctttggtttt cccacagcc 19
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaccctgagg aactcatcaa gg 22
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcttagcttt gtgtgcttta cgt 23
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ttgcatctgg tatcaaagaa agag 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cctttggaaa gtacagcaga ctat 24
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ttatatgccc aatggcacac t 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tgttggctag tgcctgttca 20
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
actggaagag gcactaaatg aac 23
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
actcatgctc aagggccaa 19
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgaccttgaa gctaagcact tca 23
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
atgaatagag tcttccttat gcca 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gtaaggaagg ttactactgg ctga 24
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gctcagccca ccaagtgtt 19
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
agatgctgaa gatcagttgg g 21
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gagtactcaa ccaagtcatt ctga 24
Claims (1)
1.一种多核苷酸在免亚硫酸氢盐甲基化检测中的用途,其特征在于,所述多核苷酸含有的碱基对长度为140~160bp,所述多核苷酸的其中一条单链含有7-13个CpG位点,所述多核苷酸含有1个TaqI酶切位点和1个HpaII酶切位点,所述多核苷酸为非人源的多核苷酸,所述多核苷酸为双链DNA,所述多核苷酸作为免亚硫酸氢盐甲基化检测中的阳性标准品或阴性标准品,所述多核苷酸作为阳性标准品时不含有未甲基化的CpG位点,所述多核苷酸作为阴性标准品时不含有甲基化的CpG位点,所述免亚硫酸氢盐甲基化检测的样本为cfDNA样本。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111145944.4A CN113817723B (zh) | 2021-09-28 | 2021-09-28 | 一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111145944.4A CN113817723B (zh) | 2021-09-28 | 2021-09-28 | 一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113817723A CN113817723A (zh) | 2021-12-21 |
CN113817723B true CN113817723B (zh) | 2022-08-12 |
Family
ID=78915799
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111145944.4A Active CN113817723B (zh) | 2021-09-28 | 2021-09-28 | 一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113817723B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115896027A (zh) * | 2022-04-07 | 2023-04-04 | 广州燃石医学检验所有限公司 | 一种生物组合物、其制备方法及应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2525024A (en) * | 2014-04-10 | 2015-10-14 | Vela Operations Pte Ltd | Universal controls for sequencing assays |
CN111575347A (zh) * | 2020-05-19 | 2020-08-25 | 清华大学 | 构建用于同时获得血浆中游离dna甲基化和片段化模式信息的文库的方法 |
CN111755072B (zh) * | 2020-08-04 | 2021-02-02 | 深圳吉因加医学检验实验室 | 一种同时检测甲基化水平、基因组变异和插入片段的方法及装置 |
-
2021
- 2021-09-28 CN CN202111145944.4A patent/CN113817723B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113817723A (zh) | 2021-12-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2470675B1 (en) | Detection and quantification of hydroxymethylated nucleotides in a polynucleotide preparation | |
US20120003657A1 (en) | Targeted sequencing library preparation by genomic dna circularization | |
JP4727670B2 (ja) | 核酸の改変された前処理によって達成されるメチル化解析を標的とするdna増幅系におけるキャリーオーバー保護のための方法 | |
CN110734908A (zh) | 高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒 | |
CN115181783A (zh) | 胞嘧啶修饰的免亚硫酸氢盐的碱基分辨率鉴定 | |
US20100256003A1 (en) | High-throughput methods for detecting dna methylation | |
CN110656156A (zh) | 一种超低频突变核酸片段检测方法、文库构建方法、引物设计方法和试剂 | |
US20090269771A1 (en) | Method of sequencing and mapping target nucleic acids | |
US20130244885A1 (en) | High-throughput sequencing method for methylated dna and use thereof | |
JP2010535513A (ja) | 高スループット亜硫酸水素dnaシークエンシングのための方法および組成物ならびに有用性 | |
US20070292866A1 (en) | Diagnosing human diseases by detecting DNA methylation changes | |
CN110699426A (zh) | 基因目标区域富集方法及试剂盒 | |
WO2014165549A1 (en) | Determination of methylation state and chromatin structure of target genetic loci | |
CN114438184B (zh) | 游离dna甲基化测序文库构建方法及应用 | |
KR101557975B1 (ko) | 염기 특이 반응성 프라이머를 이용한 핵산 증폭방법 | |
CN110938674B (zh) | 甲基化测序dna文库的构建方法及其应用 | |
CN110699425B (zh) | 基因目标区域的富集方法及体系 | |
CN114555830A (zh) | 靶核酸的检测方法、核酸结合分子的检测方法、及核酸结合能力的评价方法 | |
CN113943763B (zh) | 一种还原核酸的方法及其检测方法 | |
CN113817723B (zh) | 一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途 | |
CN116043337A (zh) | Dna甲基化标志物筛查试剂盒及方法 | |
US20150099670A1 (en) | Method of preparing post-bisulfite conversion DNA library | |
CN113462748A (zh) | Dna测序文库的制备方法及试剂盒 | |
CN110452958B (zh) | 一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用 | |
CN113862333B (zh) | 一种组合物及其氧化5-甲基胞嘧啶的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |