CN115896027A - 一种生物组合物、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种生物组合物、其制备方法及应用。所述生物组合物包括至少一种作为阳性标准品的阳性细胞系，至少一种作为阴性标准品的阴性细胞系，至少一种作为阳性参考品的阳性基因组载体，以及至少一种作为阴性参考品的阴性基因组载体。该生物组合物可以作为一种可以实现不同梯度阳性信号的标准品，可以对甲基化检测方法的准确性进行评估。

Description

一种生物组合物、其制备方法及应用
技术领域
本申请涉及生物医学领域，具体的涉及一种生物组合物及其制备方法，还包括该生物组合物用于甲基化检测的标准品的应用。
背景技术
循环DNA(cfDNA，cell free DNA)是一种存在于血液中的单链或双链形式的DNA分子，其片段长度大约144-166bp。DNA甲基化作为一种常见的表观遗传学修饰方式，在基因表达调控中发挥着重要作用，并与肿瘤的发生发展有着密切的联系，DNA甲基化具有位点广泛，灵敏度高，可进行组织溯源等优势，结合液体活检技术创伤小，取样方便等特点，血液ctDNA甲基化检测已成为当下最具潜力的早筛技术路径。
DNA甲基化(methylation)是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶(DNAmethyl-transferase，DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)作为甲基供体，将DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)(常见于基因的5'-CG-3'序列)和少量的N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。
DNA甲基化在基因表达调控中起着重要的作用。异常的DNA甲基化标记在多种疾病发生发展中过程中都被报道过，包括癌症。DNA甲基化测序作为一种高分辨率，高通量的技术，其作用在癌症早期筛查，诊断，以及监控的作用越来越被认识。
全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS，Whole Genome Bisulfite Sequencing)是甲基化测序的金标准，但是因为处理过程中对DNA的严重破坏和过高的测序成本，成为临床应用的困难。更重要的是，人类基因组的大部分区域在癌症发生发展过程中并不活跃，癌症相关的变异往往集中在某些特定区域，如CpG岛(CpG island)。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2-7％。
CpG岛在基因组中大量存在，通过大规模平行核酸测序(也称为“高通量测序”或者“下一代测序”(NGS))可以极大地辅助这些检测和分析，使得通过甲基化信号预测癌症的发生以及发生的部位成为可能。
目前，用于检测甲基化信号的技术包括:焦磷酸测序技术(pyrosequencing)，甲基化特异PCR(MSP)，高通量测序(NGS)的方法等。基于ctDNA甲基化信号检测的技术日渐成熟。对于上述方法的试剂开发及性能验证、检测过程质量控制以及不同检测方法和平台结果一致性的比较，需要大量稳定的参考品作为标准。因此，甲基化标准品的建立显得尤为重要。
目前商业化的甲基化阴性标准品主要有以下几种形式：1)未甲基化的LambdaDNA样本(从感染的大肠杆菌GM119菌株中分离得到的，该菌株缺乏dam及dcm甲基化酶活性)，优点是基因组较小，CpG位点信号接近于0，缺点是非来自于人基因组；2)人工敲除甲基化转移酶的细胞系DNA，此种CpG位点的甲基化信号去除不干净，仍存在较高的CpG信号背景，且价格昂贵；3)通过全基因组扩增将任何样本CpG位点的甲基化信号变为0。
目前商业化的甲基化阳性标准品主要是采用1)癌症细胞系，癌症细胞系中可以找到甲基化位点接近于100％的阳性位点；2)MsssI(甲基化酶)处理puc19/DNA或者人的基因组DNA来获得，后一种方法处理获得的DNA每个CpG位点的甲基化水平高达97％，但是无法实现组织溯源的信息。
当前大部分的参考标准品，通常采用超声打断获得酶切为片段化的DNA，超声打断会对DNA造成损伤，产生的DNA片段的长度分布与真实cfDNA(细胞游离DNA；cell freeDNA)/ctDNA存在较大差异。因此，需要一种稳定的与真实cfDNA片段较为接近的甲基化质控标准品制备方法。
发明内容
本申请提供了一种用于甲基化检测标准品及其制备方法，所述方法通过AtlantisdsDNase(一种限制性内切酶)或者Micrococcal Nuclease(微球菌核酸酶)片段化酶酶切细胞系提供了一种类似于血液峰形的细胞系标准品，实现甲基化血液检测标准品的需求，通过梯度掺比癌症来源的细胞系DNA和健康细胞系DNA，可以获得不同梯度肿瘤信号的标准品，同时可以实现组织溯源。除外，在标准品中添加一定比例的全甲基化的pUC19及未甲基化的Lambda基因组组合或者非甲基化的pUC19及全甲基化的Lambda基因组组合，可以进行检测准确性的评估。
本申请一方面提供了一种生物组合物，包括：至少一种作为阳性标准品的阳性细胞系，至少一种作为阴性标准品的阴性细胞系，至少一种作为阳性参考品的阳性基因组载体，以及至少一种作为阴性参考品的阴性基因组载体。
作为一种优选的实施方式，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数；所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数。
作为一种优选的实施方式，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/100，优选地，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/1000，更优选地，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/10000；所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/100，优选地，所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/1000，更优选地，所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/10000；
作为一种优选的实施方式，所述阴性基因组载体的碱基数为阴性细胞系的碱基数的大约1/1000000～1/60000；或者所述阳性基因组载体的碱基数为阳性细胞系的碱基数的大约1/1000000～1/60000。例如，所述阴性细胞系与所述阴性基因组载体的质量比为1:2×10-3至1:1×106，优选为1:2×10-4至1:1×10-5；所述阳性细胞系与所述阳性基因组载体的质量比为1:2×10-3至1:1×10-6，优选为1:2×10-4至1:1×10-5。
作为一种优选的实施方式，所述阳性细胞系与阴性细胞系的质量比为0.1:99.9至25:75之间，优选为0.5:99.5至12.5:87.5之间，更优选为1:99至5:95之间或者:99.9:0.1至75:25之间，优选为99.5:0.5至87.5:12.5之间，更优选为99:1至95:5之间。
作为一种优选的实施方式，所述阳性基因组载体与阴性基因组载体的质量比为1:99至25:75之间或者99:1至95:5之间，优选为大约1:19或者19:1。
作为一种优选的实施方式，所述阳性细胞系和所述阴性细胞系都经过片段化处理，平均片段大小为约140-160bp。例如，所述片段化处理可以包含生物酶酶切片段化和/或物理打断片段化。例如，所述酶切可以是通过Atlantis dsDNase酶或者MicrococcalNuclease片段化基因组DNA。例如，例如，所述酶切可以是通过超声打断。例如，阳性细胞系和所述阴性细胞系所述酶切可以是通过Atlantis dsDNase酶或者Micrococcal Nuclease片段化基因组DNA。
作为一种优选的实施方式，所述阳性细胞系选自如下细胞系的组合：人结直肠癌细胞系(例如：SW48)，人肺腺癌细胞系(例如：H1975)，人肝癌细胞系(例如：HepG2)，人食管癌细胞系(例如：T.T)，人卵巢癌细胞系(例如：CaoV3)，人胰腺癌细胞系(例如：PANC-1，PSN-1)。
作为一种优选的实施方式，只包含一种阳性细胞系。
作为一种优选的实施方式，所述阴性细胞系选自如下细胞系的组合：人B淋巴细胞(例如：GM24385、GM12878、GM24631、NCI.BL1184)或者人正常细胞系(例如：Beads-2B及其他人正常细胞系)。
作为一种优选的实施方式，只包含一种阴性细胞系。
作为一种优选的实施方式，所述阳性基因组载体为经过甲基化转移酶处理的pUC19 DNA和/或经过甲基化转移酶处理的Lambda，所述甲基化转移酶优选为M.Sssl。
作为一种优选的实施方式，所述阴性基因组载体为未甲基化的Lambda和/或未甲基化的pUC19 DNA。
本申请另一方面提供了一种上述生物组合物的应用，所述生物组合物用于评估癌症基因检测的准确性和组织溯源的标准品。
作为一种优选的实施方式，所述生物组合物用于评估癌症基因甲基化检测的准确性和组织溯源的标准品。
作为一种优选的实施方式，所述癌症包括：脑癌、肺癌、皮肤癌、鼻咽癌、咽喉癌、肝癌、骨癌、淋巴瘤、胰腺癌、皮肤癌、肠癌、直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、口腔癌、胃癌、实体瘤、卵巢癌、食管癌、胆囊癌、胆道癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、头颈癌、肉瘤、胸腔恶性肿瘤(除肺外)、黑色素瘤、和睾丸癌、白血病。
本申请另一方面提供了一种制备生物组合物的方法，包括如下步骤：
(1)获得至少一种作为阳性标准品的阳性细胞系和至少一种作为阴性标准品的阴性细胞系；
(2)将所述阳性细胞系和阴性细胞系进行细胞核分离，随后通过酶切将所述阳性细胞系和阴性细胞系转化为阳性片段化DNA和阴性片段化DNA；
(3)将所述阳性片段化DNA和所述阴性片段化DNA混合；
(4)获得至少一种作为阳性参考品的阳性基因组载体和至少一种作为阴性参考品的阴性基因组载体，将所述阳性基因组载体和阴性基因组载体混合，并进行打断；
(5)将上述步骤(3)和步骤(4)的产物混合。
作为一种优选的实施方式，所述酶切是通过AtlantisdsDNase酶或者MicrococcalNuclease片段化基因组DNA。
作为一种优选的实施方式，还包括：在步骤(2)的酶切之后，进行片段筛选去除gDNA大片段。
作为一种优选的实施方式，所述阳性细胞系选自如下细胞系的组合：人结肠癌细胞(例如：SW48)，人肺腺癌细胞(例如：H1975)，人肝癌细胞(例如：HepG2)，人食管癌细胞(例如：T.T)，人卵巢癌细胞(例如：CaoV3)，人胰腺癌细胞(例如：PANC-1，PSN-1)。
作为一种优选的实施方式，只包含一种阳性细胞系。
作为一种优选的实施方式，所述阴性细胞系选自如下细胞系的组合：人B淋巴细胞(例如：GM24385、GM12878、GM24631、NCI.BL1184)。
作为一种优选的实施方式，只包含一种阴性细胞系。
作为一种优选的实施方式，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数；所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数。
作为一种优选的实施方式，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/100，优选地，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/1000，更优选地，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/10000；所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/100，优选地，所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/1000，更优选地，所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/10000。
作为一种优选的实施方式，所述阴性基因组载体的碱基数为阴性细胞系的碱基数的大约1/1000000～1/60000；或者所述阳性基因组载体的碱基数为阳性细胞系的碱基数的大约1/1000000～1/60000。
作为一种优选的实施方式，所述阳性细胞系与阴性细胞系的质量比为0.1:99.9至25:75之间，优选为0.5:99.5至12.5:87.5之间，更优选为1:99至5:95之间。
作为一种优选的实施方式，所述阳性基因组载体与阴性基因组载体的质量比为1:99至25:75之间或者99:1至95:5之间，优选为大约1:19或者19:1。
作为一种优选的实施方式，按照如下质量比例将步骤(3)和步骤(4)的产物混合：1:5×10-4至1:1.5×10-5，优选为1:2×10-4。例如按照如下质量比例将步骤(3)和步骤(4)的产物混合：约1:2×10-3、约1:1×10-3、约1:5×10-4、约1:1×10-4、约1:5×10-5、约1:2×10-5、约1:1.5×10-5、或约1:1×10-5。作为一种优选的实施方式，所述打断为超声打断。
本申请另一方面提供了一种试剂盒，包含如上所述的生物组合物。
本申请另一方面提供了一种验证基因测序方法准确性的方法，按照所述基因测序方法对如权利要求5所述的生物组合物进行测序，在生物组合物已验证掺比准确性情况下，比较某一区间测序的阳性水平与阳性细胞系/阴性细胞系的质量比的误差，若误差小于30％，则认为该基因测序方法准确。
作为一种优选的实施方式，所述误差的计算方法为：测序的阳性水平分数减去阳性细胞系/阴性细胞系的质量比的差值，再除以阳性细胞系/阴性细胞系的质量比。
作为一种优选的实施方式，若误差小于25％，则认为该基因测序方法准确。
本申请另一方面提供了一种验证基因测序方法准确性的方法，其中，按照该基因测序方法对上述的生物组合物进行测序，并比较阳性基因组载体测序的甲基化水平与阳性基因组载体理论的甲基化水平(97％)的误差，若误差小于5％，则认为该基因测序方法准确。
作为一种优选的实施方式，所述误差的计算方法为：阳性基因组载体测序的甲基化水平减去阳性基因组载体理论的甲基化水平的差值，再除以阳性基因组载体理论的甲基化水平。
作为一种优选的实施方式，若误差小于3％，则认为该基因测序方法准确。
本申请另一方面提供了一种验证基因测序方法准确性的方法，其中，按照该基因测序方法对上述的生物组合物进行测序，并比较阴性基因组载体测序的甲基化水平，若甲基化水平小于1％，则认为该基因测序方法准确。
作为一种优选的实施方式，若甲基化水平小于0.5％，则认为该基因测序方法准确；优选地，若甲基化水平小于0.1％，则认为该基因测序方法准确；更优选地，若甲基化水平小于0.02％，则认为该基因测序方法准确。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请用于甲基化检测的标准品的制备流程图。
图2显示的是本申请的以SW48为例，同时对经Atlantis dsDNase酶处理后的EZ-SW48和真实cfDNA样本使用WGBS方法进行建库测序，检测两种类型样本的文库片段分布情况。上半部是使用PE LabChip片段评估仪进行片段评估的峰形图，下半部是WGBS测序评估出的片段分布图。
图3显示的是针对本申请的三个不同的酶切批次(Lot 1、Lot 2、Lot 3)两两之间对比的重复性分析图，从左至右依次是：(1)Lot 1作为横轴，Lot 2作为纵轴；(2)Lot 1作为横轴，Lot 3作为纵轴；(3)Lot 2作为横轴，Lot 3作为纵轴的重复性比对结果。
图4显示的是本申请示例的6种不同癌症细胞系(H1975，SW48，HepG2，CaoV3，PANC-1，T.T)，4种健康人细胞系(GM24385，GM12878，GM24631，NCI.BL1184)和24例真实cfDNA样本WGBS分析的热力图，其中颜色越接近左上角颜色卡的右半部分(由浅色向深色过渡)代表检测到的甲基化水平越高。
图5显示的是本申请中，以SW48为例，与EZ-GM24385以不同质量比混合(100％SW48，20％ SW48，12.5％ SW48，和纯EZ-GM24385)进行测序的部分位点的甲基化水平结果图，其中深色柱状图表示甲基化阴性结果，浅色柱状图表示甲基化阳性结果。左侧各质量比下方的括号内显示的是根据本申请方法制备的甲基化标准品的实际测得的甲基化水平，以分数显示。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“二代基因测序(NGS)”、高通量测序”或“下一代测序”通常是指第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。下一代测序平台包括但不限于已有的Illumina等测序平台。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置用于本方法。例如，二代基因测序可以具有高灵敏度、通量大、测序深度高、或低成本的优势。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454pyro sequencing)、Illumina(Solexa)sequencing、离子半导体测序(Ion semi conductor sequencing)、DNA纳米球测序(DNA nano-ball sequencing)、Complete Genomics的DNA纳米阵列与组合探针锚定连接测序法等。所述二代基因测序可以使对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。例如，本申请的方法同样可以应用于一代基因测序、二代基因测序、三代基因测序或单分子测序(SMS)。
在本申请中，术语“待测样本”通常是指需要进行检测的样本。例如，可以检测待测样本上的一个或者多个基因区域是否存在有修饰状态。
在本申请中，术语“互补区域”通常是指与参考核苷酸序列相比具有互补的区域。例如，互补核酸可以为任选地具有相反方向的核酸分子。例如，所述互补可以是指具有下面的互补性关联：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；腺嘌呤和尿嘧啶。
在本申请中，术语“修饰状态”通常是指本申请中基因片段、核苷酸或其碱基具有的修饰状态。例如，本申请中的修饰状态可以是指胞嘧啶的修饰状态。例如，本申请的具有修饰状态的基因片段可以具有改变的基因表达活性。例如，本申请的修饰状态可以是指碱基具有的甲基化修饰。例如，本申请的修饰状态可以是指在基因组DNA的CpG区域的胞嘧啶5'碳位共价结合一个甲基基团，例如可以成为5-甲基胞嘧啶(5mC)。例如，修饰状态可以是指DNA序列内存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mCyt”)。
在本申请中，术语“甲基化”通常是指本申请中基因片段、核苷酸或其碱基具有的甲基化状态。例如，本申请中基因所在的DNA片段可以在一条链或多条链上具有甲基化。例如，本申请中基因所在的DNA片段可以在一个位点或多个位点上具有甲基化。
在本申请中，术语“转化”通常是指将一种或多种结构转变为另一种结构。例如，本申请的转化可以是具有特异性。例如，不具有甲基化修饰的胞嘧啶经过转化可以变为其它结构(例如尿嘧啶)，且具有甲基化修饰的胞嘧啶经过转化可以基本不发生变化。例如，不具有甲基化修饰的胞嘧啶经过转化可以被剪切，且具有甲基化修饰的胞嘧啶经过转化可以基本不发生变化。
在本申请中，术语“重亚硫酸盐”，或称为“亚硫酸氢盐”通常是指一种可以区分具有修饰状态和不具有修饰状态的DNA区域的试剂。例如，重亚硫酸盐可以包括重亚硫酸盐、或其类似物或上述的组合。例如，重亚硫酸盐可以使未修饰的胞嘧啶的氨基脱氨基化，以使其与修饰的胞嘧啶区分。在本申请中，术语“类似物”通常是指具有类似结构和/或功能的物质。例如重亚硫酸盐的类似物可以与重亚硫酸盐具有类似的结构。例如，重亚硫酸盐的类似物可以是指一种同样可以区分具有修饰状态和不具有修饰状态的DNA区域的试剂。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
本申请提供了一种用于甲基化检测标准品及其制备方法，所述方法通过AtlantisdsDNase或者Micrococcal Nuclease片段化酶酶切细胞系提供了一种类似于血液峰形的细胞系标准品，实现甲基化血液检测标准品的需求，通过梯度掺比癌症来源的细胞系DNA和健康细胞系DNA，可以获得不同梯度肿瘤信号的标准品，同时可以实现组织溯源。除外，在标准品中添加一定比例的全甲基化的pUC19及未甲基化的Lambda基因组组合或者未甲基化的pUC19及全甲基化的Lambda基因组组合，可以进行检测准确性的评估。
所述甲基化标准品包含：作为阴性标准品的健康细胞系、作为阳性标准品的癌症细胞系、阴性小基因组载体、阳性小基因组载体构成。其中，所述健康细胞系可以选自以下的一种或多种：人B淋巴细胞(例如：GM24385、GM12878、GM24631、NCI.BL1184)。其中，所述癌症细胞系可以选自以下的一种或多种：人结肠癌细胞系(例如：SW48)，人肺腺癌细胞系(例如：H1975)，人肝癌细胞系(例如：HepG2)，人食管癌细胞系(例如：T.T)，人卵巢癌细胞系(例如：CaoV3)，人胰腺癌细胞(例如：PANC-1，PSN-1)。所述阴性小基因组载体包括：未甲基化Lambda DNA(例如：从感染的大肠杆菌GM119菌株中分离得到的,该菌株缺乏dam及dcm甲基化酶活性)或者未甲基化的pUC19。所述阳性小基因组载体包括：通过M.SssI甲基化转移酶处理pUC19 DNA或者LambdaDNA(例如：pUC19是表达Amp抗性的常用克隆载体，由pBR322克隆载体修改而来)。
本申请的甲基化标准品，可用于验证各种甲基化检测流程的准确性评估，例如：随同待测样品一起将本申请的甲基化标准品作为参考标准品进行任一完整的甲基化检测流程，从而根据对该甲基化标准品的检测结果来评判真实样本检测结果的可靠性。其中所述甲基化检测可以适用于肿瘤基因的检测，更优选地可以适用于癌症的早期检测或早期筛查，所述癌症包括：脑癌、肺癌、皮肤癌、鼻咽癌、咽喉癌、肝癌、骨癌、淋巴瘤、胰腺癌、皮肤癌、肠癌、直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、口腔癌、胃癌、实体瘤、卵巢癌、食管癌、胆囊癌、胆道癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、头颈癌、肉瘤、胸腔恶性肿瘤(除肺外)、黑色素瘤、和睾丸癌、白血病。
本领域已有的甲基化标准品存在着诸多的问题，例如甲基化阴性标准品中，未甲基化的Lambda DNA的缺点是其不来自于人基因组，人工敲除甲基化转移酶的细胞系DNA的缺点是甲基化信号去除不干净，仍存在较高的CpG信号背景，且价格昂贵。又例如甲基化阳性标准品中，MsssI(甲基化酶)处理pUC19或者人的基因组DNA来获得的标准品的缺点是无法实现组织溯源的信息。本申请提供的一种在人源标准品中掺入少量外源的、甲基化水平稳定的参考品，该种组合物用于标准品的应用，可以在评估各类甲基化检测方法的过程中，实现优异的检测准确性评估、以及适合作组织溯源的标准品。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1
总体制备步骤参见附图1，所述标准品的制备方法的总体步骤可，包括：
1)健康细胞系和癌症细胞系培养。
2)收集细胞，进行细胞核分离，随后使用Atlantis dsDNase或者MicrococcalNuclease酶片段化基因组DNA，并进行片段筛选去除gDNA大片段。
3)将酶切后的癌症细胞系DNA与健康细胞系酶切DNA进行一定比例的混合，获得不同梯度(0％-100％)的阴性和阳性标准品，此处的健康细胞系包括但不限于永生化B淋巴细胞系(例如：GM24385，GM12878，GM24631，NCI.BL1184)，癌症细胞系包括但不限于永生化癌症细胞系(例如：SW48，H1975，HepG2，T.T，CaoV3，PANC-1，PSN-1)。这些细胞系产品仅作为例举，其他合适的癌症细胞系也可以采用。
例如人基因组，选自纯净的商业化细胞系，针对不同癌种有不同的示例性的细胞系可供选择：
表1：
Figure BDA0003975033630000101
Figure BDA0003975033630000111
4)通过M.SssI甲基化转移酶处理pUC19 DNA，根据全非甲基化Lambda和pUC19基因组大小按照质量比19:1的比例混合，并进行打断。
5)根据人基因组及Lambda基因组大小差异，按照1:2×10-3至1:2×10-5，优选为1:2×10-4质量比进行混合获得混合基因组标准品。
进一步地，分别对2×10-3、2×10-4和2×10-5进行过2组对照测试，实际结果中检出的pUC19甲基化信号并无显著差异，从而证明2×10-3至2×10-5这个范围内的掺比，都是可以适用的。(参见下表2结果)
表2：不同掺比比例的标准品检测结果
Figure BDA0003975033630000112
同理地，也可以采用全非甲基化pUC19，和通过M.SssI甲基化转移酶处理的Lambda基因组大小按照质量比1:19的比例混合，并进行打断。根据人基因组及Lambda基因组大小差异，按照1:2×10-3至1:2×10-5，优选为1:2×10-4质量比进行混合获得混合基因组标准品，也就是说，混合基因组标准品中，阳性细胞系与pUC19质量比为1:1×10-4至1:1×10-6，优选为1:1×10-5。可以达到相同的效果。
实施例2
核小体酶切片段评估
参见图2，以SW48为例，同时对EZ-SW48和真实cfDNA样本使用WGBS方法进行建库测序，检测两种类型样本的文库片段分布情况(见图2)，上图使用Perkin Elmer的LabChip片段评估仪进行片段评估，图2为WGBS测序评估出的片段大小，图中可以看出，本方法制备的酶切DNA产物(左侧)及其文库的片段大小分布与真实cfDNA(右侧)的非常一致。
实施例3
核小体酶切工艺甲基化信号稳定性检测
参见图3，使用申请人的ELSA-seqTM建库方法(参见中国发明专利申请公开文本CN110892097A)完成建库，并对酶切细胞系DNA进行甲基化信号检测，通过评估相关性等指标评估方法重复性。以下所示为3个批次(Lot 1，Lot 2，Lot 3)的EZ-GM24385细胞系及试剂酶切后片段进行甲基化信号检测结果。从结果可以看出，各批次两两之间信号相关性达到0.999以上，重复性好，制备工艺比较稳定。
实施例4
组织溯源信号分析
参见图4，对抽提的健康/癌症细胞系和健康人cfDNA进行WGBS检测，得到的数据进行生信聚类分析，检测结果的甲基化水平越高，颜色越接近左上角颜色卡的右半部分(由浅色向深色过渡)。根据该实验结果显示：健康人细胞系(GM24385，GM12878，NCI.BL1184，GM24631)和健康人cfDNA(Plasma.1-24)甲基化信号聚类结果好，可以使用健康细胞系作为健康人标准品，不同的癌症来源的细胞系(H1975，SW48，HepG2，Caov3，PANC-1，T.T)具有不同的甲基化图样，可以用于表明不同来源的癌症细胞系存在不同的甲基化信号，适合作组织溯源的标准品。图示中NFDNA-1，NFDNA-2，NFDNA-3依次表示来源于GM24385、GM12878、GM24631的核小体酶切DNA(例如，NFDNA-1具有约32％的EGFR等位基因突变，可以通过固定比例掺比用于评估VAF的检测准确性)。Plasma.1、Plasma.2……Plasma.24分别表示不同来源的健康人cfDNA。
实施例5
梯度标准品掺比准确性分析
以SW48为例，通过梯度混合核小体酶切的SW48和NFDNA-1(例如：可选GM24385)获得SW48质量比分别为100％，12.5％，5％，1％，0.5％，0.10％，0.05％，0％的甲基化标准品，分别使用ddPCR和申请人的HS-UMI(HS测序方法可参见申请人的中国发明专利授权公告文本CN106835291B，在此基础上结合UMI技术即HS-UMI方法)测序方法(深度测序>100，000x)检测每种甲基化标准品的EGFR:p.G719S的等位基因突变频率(VAF)，每种方法均进行两次重复，测出的VAF分别记为VAF1和VAF2，并求取两次重复的平均VAF。具体检测结果如下表所示，ddPCR和HS-UMI测得的VAF值与每种甲基化标准品的预期VAF接近，表明本方法制备的甲基化标准品梯度准确性好。
表3：ddPCR和HS-UMI检测VAF值与预期VAF值比较
Figure BDA0003975033630000131
注：预期VAF为不同甲基化标准品对应的EGFR:p.G719S位点的理论等位基因突变频率。NA表示未检出。
参见图5，以SW48为例，通过混合核小体酶切的SW48和NFDNA-1(例如：GM24385)获得质量比分别为100％，20％，12.5％，0％的甲基化标准品，使用申请人的ELSA-seqTM建库方法(参见中国发明专利申请公开文本CN110892097A)进行建库测序检测甲基化标准品的甲基化水平，部分位点测序结果如图5所示(位点为Chr1:2,222,156-2,222,797bp；柱状图中的浅色代表甲基化DNA，深色代表非甲基化DNA。)，随着不同甲基化标准品中SW48占比的降低，不同标准品的甲基化水平也逐渐降低，左侧括号中的数字表示实际测得的甲基化水平数值，可见实际测得的甲基化水平(95.9％、23.8％、10.1％、0.5％)与按质量配比的标准品的预设甲基化水平(100％，20％，12.5％，0％)基本一致，表明该标准品可用于基于cfDNA的甲基化检测方法的性能评估。
实施例6
Lambda和pUC19混合基因组的信号评估
样本1至样本4参照实施例1进行制备，以及使用申请人的ELSA-seqTM建库方法(参见中国发明专利申请公开文本CN110892097A)进行建库测序检测甲基化标准品的甲基化水平。参见下方表，CpG.methyl.hyper指pUC19 CpG位点的甲基化水平，CpG.methyl.hypo指Lambda CpG位点的甲基化水平，进行正常的甲基化检测时(样本3、样本4)，CpG.methyl.hyper信号>95％以上，当甲基化位点保护出现异常时(样本1、样本2)，pUC19的甲基化信号异常偏低；该异常可以通过人为选择不恰当的实验条件而产生，例如：重亚硫酸盐过程中反应温度超出标准温度，或者反应时长长于反应时间，或者Methyl-seq酶法转化过程中TET2用量不足或者反应时间不足从而导致的甲基化反应异常等。所以Lambda和pUC19基因组可以作为该检测流程的准确性的内部参考，监控甲基化转化过程的准确性。
上述结果显示，本申请提供的组合物用于标准品，可以在整个甲基化测序流程中，用于判断实验条件是否符合质量控制的要求。
表4：puc19和Lambda甲基化信号示例
样本 CpG.methyl.hyper CpG.methyl.hypo
样本1 0.9240 0.0001
样本2 0.9221 0.0001
样本3 0.9738 0.0001
样本4 0.9764 0.0001
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

Claims (32)

1.一种生物组合物，其特征在于，包括：至少一种作为阳性标准品的阳性细胞系，至少一种作为阴性标准品的阴性细胞系，至少一种作为阳性参考品的阳性基因组载体，以及至少一种作为阴性参考品的阴性基因组载体。
2.如权利要求1所述的生物组合物，其特征在于，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数；所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数。
3.如权利要求2所述的生物组合物，其特征在于，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/100，优选地，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/1000，更优选地，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/10000；所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/100，优选地，所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/1000，更优选地，所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/10000。
4.如权利要求3所述的生物组合物，其特征在于，所述阴性细胞系与所述阴性基因组载体的质量比为1:2×10-3至1:1×10-6，优选为1:2×10-4至1：1×10-5；所述阳性细胞系与所述阳性基因组载体的质量比为1:2×10-3至1:1×10-6，优选为1:2×10-4至1：1×10-5。
5.如权利要求1所述的生物组合物，其特征在于，所述阳性细胞系与阴性细胞系的质量比为0.1:99.9至25:75之间，优选为0.5:99.5至12.5:87.5之间，更优选为1:99至5:95之间。
6.如权利要求1所述的生物组合物，其特征在于，所述阳性基因组载体与阴性基因组载体的质量比为1:99至25:75之间或者99:1至75:25，优选为大约1:19或者19:1。
7.如权利要求1所述的生物组合物，其特征在于，所述阳性细胞系和所述阴性细胞系都经过片段化处理，平均片段大小为约140-160bp，优选地，所述片段化处理包含生物酶酶切片段化和/或物理打断片段化。
8.如权利要求1所述的生物组合物，其特征在于，所述阳性细胞系选自如下细胞系的组合：人结直肠癌细胞系(例如：SW48)，人肺腺癌细胞系(例如：H1975)，人肝癌细胞系(例如：HepG2或)，人食管癌细胞系(例如：T.T)，人卵巢癌细胞系(例如：
CaoV3)，人胰腺癌细胞系(例如：PANC-1，PSN-1)。
9.如权利要求1所述的生物组合物，其特征在于，所述阴性细胞系选自如下细胞系的组合：人B淋巴细胞(例如：GM24385、GM12878、GM24631、NCI.BL1184)或者人正常细胞系(例如：Beads-2B及其他人正常细胞系)。
10.如权利要求1所述的生物组合物，其特征在于，所述阳性基因组载体为经过甲基化转移酶处理的pUC19 DNA和/或经过甲基化转移酶处理的Lambda DNA，所述甲基化转移酶优选为M.Sssl。
11.如权利要求1所述的生物组合物，其特征在于，所述阴性基因组载体为未甲基化的Lambda DNA和/或未甲基化的pUC19 DNA。
12.一种如权利要求8-11中任意一项所述的生物组合物的应用，其特征在于，所述生物组合物用于评估癌症基因检测的准确性和组织溯源的标准品。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述癌症包括：脑癌、肺癌、皮肤癌、鼻咽癌、咽喉癌、肝癌、骨癌、淋巴瘤、胰腺癌、皮肤癌、肠癌、直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、口腔癌、胃癌、实体瘤、卵巢癌、食管癌、胆囊癌、胆道癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、头颈癌、肉瘤、胸腔恶性肿瘤(除肺外)、黑色素瘤、和睾丸癌、白血病。
14.一种制备生物组合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得至少一种作为阳性标准品的阳性细胞系和至少一种作为阴性标准品的阴性细胞系；
(2)将所述阳性细胞系和阴性细胞系进行细胞核分离，随后通过酶切将所述阳性细胞系和阴性细胞系转化为阳性片段化DNA和阴性片段化DNA；
(3)将所述阳性片段化DNA和所述阴性片段化DNA混合；
(4)获得至少一种作为阳性参考品的阳性基因组载体和至少一种作为阴性参考品的阴性基因组载体，将所述阳性基因组载体和阴性基因组载体混合，并进行打断；
(5)将上述步骤(3)和步骤(4)的产物混合。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述酶切是通过限制性内切酶或者微球菌核酸酶片段化基因组DNA。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述阳性细胞系选自如下细胞系的组合：人结肠癌细胞(例如：SW48)，人肺腺癌细胞(例如：H1975)，人肝癌细胞(例如：
HepG2)，人食管癌细胞(例如：T.T)，人卵巢癌细胞(例如：CaoV3)，人胰腺癌细胞(例如：PANC-1，PSN-1)。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述阴性细胞系选自如下细胞系的组合：人B淋巴细胞(例如：GM24385、GM12878、GM24631、NCI.BL1184)，或者人正常细胞系(例如：Beads-2B及其他人正常细胞系)。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数；所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/100，优选地，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/1000，更优选地，所述阳性基因组载体的碱基数小于阳性细胞系的碱基数的1/10000；所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/100，优选地，所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/1000，更优选地，所述阴性基因组载体的碱基数小于阴性细胞系的碱基数的1/10000。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述阴性基因组载体的碱基数为阴性细胞系的碱基数的大约1/1000000～1/60000；或者所述阳性基因组载体的碱基数为阳性细胞系的碱基数的大约1/1000000～1/60000。
21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述阳性细胞系与阴性细胞系的按照如下质量比混合：0.1:99.9至25:75之间，优选为0.5:99.5至12.5:87.5之间，更优选为1:99至5:95之间。
22.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述阳性基因组载体与阴性基因组载体按照如下质量比混合：1:99至25:75之间或者99:1至75:25，优选为大约1:19或者19:1。
23.如权利要求14所述的方法，其特征在于，按照如下质量比例将步骤(3)和步骤(4)的产物混合：1:2×10-3至1:2×10-5，优选为1:2×10-4。
24.一种试剂盒，包含如权利要求1-11中任意一项所述的生物组合物。
25.一种验证基因测序方法准确性的方法，其特征在于，按照所述基因测序方法对如权利要求5所述的生物组合物进行测序，在生物组合物已验证掺比准确性情况下，比较某一区间测序的阳性水平与阳性细胞系/阴性细胞系的质量比的误差，若误差小于30％，则认为该基因测序方法准确。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述误差的计算方法为：测序的阳性水平分数减去阳性细胞系/阴性细胞系的质量比的差值，再除以阳性细胞系/阴性细胞系的质量比。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，若误差小于25％，则认为该基因测序方法准确。
28.一种验证基因测序方法准确性的方法，其特征在于，按照所述基因测序方法对如权利要求6所述的生物组合物进行测序，并比较阳性基因组载体测序的甲基化水平与阳性基因组载体理论的甲基化水平(97％)的误差，若误差小于5％，则认为该基因测序方法准确。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述误差的计算方法为：阳性基因组载体测序的甲基化水平减去阳性基因组载体理论的甲基化水平的差值，再除以阳性基因组载体理论的甲基化水平。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，若误差小于3％，则认为该基因测序方法准确。
31.一种验证基因测序方法准确性的方法，其特征在于，按照所述基因测序方法对如权利要求6所述的生物组合物进行测序，并比较阴性基因组载体测序的甲基化水平，若甲基化水平小于1％，则认为该基因测序方法准确。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，若甲基化水平小于0.5％，则认为该基因测序方法准确；优选地，若甲基化水平小于0.1％，则认为该基因测序方法准确；更优选地，若甲基化水平小于0.02％，则认为该基因测序方法准确。
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