JP2022537069A - 次世代配列決定ライブラリを調製するための核酸の標識化に有用なオリゴヌクレオチドが連結された三リン酸ヌクレオチド - Google Patents

次世代配列決定ライブラリを調製するための核酸の標識化に有用なオリゴヌクレオチドが連結された三リン酸ヌクレオチド Download PDF

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Abstract

本開示は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、それらを作製する方法、およびそれらを使用する方法を記載している。オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、約３～約１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドに連結されたヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、いくつかの実施形態においてバーコードとして機能することができる既知のオリゴヌクレオチドで、複数の異なる状況において複数の異なる種類の核酸を標識化するために使用され得る。得られたオリゴヌクレオチドで標識化された核酸オリゴヌクレオチドは、様々な核酸配列決定法において使用され得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月２１日に出願され、「Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｏｌｉｇｏｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された米国仮出願第６２／８６４，５８９号、および２０２０年５月２９日に出願され、「Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｏｌｉｇｏｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された米国仮出願第６３／０３２，２９７号の優先権の利益を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年６月２２日に作成された該ＡＳＣＩＩのコピーは、ＬＴ０１４７５ＰＣＴ＿ＳＬ＿ＥＡ．ｔｘｔという名称であり、１４，３１８バイトのサイズである。
本開示は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドおよびそれを使用する核酸タグ付けの方法に関する。本開示はさらに、次世代配列決定、特に、ただしこれらに限定されないが、次世代配列決定ライブラリを調製するための組成物、方法、およびキットに関する。
ＤＮＡ分子を操作および改変する能力は、現代の分子生物学の基礎を形成する。次世代配列決定（ＮＧＳ）の台頭は、特に単一細胞レベルで適用された場合、ＤＮＡ改変および合成ツールキットの新たなニーズを開いた。最大の核酸改変効率、最小のバイアス、自動化の容易さ、および小型化は、現在の方法が適切に対処していない重要なニーズの例である。
核酸ライブラリの調製は、次世代配列決定ワークフローにおける重要なステップである。これには、プラットフォーム特異的アダプターのライゲーションが含まれ、それは、種々のベンダー間で１０倍以上変化するが、一部のライゲーションの効率が非常に低いため、元のライブラリの複雑さが損なわれ、配列決定結果が低下する可能性がある。微量または個々のＤＮＡ分子でさえ配列決定は可能であるが、これには現在、前増幅技術が必要である。等温条件下でプロセッシブＤＮＡポリメラーゼによって実行される多置換反応（ＭＤＡ）は、高いゲノムカバレッジを提供するが、配列依存のバイアスをもたらし、特定のゲノム領域において過剰増幅を引き起こし、他の領域において増幅不足を引き起こす。単一細胞または超低入力ＲＮＡ配列決定ライブラリの調製の場合にしばしば行われるｃＤＮＡの前増幅は、特定の配列のドロップアウトを引き起こすか、または他の方法においてトランスクリプトームの元の組成を歪める可能性がある。これは、ゲノムおよび単一細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定における課題を克服するための新しいアプローチの必要性を示している。
典型的なＮＧＳライブラリの調製ワークフローは、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ試料のランダムな断片化、それに続く５’および３’アダプターライゲーションを含む。通常、断片化およびアダプターの追加は別々のステップとして実行される。次いで、アダプターをライゲーションした断片をＰＣＲで増幅し、精製する。ライブラリ増幅ステップでは、高度に複雑な分子の集団のバイアスのない複製が必要である。非常に忠実度の高い増幅により、誤った遺伝子バリアントの呼び出しを引き起こす可能性のあるＰＣＲエラーが制限される。あるいは、「タグ付け」は、断片化およびライゲーション反応を単一のステップに組み合わせて、ライブラリの調製プロセスを簡素化する。または、トランスポゾンでアダプターを追加することもできる。
本開示は、上記の問題のうちの１つ以上に対処し、次世代配列決定プラットフォームのための核酸ライブラリを調製するためのさらに改善された方法を提供するために提供される。
本開示は、次世代配列決定のためのライブラリを調製するための改善された核酸標識技術および方法を提供する。
したがって、いくつかの実施形態は、核酸にオリゴヌクレオチドをタグ付けするための方法を提供し、この方法は、ａ．タグ付けされる核酸を提供するステップ、ｂ．核酸をポリメラーゼおよび少なくとも１つの式（Ａ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド
Figure 2022537069000001
 またはその塩と接触させるステップを含み、式中、
ＮＢは、核酸塩基であり、
オリゴは、３～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、
ＸおよびＱの各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｎ3、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、シアノ、アミノ、エステル、およびアミドから選択され、
ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択され、
ＣＸＮは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ケトン、カーボネート、エステル、エーテル、無水物、アミド、アミノ、アミノアルキレン、イミノ、イミド、ジアゾ、カルバメートエステル、ホスホジエステル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルホンアミド、および１～４個のＮ、Ｏ、Ｓ原子、またはそれらの組み合わせを含む複素環式基であって、任意選択で炭素、窒素、または硫黄原子において置換された複素環式基から選択され、それによって第１のタグ付けされた核酸を産生する。
いくつかの実施形態において、接触は、核酸を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、およびポリメラーゼと接触させることを含み得る。
いくつかの実施形態において、方法は、プライマーを核酸にアニーリングするステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドであり、任意選択で、ジデオキシヌクレオチドは、ジデオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、ジデオキシウリジン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、方法は、以下のさらなるステップを含む。第１のタグ付けされた核酸鎖を産生した後、連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるプライマーをアニーリングするステップ、第１のタグ付けされた核酸鎖およびアニーリングされたプライマーを、核酸ポリメラーゼおよび少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドと接触させるステップ、ならびにポリメラーゼで、連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされたプライマーの３’ヒドロキシルから伸長し、第２の核酸鎖を形成するステップ。
いくつかの実施形態において、方法は、以下のさらなるステップを含む。第１のタグ付けされた核酸鎖を産生した後、連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングするステップ、第１のタグ付けされた核酸鎖およびアニーリングされたスプリントオリゴヌクレオチドを、核酸ポリメラーゼおよび少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドと接触させるステップ、ならびにポリメラーゼで、連結されたオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルからスプリントオリゴヌクレオチドを横断して伸長するステップ。
１つ以上の核酸を含む試料から核酸のライブラリを生成するための方法も提供される。適宜に、いくつかの実施形態は、１つ以上の核酸を含む試料から核酸のライブラリを生成するための方法を提供し、任意選択で、試料は、複数の細胞を含む。方法は、１つ以上の核酸に少なくとも部分的に相補的である第１のプライマーをアニーリングするステップ、１つ以上の核酸を、核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドと接触させ、それらの３’末端で、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む複数の核酸鎖を形成するステップ、連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマーをアニーリングするステップ、ならびにポリメラーゼで、連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされた第２のプライマーの３’ヒドロキシルから伸長し、それによって核酸のライブラリを産生するステップを含み得る。
いくつかの実施形態は、１つ以上の核酸を含む試料から核酸のライブラリを生成するための方法を提供し、任意選択で、試料は、複数の細胞または細胞核を含み、この方法は、１つ以上の核酸に少なくとも部分的に相補的である第１のプライマーをアニーリングするステップ、１つ以上の核酸を、第１の核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドと接触させ、３’末端で、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む複数の第１の伸長産物を形成するステップ、第１の伸長産物の連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングするステップ、ならびに第１の伸長産物を核酸ポリメラーゼおよび１つ以上のヌクレオチドと接触させ、ポリメラーゼで、連結されたオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルからアニーリングされたスプリントを横断して伸長し、第２の伸長産物を産生し、それによって核酸のライブラリを産生するステップを含む。
いくつかの実施形態において、核酸のライブラリは、二本鎖核酸のライブラリである。
いくつかの実施形態において、核酸のライブラリは、５’末端にユニバーサルハンドルを含む第１の伸長産物のライブラリであり、第１の伸長産物は、３’末端にユニバーサルハンドルを追加するように含むか、またはさらに操作され、ユニバーサルハンドルは増幅プライマーのアニーリングを可能にする。
いくつかの実施形態において、試料中の１つ以上の核酸は、オリゴヌクレオチドが連結された結合剤（ＯＴＢＡ）のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＯＴＢＡの連結されたオリゴヌクレオチドは、細胞マーカー結合剤インデックスを含み、ＯＴＢＡの結合剤は、アプタマーもしくは抗体またはそれらの機能的断片を含む。
試料をスプリントオリゴヌクレオチドと接触させ、試料は１つ超の細胞または細胞核を含むいくつかの実施形態において、細胞または細胞核の亜集団は、１つ以上の細胞マーカーを含み得る。
試料は、第１のプライマーを１つ以上の核酸にアニーリングするステップの前に２つ以上の第１の部分に分割し得、各第１の部分は、元の試料の細胞または細胞核の亜集団を含む。第１のプライマーは、第１のユニバーサルハンドル配列および第１のバーコードを含み、該第１のバーコードは、各第１の部分における第１のプライマー間で共通であるが、他の第１の部分における第１のプライマーにおいて存在する第１のバーコードとは異なり、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、第２のユニバーサルハンドル配列を含む。方法はまた、スプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングする前に、以下のさらなるステップを実行することを含み得る。第１の核酸伸長産物の形成後に第１の部分を混ぜ合わせるステップ、および混ぜ合わされた第１の部分を２つ以上の第２の部分に分割するステップ、第２の部分は、スプリントオリゴヌクレオチドを含み、スプリントオリゴヌクレオチドは、連結されたオリゴヌクレオチド上の第２のユニバーサルハンドルにアニーリングするオリゴヌクレオチド配列、各第２の部分の第２のバーコードは共通であるが、他の第２の部分の第２のバーコードとは異なる、第２のバーコードについての鋳型配列、および第３のユニバーサルハンドルの鋳型配列を含む。したがって、第１の伸長産物の３’末端に、第２のバーコードおよび第３のユニバーサルハンドルを含む、第２の伸長産物を含む核酸のライブラリが生成される。
いくつかの実施形態において、方法は、以下のさらなるステップを含み得る。第２の部分を混ぜ合わせるステップ、混ぜ合わされた第２の部分を２つ以上の第３の部分に分割するステップ、各第３の部分を増幅プライマーと接触させるステップ、増幅プライマーは、第１のユニバーサルハンドルおよび第３のユニバーサルハンドルにハイブリダイゼーションし、そこから伸長し、第２の伸長産物を増幅することができる。増幅プライマーは、任意選択で、それぞれ第３および／または第４のバーコード、ならびにそれぞれ第１および／または第２のアダプター配列を含む。増幅産物の第１、第２、および第３のバーコード配列（またはその相補体）の組み合わせは、単一の細胞または核に由来する増幅産物に特有である。
核酸にタグを付けるための方法および／または１つ以上の核酸を含む試料から核酸ライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、プライマー、連結されたオリゴヌクレオチド、またはそれらの両方は、ランダム配列、標的特異的配列またはそれらの両方を含む。
核酸にタグを付けるための方法および／または１つ以上の核酸を含む試料から核酸ライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、プライマー、連結されたオリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドのうちの１つ以上は、ユニバーサルハンドル、ユニバーサル配列、特有の分子同定子、アダプター配列、プロモーター配列、バーコード配列、インデックス配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
核酸にタグを付けるための方法および／または１つ以上の核酸を含む試料から核酸ライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、または鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
核酸にタグを付けるための方法および／または１つ以上の核酸を含む試料から核酸ライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
また、本明細書で提供されるのは、式
（Ａ）：
Figure 2022537069000002
 のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドまたはその塩であり、
式中、ＮＢは、核酸塩基であり、
オリゴは、３～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、
ＸおよびＱの各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｎ3、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、シアノ、アミノ、エステル、およびアミドから選択され、
ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択され、
ＣＸＮは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ケトン、カーボネート、エステル、エーテル、無水物、アミド、アミノ、アミノアルキレン、イミノ、イミド、ジアゾ、カルバメートエステル、ホスホジエステル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルホンアミド、および１～４個のＮ、Ｏ、Ｓ原子、またはそれらの組み合わせを含む複素環式基であって、任意選択で炭素、窒素、または硫黄原子において置換された複素環式基から選択される。
いくつかの実施形態において、ＣＸＮはクリックであり、クリックは、以下の対の官能基のうちの１つの間のクリック反応の産物である。
ｉ）アルキニルおよびアジド、
ｉｉ）チオールおよびアルキニル、
ｉｉｉ）チオールおよびアルケニル、
ｉｖ）アジドおよびシクロオクタニル、ならびに
ｖ）シクロオクタニルおよびニトロン。
核酸ライブラリの調製における、または核酸のタグ付けにおける使用のための、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの使用も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、概して、式（Ａ）による構造、またはその塩を有する。
Figure 2022537069000003
式中、ＮＢは、核酸塩基であり、オリゴは、３～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、ＸおよびＱの各々は独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｎ３、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、シアノ、アミノ、エステル、およびアミドから選択され、ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択され、ＣＸＮは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ケトン、カーボネート、エステル、エーテル、無水物、アミド、アミノ、アミノアルキル、イミノ、イミド、ジアゾ、カルバメートエステル、ホスホジエステル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルホンアミド、および１～４個のＮ、Ｏ、Ｓ原子、またはそれらの組み合わせを含む複素環式基であって、任意選択で炭素、窒素、または硫黄原子において置換された複素環式基から選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物の塩は、四級アンモニウム塩である。
いくつかの実施形態において、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｎ3、およびアミノから選択される。他の実施形態において、Ｘは、Ｈ、Ｎ3、およびＯＨから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘは、ＯＨである。他の実施形態において、Ｘは、Ｈである。
いくつかの実施形態において、Ｑは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ3である。他の実施形態において、Ｑは、Ｈである。
いくつかの実施形態において、オリゴは、
Figure 2022537069000004
 から選択され、式中、オリゴ＊はオリゴ基由来の残りの２～９９ヌクレオチドであり、ＮＢ２は、核酸塩基である。
いくつかの実施形態において、ＣＸＮは、各々が１～３個のヘテロ原子を有する５員複素環および６員複素環から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＸＮは、ピロロ、チオフェニル、フラニル、ピロリジニル、チオラニル、テトラヒドロフラニル、イソキサゾリル、オキサゾロ、ピラゾロ、イミダゾリル、イソチアゾロ、チアゾリル、トリアゾロ、オキサジアゾロ、チアジアゾロ、ピラニル、チオピラニル、ピリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ヘキサヒドロピリダジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、モルフォリノ、チアジニル、オキサジノ、ジチアニル、トリアジニル、ジチアジノ、チアジアジノ、トリアジナニル、およびオキサチアジノから選択される。
他の実施形態において、ＣＸＮは、クリックであり、クリックは、クリック反応の産物である。いくつかの実施形態において、クリックは、以下の対の官能基のうちの１つの間のクリック反応の産物である。ｉ）アルキニルおよびアジド、ｉｉ）チオールおよびアルキニル、ｉｉｉ）チオールおよびアルケニル、ｉｖ）アジドおよびシクロオクタニル、ならびにｖ）シクロオクタニルおよびニトロン
いくつかの実施形態において、ＣＸＮは
Figure 2022537069000005
 である。
いくつかの実施形態において、ＺおよびＹは、各々、リンカーまたは連結部分であり、これは、ｄｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとオリゴヌクレオチドとの間の全体的な連結を所望の特性で提供するように変化し得る特定の官能基を指す。
いくつかの実施形態において、ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、各ＺおよびＹは、独立して、アミノ、アミド、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。他の実施形態において、Ｙは、アルキレンまたはアルキニレンである。
他の実施形態において、Ｚは、アルキニレン、アルキレン、エーテル、およびアミドのうちの１つ以上の組み合わせである。さらに他の実施形態において、－ＮＢ－Ｚ－の組み合わせは、
Figure 2022537069000006
 であり、式中、Ｌ1は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、およびポリアルキレングリコールから選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物は、式（Ｂ１）～（Ｂ４）
Figure 2022537069000007
 の化合物およびそれらの塩から選択され、式中、オリゴ＊は、オリゴ基由来の残りの２～９９ヌクレオチドであり、ＮＢ２は、核酸塩基であり、Ｌ1は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、およびポリアルキレングリコールから選択され、Ｌ2は、アルキレンまたはアルキニレンである。
他の実施形態において、Ｌ1は、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ２－Ｃ１２アルケニレン、Ｃ２－Ｃ１２アルキニレン、および２～８グリコール単位を有するポリアルキレングリコールである。他の実施形態において、Ｌ1は、２グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ２）、４グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ４）、または６グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ６）、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、イソプロピレン、１－ブチレン、シス－２－ブチレン、トランス－２－ブチレン、イソブチレン、１－ペンチレン、シス－２－ペンチレン、トランス－２－ペンチレン、イソペンチレン、およびヘキシレンから選択される。さらに他の実施形態において、Ｌ1は、－ＣＨ2－、－（ＣＨ2）3－、－（ＣＨ2）5－、ＰＥＧ２、およびＰＥＧ４から選択される。
いくつかの実施形態において、連結基Ｙは、アルキレンまたはアルキニレンから選択されるＬ2の亜群を含む。他の実施形態において、Ｌ2は、Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルキニレンである。他の実施形態において、Ｌ2－オリゴの組み合わせは、－（ＣＨ2）4－オリゴまたは－（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ－オリゴから選択される。
いくつかの実施形態において、オリゴは、その５’－リン酸を介してｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰの核酸塩基へのいずれかでヌクレオチドに連結される。いくつかの実施形態において、オリゴは、核酸塩基（ＮＢ２）を介して連結される。
いくつかの実施形態において、ＮＢおよびＮＢ２は、独立して核酸塩基である。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アデニン、７－デアザ－アデニン、シトシン、グアニン、７－デアザグアニン、チミン、ウラシルおよびイノシンから選択される。
いくつかの実施形態において、ＮＢは、ピリミジンであり、ピリミジンは、核酸塩基の５位でオリゴヌクレオチドに連結される。他の実施形態において、ＮＢは、プリンであり、プリンは、核酸塩基の７位でオリゴヌクレオチドに連結される。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドまたはその塩が提供される。
Figure 2022537069000008
 式中、ＸはＨ、Ｎ3、またはＯＨであり、
ＮＢは、アデニン、７－デアザ－アデニン、シトシン、グアニン、７－デアザグアニン、チミン、ウラシルおよびイノシンから選択される核酸塩基を表し、
ＺおよびＹはリンカーであり、ＺおよびＹは、各々独立して、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの連結部位を含み、
クリックは、クリック反応の産物であり、
オリゴは、３～１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、「クリック」は、以下の対の官能基のうちの１つの間のクリック反応の産物である。
ｉ）アルキニルおよびアジド、
ｉｉ）アジドおよびアルキニル、
ｉｉｉ）チオールおよびアルキニル、
ｉｖ）アルキニルおよびチオール、
ｖ）チオールおよびアルケニル、
ｖｉ）アルケニルおよびチオール、
ｖｉｉ）アジドおよびシクロオクタニル、
ｖｉｉｉ）シクロオクタニルおよびアジド、
ｘｉ）ニトロンおよびシクロオクタニル、ならびに
ｘｉｉ）シクロオクタニルおよびニトロン。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドまたはその塩が提供される。
Figure 2022537069000009
 式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｎ3であり、
ＮＢは、アデニン、７－デアザ－アデニン、シトシン、グアニン、７－デアザグアニン、チミン、ウラシルおよびイノシンから選択される核酸塩基を表し、
ＺおよびＹはリンカーであり、ＺおよびＹは、各々独立して、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの連結部位を含み、
オリゴは、３～１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである。
式（Ｉ）または（ＩＩ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのいくつかの実施形態において、Ｘは、ＯＨである。他の実施形態において、Ｘは、Ｈである。
いくつかの実施形態において、アルキレンは、Ｃ1－Ｃ6、アルキレンである。いくつかの実施形態において、アルケニレンは、Ｃ2－Ｃ6アルケニレンである。
いくつかの実施形態において、アルキニレンは、Ｃ2－Ｃ6アルキニレンである。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコールは、２～８個のグリコール単位を有する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、その５’末端でヌクレオチドに連結されている。
いくつかの実施形態において、ＺおよびＹの一方は、トリアゾール環の１位に共有結合で結合し、ＺおよびＹの他方は、トリアゾール環の４位に共有結合で結合する。いくつかの実施形態において、Ｚは、トリアゾール環の１位に共有結合で結合し、Ｙは、トリアゾール環の１位に共有結合で結合する。他の実施形態において、Ｚは、トリアゾール環の４位に共有結合で結合し、Ｙは、トリアゾール環の１位に共有結合で結合する。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドまたはその塩が提供される。
Figure 2022537069000010
 式中、
Ｌ１は、アルキレン、ポリアルキレングリコール、またはそれらの組み合わせを含むリンカーであり、
Ｌ２は、アルキニレンを含むリンカーである。
いくつかの実施形態において、Ｌ1は、２、４、または６個のアルケニレングリコール基を有するポリアルケニレングリコールを含む。いくつかの実施形態において、ポリアルケニレングリコールはポリエチレングリコールである。
いくつかの実施形態において、Ｌ1は、１～１２個の炭素原子を有するアルキレンを含む。いくつかの実施形態において、アルキレンは、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、イソプロピレン、１－ブチレン、シス－２－ブチレン、トランス－２－ブチレン、イソブチレン、１－ペンチレン、シス－２－ペンチレン、トランス－２－ペンチレン、イソペンチレン、またはヘキシレンである。
いくつかの実施形態において、Ｌ2は、ヘキシニルである。
いくつかの実施形態において、核酸塩基は、ピリミジンであり、ピリミジンは、核酸塩基の５位でオリゴヌクレオチドに連結される。他の実施形態において、核酸塩基は、プリンであり、プリンは、核酸塩基の７位でオリゴヌクレオチドに連結される。
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのいくつかの実施形態において、塩は、四級アンモニウム塩である。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、バーコード配列、アダプター配列、特有の分子同定子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、核酸にオリゴヌクレオチドをタグ付けするための方法が提供され、方法は、以下を含む。
タグ付けされる核酸を提供すること、
核酸を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドおよびポリメラーゼと接触させること、それによってタグ付けされた核酸を産生すること。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、方法は、核酸を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、およびポリメラーゼと接触させることをさらに含む。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、方法は、プライマーを核酸にアニーリングすることをさらに含む。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、方法は、スプリントオリゴヌクレオチドをタグ付けされた核酸にアニーリングすることをさらに含む。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、核酸は、５’末端、３’末端、またはそれらの両方でタグ付けされる。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、核酸は複数の位置でタグ付けされる。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、核酸は、ニック翻訳またはギャップ充填反応中にオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドでタグ付けされる。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、方法は、例えばライゲーションまたは重合反応によって、アダプター配列を核酸の３’末端に付加することをさらに含む。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、方法は、１つ以上の配列（例えば、バーコード配列、ユニバーサル配列、特有の分子同定子配列、インデックス配列、プロモーター配列、配列、アダプター配列など）を、例えば、ライゲーションまたは重合反応により、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの３’末端に付加することをさらに含む。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、方法は、タグ付けされた核酸をＰＣＲに供することをさらに含む。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、方法は、タグ付けされた核酸を、タグ付けされた核酸の連結されたオリゴヌクレオチド上のユニバーサルハンドル配列に部分的に相補的なスプリントオリゴヌクレオチドと接触させ、ポリメラーゼで、スプリントオリゴヌクレオチドを横断して連結されたオリゴヌクレオチドの３’ＯＨを介して伸長することをさらに含む。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡであり、他の実施形態において、核酸は、ＲＮＡである。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｘ型ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素である。他の実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体である。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、ＴｄＴである。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、ヌクレオチドオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドであり、任意選択で、デオキシヌクレオチドは、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオキシウリジン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、ヌクレオチドオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドであり、任意選択で、ジデオキシヌクレオチドは、ジデオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、ジデオキシウリジン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、方法におけるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの濃度は、１ｆｍｏｌ～１０μｍｏｌの範囲である。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド対対応する天然のヌクレオチド（すなわち、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、または連結されたオリゴヌクレオチドを欠くが、天然に存在し、連結されたオリゴヌクレオチドを有さない他の修飾されたヌクレオチドの両方を含むヌクレオチド）のモル比は、１：１～１：１０００の範囲である。
本明細書に記載のヌクレオチドタグ付け反応のいくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つのクリーンアップステップを実行することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、核酸にオリゴヌクレオチドをタグ付けするための方法が提供され、方法は、タグ付けされる核酸を提供すること、核酸を第１の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドと接触させること、それによって第１のタグ付けされた核酸鎖を産生することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、第１のタグ付けされた核酸鎖を産生した後、連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるプライマーをアニーリングすること、第１のタグ付けされた核酸鎖およびアニーリングされたプライマーを核酸ポリメラーゼおよび少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドと接触させること、ならびにポリメラーゼで、連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされたプライマー上の３’ヒドロキシルから伸長し、第２の核酸鎖を形成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、任意選択で、第２の核酸鎖を形成した後にタグ付けされた核酸鎖をエキソヌクレアーゼと接触させることをさらに含み、第１の核酸鎖はエキソヌクレアーゼによって分解される。いくつかの例において、第１の核酸鎖が５’－リン酸を有する場合、第１の核酸鎖を分解するためにラムダエキソヌクレアーゼを使用し得る。
いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸を含む試料から核酸のライブラリを生成するための第１の方法が提供され、方法は以下を含む。
ａ．１つ以上の核酸に少なくとも部分的に相補的である第１のプライマーをアニーリングすること、
ｂ．１つ以上の核酸を、核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドと接触させ、それらの３’末端で、第１のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む１つ以上の第１の核酸鎖を形成すること、
ｃ．連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマーをアニーリングすること、ならびに
ｄ．ポリメラーゼで、連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされた送信プライマーの３’ヒドロキシルから伸長し、それによって核酸のライブラリを産生すること。
いくつかの実施形態において、任意選択で、試料が複数の細胞または核を含む、１つ以上の核酸を含む試料から核酸のライブラリを生成するための第２の方法が提供され、方法は以下を含む。
ａ．１つ以上の核酸に少なくとも部分的に相補的である第１のプライマーをアニーリングすること、
ｂ．第１の核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを有する１つ以上の核酸を、３’末端で、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む複数の第１の伸長産物へ接触させること、
ｃ．第１の伸長産物の連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングすること、ならびに
ｄ．第１の伸長産物を第２の核酸ポリメラーゼと接触させ、ポリメラーゼで、連結されたオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルからアニーリングされたスプリントオリゴヌクレオチドを横断して伸長し、それによって核酸のライブラリを産生して第２の伸長産物を産生し、それにより核酸のライブラリを産生する。
核酸のライブラリを生成するための第１または第２の方法のいくつかの態様において、１つ以上のポリヌクレオチドは、第１のプライマーのアニーリングの前に生成される複数のポリヌクレオチド断片を含む。
核酸のライブラリを生成するための第１の方法のいくつかの態様において、第２のアニーリングされたプライマーと核酸ポリメラーゼとの接触は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの存在下で行われ、第２の核酸鎖は、その３’末端でオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む。核酸のライブラリを生成するための方法のいくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドにおける連結されたオリゴヌクレオチドと、第２のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドにおける連結されたオリゴヌクレオチドとは異なる。
核酸のライブラリを生成するための第２の方法のいくつかの態様において、試料中の１つ以上の核酸は、オリゴヌクレオチドが連結された結合剤（ＯＴＢＡ）のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＯＴＢＡのオリゴヌクレオチドは、細胞マーカー結合剤インデックスを含み、ＯＴＢＡの結合剤は、アプタマーもしくは抗体またはそれらの機能的断片を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、機能的な抗体断片である。例えば、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの抗体の一部であり得る。抗体断片は、全長抗体によって認識される同じ抗原と結合し得る。抗体断片は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、ならびに軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）など抗体の可変領域からなる単離された断片を含み得る。例示的な抗体には、癌細胞に対する抗体、ウイルスに対する抗体、細胞表面受容体（例えば、ＣＤ８、ＣＤ３４、およびＣＤ４５）に結合する抗体、および治療用抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「インデックス」または「細胞マーカー結合剤インデックス」は、細胞マーカー結合剤を同定し、それに特異的であるオリゴヌクレオチド配列を指す（すなわち、各細胞マーカー結合剤に特有のユニバーサル配列である）。
核酸のライブラリを生成するための第２の方法のいくつかの態様において、１つ以上の核酸を含む試料は、１つ超の細胞または核を含み、細胞または細胞核（またはその亜集団）は、１つ以上の細胞マーカーを含み得る。いくつかの態様において、細胞マーカーは、試料中の細胞の一部によって発現される。いくつかの態様において、細胞マーカーは、細胞表面マーカーである。
核酸のライブラリを生成するための第２の方法のいくつかの態様において、試料は、試料の１つ以上の核酸に少なくとも部分的に相補的である第１のプライマーがアニーリングされる前に、元の試料の細胞または細胞核の亜集団を各々が含む２つ以上の第１の部分に分割される。第１のプライマーは、第１のユニバーサルハンドルおよび第１のバーコードを含み得、連結されたオリゴヌクレオチドは、第２のユニバーサルハンドルを含み得る。第１のバーコード配列は、各部分における第１のプライマー間で共通であるが、他の第１の部分における他の第１のプライマーの第１のバーコード配列とは異なり、該第１の部分を、アニーリングされた第１のプライマーの伸長が可能な条件下で接触させて、第１の核酸伸長産物を形成する。方法は、第１の核酸伸長産物の形成後に第１の部分を混ぜ合わせるさらなるステップ、および混ぜ合わされた第１の部分を２つ以上の第２の部分に分割するさらなるステップを含み得る。各第２の部分を、スプリントオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、および１つ以上のヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）と接触させ得る。スプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）連結されたオリゴヌクレオチドの第２のユニバーサルハンドルにアニーリングするオリゴヌクレオチド配列、（ｉｉ）各第２の部分におけるスプリントオリゴヌクレオチドの第２のバーコードは共通であるが、他の第２の部分におけるスプリントオリゴヌクレオチドの第２のバーコードとは異なる、第２のバーコードの鋳型配列、および（ｉｉｉ）第３のユニバーサルハンドルについての鋳型配列を含み得る。ポリメラーゼは、スプリントオリゴヌクレオチドを横断して連結されたオリゴヌクレオチドの３’ＯＨを伸長し、それによって５’から３’に向かって、第１のユニバーサルハンドル、第１のバーコード、試料核酸配列のコピー、第２のユニバーサルハンドル、第２のバーコード、および第３のユニバーサルハンドルを含む第２の核酸伸長産物を生成する。方法は、第２の部分を混ぜ合わせ、混ぜ合わされた第２の部分を２つ以上の第３の部分に分割するステップをさらに含み得る。
増幅産物を含む核酸のライブラリを生成するために、第３の部分を、第２の伸長産物の５’および３’末端の第１および第３のユニバーサル配列にハイブリダイゼーションする増幅プライマー、ポリメラーゼおよびヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）と接触させ得る。増幅プライマーは、例えば、配列決定アダプター、または任意の他の所望の配列を含み得る。増幅産物の第１、第２、および第３のバーコード配列（またはその相補体）の組み合わせは、単一細胞の試料核酸に由来する増幅産物に特有である。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する第１および第２の方法のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、式（Ａ）、（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のうちのいずれか１つを有するオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドである。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する第１および第２の方法のいくつかの態様において、プライマー、連結されたオリゴヌクレオチド、またはそれらの両方が、ランダム配列、標的特異的配列、またはそれらの両方を含む。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する第１および第２の方法のいくつかの態様において、プライマー、連結されたオリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルハンドル、ユニバーサル配列、特有の分子同定子、アダプター配列、プロモーター配列、バーコード配列、インデックス配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する第１および第２の方法のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドもしくはスプリントオリゴヌクレオチド、またはそれらの両方が、親和性タグをさらに含む。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する第１および第２の方法のいくつかの態様において、ポリメラーゼは、Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｘ型ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素である。Ｂ型ポリメラーゼの例としては、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼ、およびＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ、Ｐ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ－７のファミリーＢポリメラーゼなどのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属のものが挙げられる。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体から選択される。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する第１および第２の方法のいくつかの態様において、ヌクレオチドは、デオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する第１および第２の方法のいくつかの態様において、方法は、ライブラリを増幅することをさらに含む。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する第１および第２の方法のいくつかの態様において、および本明細書に記載の核酸にタグ付けする方法のいくつかの実施形態において、ステップ（ａ）におけるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの濃度は、１ｆｍｏｌ～１０μｍｏｌの範囲である。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド対対応する天然のヌクレオチドのモル比は、１：１～１：１０００の範囲である。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つのクリーンアップステップを実行することをさらに含む。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡなどである。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡを逆転写して対応するｃＤＮＡを産生することをさらに含む。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、方法は、第１のプライマーをアニーリングする前および／または試料を分割する前に、細胞を固定および透過性にすることをさらに含む。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、方法は、１つ以上の伸長産物を生成した後に細胞を溶解することをさらに含む。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、第１の核酸伸長産物を生成した後、第１の部分または混ぜ合わされた第１の部分をブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させ、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の伸長プライマーの細胞の核酸へのハイブリダイゼーションを防止する。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、方法は、第２の核酸伸長産物を生成した後、第３の部分を第２の伸長プライマーと接触させる前に、スプリントオリゴヌクレオチドを除去するステップをさらに含む。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、スプリントオリゴヌクレオチドは、結合部位を含み、方法は、第２の部分または混ぜ合わされた第２の部分を、同種の結合部位を含むスプリントオリゴヌクレオチドの結合および除去を促進する捕捉部位を含む化合物と接触させるステップを含む。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、結合部位および同種の捕捉部位は、ストレプトアビジンおよびビオチン、マルトースおよびマルトース結合タンパク質、グルタチオンおよびグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、キチンおよびキチン結合タンパク質、またはアプタマーおよびその抗原の結合対から選択される結合対である。
本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、捕捉部位は、固体支持体上に固定化される。本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、固体支持体は、ビーズを含む。本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、ビーズは、磁性または常磁性のビーズである。本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、第１の伸長プライマーは、伸長条件下で目的のｍＲＮＡにハイブリダイゼーションすることができる配列を含む。本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、第１の伸長プライマーは、３’末端にポリ（Ｔ）を含む。本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、第１の伸長プライマーは、３’末端にランダムヘキサマー配列を含む。本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、第１の部分を、伸長プライマーの混合物と接触させ、少なくとも１つの第１の伸長プライマーは、３’末端にポリ（Ｔ）配列を含み、少なくとも１つの第１の伸長プライマーは、ランダムヘキサマー配列を含む。本明細書に記載の核酸のライブラリを生成する方法のいくつかの実施形態において、任意選択の第１および第２のアダプターは、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム、ＩＯＮ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォームなどの様々なＮＧＳプラットフォームで配列決定するためのアダプターを含む。
いくつかの実施形態において、式（Ａ）、（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを調製するための方法が提供され、方法は、以下を含む。
ａ．第２の官能基とのクリック反応を受けることができる第１の官能基に共有結合で結合したヌクレオチドを提供すること、クリック反応を受けてトリアゾール環を形成することができる第２の官能基に共有結合で結合したオリゴヌクレオチドを提供すること、ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドと接触させてクリック反応産物を形成すること。
第１および第２の官能基は、それぞれ、以下から選択される。
ｉ）アルキニルおよびアジド、
ｉｉ）アジドおよびアルキニル、
ｉｉｉ）チオールおよびアルキニル、
ｉｖ）アルキニルおよびチオール、
ｖ）チオールおよびアルケニル、
ｖｉ）アルケニルおよびチオール、
ｖｉｉ）アジドおよびシクロオクタニル、
ｖｉｉｉ）シクロオクタニルおよびアジド、
ｘｉ）ニトロンおよびシクロオクタニル、ならびに
ｘｉｉ）シクロオクタニルおよびニトロン。
いくつかの実施形態において、第１および第２の官能基は、それぞれ、ｉ）アルキニルおよびアジド、およびｉｉ）アジドおよびアルキニルから選択される。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、銅触媒および銅（Ｉ）配位子の存在下でヌクレオチドをオリゴヌクレオチドと接触させて、１，２，３－トリアゾールを形成することを含む。いくつかの実施形態において、銅触媒は、銅（Ｉ）または銅（ＩＩ）を含み、触媒が銅（ＩＩ）である場合、還元剤が存在する。いくつかの実施形態において、銅触媒は、Ｃｕ（ＮＯ3）2Ｃｕ（ＯＡｃ）、ＣｕＳＯ4またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態において、還元剤は、アスコルビン酸塩、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２．４．６－トリクロロフェノール（ＴＣＰ）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ硫酸塩、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、印加電位、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈ、Ｗ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、還元剤は、アスコルビン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、配位子は、トリス（ベンジルトリアゾリルメチル）アミンまたはトリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミンを含む。
いくつかの実施形態において、配列決定ライブラリを産生するためのキットが提供され、キットは以下を含む。
ａ．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、ならびに
（ｉ）Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕおよび／もしくはＴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせ、
（ｉｉ）ポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）プライマーおよび／もしくはアダプター配列、
（ｉｖ）緩衝液、または
（ｖ）塩のうちの少なくとも１つ。
いくつかの実施形態において、キットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、および／またはＴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、キットは、ポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼ、修飾されたポリメラーゼ、変異型ポリメラーゼ、操作されたポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、およびＨＩＶ－１逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体である。
いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上のプライマー、アダプター、バーコード、または特有の分子同定子配列を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも１つの緩衝液を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも１つの塩を含む。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、組み合わせバーコーディングのためのキットを含む。キットは、以下を含み得る。
ａ．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、ならびに
（ｉ）Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕおよび／もしくはＴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせ、
（ｉｉ）ポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）プライマーおよび／もしくはアダプター配列、
（ｉｖ）緩衝液、または
（ｖ）塩のうちの少なくとも１つ。
いくつかの実施形態において、以下のポリメラーゼのうちの１つ以上を有する組み合わせバーコーディングキットが提供される。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、およびＨＩＶ－１逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体。例えば、好ましい実施形態において、組み合わせバーコーディングキットは、逆転を含み得る。例として、組み合わせバーコーディングキットは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素およびＰｆｕｓｉｏｎ－ｅｘｏ－ポリメラーゼを含み得る。
いくつかの実施形態において、キットは、複数の区画を提供する容器をさらに含み、各区画は、区画特異的バーコードを含むプライマーを含む。例えば、いくつかの実施形態において、
次に、本開示の特定の実施形態を詳細に参照し、その例を添付の図に示す。本開示は、図示の実施形態と併せて説明されるが、それらは、開示をそれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解されるだろう。それどころか、本開示は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、開示に含まれ得るすべての代替、修正、および同等物を網羅することを意図している。
ＮＧＳライブラリの調製におけるオリゴヌクレオチドが連結されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の適用の概略図を示す。この実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたｄＮＴＰは、核酸中の複数の位置に組み込まれる（図１Ａ）。図１Ｂは、連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされたプライマーの伸長、およびその後の非天然リンカーを通るポリメラーゼの読み過ごしを示す。 ＮＧＳライブラリの調製におけるオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）の適用の概略図を提供する。この実施形態において、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、第１のアダプター配列を含む単一のオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰを、鋳型非依存性様式で核酸の３’末端に付加する（図２Ａ）。さらに、第２のアダプターをアニーリングしてライゲーションし、両端に相補的およびミスマッチな領域を有するアダプターを有するポリヌクレオチドのライブラリを提供する（図２Ｂ）。 オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを組み込むことにより、プライマー伸長およびランダムＤＮＡ合成終結の基本原理を示す。これにより得られたＤＮＡ断片の両端に事前に設計された配列タグが導入される。次いで、タグ付けされたＤＮＡ断片のライブラリは、ＰＣＲプライマーを使用して増幅され得、これにより、順次プラットフォーム特異的アダプター配列が導入される。必要に応じて、連結されたオリゴヌクレオチドは、核酸標的の濃縮のために使用され得る親和性タグ（例えば、ビオチン、左側のスキーム）を含み得る。タグ付けされたＤＮＡ断片の長さは、オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰ濃度および／または対応する天然のデオキシヌクレオチドに対する比率の調整を介して制御され得る。 ニック翻訳またはギャップ充填反応中にオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰを組み込むことによるＤＮＡ標識化の原理を示す。 （ＴｄＴ）によるオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰの鋳型非依存性の組み込みによるＤＮＡ末端標識化の基本原理を示す。図３６Ａに示されるように、二本鎖、一本鎖、および部分的に二本鎖のＤＮＡの末端は標識され得る。 ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰの鋳型非依存性の組み込みによるＲＮＡ末端標識の基本原理を示す。 アジド修飾ｄＣＴＰを調製するための例示的な合成スキームおよびいくつかの例示的なリンカーの構造を示す。 アジド修飾ｄＡＴＰを調製するための例示的な合成スキームを示す。 オリゴヌクレオチドが連結されたｄＣＴＰを調製するための例示的なクリック反応スキームを、いくつかの例示的なリンカーの構造とともに示す。 オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰを調製するための例示的なクリック反応スキームを示す。 様々な種類のポリメラーゼのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを組み込む能力を試験する実験の結果を示す。矢印はクリック反応産物を示す。Ｋ－レーンは反応前のＣｙ５が標識された鎖を示し、Ｋ＋レーンは４つの天然のｄＮＴＰ（ＡおよびＢ）またはｄＣＴＰ（Ｃ）を使用した反応産物を示す。Ｃ６－Ｂ１、ＰＥＧ４－Ｂ１、Ｃ２－Ｂ１、Ｃ４－Ｂ１およびＰＥＧ２－Ｂ１は、表１に提供されるクリック反応産物に対応し、Ｂ１は、配列番号３３に対応する。 オリゴヌクレオチドが連結された組み込み実験の結果を示す。具体的には、図１２Ａは、複数のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込み実験のための核酸基質を示す。矢印は、オリゴヌクレオチドが連結されたｄＣＴＰの組み込みの可能性がある部位を示す。図１２Ｂは、ＤＮＡ／ＲＮＡ基質上のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込みを示すゲルの画像である。Ｋ－レーンは反応前のＣｙ５が標識された鎖を示し、Ｋ＋レーンは４つの天然のｄＮＴＰを使用した反応産物を示し、レーン２～５は天然のｄＮＴＰの非存在下での様々な量のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを組み込んだ重合反応産物を示す（Ｃ２－Ｂ２はアジド－Ｃ２－ｄＣＴＰと配列番号２３との間のクリック反応から生じるＯＴＤＮを示す）。レーン８における産物は、複数のオリゴヌクレオチドが連結されたシトシンの組み込み事象の発生を示す。 ｄｄＵＴＰの組み込みおよびＰＡＧＥゲルを示す。すなわち、二本鎖および一本鎖核酸でのＴｄＴによるｄｄＵＴＰの組み込みを示すスキームが提供される。結果をＰＡＧＥゲルを使用して分析した。Ｋ－レーンは反応前のＣｙ５が標識された鎖を示す。ｄｄＵＴＰ－ｐレーンは、オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰ（配列番号２）の組み込みが成功したことを示す。 ＲＮＡの３’末端のポリ（Ｕ）ポリメラーゼ標識化の実験結果を示す。この実験により、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰを組み込むことが確認された。 いくつかの異なるポリメラーゼでのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込み実験の結果を示す。矢印は、組み込み事象の成功を示す。Ｋ－レーンは反応前のＣｙ５が標識された鎖を示し、Ｋ＋レーンは天然のｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを使用した場合の反応産物を示す。「ｄｄＵＴＰ」レーンはｄｄＵＴＰの組み込みを示し、「ＯＴＤＤＮ」レーンはオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰ（配列番号１）の組み込みを示す。 ＰＣＲにおいて特定のプライマーを使用してポリメラーゼのオリゴヌクレオチドが連結されたプライマー伸長読み過ごし事象を確認するための原理実証実験モデルのスキームを示す。まず、第１のプライマーは、組み込まれる最初のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドが連結されたデオキシヌクレオチド（オリゴヌクレオチドが連結されたｄＣ）であるように鋳型にアニーリングされる（ステップＩ）。次いで、第２のプライマー（ステップＩＩの破線）をアニーリングし、プライマー伸長のためにＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを添加する。曲線の矢印は、読み過ごし位置を示す。次いで、伸長されたＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する（ステップＩＩＩ）。正しい読み過ごし事象を確認するために、得られたＰＣＲ断片をクローン化し、サンガー配列決定を行った（データは示していない）。 正しい読み過ごし産物の形成を確認するための別の実験のスキームを示す。図１７Ｂは、結果を示すゲルの画像である（図１７Ｂ）。図１２のスキームからのプライマー伸長産物は、開始鋳型として使用される（配列番号３０および３１）。黒丸はＣｙ５色素、白丸はＣｙ３色素を示す。 アラインメント結果を示す。図１８Ａは、２つのＭ１３ｍｐ１８特異的プライマーの伸長およびオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰの組み込みによるランダムな終結によって生成されたアンプリコンライブラリの配列決定時に得られたリードのアラインメントを示す。アラインメント（図１８Ｂ）は、プライミング部位に対応する固定された位置に位置する両方の挿入物の５’末端での２つのＭ１３ｍｐ１８ゲノム遺伝子座のカバレッジを示し、３’末端はオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰ組み込み部位に対応するランダム領域で発生する。 ランダムプライマーの伸長およびオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰの組み込みによる終結によって生成されたアンプリコンライブラリの配列決定時に得られたリードのアラインメントを示す。アラインメントはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２染色体全体のカバレッジを示す。 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のゲノムコンテキストの分析の原理を示す。図２０Ａは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子マップと、オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰの終結を使用する、つまり単一の外向きプライマーから開始するセミ標的化断片ライブラリの調製の戦略を示す。図２０Ｂおよび２０Ｃは、対応するＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの電気泳動図である。Ｖ１～Ｖ９は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内の可変配列の領域を示す。 図２０に示される原理に従ったＡＴＣＣ（商標）ＭＳＡ－１００２（商標）微生物叢標準配列決定の結果を示す。 ランダムプライマーの伸長およびオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みによるＤＮＡ合成の終結による転写産物の全長をカバーする断片ライブラリの生成を含む、鎖特異的ｍＲＮＡ配列決定ライブラリの調製の基本原理を示す。タグ付けされた断片のライブラリの生成は、第２の鎖合成中に実行される。次いで、タグ付けされたＤＮＡ断片のライブラリは、ＰＣＲプライマーを使用して増幅され得、これにより、順次プラットフォーム特異的アダプター配列が導入される。タグ付けされたＤＮＡ断片の長さは、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの濃度および／または対応する天然のデオキシヌクレオチドに対する比率の調整を介して制御され得る。図２２は、配列番号４１として「ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ」を開示する。 図２２に示す原理に従って調製されたｍＲＮＡ配列決定ライブラリについて算出された遺伝子本体カバレッジを示す。 オリゴ（ｄＴ）逆転写プライマーの伸長およびオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みによるｃＤＮＡ合成の終結による転写産物の３’末端をカバーする断片ライブラリの生成を含む、鎖特異的ｍＲＮＡ配列決定ライブラリの調製の基本原理を示す。次いで、タグ付けされたｃＤＮＡ断片のライブラリは、ジデオキシヌクレオチドにコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーの線形伸長によって前増幅され得る。高いリンカー読み過ごし活性を有するポリメラーゼを採用して実施されるこの手順は、転写産物の検出感度を改善し得る。次いで、プラットフォーム特異的アダプター配列を導入するプライマーを使用したＰＣＲによって最終増幅が実施される。タグ付けされたｃＤＮＡ断片の長さは、逆転写ステップでのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの濃度および／または対応する天然のデオキシヌクレオチドに対する比率の調整を介して制御され得る。オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの濃度および対応する天然のデオキシヌクレオチドに対する比率は、広範囲のＲＮＡ入力量にわたって同様のサイズの挿入物を生成し得る。図２４は、配列番号４１として「ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ」を開示する。 図２４に示す原理に従って調製されたｍＲＮＡ配列決定ライブラリについて算出された遺伝子本体カバレッジを示す。 オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを使用した３’ｍＲＮＡ－ｓｅｑライブラリの調製の結果を示す。（図２６Ａ）は得られたライブラリのＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの電気泳動図を示し、および（図２６Ｂ）は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込み部位から開始する配列決定リードの塩基組成を示す。最初の位置の「Ａ」は、ｄｄＵＴＰ組み込み部位に対応する。 オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの技術を単一細胞ＲＮＡ配列決定ライブラリの調製ワークフローに組み込んだ概念実証実験の結果を示す。図２７Ａは、調製されたライブラリのＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの電気泳動図を示し、図２７Ｂは、検出された転写産物の生物型の分布を示し、図２７Ｃおよび２７Ｄは、それぞれ、細胞バーコード当たりの平均遺伝子数および特有の分子同定子（ＵＭＩ）数の推定を示す。 第２の鎖合成プライマーの伸長およびオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みによるＤＮＡ合成の終結による転写産物の５’末端をカバーする断片ライブラリの生成を含む、鎖特異的ｍＲＮＡ配列決定ライブラリの調製の基本原理を示す。次いで、タグ付けされたＤＮＡ断片のライブラリは、ＰＣＲプライマーを使用して増幅され得、これにより、順次プラットフォーム特異的アダプター配列が導入される。タグ付けされたＤＮＡ断片の長さは、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの濃度および／または対応する天然のデオキシヌクレオチドに対する比率の調整を介して制御され得る。図２８は、配列番号４１として「ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ」を開示する。 は、図２８に示す原理に従って調製されたｍＲＮＡ配列決定ライブラリについて算出された遺伝子本体カバレッジを示す。 オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド配列に含まれるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターから生成されたインビトロ転写産物を示す。約４９ｎｔのＲＮＡ断片のピークは、リンカー部位で合成が終結した転写産物を示し、約９５ｎｔのＲＮＡ断片のピークは、二次構造の影響を受けた同じ転写産物の移動を示す。約６１ｎｔの長さのＲＮＡ断片のピークは、リンカーホッピングで合成された転写産物を示す。約１３８ｎｔのＲＮＡ断片のピークは、二次構造の影響を受けた同じ転写産物の移動を示す。結果は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドに含まれるＴ７プロモーター配列が機能的であり、インビトロ転写開始部位として機能し得ることを示す。 配列番号２４（Ｃｙ５標識）および２７のアラインメントを示す二本鎖を示す。 配列番号２４（Ｃｙ５標識およびビオチン化）および２８のアラインメントを示す二本鎖を示す。 配列番号３１および３２のアラインメントを示す二本鎖を示す。 いくつかの例示的な抗逆転キャップ類似体の構造を示す。 全長配列決定アダプター修飾を含むオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを用いたＰＣＲフリーＲＮＡライブラリの調製の基本原理を示す。得られたライブラリの配列決定時に、予想される構造のリードはｃＤＮＡ断片に対応し、転写産物の予想される部分をカバーする。図３５Ａは、配列番号４２として「ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ」を開示する。 末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によるオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドでの鋳型非依存性ＤＮＡ末端標識化の原理を示す。（Ａ）第２の標識化ステップの前に鋳型ＤＮＡオリゴヌクレオチドを除去しない標識化スキームおよび標識化の結果、ならびに（Ｂ）エキソヌクレアーゼ処理による鋳型鎖の除去時の標識化スキームおよび標識化の結果。 両方の末端に既知の配列を有する複数のＤＮＡ断片を生成するオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド（ＯＴＤＤＮ）での鋳型依存性ＤＮＡ末端標識化の原理を示す（図３７Ａ）。結果は、そのような二重タグ付けの原理が、ライブラリの調製の配列決定に採用できることを示す（図３７Ｂ～３７Ｃ）。 オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド（ＯＴＤＤＮ）の鋳型指向性伸長を介した３’末端標化識核酸の原理を示す。 単一細胞、全トランスクリプトーム解析のための組み合わせバーコーディングワークフローにおけるオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの使用を示す例示的なワークフローの概略図である。ＢＣ＝バーコード、Ｂ＝ビオチン、ＳＡ＝ストレプトアビジン。 Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０，１７６－１８２（２０１８）からのＳＰＬｉＴ－ｓｅｑプロトコルを要約する。Ｐ５およびＰ７は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでの配列決定に関連する配列を表す。ＲＴ＝逆転写、ＳＰＲＩ＝固相可逆固定化、Ｔｎ５＝トランスポザーゼＴｎ５、ＴＳＯ＝鋳型スイッチオリゴヌクレオチド。図４０は、出現順に、それぞれ、配列番号４３、４４、４３、４４、４３、４４、４４および４４を開示する。 従来のＳＰＬｉＴ－ｓｅｑプロトコル（「元のワークフロー」）と比較したオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを使用する現在の組み合わせバーコーディングプロトコル（「ＯＴＤＤＮワークフロー」）を要約する。Ｓ５およびＳ７配列は、増幅中のアダプター追加のためのハンドル配列を表す。Ｐ５、Ｐ７、インデックス５、およびインデックス７は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでの配列決定に関連する配列を表す。ＭＥ＝モザイク末端。 第１（Ａ）および第２（Ｂ）増幅反応後の実施例９に従って本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド（ＯＴＤＤＮ）組み合わせバーコーディングワークフローを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から調製されたＲＮＡのＮＧＳライブラリの調製物のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの電気泳動図である。 実施例９に従って本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド（ＯＴＤＤＮ）組み合わせバーコーディングワークフローを使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製されたＲＮＡのライブラリの調製物のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの電気泳動図である。 オリゴヌクレオチドに結合した抗体を含む、オリゴヌクレオチドが連結された細胞マーカー結合剤（ＯＴＢＡ）を作製するための例示的なスキームを示す。オリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に、５’ハンドル（５’ハンドル）、細胞結合剤インデックス（Ａｂインデックス）、および３’ＯＨを有するポリ（Ａ）配列（ポリＡ３０、配列番号４６）を含む。また、抗体に連結された５’ハンドル配列の鋳型指向性伸長を容易にするための鋳型として使用されるスプリントも示す。図４８は、配列番号４０として「ＰｏｌｙＴ３０」を開示する。 本明細書に記載の組み合わせバーコーディングワークフローを使用して、ＨＥＫ－２９３およびＮＩＨ－３Ｔ３細胞から核酸ライブラリを調製した場合の単一細胞の分解能を示す。ＨＥＫ－２９３およびＮＩＨ－３Ｔ３ライブラリを混合し、ともに処理した。マップされたリードはバーコードで選別され、種ごとにプロットされた。Ｘ軸のバーコードはヒト配列のリード（ヒトリード）であり、Ｙ軸のバーコードはマウス配列のリード（マウスリード）である。軸から外れたバーコードは、同じバーコードを共有する２つ以上の細胞が原因である（つまり、単一細胞の分解能が不足している）。
配列の説明
以下の表により、本明細書で参照される特定の配列のリストが提供される。
Figure 2022537069000011
Figure 2022537069000012
Figure 2022537069000013
本開示は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、それらを作製する方法、およびそれらを使用する方法を提供する。オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは約３～約１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドに連結されたヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを使用して、複数の異なる用途において複数の異なる種類の核酸に既知のオリゴヌクレオチドを標識またはタグ付けし得、これは特有の配列を担持し、バーコード（例えば、細胞または核のバーコード、区画バーコード、インデックスＵＭＩなど）、伸長プライマー、アニーリング部位、または下流用途において使用される特定のプロモーターをコードする配列（Ｔ７プロモーター配列など）として機能し得る。
一実施形態において、ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドに連結されたヌクレオチドを核酸鎖に組み込み、核酸合成開始のための新しいプライミング部位を提供する。連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的なプライマーが提供され、連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングすることが可能になる。ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド上の非天然リンカーを通ってアニーリングされたプライマーを伸長し、それによって新しい核酸鎖を生成し得る。
他の実施形態において、ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドに連結されたヌクレオチドを核酸鎖に組み込み、スプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングするためのユニバーサルハンドル配列を提供する。スプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）連結されたヌクレオチドのユニバーサルハンドル配列にアニーリングすることができる配列および（ｉｉ）所望の配列についての鋳型を含む。ポリメラーゼは、鋳型指向性重合を介して、アニーリングされたスプリントオリゴヌクレオチドを横断して連結されたオリゴヌクレオチドの３’ＯＨを伸長し得、それにより、任意の所望の配列（バーコード、特有の分子同定子、ユニバーサル配列、ランダム配列、特有の分子同定子、プロモーターなど）を組み込み、新しい核酸鎖を生成し得る。
得られた新しい核酸鎖を、さらに操作し得る（例えば、その後の増幅、伸長、ライゲーション、または他の処理を使用して）。例として、得られた新しい核酸鎖を増幅して、および／またはアダプター付加反応に供して、次世代配列決定ライブラリを提供し得る。配列決定ライブラリは、多くの配列決定方法において、様々なプラットフォームにわたって役立つ。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ｄＮＴＰ核酸塩基を介してｄＮＴＰに連結され得る。オリゴヌクレオチドがｄＮＴＰに連結される場合、ヌクレオチドを核酸に複数回組み込むことが可能である（例えば、図１および１２を参照されたい）。あるいは、オリゴヌクレオチドは、ｄｄＮＴＰ核酸塩基を介してｄｄＮＴＰ（ＯＴＤＤＮ）に連結される。オリゴヌクレオチドがｄｄＮＴＰに連結される実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込みは、核酸合成を終結させる（図３を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、「クリック」ケミストリーを使用して調製され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、アジド基とアルキン基との間の（３＋２）環化付加反応、次ぐ１，２，３－トリアゾール環の形成などのクリック反応の結果として、ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰの核酸塩基に連結され、それはオリゴヌクレオチドをｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰと化学的に接合する
いくつかの実施形態において、連結されたオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼによる核酸合成のためのプライミング部位として使用され得る。連結されたオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーは、配列決定のためのアダプターおよび／またはバーコードを付加するために使用される尾部配列を有し得る（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルにハイブリダイゼーションするために使用されるＰ５およびＰ７配列）。
本明細書に記載の実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、標的産物の濃縮を容易にするために親和性タグを修飾され得る。
Ｉ．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド
本アプローチは、オリゴヌクレオチドが修飾されたヌクレオチドの核酸への組み込みに基づく。様々な核酸ポリメラーゼは、それらの核酸塩基に結合したかさ高い基を有する修飾されたヌクレオチドを組み込む能力を有し、そのような修飾されたヌクレオチドは、例えば、ランダム化されたヘキサマーから開始される核酸コピープロセス中に、核酸ポリメラーゼによって成長中の核酸鎖に組み込まれ得る、または末端トランスフェラーゼなどの鋳型非依存性ポリメラーゼによって一本鎖または二本鎖核酸の非常に３’末端に付加されるであろうと期待される（例えば、図１および２を参照されたい）。修飾されたヌクレオチドがそれらの糖部位に３’－ヒドロキシル基を有する場合、コピーされた核酸へのオリゴヌクレオチドを有するヌクレオチドの少なくとも１つおよび任意選択で複数の組み込みが期待される。そのような新たに合成された核酸上に複数のプライミング部位を有することは、例えば、ランダムヘキサマーおよび組み込まれたヌクレオチドに結合した連結されたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（図１）の両方を伸長プライマーとして使用するバイアスのない等温増幅を容易にする。末端トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）で二本鎖ＤＮＡの構造に３’末端において組み込まれたオリゴヌクレオチドを有するヌクレオチドを使用して、完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを反対のＤＮＡ鎖（相補的およびミスマッチのアダプター領域、図２を参照されたい）に付加することができる。適切に設計されたオリゴヌクレオチドを使用することにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを含むがこれに限定されない様々なプラットフォームでの配列決定に適合するＤＮＡ末端を生成することが可能である。
理論に拘束されないが、核酸合成中の修飾されたヌクレオチドの効率的な組み込みは、結合した標識のサイズに大きく依存すると考えられている。例えば、ヌクレオチド複素環式塩基と標識との間の連結基（または複数の基）（すなわち、式（Ａ）の－Ｙ－ＣＸＮ－Ｚ－基）の長さは、組み込みに顕著な影響を及ぼし得る。リンカーは、標識の立体障害およびヌクレオチドの立体構造の変化を低減するのに十分に長い必要がある。同時に、核酸鎖へのバックフォールディングを避けるために十分に短い必要がある。さらに、リンカーの末端官能基は、核酸ポリメラーゼ酵素によって許容される必要がある。適切に設計されたリンカーは、大きな標識を有するヌクレオチドの組み込みを可能にする。
オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが３’－ヒドロキシル基の代わりに３’－Ｈを有する場合（例えば、ジデオキシ修飾されたヌクレオチド）、そのようなオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込みは、核酸合成を終結させる（図３）。オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド（ＯＴＤＤＮ）が合成反応において使用される場合、ランダムに終結した断片のセットが生成される。
例えば、対応する天然のヌクレオチドに対する合成反応におけるＯＴＤＤＮの濃度を、調整することにより、合成（および合成された鎖の長さ）を操作し得る。いくつかの実施形態において、合成反応は、例えば、単一の種類のＯＴＤＤＮ（例えば、ＯＴｄｄＡＴＰ、ＯＴｄｄＴＴＰ、ＯＴｄｄＣＴＰ、ＯＴｄｄＣＴＰ、ＯＴｄｄＵＴＰ）を含む。いくつかの例において、合成反応は、例えば、２つ以上のＯＴＤＤＮの組み合わせ（例えば、ＯＴｄｄＴＴＰおよびＯＴｄｄＣＴＰ、または他の組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態において、反応中に存在する単一の種類のＯＴＤＤＮ（他の天然のヌクレオチドを伴う）が存在し、反応は、例えば、対応する天然のヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態において、反応中に単一の種類のＯＴＤＤＮが存在し、反応は、対応する天然のヌクレオチドと比較して比較的多くの存在するＯＴＤＤＮ、ほぼ等量のＯＴＤＤＮおよび対応する天然のヌクレオチド、または対応する天然のヌクレオチドと比較して比較的少なく存在するＯＴＤＤＮを含む。
伸長反応から（例えば、連結されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションした伸長プライマーから、またはスプリントオリゴヌクレオチドを横断した連結されたオリゴヌクレオチドの伸長から）、またはＯＴＤＤＮを利用する増幅反応から得られる核酸を、さらに操作し得る（例えば、その後の増幅、伸長、ライゲーション、または他の処理を使用して）。例として、次いで、ＯＴＤＤＮを組み込んだ伸長産物を、上記のように下流の操作（例えば、さらなる伸長反応、増幅反応など）に供し得る。いくつかの例において、ＯＴＤＤＮが組み込まれた伸長産物を、プラットフォーム特異的な全長配列決定のアダプターの導入のための下流伸長または増幅（例えば、ＰＣＲ）反応において使用し得る。いくつかの実施形態において、この方法はまた、核酸断片化についての必要性を克服するために使用され得る。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、濃縮を容易にするために、任意選択で親和性標識（例えば、ビオチン修飾された）を含み得る。あるいは、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、他の標識を含み得る。
本開示の方法は、任意のヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの連結、その後の核酸ポリメラーゼを用いた鎖合成中の核酸配列への組み込みを有利に可能にする。したがって、本明細書で提供される方法は、任意の核酸配列組成物の任意の最終（すなわち、例えば、３’末端などの末端）ヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの結合を有利に可能にする。
いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、概して、式（Ａ）による構造、またはその塩を有する。
Figure 2022537069000014
 式中、ＮＢは、核酸塩基であり、オリゴは、３～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、ＸおよびＱの各々は独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｎ３、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、シアノ、アミノ、エステル、およびアミドから選択され、ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択され、ＣＸＮは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ケトン、カーボネート、エステル、エーテル、無水物、アミド、アミノ、アミノアルキル、イミノ、イミド、ジアゾ、カルバメートエステル、ホスホジエステル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルホンアミド、および１～４個のＮ、Ｏ、Ｓ原子、またはそれらの組み合わせを含む複素環式基であって、任意選択で炭素、窒素、または硫黄原子において置換された複素環式基から選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物の塩は、四級アンモニウム塩である。
いくつかの実施形態において、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｎ3、およびアミノから選択される。他の実施形態において、Ｘは、Ｈ、Ｎ3、およびＯＨから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘは、ＯＨである。他の実施形態において、Ｘは、Ｈである。
いくつかの実施形態において、Ｑは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ3である。他の実施形態において、Ｑは、Ｈである。
いくつかの実施形態において、ＸおよびＱは、Ｈである。
オリゴヌクレオチド、「オリゴ」は、以下のＣ１に示されるようにｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰの核酸塩基に５’－リン酸を介して、または以下のＣ２に示されるように核酸塩基（ＮＢ２）を介してヌクレオチドに連結され得る。
Figure 2022537069000015
構造Ｃ１およびＣ２は、式（Ａ）のオリゴがｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰにどのように連結されるかのより詳細な図を提供する。したがって、Ｏｌｉｇｏ＊は、式（Ａ）の化合物に存在する元のオリゴ配列の１ユニットを除くすべてを表す。
「ＣＸＮ」は、結果として中間体がカップリングして、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを形成する、中間体上の官能基間の反応によって形成される基である。
他の実施形態において、反応は、１～４個のＮ、Ｏ、Ｓ原子またはそれらの組み合わせを含む複素環式基を形成し得、複素環式基は、任意選択で炭素、窒素または硫黄原子において置換されている。いくつかの実施形態において、反応は、ｉ）１つのヘテロ原子を有する５員複素環（例えば、ピロール、チオフェン、フラン、ピロリジン、チオラン、テトラヒドロフラン）、ｉｉ）１，２位または１，３位に２つのヘテロ原子を有する５員複素環（例えば、イソオキサゾール、オキサゾール、ピラゾール、イミダゾール、イソチアゾール、チアゾール）、ｉｉｉ）３つのヘテロ原子を有する５員複素環（例えば、トリアゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール）、ｉｖ）１つのヘテロ原子を有する６員複素環（例えば、ピラン、チオピラン、ピリジン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、ピペリジン）、ｖ）２つのヘテロ原子を有する６員複素環（例えば、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ヘキサヒドロピリダジン、ヘキサヒドロピリミジン、ピペラジン、ジオキサン、モルホリン、チアジン、オキサジン、ジチアン）、およびｖｉ）３つのヘテロ原子を有する６員複素環（例えば、トリアジン、ジチアジン、チアジアジン、トリアジナン、オキサチアジン）から選択される複素環式基を形成し得る。
いくつかの実施形態において、ＣＸＮは、各々が１～３個のヘテロ原子を有する５員複素環および６員複素環から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＸＮは、ピロロ、チオフェニル、フラニル、ピロリジニル、チオラニル、テトラヒドロフラニル、イソキサゾリル、オキサゾロ、ピラゾロ、イミダゾリル、イソチアゾロ、チアゾリル、トリアゾロ、オキサジアゾロ、チアジアゾロ、ピラニル、チオピラニル、ピリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ヘキサヒドロピリダジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、モルフォリノ、チアジニル、オキサジノ、ジチアニル、トリアジニル、ジチアジノ、チアジアジノ、トリアジナニル、およびオキサチアジノから選択される。
いくつかの実施形態において、ＣＸＮは、
Figure 2022537069000016
 である。
いくつかの実施形態において、ＺおよびＹは、各々、リンカーまたは連結部分であり、これは、ｄｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとオリゴヌクレオチドとの間の全体的な連結を所望の特性で提供するように変化し得る特定の官能基を指す。いくつかの実施形態において、ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、各ＺおよびＹは、独立して、アミノ、アミド、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。他の実施形態において、Ｙは、アルキレンまたはアルキニレンである。他の実施形態において、Ｚは、アルキニレン、アルキレン、エーテル、およびアミドのうちの１つ以上の組み合わせである。他の実施形態において、Ｚは、（ＣＨ－ＣＨ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2ＣＨ2）ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）5－または－ＨＮ－である。さらに他の実施形態において、－ＮＢ－Ｚ－の組み合わせは、
Figure 2022537069000017
 またはＮＢ－ＨＮ－Ｌ1－、－ＮＢ－（ＣＨ－ＣＨ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2ＣＨ2）ＮＨＣ（Ｏ）－Ｌ1）であり、Ｌ1は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、およびポリアルキレングリコールから選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物は、式（Ｂ１）～（Ｂ４）の化合物
Figure 2022537069000018
 およびそれらの塩から選択され、式中、オリゴ＊は、オリゴ基由来の残りの２～９９ヌクレオチドであり、ＮＢ２は、核酸塩基であり、Ｌ1は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、およびポリアルキレングリコールから選択され、Ｌ2は、アルキレンまたはアルキニレンである。
いくつかの実施形態において、ＣＸＮは、クリックケミストリーを使用して作製された、本明細書に記載のうちの１つ以上の基を含む。
いくつかの実施形態において、連結基Ｚは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、およびポリアルキレングリコールから選択されるＬ1の亜群を含む。他の実施形態において、Ｌ1は、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、Ｃ２－Ｃ１２アルケニレン、Ｃ２－Ｃ１２アルキニレン、および２～８グリコール単位を有するポリアルキレングリコールである。他の実施形態において、Ｌ1は、２グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ２）、４グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ４）、または６グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ６）、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、イソプロピレン、１－ブチレン、シス－２－ブチレン、トランス－２－ブチレン、イソブチレン、１－ペンチレン、シス－２－ペンチレン、トランス－２－ペンチレン、イソペンチレン、およびヘキシレンから選択される。さらに他の実施形態において、Ｌ1は、－ＣＨ2－、－（ＣＨ2）3－、－（ＣＨ2）5－、ＰＥＧ２、およびＰＥＧ４から選択される。
いくつかの実施形態において、連結基Ｙは、アルキレンまたはアルキニレンから選択されるＬ2の亜群を含む。他の実施形態において、Ｌ2は、Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルキニレンである。他の実施形態において、Ｌ2－オリゴの組み合わせは、－（ＣＨ2）4－オリゴまたは－（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ－オリゴから選択される。オリゴヌクレオチド、「オリゴ」は、ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰの核酸塩基に５’－リン酸を介して、または核酸塩基（ＮＢ２）を介してヌクレオチドに連結され得る。
ＮＢおよびＮＢ２は、独立して、核酸塩基である。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アデニン、７－デアザアデニン、シトシン、グアニン、７－デアザグアニン、チミン、ウラシルおよびイノシンから選択される。ＮＢ２は、オリゴ基の単一ヌクレオチドであるため、ＮＢ－オリゴ＊の組み合わせはオリゴである。
いくつかの実施形態において、ＮＢは、ピリミジンであり、ピリミジンは、核酸塩基の５位でオリゴヌクレオチドに連結される。他の実施形態において、ＮＢは、プリンであり、プリンは、核酸塩基の７位でオリゴヌクレオチドに連結される。
本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、概して、式（Ｉ）による構造、またはその塩を有する。
Figure 2022537069000019
式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、またはＮ3であり、ＮＢは、核酸塩基を表し、ＺおよびＹは、リンカーであり、オリゴは、３～１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを表し、クリックは、ＺおよびＹリンカーに共有結合で結合するクリック反応の反応産物を表す。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アデニン、７－デアザアデニン、シトシン、グアニン、７－デアザグアニン、チミン、ウラシルおよびイノシンから選択される。いくつかの実施形態において、ＺおよびＹは、各々独立して、結合、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの連結部位を含む。
あるいは、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、非環式（Ｉ’）であり得る。
Figure 2022537069000020
クリック反応産物は、銅触媒によるアジド－アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）、銅を含まないクリックケミストリーとしても知られるひずみ促進アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）、ひずみ促進アルキン－ニトロン付加環化（ＳＰＡＮＣ）、アルキンヒドロチオール化、およびアルケンヒドロチオール化などの反応産物を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、クリック反応は、アジドおよびアルキンの（３＋２）付加環化反応であり、その結果、１，２，３－トリアゾールが生じる。反応産物は、トリアゾール産物を提供し、それにより式（ＩＩ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、またはその塩を提供する。
Figure 2022537069000021
 式中、Ｘ、ＮＢ、Ｚ、Ｙおよびオリゴは、上記で定義されたとおりである。式（ＩＩ）において、ＺおよびＹのうちの一方が、トリアゾールの１位に共有結合で結合し、ＺおよびＹのうちの他方が、トリアゾールの４または５の位置に共有結合で結合する。一実施形態において、Ｘは、ＯＨであり、別の実施形態において、Ｘは、Ｈであり、さらに別の実施形態において、Ｘは、Ｎ3である。
いくつかの実施形態において、リンカーＺおよび／またはＹは、炭素ベースの鎖、例えば、線状または分岐状であり得る１～１２個の炭素原子を有するアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態において、アルキレンは、直鎖または分岐のＣ1－Ｃ6、アルキレンである。リンカーＺおよび／またはＹはまた、２～１２個の炭素を有する直鎖または分岐のアルケニレンを含み得る。あるいは、アルケニレンは、直鎖または分岐ＣのＣ2－Ｃ6アルケニレンである。いくつかの実施形態において、リンカーＺおよびＹは、２～１２個の炭素の直鎖または分岐のアルキニレン鎖を含む。いくつかの実施形態において、アルキニレンは、直鎖または分岐のＣ2－Ｃ6、アルキニレンである。
いくつかの実施形態において、Ｚおよび／またはＹは、２～２０のアルキレングリコール単位を有するポリアルキレングリコールを含み、他の実施形態において、ポリアルキレングリコールは、２～８のアルキレングリコール単位を有する。いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコールは、２、４、または６～８個のグリコール単位を有する。適切なアルキレングリコール単位は、エチレングリコール、１，２－プロパンジオール、１，２－ブチレングリコールなどを含む。
オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、より具体的には、式（ＩＩＩ）の構造、またはその塩を有し得る。
Figure 2022537069000022
式中、Ｌ1およびＬ2は、各々独立して、アルキレン、アルキニレン、ポリアルキレングリコール、またはそれらの任意の組み合わせを含むリンカーである。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、式（ＩＩＩ）の構造、またはその塩を有し得、式中、Ｌ1は、アルキレン、ポリアルキレングリコール、またはそれらの組み合わせを含むリンカーであり、Ｌ2は、２～１２個の炭素を有するアルキニレンを含むリンカーである。より具体的には、Ｌ2は、ヘキシニルである。ポリアルキレングリコールは、２～６個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールであり得る。別の実施形態において、Ｌ1は、１～１２個の炭素原子を有するアルキレンを含む。より具体的には、アルキレンは、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、イソプロピレン、１－ブチレン、シス－２－ブチレン、トランス－２－ブチレン、イソブチレン、１－ペンチレン、シス－２－ペンチレン、トランス－２－ペンチレン、イソペンチレン、またはヘキシレンである。
あるいは、銅を含まないクリックケミストリーとしても知られるひずみ促進アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）を使用してオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを生成する場合、得られる本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、概して式（ＩＶ）による構造またはその塩を有する。
Figure 2022537069000023
式中、Ｘは、ＨまたはＯＨまたはＮ3であり、ＮＢは、核酸塩基を表し、ＺおよびＹは、リンカーであり、オリゴは、３～１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを表す。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アデニン、７－デアザアデニン、シトシン、グアニン、７－デアザグアニン、チミン、ウラシルおよびイノシンから選択される。いくつかの実施形態において、ＺおよびＹは、各々独立して、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの連結部位を含む。
あるいは、いくつかの実施形態において、アジド修飾をヌクレオチドの３’位置に導入することができ、したがって、オリゴヌクレオチドをヌクレオチドの３’位置（ＶおよびＶＩ）に共有結合で連結し得る。
Figure 2022537069000024
ＮＢは、核酸塩基を表し、Ｙは、リンカーであり、オリゴは、３～１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを表す。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アデニン、７－デアザアデニン、シトシン、グアニン、７デアザグアニン、チミン、ウラシルおよびイノシンから選択される。いくつかの実施形態において、ＺおよびＹは、各々独立して、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｃ）－、－ＮＨ－、－Ｓ－、－Ｏ－、アルキル、アルケニル、およびアルキニル、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの連結部位を含む。
本開示のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、ピリミジン核酸塩基を含む。これらの実施形態において、ピリミジン核酸塩基は、ピリミジンの５位でオリゴヌクレオチドに結合される（例えば、化合物Ｅ１を参照されたい）。あるいは、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドがプリン塩基を含む場合、プリン核酸塩基は、核酸塩基の７位でオリゴヌクレオチドに結合される。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、５’末端のリン酸基にＣ６（ヘキシニル）－アルキンモチーフを有するオリゴヌクレオチドを使用して得られる（例えば、化合物Ｅ２を参照されたい）。
Figure 2022537069000025
本開示のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの塩は、四級アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などを含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、その５’末端でヌクレオチドに連結される。いくつかの実施形態において、アルキン修飾は、８個の炭素原子のスペーサーを介してオリゴヌクレオチド核酸塩基に付加され、「Ａｌｄ」修飾と称されるか、あるいは、アルキン基は、ヘキシニルリンカーを介してオリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸に結合される。本説明全体で使用されているように、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが「Ａｌｄ」を有することが示される場合（例えば、ｄｄＵＴＰ－ＡｌｄＵ－［オリゴヌクレオチド配列］）、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの核酸塩基に８個の炭素原子のスペーサーを介して結合したアルキン基の反応中にヌクレオチドに連結された（共有結合で連結された）と理解される。あるいは、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが「ＨＥＸＹＮＹＬ」を有することが示される場合（例えば、ｄｄＵＴＰ－ＨＥＸＹＮＹＬ－［オリゴヌクレオチド配列］）、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸にヘキシニルリンカーを介して結合したアルキン基の反応中にヌクレオチドに連結された（共有結合で連結された）と理解される。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドは、例えば、その３’末端に修飾を有する。いくつかの例において、修飾は、ビオチン、リン酸、アミン、またはホスホロチオエート修飾である。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。
連結されたオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが使用される方法に依存する。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドは、３～１００ヌクレオチド、１０～１００ヌクレオチド、１０～５０ヌクレオチド、または２０～４０ヌクレオチドである。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドは、１００ヌクレオチド超の長さ、例えば、最大１０００ｎｔであり得る。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、任意の特定の配列に限定されない。むしろ、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、バーコード配列、アダプター配列、特有の分子同定子、インデックス配列、ポリメラーゼのアニーリング部位、ハンドル配列、ユニバーサルハンドル、ユニバーサル配列など、ランダム配列、標的特異的配列、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの例において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、式Ｂ１およびＢ３の化合物から選択され、式中、Ｘは、ＯＨであり、Ｑは、Ｈであり、Ｌ1は、Ｃ１アルキレン、Ｃ３アルキレン、Ｃ５アルキレン、２グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ２）、または４グリコール単位のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４）であり、Ｌ2は、Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの例において、Ｌ2－オリゴの組み合わせは、（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ－オリゴである。
いくつかの例において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、式Ｂ２およびＢ４の化合物から選択され、式中、Ｘは、ＯＨであり、Ｑは、Ｈであり、Ｌ1は、Ｃ１アルキレン、Ｃ３アルキレン、Ｃ５アルキレン、２グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ２）、または４グリコール単位のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４）であり、Ｌ2は、Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの例において、Ｌ2－オリゴの組み合わせは、－（ＣＨ2）4－オリゴである。
いくつかの例において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、式Ｂ１およびＢ３の化合物から選択され、式中、Ｘは、Ｈであり、Ｑは、Ｈであり、Ｌ1は、Ｃ１アルキレン、Ｃ３アルキレン、Ｃ５アルキレン、２グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ２）、または４グリコール単位のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４）であり、Ｌ2は、Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの例において、Ｌ2－オリゴの組み合わせは、（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ－オリゴである。
いくつかの例において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、式Ｂ２およびＢ４の化合物から選択され、式中、Ｘは、Ｈであり、Ｑは、Ｈであり、Ｌ1は、Ｃ１アルキレン、Ｃ３アルキレン、Ｃ５アルキレン、２グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ２）、または４グリコール単位のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４）であり、Ｌ2は、Ｃ１－１２アルキレンまたはＣ１－１２アルキニレンである。いくつかの例において、Ｌ2－オリゴの組み合わせは、－（ＣＨ2）4－オリゴである。さらなる例示的なオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、式Ｂ１およびＢ３の化合物から選択され、式中、Ｘは、Ｈであり、Ｑは、Ｈであり、Ｌ１は、Ｃ１アルキレンであり、Ｌ2－オリゴの組み合わせは、（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ－オリゴであり、ＮＢおよびＮＢ２は、独立して、チミン、アデニン、グアニン、シトシン、またはウラシルから選択される。さらなる例示的なオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、式Ｂ２およびＢ４の化合物から選択され、式中、Ｘは、Ｈであり、Ｑは、Ｈであり、Ｌ1は、Ｃ１アルキレンであり、Ｌ2－オリゴの組み合わせは、（ＣＨ2）4－オリゴであり、ＮＢおよびＮＢ２は、独立して、チミン、アデニン、グアニン、シトシン、またはウラシルから選択される。
以下のリストにより、いくつかのさらに代表的なオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを提供される。
Figure 2022537069000026
Figure 2022537069000027
Figure 2022537069000028
Figure 2022537069000029
ＩＩ．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの作製方法
オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを調製するために様々な戦略を使用することができ、請求された組成物およびそれらを使用する方法は、これらの有用な化合物を作製する方法のいずれの説明によっても制限されない。
Ａ．核酸修飾におけるクリックケミストリー
「クリックケミストリー」という用語は当技術分野でよく理解されており、概して、容易に精製され、位置特異的である速い反応を指す。クリックケミストリーは、選択した基質と特定の分子との接合を可能にする反応のクラスである。クリックケミストリーは単一の特定の反応ではないが、事実上の例に従う産物を生成する方法をし、これは、小さなモジュラーユニットを接合することによって物質も生成する。多くの用途において、クリック反応は、生体分子およびレポーター分子を接合する。クリックケミストリーは、生物学的条件に限定されない。「クリック」反応の概念は、薬理学的および様々な生体模倣用途で使用されてきた。しかしながら、それらは生体分子の検出、位置特定、および認定に特に有用になっている。古典的なクリック反応は、銅触媒によるアジドとアルキンとの反応であり、５員のヘテロ原子環を形成する、Ｃｕ（Ｉ）触媒によるアジド－アルキン付加環化反応（ＣｕＡＡＣ）である。ひずみ促進アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）または銅を含まない反応、ひずみ促進アルキン－ニトロン付加環化（ＳＰＡＮＣ）、アルキンヒドロチオール化、およびアルケンヒドロチオール化を含むさらなるの反応が当技術分野で知られており、本開示のＣＸＮ基を作成するのに有用である。
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「接触する」、「添加する」、「反応する」、「処理する」などの用語は、ある反応物、試薬、溶媒、触媒、反応性基などを別の反応物、試薬、溶媒、触媒、反応性基などと接触させることを意味する。反応物、試薬、溶媒、触媒、反応性基などは、個別に、同時に、または別々に添加され得、所望の結果を達成する任意の順序で添加され得る。それらは、加熱または冷却装置の存在下または非存在下で添加され得、任意選択で不活性雰囲気下で添加され得る。
本出願の場合、クリック反応はヌクレオチドに対して行われ、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを産生し、これは、さらなる用途を妨害する可能性のある未反応のクリック反応前駆体および他の残基を除去する必要がなくなる。本明細書に提示される方法はまた、ＤＮＡ合成終結（これは断片化と同様の効果を有し、合成終結反応の結果は異なるより短いＤＮＡ断片のセットである）およびタグ付けが単一のステップで実行されるのでワークフローを単純化するという利点を有する。
いくつかの実施形態において、本開示によるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを調製するための方法は、第２の官能基とのクリック反応を受けることができる第１の官能基に共有結合で結合したヌクレオチドを提供すること、クリック反応を受けることができる第２の官能基に共有結合で結合したオリゴヌクレオチドを提供することを含み、第１および第２の官能基は、それぞれ、以下の対、アルキニルおよびアジド、アジドおよびアルキニル、チオールおよびアルキニル、アルキニルおよびチオール、チオールおよびアルケニル、アルケニルおよびチオール、アジドおよびシクロオクタニル、シクロオクタニルおよびアジド、ニトロンおよびシクロオクタニル、シクロオクタニルおよびニトロンから選択され、銅触媒および銅（Ｉ）配位子の存在下でヌクレオチドをオリゴヌクレオチドと接触させて、クリック反応産物を形成することを含む。
特定の実施形態において、方法は、１，２，３－トリアゾールを形成するためのアジドおよびアルキンのクリック反応を含む。アジドおよび末端または内部アルキンは、１，３－双極子付加環化（Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化）反応を受け、１，２，３－トリアゾールを生成し得る。しかしながら、この反応には長い反応時間と高温が必要である。あるいは、アジドおよび末端アルキンは、室温で銅（Ｉ）触媒によるアジド－アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）を受け得る。そのような銅（Ｉ）触媒によるアジド－アルキン付加環化は、「クリックケミストリー」としても知られ、Ｈｕｉｓｇｅｎ １，３－双極付加環化のバリアントであり、有機アジドおよび末端アルキンが反応して１，２，３－トリアゾールの１，４－位置異性体が得られる。「クリック」ケミストリー反応の例は、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００５年１０月６日に公開された米国特許出願公開第２００５／０２２２４２７号、ＰＣＴ／ＵＳ０３／１７３１１、Ｌｅｗｉｓ Ｗ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ’ｌ Ｅｄ．４１（６）：１０５３、Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｅｄ．２００１，４０：２００４－２０２１においてレビューされた方法）によって説明されており、化合物のライブラリを作成するために、（炭素－炭素結合とは対照的に）ヘテロ原子結合で相互に高収率で反応し、副反応がほとんどない試薬を開発した。
標識（レポーター基、固体支持体または担体分子）を核酸にコンジュゲートさせるために本明細書に記載の方法において使用される「クリックケミストリー」反応のための触媒として使用される銅は、Ｃｕ（Ｉ）還元状態にある。そのような銅（Ｉ）触媒によるアジド－アルキン付加環化において使用される銅（Ｉ）の供給源は、臭化第一銅またはヨウ化第一銅などのハロゲン化第一銅を含むがこれらに限定されない任意の第一銅塩であり得る。しかしながら、この位置選択的付加環化は、金属触媒および還元剤の存在下でも実施され得る。
特定の実施形態において、銅は、還元剤の存在下で、Ｃｕ（ＩＩ）還元状態で（例えば、Ｃｕ（ＮＯ3）2、Ｃｕ（ＯＡｃ）2、またはＣｕＳＯ4などであるがこれらに限定されない塩として）提供され得、Ｃｕ（ＩＩ）の還元によってＣｕ（Ｉ）がインサイチュで形成される。このような還元剤は、アスコルビン酸塩、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２．４．６－トリクロロフェノール（ＴＣＰ）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ硫酸塩、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、または印加電位を含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、還元剤は、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈ、およびＷから選択される金属を含む。特定の実施形態において、還元剤はアスコルビン酸塩である。
いくつかの実施形態において、アジドおよびアルキンの（３＋２）付加環化は、配位子の存在下で実施される。理論に拘束されないが、配位子はＣｕ（Ｉ）イオンを安定化し、それによってＣｕ（ＩＩ）イオンへの酸化を防ぐと考えられている。例えば、配位子は、３－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル］プロパノール（ＢＴＴＰ）、３－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル］硫酸水素プロピル（ＢＴＴＰＳ）、２－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル］エチル水素硫酸塩（ＢＴＴＥＳ）、バソフェナントロリン二スルホン酸二ナトリウム塩（ＢＴＴＡＡ）、Ｎε－（（１Ｒ，２Ｒ）－２－アジドシクロペンチルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＢＰＳ）、ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、トリス（２－ベンズイミダゾリルメチル）アミン（（ＢｉｍＨ）３）トリス－（ベンジルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＢＴＡ）、またはトリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）から選択され得る。特定の実施形態において、リガンドは、ＴＨＰＴＡである。
核酸を標識化するための銅（Ｉ）触媒によるアジド－アルキン付加環化は、水、ならびに、水と、アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ｔｅｒｔ－ブタノール（ｔＢｕＯＨ）およびアセトンを含む様々な（部分的に）混和性有機溶媒との混合物を含む様々な溶媒中で実施され得る。
いくつかの実施形態において、ＣＸＮを形成するクリック反応は、ｉ）アルキニル基とアジド基との間の反応である。
アジド中間体は、図７および図８に示される方法を使用して調製され得る。様々なｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰ出発物質が市販されている。いくつかの実施形態において、以下のＤ１およびＤ２のアジド中間体が提供され、式中、ＮＢ、Ｌ1、ＸおよびＱは、本明細書に記載のとおりである。
Figure 2022537069000030
Ｄ２のアジド中間体は、例えば、図７および８に示される方法の原理スキームを使用して、適切な構造の出発物質を使用して、調製され得る。
中間アルキン化合物の例、Ｃ３およびＣ４は、市販されており
Figure 2022537069000031
 式中、ＮＢ２、Ｌ2、およびオリゴ＊は、本明細書に記載のとおりである。
オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、例えば、図９および図１０に示される方法を使用して、上記のアジド中間体および中間体アルキン化合物から調製され得る。様々なｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰ出発物質が市販されている。図９および１０は、中間体アルキン化合物Ｃ４およびＤ１のアジド中間体が使用される場合の例示的な調製方法を示す。あるいは、中間体アルキン化合物Ｃ３およびＤ１のアジド中間体、またはＣ３およびＤ２、またはＣ４およびＤ２の組み合わせを、例示されるような反応において使用して、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを調製し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを調製するための方法であり、方法は以下を含む。
ａ．第２の官能基とのクリック反応を受けることができる第１の官能基に共有結合で結合したヌクレオチドを提供すること、クリック反応を受けてトリアゾール環を形成することができる第２の官能基に共有結合で結合したオリゴヌクレオチドを提供すること、ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドと接触させてクリック反応産物を形成すること。
第１および第２の官能基は、それぞれ、以下から選択される。
ｉ）アルキニルおよびアジド、
ｉｉ）アジドおよびアルキニル、
ｉｉｉ）チオールおよびアルキニル、
ｉｖ）アルキニルおよびチオール、
ｖ）チオールおよびアルケニル、
ｖｉ）アルケニルおよびチオール、
ｖｉｉ）アジドおよびシクロオクタニル、
ｖｉｉｉ）シクロオクタニルおよびアジド、
ｘｉ）ニトロンおよびシクロオクタニル、ならびに
ｘｉｉ）シクロオクタニルおよびニトロン。
いくつかの実施形態において、第１および第２の官能基は、それぞれ、ｉ）アルキニルおよびアジド、ならびにｉｉ）アジドおよびアルキニルから選択される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、銅触媒および銅（Ｉ）配位子の存在下でヌクレオチドをオリゴヌクレオチドと接触させて、１，２，３－トリアゾールを形成することを含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたは３’－デオキシリボヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、銅触媒は、銅（Ｉ）または銅（ＩＩ）を含み、触媒が銅（ＩＩ）である場合、還元剤が存在する。他の実施形態において、銅触媒はＣｕ（ＮＯ3）2Ｃｕ（ＯＡｃ）、ＣｕＳＯ4またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態において、還元剤は、アスコルビン酸塩、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２．４．６－トリクロロフェノール（ＴＣＰ）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ硫酸塩、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、印加電位、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈ、Ｗ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態において、還元剤は、アスコルビン酸ナトリウムを含む。
いくつかの実施形態において、銅（Ｉ）配位子の配位子は、トリス（ベンジルトリアゾリルメチル）アミンを含む。
ＩＩＩ．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの使用方法
オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド連結を有するヌクレオチドが合成反応（例えば、伸長反応、増幅反応、ＴｄＴ反応など）から形成される核酸に組み込まれ得るように核酸合成反応における試薬として使用され得る。有利なことに、これにより、直接的に、すなわち、オリゴヌクレオチドに連結されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが機能的配列を提供する場合、または間接的に、例えば、本明細書でさらに説明するように、様々な機能的配列の付加を可能にする配列を提供することによって、様々な種類の機能的配列（例えば、配列決定アダプター、プロモーター配列、バーコード、特有の分子同定子、ハンドル配列など）の組み込みを可能にする。
したがって、本明細書で提供される態様は、核酸、例えば、試料核酸または試料ポリヌクレオチドに特定のオリゴヌクレオチド配列を直接タグ付けするためのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの使用を開示する。
例えば、ポリヌクレオチド試料から核酸のライブラリを生成するための方法が提供される。そのような方法は、以下のステップを含み得る。
ａ．第１の伸長プライマーを１つ以上の試料ポリヌクレオチドまたは試料核酸にアニーリングするステップ、
ｂ．１つ以上の試料ポリヌクレオチドまたは試料核酸を、核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのヌクレオチド、および本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを含む第１の伸長産物を形成するステップ、
ｃ．連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマーをアニーリングして、第２のアニーリングされた複合体を形成するステップ、
ｄ．第２のアニーリングされた複合体を核酸ポリメラーゼと接触させて、連結されたオリゴヌクレオチドから核酸分子を産生し、
それにより、その末端の少なくとも１つが連結されたオリゴヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドのライブラリを産生するステップ。
いくつかの実施形態において、第１の伸長プライマーは、ユニバーサル配列を含み、それにより、その末端にユニバーサル配列および連結されたオリゴヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドのライブラリが産生される。（図３を参照されたい）。いくつかの実施形態において、第１の伸長プライマーはユニバーサル配列を含み、第２のプライマーはユニバーサル配列を含み、それにより、その末端にユニバーサル配列および連結されたオリゴヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドのライブラリが産生される。いくつかの実施形態において、第１および第２のプライマーは、異なるユニバーサル配列を含む。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、第１の伸長プライマーを試料ポリヌクレオチドにアニーリングするステップの前に断片化される。
上記の方法において、核酸は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドおよびその対応する未修飾の天然のヌクレオチドの組み合わせを使用することにより、所定の位置またはランダムな位置で特定のオリゴヌクレオチド配列をタグ付けされ得る。オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのランダムな組み込みの頻度は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドおよび対応する天然のヌクレオチドのモル比の調整を介して制御され得る。
第１の伸長プライマーがユニバーサル配列およびランダム配列を含むいくつかの態様において、方法は、全ゲノムまたは全トランスクリプトーム配列決定に有用であり得る。他の実施形態において、第１のプライマーが特定のプライマーを含む場合、この方法は、標的化されたＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定に有用であり得る。
他の例において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを使用して、例えば鋳型依存性様式で、バーコード、特有の分子同定子、ハンドル、および／または配列決定アダプターなどの情報の追加を容易にすることができる。したがって、いくつかの実施形態において、鋳型依存的様式で核酸配列を試料ポリヌクレオチドに付加する方法が提供される。方法は、（ａ）第１のプライマーを１つ以上の試料ポリヌクレオチドまたは試料核酸にアニーリングするステップ、（ｂ）１つ以上の試料ポリヌクレオチドまたは試料核酸を、核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのヌクレオチド、および本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド（ＯＴＤＤＮ）と接触させ、３’末端にＯＴＤＤＮが組み込まれた１つ以上の試料ポリヌクレオチドまたは試料核酸の少なくとも一部のコピーを含む第１の伸長産物を形成するステップを含み得る。伸長産物を、（ｉ）ＯＴＤＤＮのオリゴヌクレオチド部分にハイブリダイゼーションする配列、および（ｉｉ）ポリメラーゼおよびヌクレオチド（第１の伸長反応から存在しても存在しなくてもよい）の存在下での所望の追加の配列のための鋳型を含むスプリントオリゴヌクレオチドと接触させることによって、必要な情報を第１の伸長産物の３’末端に追加し得、それにより第２の伸長産物を産生する。この手段により、バーコード、インデックス、特有の分子同定子、アダプター（例えば、配列決定アダプター）、ハンドル配列、プロモーター配列、またはそれらの任意の組み合わせ、または他の任意の所望の配列などの所望の追加配列が、第１の伸長産物の連結されたオリゴヌクレオチドの３’末端に付加される。
いくつかの例において、スプリントオリゴヌクレオチドは、スプリントの３’末端からの伸長を防止するブロッキング基を含むことができる。例えば、スプリントは、３’アミノ、３’リン酸、ジデオキシ、または伸長を妨げる他の修飾を含み得る。いくつかの例において、スプリントオリゴヌクレオチドは、スプリントオリゴヌクレオチドの精製を可能にする機能的部位（例えば、ビオチン／ストレプトアビジンなどの同種の捕捉部位に特異的に結合する結合部位）を含み得る。
試料ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子などであり得る。いくつかの実施形態において、試料ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、試料ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、試料ポリヌクレオチドは、目的の分子（例えば、抗体またはその断片、アプタマーなどの細胞結合剤）に連結された（例えば、共有結合または非共有結合で連結した）オリゴヌクレオチドである。
試料核酸または試料ポリヌクレオチドにアニーリングする第１のプライマーは、伸長条件下で試料ポリヌクレオチドにアニーリングすることを可能にするハイブリダイゼーション配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション配列は、ｍＲＮＡへの第１の伸長プライマーの結合を可能にするポリ（Ｔ）尾部であり得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション配列は、試料ポリヌクレオチドへの第１の伸長プライマーの非選択的結合を可能にするランダム配列（例えば、ランダムヘキサマーなど）であり得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション配列は、（例えば、特定の標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを可能にする）標的特異的配列であり得る。いくつかの実施形態において、試料核酸または試料ポリヌクレオチドを、１種より多くのハイブリダイゼーション配列を含む第１のプライマー（例えば、ポリ（Ｔ）ハイブリダイゼーション配列を有する第１の伸長プライマーおよびランダムヘキサマーなどのランダムハイブリダイゼーション配列を有する第１の伸長プライマーの混合物）と接触させる。
図３８は、本明細書に記載のオリゴテザーヌクレオチドを使用して、末端プライマー伸長産物の３’末端への遺伝情報の付加を容易にできる方法を示す例示的なワークフローを示すスキームを示す。図３８は、試料ポリヌクレオチドがｍＲＮＡであるワークフローを例示しているが、ワークフローは、試料ヌクレオチドがＤＮＡ（例えば、ｇＤＮＡ）、目的の分子（例えば、図４４に示されるような細胞マーカー結合剤）に連結されたオリゴヌクレオチドである状況で使用され得る。
いくつかの実施形態において、本方法は、任意選択で、少なくとも１つのクリーンアップステップを実行することを含む。
上記の方法において使用され、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、１ｆｍｏｌ～１０μｍｏｌの範囲であり得る。特定の状況において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド対対応する天然のヌクレオチドの比率は、１：１～１：１０００の範囲である。例えば、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド対対応する天然のヌクレオチドの比率は、１：１０、１：５０、または１：１００である。いくつかの実施形態において、試料を、オリゴヌクレオチドが連結されたチミン、アデニン、グアニン、シトシン、またはウラシルヌクレオチドのうちの２つ以上と接触させる。
上記の方法において、単一のポリメラーゼを使用し得る。あるいは、２つの異なるポリメラーゼを使用し得、第１のポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを組み込むためのものであり、第２のポリメラーゼは、プライマーの伸長／読み過ごしのためのものである。ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを組み込み、組み込まれたオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの非天然リンカーを読み過ごし、および／またはプライマー／オリゴヌクレオチドを伸長する間のポリメラーゼ反応は、ポリメラーゼ活性に適した条件下で実施され得る。例えば、プライマー／鋳型系、ポリメラーゼ反応緩衝液、インキュベーション温度およびインキュベーション時間は、対応するポリメラーゼについて典型的推奨されるとおりであり得る。
別の実施形態において、ＴｄＴは、鋳型非依存性様式で、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡの３’末端に単一のオリゴヌクレオチドに連結されたジデオキシヌクレオチドを組み込む。このような手段により、例えば、ＮＧＳなどのためのアダプターを、試料核酸に付加することができる。いくつかの実施形態において、ＯＴＤＤＮのオリゴヌクレオチド配列は、第１のアダプター配列を含み得る。第１のアダプター配列に部分的に相補的である第２のアダプターは、アニーリングされ、鋳型核酸にライゲーションされ得る。（例えば、図２を参照されたい）。結果として得られるライブラリは両端にアダプターを有し、アダプターには相補的および不一致の領域を有する。ライブラリはさらに増幅され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法におけるヌクレオチドに連結されたオリゴヌクレオチド（または本明細書に記載の間接的に試料ポリヌクレオチドに付加されるオリゴヌクレオチド）は、Ｔ７プロモーター配列を含む。そのように本明細書で提供されるのは、試料核酸またはポリヌクレオチドにインビトロ転写開始部位を導入する手段である。
上記の本明細書に記載の方法はまた、単一細胞または核配列決定の用途に使用され得る。オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの使用は、例えば、単一細胞または核に由来する核酸の前増幅の必要性を排除することによって、ウェルまたはチューブなどの従来の区画中では実施されない単一細胞または核配列決定法を改善し得る。例えば、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを使用して、組織試料のトランスクリプトームの、ゲノムの、およびタンパク質学のデータを空間的に分解するために使用される方法を改善し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、大きなゲノムの分析に有用であり得る。遺伝子末端を標的とし、外側を向いている特定のプライマーは、ゲノムコンテキストの分析のためにオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの技術を採用するように設計され得る。この原理は、既知の特定の遺伝子座の近くにある未知の配列領域を調査することを目的とした任意の実験系に適用できる。
別の例として、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、以下を含む核酸にオリゴヌクレオチドをタグ付けするための方法において使用され得る。
ｅ．プライマーを核酸にアニーリングすること、
核酸を本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、およびポリメラーゼと接触させ、それにより、タグ付けされた核酸を産生すること。
いくつかの実施形態において、接触は、核酸を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、オリゴヌクレオチドに連結されていない少なくとも１つのヌクレオチド、およびポリメラーゼと接触させることを含む。
いくつかの実施形態において、単一の種類のオリゴヌクレオチドに連結されたヌクレオチドの組み込みが実施される。他の実施形態において、複数の異なるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込みが望ましい。
いくつかの用途では、方法は、核酸の５’末端および／または３’末端にアダプター配列を付加する（例えば、ライゲーションする）ことを含む。方法はまた、タグ付けされた核酸を、例えば、インデクシングＰＣＲなどのＰＣＲによる増幅に供することをさらに含み得る。
オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの両方を含む、異なる種類の核酸の合成反応において採用され得る。いくつかの例において、ギャップファイリング反応またはニック翻訳中に、核酸がオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドでタグ付けされる。例えば、二本鎖ＤＮＡは、ニック翻訳またはギャップ充填反応中にオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みにより、事前に設計された特定の配列タグによってランダムに標識化される（図４）。オリゴヌクレオチドの組み込みの頻度は、ＤＮＡニッキング率の調整（例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ処理時間を変更することによって）を介して制御され得る。得られたポリヌクレオチドライブラリは、３’末端に事前に設計されたタグを有するであろう。平均断片長はニッキング率を介して制御されるため、タグ付けは、ニック翻訳またはギャップ充填反応混合物において、単一の天然のヌクレオチドをオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドで完全に置換することによって実行され得る。
ＤＮＡ末端標識化：末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によるオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みを介して、事前に設計された配列での鋳型非依存性ＤＮＡ ３’末端標識化が達成される。この目的のために、ジデオキシヌクレオチドに連結されたオリゴヌクレオチドは、伸長されないように、ブロックされた３’末端（例えば、３’リン酸または３’アミノ修飾、またはジデオキシヌクレオチドを有する）を有し得る。標識化の第１のラウンドの後、コンジュゲーションリンカーを読み過ごすことができる任意のポリメラーゼによるジデオキシヌクレオチドにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドからのプライマー伸長時に相補鎖が合成される。次いで、新たに合成された鎖がアクセス可能な３’末端を有するので、ＤＮＡ末端標識化の第２のラウンドが実施される（図５）。
ＲＮＡ末端標識化。任意の事前に設計された配列での鋳型非依存性のＲＮＡ ３’末端標識化は、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みを介して達成され得る（Ｔａｉｌｉｎｇ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ｗｉｔｈ ｙｅａｓｔ ｐｏｌｙ（Ａ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｖａｒｉｏｕｓ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｇ．Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｗ．Ｋｅｌｌｅｒ．ＲＮＡ（１９９８），４：２２６－２３０，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。次いで、組み込まれたオリゴヌクレオチドは、逆転写酵素の鋳型スイッチ活性を介して５’末端を標識する可能性を伴う逆転写のためのユニバーサルプライミング部位として機能し得る。得られたタグ付けされたｃＤＮＡは、ＰＣＲを介して配列決定対応ライブラリに変換され、これにより、順次プラットフォーム特異的全長アダプターが導入される（図６）。
ＰＣＲフリーのＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定対応ライブラリの調製。配列決定プラットフォームに統合されたポリメラーゼが非天然のリンカーを介して読み過ごすことができる限り、ＤＮＡおよびＲＮＡ試料の両方からＰＣＲフリーの配列決定対応ライブラリの調製が可能である。全長アダプターに対応する５’アンカーを有するプライマーを使用したワンステッププライマー伸長、および第２の全長プラットフォーム特異的アダプター配列を有するオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みによる終結は、配列決定対応の一本鎖ライブラリの生成を可能にし、それは任意の他の酵素操作なしで配列決定に供し得る。これは、必要なライブラリ準備ステップが少なくなるという利点を提供する。ＲＮＡ試料を使用する場合、そのような戦略は、５’および３’末端にアダプターを含む配列決定対応の一本鎖ＤＮＡを達成するために必要なのは、第１の鎖のｃＤＮＡの合成のみであるというさらなる利点を提供する。
連結されたヌクレオチドへの配列の鋳型指向性付加。連結されたヌクレオチドが核酸に組み込まれると、連結されたオリゴヌクレオチドを使用して、鋳型非依存性様式で、バーコード、インデックス、特有の分子タグ、ハンドル、プロモーター、および／または配列決定アダプターなどの情報を付加することが容易になり得る。連結されたオリゴヌクレオチドは、スプリントオリゴヌクレオチドのアニーリング部位を提供する３’ハンドルを含み得る。連結されたオリゴヌクレオチドへのスプリントオリゴヌクレオチドのアニーリングは、第２のアニーリングされた複合体を形成する。伸長条件下でポリメラーゼおよびヌクレオチドと接触すると、連結されたオリゴヌクレオチドの３’末端が鋳型非依存性様式で伸長され、スプリントオリゴヌクレオチドの５’末端によって提供される所望の情報が組み込まれる。この方法によって、本明細書に開示の方法を使用して、アダプター配列を組み込み、ワークフローを大幅に単純化することにより、ＮＧＳライブラリを調製するために従来のワークフローを有利に改善し得る。
Ａ．修飾されたヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼ
オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを核酸合成産物に組み込むために、ポリメラーゼを使用し得る。
ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼは、酵素基質として修飾されたヌクレオシド三リン酸を受け入れることが示されている。例えば、修飾されたヌクレオシド三リン酸は、プライマー伸長および増幅プロトコルに一般的に使用されるＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｆｘポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによって容認される。あるいは、修飾されたヌクレオシド三リン酸は、例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼなどの中温性ポリメラーゼによって容認される。
修飾ヌクレオチド、特に本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼは、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼから選択され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、または鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼである。これらのポリメラーゼは、例えば、修飾されたヌクレオチドを許容し、それらを核酸の鎖により効率的に組み込むことができる、野生型、変異型アイソフォーム、キメラ型、およびエキソポリメラーゼなどの遺伝子操作されたバリアントならびに他の変異体を含む。
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼ、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ、ＸファミリーポリメラーゼおよびＲＴファミリーポリメラーゼ、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体から選択される。
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）またはポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）などの鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの例において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＴ７型バクテリオファージ由来の他のＲＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。他の例において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｑ－ベータレプリカーゼなどのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。これらのポリメラーゼは、例えば、修飾されたヌクレオチドを許容し、それらを核酸の鎖により効率的に組み込むことができる、野生型、変異型アイソフォーム、キメラ型、ならびに遺伝子操作されたバリアントおよび変異体を含む。
いくつかの実施形態において、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性または中温性ポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性（例えば、ａｒｃｈｅａｌ）または中温性ポリメラーゼである。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片などのＰｏｌ Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｔ３（Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ）またはＴ７（Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ）などのバクテリオファージ由来のポリメラーゼ、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体から選択されるＡファミリーＤＮＡポリメラーゼである。ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントおよび誘導体は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）（ジデオキシヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチドをより効率的に組み込むことができる変異型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）（ジデオキシヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチドをより効率的に組み込むことができるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ変異体の組み合わせ）、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの短縮バージョン）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０（ジデオキシヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチドをより効率的に組み込むことができるＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ変異体）であり得る。
他の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ファージＰｈｉ２９ポリメラーゼ、およびファージＢ１０３ポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ株ＧＢ－Ｄ（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼ）、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｐ．ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ（Ｐｃａ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｐ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕ ｓｐ．９°Ｎ－７（９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ）などのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＢ型ポリメラーゼ、ならびにそのバリアントおよび誘導体から選択されるＢファミリーＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、Ｂ型ＤＮＡポリメラーゼは、修飾されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、ｄｓＤＮＡ結合ドメインと融合したキメラＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ様ＤＮＡポリメラーゼであり、例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、２０１７年１月１３日に出願された米国特許出願第１５／４０５，５７４号に記載されているように、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－または他のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ様ＤＮＡポリメラーゼであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。エキソヌクレアーゼマイナス修飾は、エキソヌクレアーゼ活性を阻害するためのエキソヌクレアーゼドメインにおける修飾（Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３Ａ）または他のそれぞれの修飾を含む。ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの他のバリアントおよび誘導体は、例えば、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼ（ジデオキシヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチドを組み込む能力が増強された９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ変異体）であり得る。
他の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼならびにそのバリアントおよび誘導体から選択されるＸ型ポリメラーゼである。
他の実施形態において、ポリメラーゼは、ＨＩＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素およびＡＭＶ逆転写酵素ならびにそのバリアントおよび誘導体から選択されるＲＴポリメラーゼである。
場合によっては、ポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ（変異型ＭＭＬＶ ＲＴ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ（変異型ＭＭＬＶ ＲＴ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ（変異型ＭＭＬＶ ＲＴ）、Ｍａｘｉｍａ（商標）（変異型ＭＭＬＶ ＲＴ）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）（変異型ＭＭＬＶ ＲＴ）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ（変異型ＭＭＬＶ ＲＴ）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、およびＨＩＶ－１逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体から選択される。
いくつかの例において、ポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ（変異型ＭＭＬＶ ＲＴ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、Ｍａｘｉｍａ Ｈ（変異型ＭＭＬＶ ＲＴ）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体から選択される。
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼ、修飾されたポリメラーゼ（例えば、化学修飾を有するポリメラーゼ）、変異型ポリメラーゼ、キメラポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼマイナスポリメラーゼ、操作されたポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせである。修飾されたヌクレオチドを許容し、それらを核酸の鎖に組み込むｅｘｏ－ポリメラーゼおよび他の変異体などの遺伝子操作されたバリアントを使用し得る。
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、コンジュゲーションリンカーを読み過ごすことができる。オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込み時に提供される非天然リンカーを読み過ごすことができるポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼと比較して、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、プライマー伸長および／または増幅プロトコルのために一般的に使用されるＤＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態において、非天然リンカーを読み過ごすことができるポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼから選択される。
Ｂ．核酸配列決定
いくつかの実施形態において、本開示は、核酸配列決定において使用される核酸のライブラリの調製に関する。いくつかの実施形態において、鋳型核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、鋳型核酸配列は、二本鎖ＤＮＡに由来し、ゲノムＤＮＡであり得る。あるいは、鋳型核酸配列は一本鎖ＤＮＡであり得る。他の実施形態において、鋳型核酸配列は、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、鋳型核酸は、オリゴヌクレオチドが連結された結合剤（ＯＴＢＡ）によって提供されるヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、配列決定は、超並列核酸配列決定である。
いくつかの実施形態において、配列決定のためのライブラリの調製は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを使用する以下のステップによって実施される。最初に、相補的プライマーを鋳型核酸鎖にアニーリングし、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドおよびポリメラーゼと接触させて、合成された相補的核酸鎖に組み込む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのデオキシバージョンが使用される場合、核酸鎖は、従来のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを組み込むことによってさらに伸長され得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのジデオキシバージョンが使用される場合、ポリメラーゼによる鎖のさらなる伸長は、組み込まれたオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド上の終結基によってブロックされる。次いで、いくつかの実施形態において、鎖は、プライマー伸長ベースの反応、例えば、非対称ＰＣＲ、インデクシングＰＣＲ、または逆転写反応を含むがこれらに限定されないＰＣＲに供され、様々な配列決定法で使用される。いくつかにおいて、配列決定ライブラリは、ユニバーサルハンドル配列を含む連結されたオリゴヌクレオチドの組み込み、およびユニバーサルハンドル配列へのスプリントオリゴヌクレオチドのアニーリングによって調製され、スプリントオリゴヌクレオチドは配列決定アダプターを含む。
核酸断片を増幅する方法は、この分野の当業者には周知である。増幅は、いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＭＤＡ、ＲＣＡ、ＮＡＳＢＡ、ＬＡＭＰ、ＨＤＡ、ＩＣＡＮ、ＮＥＡＲおよびＥＸＰＡＲを含むがこれらに限定されない任意の等温ＤＮＡ増幅法によって達成され得る。核酸断片を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロアレイ、蛍光分析または分光光度分析を使用して定量し得る。
本明細書に記載の技術は、任意の特定の配列決定プラットフォームに限定されるものではなく、概して適用可能であり、プラットフォームとは独立している。いくつかの実施形態において、技術は、エマルジョンＰＣＲベースの方法、ビーズベース、および非ビーズベースの方法に適用可能である。
産生された核酸分子を配列決定する適切な方法は、当業者には周知である。例えば、核酸断片は、マキサムギルバート、サンガー、パイロ配列決定、合成ごとの配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、ライゲーションごとの配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）、単一分子リアルタイム配列決定、質量分析、超並列署名配列決定、ポロニー配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、半導体配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、ヘリスコープおよび単一分子配列決定などの当技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して配列決定され得る。
Ｃ．単一細胞または単一核分析のための組み合わせバーコーディング
オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド（ＯＴＤＤＮ）を使用して、組み合わせバーコーディング法を大幅に簡素化および改善し得る。単一細胞および単一核分析の状況において、例えば、目的の生体分子（例えば、細胞表面分子、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを含む核酸など）の組み合わせバーコーディングに基づく単一細胞／核分析プロトコルの品質、など）が改善される。
組み合わせバーコーディングワークフロー
図３９に示すように、細胞レベルで全トランスクリプトーム解析を改善するための方法が本明細書で提供される。図３９は全トランスクリプトーム分析を示しているが、本明細書に記載の組み合わせバーコーディングワークフローを、１つ以上の特定の核酸および／またはタンパク質標的を分析するために、例えば、標的特異的配列（目的の標的ｍＲＮＡまたはＤＮＡ配列、または本明細書の他の場所に記載されているＯＴＢＡなどの目的の生体分子に連結されたヌクレオチドなど）を有する第１の伸長プライマーを使用することによって、容易に適合および多重化させ得る。同様に、本明細書に記載の組み合わせバーコーディングワークフローを、本明細書の他の場所に記載のとおりｇＤＮＡをＯＴＤＤＮでランダムにタグ付けし、本明細書に提供される組み合わせバーコーディングワークフローに従うことにより、全ゲノム分析（ＷＧＡ）に適合させ得る。本明細書に記載の方法において、個々の試料細胞の生体分子を固定化し、その後、試料細胞を透過性にする。本明細書で提供される組み合わせワークフローを使用して、以下でさらに説明するオリゴヌクレオチドが連結された細胞結合剤を使用してタンパク質を分析する場合、試料細胞をＯＴＢＡで処理して、固定前に結合できるようにする。
本明細書に開示の方法において有用な固定および透過化の方法は、当技術分野において周知である。例として、本明細書に開示の方法で使用され得る固定剤は、ホルムアルデヒド、ホルマリン、メタノール、パラホルムアルデヒド、メタノール：酢酸などを含むがこれらに限定されない。例えば、いくつかの態様において、細胞は、例えばリン酸緩衝生理食塩水中、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％（ｖ／ｖ）またはそれ以上、または間の任意の範囲のホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドに細胞を接触させることによって固定化され得る。
本明細書に開示の実施形態において細胞を透過性にするための有用な薬剤は、トリトン１００、サポニン、Ｔｗｅｅｎ２０、およびメタノール、アセトンなどの有機溶媒を含むが、これらに限定されない。例えば、いくつかの態様において、細胞を、例えば、０．０１～１０％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ１００、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれ以上のホルムアルデヒドで処理し得る。
分析される固定化および透過化された試料細胞集団は複数の第１の部分に分割される。例として、第１の部分の各々は、各個々の細胞が第１の部分にランダムに分配されるように、異なるマイクロウェルまたはチューブに添加され得る。第１の部分の各々を、第１の伸長反応に供して、第１の伸長産物を生成する。例えば、逆転写酵素（ＲＴ）を第１の伸長反応に使用して、ｃＤＮＡである第１の伸長産物を生成し得る。第１の部分の各々を、（ｉ）ポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡ試料核酸／ポリヌクレオチドを分析するための逆転写酵素）、（ｉｉｉ）異なる第１の部分の各々に特有の第１のバーコード（すなわち、第１の伸長バーコードまたは第１のウェル特異的バーコード）を含む第１のプライマー（例えば、逆転写酵素（ＲＴ）伸長プライマー）、（ｉｖ）ヌクレオチド、および（ｖ）ユニバーサルハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰと接触させる。接触ステップは、伸長条件下で行われ得る（例えば、伸長ステップにおいて使用されるポリメラーゼのための典型的な条件下）。
全トランスクリプトーム解析の場合、第１の伸長プライマーは、ｍＲＮＡのバイアスのない増幅を可能にする配列を含み得る。したがって、第１の伸長プライマーは、ｍＲＮＡのバイアスのないプライミングを可能にするためにポリ（Ｔ）を含み得る。あるいは、第１の伸長プライマーは、細胞ＲＮＡのランダムプライミングを容易にするための配列（例えば、ランダムヘキサマー）を含み得る。いくつかの実施形態において、ポリ（Ｔ）またはランダムプライマーは、第１の伸長プライマーの３’末端に含まれる。さらに他の方法において、ポリ（Ｔ）を有するプライマーと、ランダムプライミングを容易にするための配列を含むプライマーとの組み合わせが、伸長反応において使用される。
本明細書に記載の改良された組み合わせバーコーディングワークフローは、標的ｍＲＮＡ、標的ＤＮＡ、標的タンパク質などの標的生体分子を分析する状況下で使用され得る。標的核酸およびタンパク質分析のワークフローにおいて、第１の伸長プライマーは、標的特異的配列を含み得る。例えば、標的ｍＲＮＡまたはＤＮＡの状況下で、第１の伸長プライマーは、目的の標的配列に特異的にハイブリダイゼーションする配列を含み得る。標的タンパク質（または細胞マーカー）の分析の状況下で、（ｉ）目的のタンパク質、生体分子、または細胞マーカーに特異的に結合し、（ｉｉ）結合剤を同定する関連オリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドに連結された結合剤は、固定前に試料細胞に結合することを可能にする。そのため、ＯＴＢＡは、標的核酸の分析のために使用される標的特異的配列と同じ様式で機能する。このようにして、ＯＴＢＡはタンパク質に結合し、タンパク質発現に関するデータを、核酸の配列決定に使用される装置と方法論を使用して分析され得る形式に変換するために使用し得る。フルオロフォアで標識された抗体を使用する方法では、フルオロフォアのスペクトルの重複に問題がある可能性があるため、タンパク質シグナルを、核酸の配列決定のための機器および方法論を使用して分析され得る形式に変換することで、複数のタンパク質シグナルの分解能を高めることができる。また、ＯＴＢＡを使用する方法は、フルオロフォアおよびフルオロフォアの分析のための機器（ＦＡＣＳソーティングに使用されるものなど）の使用を必要とせずに実施され得る。
当業者は、本明細書で以下に説明する組み合わせワークフローが容易に多重化できることを容易に理解するであろう。例えば、本明細書に記載の組み合わせバーコーディングワークフローを多重化することにより、トランスクリプトームおよび１つ以上の標的生体分子（例えば、標的タンパク質など）を同時に処理および分析し得る。例えば、以下の本明細書に記載のとおり、細胞集団を、結合剤インデックスおよび３’ポリ（Ａ）尾部を含むオリゴヌクレオチドを含む１つ以上のＯＴＢＡ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のＯＴＢＡ）と接触させ得る。（図４４を参照されたい）。固定化および透過化された細胞は、第１の区画に分割され、全トランスクリプトーム解析で細胞が処理されるのと同じ方法で処理される。すなわち、３’ポリ（Ｔ）配列を含む第１の伸長プライマーを使用する。
第１の区画がマイクロウェルまたはチューブである方法において、マイクロウェルまたはチューブは、各々が第１の伸長プライマー、およびオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰを含むように提供され得る。必要に応じて、マイクロウェルまたはチューブは、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、またはそれらの両方をさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、マイクロウェルまたはチューブは、事前に充填された（例えば、乾燥されたまたは溶液中で）第１の伸長プライマーなどを含み得る。
第１の伸長は、第１の伸長産物（例えば、分析される試料核酸がＲＮＡである場合のｃＤＮＡ）へのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰのランダムな組み込みをもたらし、それによって各第１の核酸伸長産物のランダムな終結点が生成される。各伸長産物の「停止」点は、各第１の伸長産物の子孫を決定するための同定子として有利に使用され得る。各第１の核酸伸長産物は、各個々の第１の部分内のすべての核酸伸長産物に共通であり、他の区画における第１のバーコード／他の区画において生成された第１の伸長産物に対して特有である第１のバーコード（その５’末端）、および後続の反応において伸長し得る３’ＯＨを提供する３’末端の第２のユニバーサルハンドルを含む。
複数の第１の部分は、例えば単一のチューブまたはウェルへ混ぜ合わされ、またはプールされ、その後、例えば、個々のマイクロウェル、チューブなどの中に、複数の第２の部分に分割される。したがって、個々の細胞は、再び個々の第２の部分にランダムに分配される。
第２の部分を、スプリントオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドと接触させる。スプリントオリゴヌクレオチドは、３’末端に第１の核酸伸長産物上の第２のユニバーサルハンドルにアニーリングする配列を含む。スプリントオリゴヌクレオチドはまた、スプリントの伸長を防止するために、３’末端に修飾（例えば、３’アミノ、３’リン酸、３’ジデオキシヌクレオチドなど）を含み得る。第３のユニバーサルハンドル配列のための鋳型配列は、スプリントオリゴヌクレオチドの５’末端に存在する。第２のユニバーサルハンドルにハイブリダイゼーションする配列および第３のユニバーサルハンドルの間に、スプリントオリゴヌクレオチドは、各第２の部分に特有の第２のバーコードのための鋳型配列を含む。したがって、第２の部分内の第１の伸長産物はさらに伸長されて、５’から３’方向に、第１のユニバーサルハンドル配列、ｃＤＮＡ、ジデオキシヌクレオチド、第２のユニバーサルハンドル、第２のバーコードおよび第３のユニバーサルハンドルを含む第２の伸長産物を生成する。
いくつかの例において、第３のバーコードおよび第４のユニバーサルハンドルを、試料の核酸試料に付加し得る。具体的には、第２の部分を混ぜ合わせ／プールし、例えば、個々のマイクロウェル、チューブなどの中で、複数の第３の部分に分割し得る。したがって、個々の細胞は、個々の第３の部分にランダムに分散される。プールおよび分割の後に各部分に特有のバーコードを付加するために第２のスプリントオリゴヌクレオチドのセットを使用する伸長反応は、複数回実施され得、各反復は、各部分に特有の別のバーコード（ただし、特定の部分に分散されたすべての細胞に共通）の核酸への追加をもたらす。
いくつかの実施形態において、方法は、例えば、第２の核酸伸長産物を生成した後、第３の部分を第２の伸長プライマーと接触させる前に、スプリントオリゴヌクレオチドを除去、ブロックまたは消化するステップを含む。いくつかの実施形態において、スプリントオリゴヌクレオチドは、結合部位を含み、方法は、第２の部分または混ぜ合わされた第２の部分を、同種の結合部位を含むスプリントオリゴヌクレオチドの結合および除去を容易にする捕捉部位を含む化合物と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態において、結合部位および同種捕捉部位は、ストレプトアビジンおよびビオチン、マルトースおよびマルトース結合タンパク質、グルタチオンおよびグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、キチンおよびキチン結合タンパク質、またはアプタマーおよびその抗原のうちの結合対から選択される結合対である。いくつかの実施形態において、生体試料は、固体支持体上に固定化される。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、ビーズは、磁性または常磁性のビーズである。
所望の数のバーコードが各細胞内の核酸伸長産物に付加された後、細胞を溶解して核酸伸長産物を放出するために、最終部分を溶解条件下で接触させ得る。例えば、方法は、第２の部分を、混ぜ合わせ、混ぜ合わせた第２の部分を分割し、第３の部分に分割し、第３のヌクレオチド伸長産物を生成することを含み得、各第３ヌクレオチド伸長産物内の第１、第２、および第３のバーコード配列（またはその相補体）の組み合わせは、単一細胞に由来する各核酸伸長産物に特有のものである。「特有」とは、第１、第２、および第３のバーコード配列の組み合わせがほぼ完全に特有である可能性があることを意味するが、この用語は、１つ以上のバーコードの偶然の繰り返しを除外するものではない。
いくつかの実施形態において、ＯＴＤＤＮを、全トランスクリプトーム分析、全ゲノム分析、有向性ｍＲＮＡ分析、短いＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）など、およびそれらの組み合わせなどの単一細胞または単一核ワークフローに組み込み得る。ほんの一例として、本明細書で提供されるのは、細胞集団内の単一細胞または核のトランスクリプトームを分析するためのワークフローである（図３９を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組み合わせバーコーディング法は、細胞または核内の核酸、タンパク質、および他の生体分子が無傷のままであり、それらの起源の細胞内に固定されるように、細胞集団内の細胞または核を固定化および透過化するステップをさらに含む。同時に、透過化ステップは、試薬（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマーなど）が、例えば、逆転写、増幅反応などにおいて機能することができる細胞または核に入るのを可能にするように機能する。細胞および核を固定化および透過化する多くの方法が当技術分野において既知である。例として、本明細書に開示の実施形態において有用な細胞を固定化および透過化するための方法は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ（３６０）１７６－１８２，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、米国特許出願公開第２０１６／０１３８０８６号、および国際特許出願公開第２０１４／０６０８４３号に記載のものを含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組み合わせバーコーディング法は、１つ以上の伸長産物を生成した後に細胞を溶解することをさらに含み得る。さらに、本明細書で提供される組み合わせバーコーディング法はまた、最後のバーコードの付加の後、１つ以上の増幅反応を含み得る。いくつかの実施形態において、増幅プライマーは、伸長産物の３’および５’末端に存在するユニバーサルハンドルにアニーリングし得る。増幅プライマーは、任意選択でアダプター配列（例えば、本明細書の他の場所に記載のとおり、核酸ライブラリを所望のＮＧＳプラットフォームで処理および分析することを可能にする配列決定アダプター）を含み得る。
組み合わせバーコーディング法はまた、溶解ステップなどに続く細胞破片から離れた核酸の精製を含むがこれらに限定されない１つ以上の試料調製ステップを含み得る。
Ｄ．対象の生体分子の空間分解能
本明細書に記載の改良された核酸タグ付けおよび核酸ライブラリの調製法はまた、組織試料中の目的の生体分子を空間的に分解するために使用され得る。
いくつかの方法では、組織試料を、５’から３’方向にアドレス可能なバーコードドメイン（例えば、アレイ上の位置情報をコードする第１のバーコード）およびハイブリダイゼーションドメイン（すなわち、アドレス可能なプライマーの組織試料のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にするドメイン）を含むアドレス可能なプライマーのアレイと接触させ得る。アドレス可能なバーコードは、アレイのｘ座標とｙ座標に関連する情報を含み得る。本明細書に記載の実施形態において有用なアドレス可能なバーコードドメインのアレイは、当技術分野において既知である。
本明細書で使用される場合、「アレイ」という用語は、相対的な位置に従って互いに区別することができる特徴または部位の集団を指す。アレイの異なる部位にある異なる分子は、アレイ内の部位の位置に従って互いに区別され得る。アレイの個々の部位は、特定の種類の１つ以上の分子を含み得る。例えば、部位は、特定の配列を有する単一の標的核酸分子を含み得、または部位は、同じ配列（および／またはその相補的配列）を有するいくつかの核酸分子を含み得る。本明細書に記載の実施形態において使用され得るアドレス可能なバーコードのアレイの非限定的な例としては、国際特許出願番号第２０１６／１６８８２５号、同第２０１２／１４０２２４号、同第２０１４／０６０４８３号、同第２０１６／１６２３０９号などにおいて記載されるアレイが挙げられる。いくつかの実施形態において、アドレス可能なプライマーは、固体表面に共有結合で結合する。
組織試料のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、組織試料に結合したＯＴＢＡのオリゴヌクレオチドなどであり得る。したがって、ハイブリダイゼーションドメインは、目的の配列（例えば、ポリ（Ｔ）、またはランダム配列）へのバイアスのないハイブリダイゼーションを容易にすることができ、または特定の標的配列（例えば、特定のｍＲＮＡ配列）へのハイブリダイゼーションを可能にし、またはＯＴＢＡのオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にする。
組織試料をアドレス可能なプライマーのアレイと接触させて、オリゴヌクレオチドが連結されたジドキシヌクレオチド、連結されていないヌクレオチド、およびポリメラーゼの存在下で第１のアニーリングされた複合体を生成し得る。第１のアニーリングされた複合体の伸長は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド）の第１の伸長産物への組み込みをもたらす。組み込まれたＯＴＤＤＮを含む第１の伸長産物を、本明細書の他の場所に記載されているように操作し、例えば、ＮＧＳ配列決定に適した核酸ライブラリを産生し得る。
アドレス指定可能なプライマーを、アレイ上の種々の特徴に共有結合で連結させ得る。アドレス可能なプライマーは、アレイ上の特徴からアドレス可能なプライマーの少なくとも一部分を放出する手段を提供する切断ドメインをさらに含むことができ、放出された部分は、位置バーコードおよびハイブリダイゼーション配列を含む。例えば、アドレス可能なプライマーは、例えば、組織核酸の存在下でアドレス可能なプライマーの伸長時に、制限酵素による切断を容易にする配列を含み得る。
組織切片は、第１の伸長産物が形成される前後に、視覚化または画像化され、例えば、染色および写真撮影され得る。したがって、いくつかの態様において、アドレス可能なバーコードは、組織試料内の位置と相関する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、分析される生体分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質）の三次元プロファイルを生成するために、複数の連続する組織切片に対して実行され得る。したがって、いくつかの実施形態において、アドレス可能なプライマーのバーコードは、さらにｚ座標を含む。
ＩＶ．キット
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドおよび／またはオリゴが連結された細胞マーカー結合剤を含むキットも提供される。いくつかの実施形態において、キットは、上記のようにオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドおよび／またはオリゴが連結された細胞マーカー結合剤（ＯＴＢＡ）、ならびに、（ｉ）Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕおよび／またはＴヌクレオチド、（ｉｉ）ポリメラーゼ、プライマーおよび緩衝液のうちの少なくとも１つを含む核酸配列決定ライブラリを産生するためのものである。
キットに含まれ得るポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、およびＨＩＶ－１逆転写酵素、ならびにそれらの様々な誘導体または変異体から選択され得る。
いくつかの実施形態は、組み合わせバーコーディングのためのキットに関する。キットは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドと、ポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチド、複数の第１のバーコードを含む複数の第１の伸長プライマー、複数の第２のバーコードを含む複数の第２の伸長プライマー、バーコード、複数の第３のバーコードを含む複数の増幅プライマー、および少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。
Ｖ．定義
本教示を詳細に説明する一方で、開示は特定の組成物または処理ステップに限定されず、それ自体が変化し得ることを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を指示していない限り複数形の言及を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「色素」への言及は、複数の色素を含み、「細胞」への言及は、複数の細胞などを含む。
測定値および測定可能な値は、有効数字および測定に関連する誤差を考慮して、近似値であると理解される。すべての範囲は、「エンドポイントを含まない」などの明示的な除外がない場合、エンドポイントを含むものとして解釈される。したがって、例えば、「１０～１５以内」には、値１０および１５が含まれる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。前述の概要および詳述の両方が例示および説明のためのみのものであり、本教示を限定するものではないことを理解されたい。本明細書に特に記載されていない限り、様々な構成成分を「含む」と記載されている明細書の実施形態は、記載されている構成成分「からなる」または「から本質的になる」ともみなされる。
本明細書に使用される節の見出しは、構成目的のものに過ぎず、決して所望の主題を限定すると解釈されるものではない。参照により組み込まれた任意の文献が本明細書において定義された用語と矛盾する場合、本明細書が優先される。本教示を様々な実施形態と併せて記載するが、本教示をかかる実施形態に限定することを意図していない。むしろ、本教示は、当業者が理解するように、様々な代替物、変形物、および等価物を包含する。
それらに限定されるものではないが、特許、特許出願、記事、書籍、論文、およびインターネットウェブページを含む、本出願で引用されるすべての文献および同様の資料が、いかなる目的であれ、それらの全体が参照によって明示的に組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術および科学用語は、本明細書に記載される様々な実施形態が属する分野の当業者に通常理解されるものと同様の意味を有する。組み込まれた参照文献における用語の定義が、本教示において提供される定義と異なるように見える場合、本教示に提供される定義が優先されるものとする。
本技術の理解を容易にするために、いくつかの用語および句を以下に定義する。詳細な説明全体を通して、追加の定義が記載される。
本明細書で使用される「一実施形態において」という句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らないが、そうである場合もある。さらに、本明細書で使用される「別の実施形態において」という句は、必ずしも異なる実施形態を指すとは限らないが、そうである場合もある。したがって、以下に説明するように、本開示の様々な実施形態は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わせ得る。
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を指示していない限り複数形の言及を含む。したがって、例えば、「部分」への言及は、複数のそのような部分などを含む。「含む」という用語およびその文法上の同等物は、具体的に同定された特徴に加えて、他の特徴が任意選択で存在することを意味するために、本明細書において使用される。本明細書において２つ以上の定義されたステップを含む方法に言及する場合、定義されたステップは任意の順序でまたは同時に実行され得（文脈がその可能性を除外する場合を除く）、方法は任意選択で、定義されたステップの前、２つの定義されたステップの間、またはすべての定義されたステップの後に実施される１つ以上の他のステップを含み得る（文脈がその可能性を除外している場合を除く）。本明細書において「第１」および「第２」の特徴に言及する場合、これは、概して、識別の目的で行われ、文脈が別の方法を必要とする場合を除き、第１および第２の特徴は、同じでも異なってもよく、第１の特徴への言及は、第２の特徴が必ずしも存在することを意味するわけではない（存在する場合もある）。本明細書において「ａ」または「ａｎ」特徴に言及する場合、これには、そのような特徴が２つ以上ある可能性を含む。
本開示による「ヌクレオチド」という用語は、特に、リボヌクレオチド、２’－デオキシリボヌクレオチドまたは２’、３’－ジデオキシリボヌクレオチドに関する。ヌクレオチド類似体は、糖または骨格が修飾されたヌクレオチド、特に酵素的に核酸に組み込まれ得るヌクレオチド類似体から選択され得る。糖が修飾されたヌクレオチドのいくつかの実施形態において、リボース糖の２’－ＯＨまたはＨ基は、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲ2またはＣＮから選択される基によって置き換えられ、ＲはＣ１－Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。リボース自体が、シクロペンタンまたはシクロヘキセン基などの他の炭素環式または複素環式の５または６員基で置き換えられ得る。骨格が修飾されたヌクレオチドの一実施形態において、ホスホ（トリ）エステル基は、例えば、ホスホロチオエート基またはＨ－ホスホネート基などの修飾基によって置き換えられ得る。さらなる実施形態において、ヌクレオチド類似体は、モルフォリノ核酸、ペプチド核酸またはロックド核酸などの核酸類似体の合成のための基礎的要素を含む。
「核酸塩基」という用語は、天然または非天然のプリンまたはピリミジン塩基のいずれかを指す。核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、７－デアザ－アデニンおよび７－デアザグアニン、イノシンを含む。
本明細書で使用される場合、「ｄＮＴＰ」という句は、２’－デオキシヌクレオチド三リン酸を意味し、ヌクレオチドは、天然または非天然の核酸塩基を含む。
本明細書で使用される場合、「ｄｄＮＴＰ」という句は、２’，３’－ジデオキシヌクレオチド三リン酸を意味し、ヌクレオチドは、天然または非天然の核酸塩基を含む。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む分子として定義される。その正確なサイズは多くの要因に依存し、それは順次オリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、合成的にまたはクローニングによって得られる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、鎖状に共有結合で結合されたヌクレオチドモノマーからなるポリマー分子を指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）はポリヌクレオチドの例である。本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、線状または環状ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡ、断片化ｄｓＤＮＡ／ＲＮＡ、線状または環状ＲＮＡ、および他の既知の形態または核酸などの二本鎖または一本鎖核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド核酸塩基に共有結合で結合する２つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む分子を指す。例えば、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドは、トリアゾール環を介してヌクレオチド核酸塩基に共有結合で結合している。そのような共有結合での結合は、「クリックケミストリー」プロセスの結果であり得る。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドは、ＯＴＤＮ（オリゴヌクレオチドが連結されたデオキシヌクレオチド）またはＯＴＤＤＮ（オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド）と称され得る。
本明細書で使用される場合、「二本鎖」という用語は、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、ポリヌクレオチドの相補鎖間のヌクレオチドの一部またはすべてが互いに水素結合して、部分的または完全な二重らせんを形成することを意味する。部分的に二本鎖のポリヌクレオチドは、そのヌクレオチドの少なくとも１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が相補的ヌクレオチドに水素結合することができる。
一本鎖ポリヌクレオチドは、二重らせんが形成されないか、または所与の一連のハイブリダイゼーション条件下で不安定であるように、別のポリヌクレオチドとほとんど、またはまったく水素結合を有しないポリヌクレオチドを指す。
「ポリメラーゼ」は、概して、ヌクレオチド、オリゴマー、およびそれらの類似体における３’－ＯＨおよび５’－三リン酸との間の反応を触媒して核酸ポリマーを形成する酵素である。ポリメラーゼには、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ、ＫＯＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、末端トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むが、これらに限定されない。これらのポリメラーゼは、例えば、修飾されたヌクレオチドを許容し、それらを核酸の鎖に組み込む、野生型、変異型アイソフォーム、キメラ型、およびエキソポリメラーゼなどの遺伝子操作されたバリアントならびに他の変異体を含む。
本明細書で使用される場合、「バーコード」という用語は、バーコードが関連付けられている核酸のいくつかの特徴を同定することを可能にする既知の核酸配列を指す。いくつかの実施形態において、同定される核酸の特徴は、核酸が由来する試料または供給源である。ほんの一例として、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、細胞の集団中に存在する単一の細胞における目的の核酸への複数のバーコード（例えば、２、３、４、５、６個、またはそれ以上）の付加を記載する。各個々の細胞の核酸に追加されたバーコードの特有の組み合わせにより、目的のタグ付けされた核酸が由来する細胞の同定が有利に可能になる。いくつかの実施形態において、バーコードは、長さが少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ヌクレオチド、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、バーコードは、長さが１０、９、８、７、６、５、または４ヌクレオチドより短い。いくつかの実施形態において、いくつかの核酸に関連するバーコードは、他の核酸に関連するバーコードとは異なる長さのものである。概して、バーコードは十分な長さのものであり、関連付けられているバーコードに基づいて試料の同定が可能なように十分に異なる配列を含む。いくつかの実施形態において、それが関連するバーコードおよび試料供給源は、変異、挿入、または欠失などのバーコード配列中の１つ以上のヌクレオチドの変異、挿入、または欠失の後に正確に同定され得る。いくつかの実施形態において、複数のバーコードにおける各バーコードは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の位置などの２つ以上のヌクレオチド位置で、複数の他のすべてのバーコードとは異なる。いくつかの実施形態において、１つ以上のアダプターは、複数のバーコード配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、技術の方法は、標的核酸が接合されているバーコード配列に基づいて、標的核酸が由来する試料または供給源を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、技術の方法は、標的核酸が接合されているバーコード配列に基づいて標的核酸を同定することをさらに含む。方法のいくつかの実施形態は、バーコードヌクレオチド配列を決定することによって、標的ヌクレオチド配列の供給源または試料を同定することをさらに含む。方法のいくつかの実施形態は、所望の標的の発現レベルまたはコピー数状態を決定するための分子集計用途（例えば、デジタルバーコード羅列および／またはビニング）をさらに含む。概して、バーコードは、標的核酸に接合された場合に、標的ポリヌクレオチドが由来する試料の同定子として機能する核酸配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、「プライマー」または「伸長プライマー」という用語は、天然に存在するか合成的に産生されるかにかかわらず、適切な条件下で、例えば、適切な緩衝液（「緩衝液」は適切なｐＨ、イオン強度、補因子などを含む）中および適切な温度でのヌクレオチド三リン酸およびポリメラーゼ酵素（例えば、熱安定性ポリメラーゼ酵素）の存在下に置かれた場合、核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、いくつかの実施形態において、増幅の最大効率のために一本鎖であり得るが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、まずその鎖を分離するように処理される。いくつかの実施形態において、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、伸長産物の合成をプライミングするのに十分に長い必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、ポリメラーゼ酵素（例えば、熱安定性であるかどうか）、および方法の使用を含む多くの要因に依存するであろう。本明細書で使用される場合、「アダプター」という用語は、概して、例えば、核酸分子にライゲーションされ得、それにより、配列決定プラットフォームで配列決定され得る核酸産物を生成し得る任意の線状オリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、アダプターは、二本鎖構造を形成する２つの逆相補的オリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、プライマー、アダプターなどのようなオリゴヌクレオチドは、「ユニバーサル」配列を含む。ユニバーサル配列は、例えば、既知の配列（例えば、ユニバーサル配列に相補的）のプライマーまたはプローブを使用するプライマーまたはプローブ結合部位として使用するための既知の配列である。技術の実施形態において、プライマーの鋳型特異的配列、プライマーのバーコード配列、および／またはアダプターのバーコード配列は、例えば、断片から断片へ、試料から試料へ、供給源から供給源へ、または関心領域から関心領域へと異なる可能性があり、技術の実施形態は、ユニバーサル配列が、断片から断片へ、試料から試料へ、供給源から供給源へ、または関心領域から関心領域へと同じであることを提供し、ユニバーサル配列を含む断片は、同様の方法または技術を使用して（例えば、同じプライマーまたはプローブを使用して）、同じまたは同様の様式で、例えば、増幅、同定、配列決定、単離などで操作および／または処理され得る。
本明細書で使用される場合、「ハンドル」という用語（「増幅ハンドル」または「ＰＣＲハンドル」という用語と交換可能に使用される）は、それ自体が構築物オリゴヌクレオチド配列の増幅のためのアニーリング部位を提供するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列である、機能的構成成分オリゴヌクレオチドを指す。本実施形態で使用されるハンドルは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、修飾された塩基またはそれらの塩基の組み合わせ、またはポリアミドなどのポリマーから形成され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示の実施形態において使用されるユニバーサルハンドルは、長さが約１０のそのようなモノマー構成成分、例えば、ヌクレオチド塩基である。他の実施形態において、ユニバーサルハンドルは、長さが少なくとも約５～１００個のモノマー構成成分、例えば、ヌクレオチドである。したがって、様々な実施形態において、本明細書に記載のユニバーサルハンドルは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、８０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または最大１００個モノマー構成成分、例えば、核酸である。したがって、本明細書に記載の「ユニバーサルハンドル」は、本明細書の他の場所に記載のポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなどによる伸長のためのアニーリング部位として適切な一般的な配列であり得、または伸長プライマー結合部位、配列決定プライマー結合部位などを含み得る。
「特有の分子インデックス」（ＵＭＩ）という用語は、個々のＤＮＡ分子を互いに区別するために使用され得る、ＤＮＡ分子において適用または同定されるヌクレオチドの配列を意味する。ＵＭＩはＤＮＡ分子を同定するために使用されるため、特有の分子同定子とも呼ばれる。ＵＭＩは、それらが関連付けられているＤＮＡ分子とともに配列決定されて、リード配列が１つの供給源ＤＮＡ分子のものであるか別のものであるかを決定することができる。
本明細書で使用される場合、「スプリントオリゴヌクレオチド」という用語は、鋳型非依存性様式で既存の核酸産物への核酸配列の伸長またはライゲーションを促進して伸長された核酸産物を形成するための鋳型として使用されるオリゴヌクレオチドを指すが、それは、伸長されないか、または核酸産物に組み込まれない。ほんの一例として、本明細書に記載のいくつかの実施形態において、スプリントオリゴヌクレオチドは、以下の構成成分を含み得る。（ｉ）伸長される核酸産物に存在する同種のハンドル配列へのハイブリダイゼーションを可能にする配列、（ｉｉ）バーコード配列、および（ｉｉｉ）図３８に示されるように、（ｉ）のハンドルとは異なるハンドル配列を伸長された核酸産物に組み込むための鋳型である配列。スプリントオリゴヌクレオチドは、任意選択で、反応混合物からの除去を容易にする手段、例えば、ビオチン部位などを含む。いくつかの態様において、スプリントオリゴヌクレオチドはまた、３’末端からのスプリントオリゴヌクレオチドの伸長を防止する修飾を含む（例えば、３’アミノ、３’リン酸、３’ジデオキシなど）。
本明細書で使用される場合、「核酸合成」という用語は、ポリヌクレオチドの新しい鎖を作製するための、または既存のポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を伸長させるための任意のインビトロ方法を指す。本開示による合成は、ポリメラーゼの使用でポリヌクレオチド鋳型配列のコピー数を増加させる増幅を含む。ポリヌクレオチド合成は、ポリヌクレオチド（すなわち、プライマー）へのヌクレオチドの組み込みをもたらし、それにより、ポリヌクレオチド鋳型に相補的な新しいポリヌクレオチド分子を形成する。形成されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、追加のポリヌクレオチド分子を合成するための鋳型として使用され得る。
本明細書で使用される場合、「鋳型ＤＮＡ分子」という用語は、例えば、プライマー伸長反応において、ＤＮＡポリメラーゼによって相補的な核酸鎖が合成される核酸の鎖を指す。
本明細書で使用される場合、「鋳型依存的様式」という用語は、プライマー分子の鋳型依存的伸長（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成など）を含むプロセスを指す。「鋳型依存的様式」という用語は、典型的には、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチド合成を指し、ポリヌクレオチドの新たに合成された鎖の配列は、相補的塩基対プライミングの周知の規則によって決定される。
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、２つのポリヌクレオチド鎖の領域間または塩基対形成を介した２つのヌクレオチド間の配列相補性の広い概念を指す。アデニンヌクレオチドは、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特定の水素結合（「塩基対形成」）を形成することができることが知られている。同様に、シトシンヌクレオチドはグアニンヌクレオチドと塩基対形成することができることが知られている。
「タグ」または「オリゴヌクレオチドタグ」とは、ライブラリのオリゴヌクレオチド部分を意味し、その少なくとも一部は情報をコードする。「タグ」は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドで核酸に付加された任意のヌクレオチド配列であり得る。そのような情報の非限定的な例には、構成成分（すなわち、それぞれ足場タグまたは基礎的要素タグのような足場または基礎的要素）の追加（例えば、結合反応による）、ライブラリにおけるヘッドピース、ライブラリの同一性（つまり、同一性タグとして）、ライブラリの使用（つまり、使用タグとして）、および／またはライブラリメンバーの起源（つまり、起源タグとして）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ライブラリ」という用語は、核酸に関して使用される場合、異なる化学組成（例えば、異なる配列、異なる長さなど）を有する核酸の集合を意味することを意図している。典型的には、ライブラリにおける核酸は、属またはクラスの共通の特徴または特性を有するが、それ以外では何らかの点で異なる、異なる種であろう。例えば、ライブラリは、ヌクレオチド配列が異なるが、糖リン酸骨格を有することに関して類似している核酸種を含み得る。ライブラリは、当技術分野で知られている技術を使用して作成し得る。本明細書で例示される核酸は、例えば、ゲノム（例えば、ヒトゲノム）の消化物またはゲノムの混合物を含む、任意の供給源から得られる核酸を含み得る。別の例において、核酸は、特定の環境または生態系のメタゲノム研究から得られたものであり得る。この用語は、ＤＮＡライブラリなどの人工的に作成された核酸ライブラリも含む。
「クリックケミストリー」および「クリック反応」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、当技術分野でのそれらの使用と一致することを意図している。概して、クリックケミストリー反応は速く（例えば、反応の完了まで迅速）、単純で、容易に精製され、位置特異的である。クリックケミストリーは、銅触媒によるアジド－アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）、銅を含まないクリックケミストリーとしても知られるひずみ促進アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）、ひずみ促進アルキン－ニトロン付加環化（ＳＰＡＮＣ）、アルキンヒドロチオール化、およびアルケンヒドロチオール化などの反応を含むが、これらに限定されない。銅を触媒として使用するクリックケミストリーは、しばしば不安定なＣｕ（Ｉ）を安定化する配位子を含む。特定の理論に拘束されることなく、配位子は、反応性Ｃｕ（Ｉ）からＣｕ（ＩＩ）への酸化からＣｕ（Ｉ）イオンを安定化または保護し得、反応における塩基の必要性を低減または排除するプロトン受容体としても作用し得る。ポリヌクレオチド間のクリックケミストリーは、いくつかの実施形態において、２つの反応するパートナーを反応するのに十分に近接させる部位を使用することによって支援され得る。
本明細書で使用される場合、特に明記されていない限り、「アジド（ａｚｉｄｅ）」または「アジド（ａｚｉｄｏ）」という用語は、Ｎ3、または－Ｎ＝Ｎ+＝Ｎ-、または－Ｎ-－Ｎ+≡Ｎを指す。
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「約」または「ほぼ」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。特定の実施形態において、「約」または「ほぼ」という用語は、１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。特定の実施形態において、「約」または「ほぼ」という用語は、所与の値または範囲の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．０５％以内を意味する。
本明細書で使用される場合、「標識」は、核酸を標識化するのに有用な化学的または生化学的部位である。「標識」は、例えば、蛍光剤、化学発光剤、親和性剤、ブロッキング基、発色剤、消光剤、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、阻害剤、ナノ粒子、磁性粒子、および当技術分野で知られている他の部位を含む。標識は、測定可能なシグナルを生成することができ、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドに共有結合または非共有結合で接合され得る。いくつかの例において、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの一部は、標識として機能し得る。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「リンカー」という用語は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから選択される非水素原子を組み込んだ単一の共有結合または一連の安定な共有結合を指す。例示的な連結メンバーは、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｃ）－、－ＮＨ－、－Ｓ－、－Ｏ－、アルキル、アルケニル、およびアルキニル鎖から選択される少なくとも１つの部位を含む。リンカーはまた、２つ以上の連結メンバーの組み合わせを含み得る。
本明細書で使用される場合、「アルキル」または「アルキレン」という用語は、例えば、１～１２個の炭素原子または１～６個の炭素原子、１～４個の炭素原子または２～３個の炭素原子の飽和、直鎖または分岐の炭化水素鎖に由来するラジカルを指す。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、およびｎ－ヘキシルならびに任意の異性体、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ｎ－ブチレン、ペンチレンなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」および「アルケニレン」という用語は、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を含む２～１０個の炭素原子の直鎖または分岐の炭化水素鎖に由来するラジカル基を指す。例としては、エテニル（ビニル）、１－プロペニル、２－プロペニル（アリル）、イソプロペニル、ブテニル、ブタ－１，４－ジエニル、ペンテニル、ヘキセニル、エテニレン）、プロペニレン、ブテニレン、ヘキセニレンなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」または「アルキニレン」という用語は、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を含む２～１０個の炭素原子の直鎖または分岐の炭化水素鎖に由来する二価基を指す。
「アミノ」という用語は、ＮＲ1Ｒ2型を指し、式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素およびＣ１－Ｃ８アルキル基から選択される。
本明細書で使用される場合、「ポリアルキレングリコール」という用語は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコールなどの直鎖または分岐のポリアルキレングリコールポリマーを指す。例示的なポリアルキレングリコールは、２～１０個のアルキレングリコール単位を有する。「アルキレングリコールサブ単位」という用語は、単一のアルキレングリコール単位を指す。例えば、エチレングリコールサブ単位は、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－であろう。例示的なポリアルキレングリコールには、２～１０個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールが含まれ、特定の実施形態において、２、４、または６個のエチレングリコール単位を有するものは、それぞれＰＥＧ２、ＰＥＧ４、およびＰＥＧ６とも称される。
用語「アルコキシ」または基－ＯＲ3は、Ｒ3がＣ１－８アルキル基であることを指す。例として、－ＯＭｅ（メトキシ）、－ＯＥｔ（エトキシ）、－Ｏ（ｎＰｒ）（ｎ－プロポキシ）、－Ｏ（ｉＰｒ）（イソプロポキシ）、－Ｏ（ｎＢｕ）（ｎ－ブトキシ）、－Ｏ（ｉＢｕ）（イソブトキシ）、－Ｏ（ｔＢｕ）（ｔｅｒｔ－ブトキシ）などのＯＣ１－８アルキルが挙げられる。
本明細書に開示される化学構造は、所与の各構造を表すことができる可能な共鳴構造のうちの１つの表現であることが理解されよう。さらに、定義により、共鳴構造は、電子の非局在化を表すために当業者によって使用される単なる図式的表現であり、本開示は、任意の所与の構造についての１つの特定の共鳴構造を示すことによって決して限定されないことが理解されよう。
「単離された」という用語は、本明細書で核酸ポリマーに関して使用される場合、その起源または操作により、それが天然に付けられるか、またはそれと最初に取得されたときに関連付けられる構成成分の少なくともいくつかから分離される核酸ポリマーを意味する。「単離された」とは、代替的または追加的に、目的の核酸ポリマーが人の手によって産生または合成されることを意味する。
本開示は、以下の実施例および関連する図を参照して、ほんの一例として、これからさらに詳細に説明されよう。
以下は、本明細書に開示の方法、使用、および組成物の例である。上記の所与の一般的かつ詳細な説明を前提として、他の様々な実施形態を実施され得ることが理解される。以下の例は、本教示を説明する目的で与えられたものであり、開示または特許請求の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
実施例１．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの調製
Ａ．アジドが修飾されたヌクレオチドの調製
５－プロパルギルアミノ－ｄＣＴＰ（化合物６）または７－デアザ－７－プロパルギルアミノ－ｄＡＴＰ（化合物７）などのアミノが修飾されたヌクレオチドは、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＳＫＵ ＮＵ－１６１１－１およびＮＵ－８０９）から市販されている。アジド－ＮＨＳ－エステルを有する異なるリンカーを利用して、対応するアジド－置換－ｄＣＴＰを、Ｎａ2ＣＯ3／ＮａＨＣＯ3のｐＨ９の溶液中で所望の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－アジド－化合物と反応させることにより合成し（図７）、５０～９０％の間隔での収率であった。
同じ反応条件に従って、アジド－Ｃ２－ｄＡＴＰを合成した（図８）。
Ｂ．アルキンが修飾されたオリゴヌクレオチドの調製
オリゴマー：（ＡｌｄＵ）ＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＣＡＧＡＴＧＴＡＡＣＡ（配列番号３３）は、様々な商業的供給業者からアルキン修飾を加えて市販されている。このオリゴヌクレオチドの配列は、もともとＳｔａｓｅｖｓｋｉｊ ｅｔ ａｌ，２０１７に開示されていたが、本実施例において、最初にオリゴヌクレオチドの５’末端塩基にアルキン修飾が付加されている。５’末端核酸塩基または５’末端リン酸でアルキン修飾されたオリゴヌクレオチドは、様々な商業的供給業者から市販されている。
Ｃ．クリック反応－オリゴヌクレオチドが連結されたｄＣＴＰの合成
すべてのクリックアジド－アルキン付加環化反応については、「ＣｕＡＡＣ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（ＴＨＰＴＡ ｂａｓｅｄ）」（ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＬＫ－０７２、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が、製造元の指示に従って使用された。反応条件は以下のとおりである。４２μＭのオリゴマー（配列番号３３または配列番号２３）、２ｍＭのＣｕＳＯ4、１０ｍＭのＴＨＰＴＡ、０．１Ｍのアスコルビン酸ナトリウム、７８ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）、８４μＭのアジド前駆体。
クリック反応を使用して、５つの異なるオリゴヌクレオチドが連結されたデオキシヌクレオチドを合成した（図９）。反応混合物を分析し、液体クロマトグラフィーで精製した。これらの反応の結果を表１に要約する。
Figure 2022537069000032
オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドをもたらすクリック反応は、例えば、オリゴヌクレオチドがＡｌｘｙｌ（Ｍｅｔａｂｉｏｎ）修飾で修飾されている場合、アジドが修飾されたヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸に結合したアルキン基を有するオリゴヌクレオチド（式Ｃ１の化合物に示される）を使用して、ヘキシニルリンカーを介して行うこともできる。式Ｅ２の化合物が例として提供されている。
Ｄ．クリック反応－オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰの合成
続いて、化合物９を、オリゴヌクレオチド（配列番号３３または配列番号２３）との付加環化（クリック）反応において利用した（図１０）。クリック反応には、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの「ＣｕＡＡＣ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（ＴＨＰＴＡ ｂａｓｅｄ）」を使用した。産物である化合物１０を逆相クロマトグラフィーにより精製し、質量分析により確認した。あるいは、ヘキシニルリンカーを介してオリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸に結合したアルキン基を有するオリゴヌクレオチドを、化合物９とのクリック反応に使用した。
実施例２．種々のポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドが連結されたｄＮＴＰの組み込み
オリゴヌクレオチドが連結されたｄＮＴＰを合成鎖に組み込む能力について、種々のポリメラーゼを選択して試験した。文献によると、ファミリーＡ、ファミリーＢ、逆転写酵素（ＲＴ）ファミリー、および末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の酵素が、かさばるヌクレオチド類似体を組み込むことができると期待される。それにもかかわらず、これはヌクレオチド類似体自体に依存する可能性がある（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ． ａｌ，２００５、Ｔａｕｒａｉｔｅ ｅｔ ａｌ，２０１７）。
Ａ．オリゴヌクレオチドが連結されたデオキシヌクレオチドの組み込み
Figure 2022537069000033
実験系は、プライマーおよびオリゴヌクレオチドの二本鎖（例えば、配列番号２４および２７の二本鎖、図３１）の突出した５’末端の伸長に基づいていた。天然のｄＮＴＰとの反応は、突出した末端の完全な充填、およびプライマーの伸長がもたらされたが、単一のオリゴヌクレオチドが連結されたデオキシ／ジデオキシヌクレオチドを組み込むと、オリゴヌクレオチドによるプライマー標識化がもたらされた。プライマー伸長反応は、試験した各ポリメラーゼの最適な緩衝液および温度で実施された。次に、反応産物を１５％ＴＢＥ－尿素ＰＡＧＥで分解した。伸長プライマー配列番号２４は５’－Ｃｙ５蛍光標識を有するため、プライマー伸長産物が検出された。
Ａ型ポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｒｅｃ）：２ｐｍｏｌのＣｙ５－２９｜｜４９基質（配列番号２４および２７、図３１）、２０ｐｍｏｌのＯＴＤＮ、１ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液、２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＥＰ０４０５）、２５ｍＭのＭｇＣｌ2を、９５℃で１０秒間、次いで６０℃で１０分間インキュベーションした。
Ｂ型ポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）：２ｐｍｏｌのＣｙ５－２９｜｜４９基質、２０ｐｍｏｌのＯＴＤＮを、９５℃で１０秒間、次いで６０℃で１０分間インキュベーションした。
ＲＴ型ポリメラーゼ（Ｍａｘｉｍａ Ｈ－）：５ｐｍｏｌのＣｙ５－Ｂ２９｜｜３０基質（配列番号２４および２８、図３２）、５０ｐｍｏｌのＯＴＤＮ、２００ＵのＭａｘｉｍａ Ｈ－ＲＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＥＰ０７５２）、１ｘＲＴ緩衝液を、５０℃で２０分間インキュベーションした（図１１Ａ～１１Ｃ）。
図１１Ａ～１１Ｃから分かるように、対応する酵素に典型的かつ推奨される反応条件下（緩衝液および反応温度など）で、試験されたすべてのポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを組み込むことができた。また、様々なリンカーを含むオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが、試験されたポリメラーゼの各々によって組み込まれた。また、ＲＴポリメラーゼがオリゴヌクレオチドが連結されたデオキシヌクレオチドの複数の組み込みを実施できることも確認された。１１２ｎｔのＲＮＡ断片（配列番号３０）をＣｙ５が標識された相補的ＤＮＡプライマー（配列番号２９）にアニーリングし、ＲＴポリメラーゼでプライマー伸長反応条件に供した（図１２Ａ、矢印はオリゴヌクレオチドが連結されたｄＣＴＰ組み込み部位を示す）。反応混合物は、オリゴヌクレオチドが連結されたデオキシシチジンおよび未修飾（天然）のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰを含んだ。次いで、反応産物を２０％ＴＢＥ－尿素ＰＡＧＥで分解した（図１２Ｂ）。レーン８の複数のバンドにより、複数のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド組み込み事象が確認する。したがって、典型的な反応条件下（緩衝液および反応温度など）で、Ｍａｘｉｍａ Ｈ－ＲＴは、合成されたＤＮＡ鎖の複数の位置にオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを組み込むことができた。また、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡプライマー／鋳型系のいずれかが使用された場合、逆転写酵素は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを組み込み、核酸鎖をさらに伸ばすことができた。
Ｂ．オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込み
オリゴヌクレオチドが連結されたデオキシヌクレオチドと同様の実験系を使用した。２つのアニーリングされたオリゴヌクレオチドの二本鎖の突出した５’末端の充填を実施した。ｄＴＴＰとの反応は、突出した末端での完全な充填、および１０ヌクレオチドまでプライマーの伸長をもたらしたが、単一のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを組み込むと、２３ｎｔのオリゴヌクレオチド（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼについては配列番号２、ならびに他のポリメラーゼ反応については配列番号１）でプライマーが標識化された。
プライマー伸長反応は、試験した各ポリメラーゼについて最適な緩衝液および温度で実施された。反応ごとに、２ｐｍｏｌの基質オリゴヌクレオチド二本鎖（配列番号３１および３２、図３３）および２０ｐｍｏｌのｄＴＴＰまたはオリゴヌクレオチドに連結されたｄｄＵＴＰ（化合物１０の構造に対応）を使用した。次いで、反応産物を１５％ＴＢＥ－尿素ＰＡＧＥで分解した（ＴｄＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の結果を図１３に、他のポリメラーゼの結果を図１５Ａ－１５Ｅに示す）。伸長プライマーは５’－Ｃｙ５蛍光標識を有するため、プライマー伸長産物が検出された。オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みによってＲＮＡの３’末端を標識するポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ，ＵＳＡ）の能力を、合成した１００ｎｔの転写産物で試験した。１ｐｍｏｌのＲＮＡおよび１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰ（配列番号２）を、製造元の推奨に従って実施されたテーリング反応に使用した。Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して反応産物を精製し、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｋｉｔを使用してＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析した（図１４）。この実験の結果により、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰを組み込んでいることを確認する。
オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰの組み込みが可能であると同定されたポリメラーゼは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、およびＰｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－（図１５Ａ～１５Ｅ）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）（図１３）、およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（図１４）を含む。この実施例および図１３から１５で提供される結果は、有利には、Ａ型、Ｂ型、Ｘ型ポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む様々な種類のプのポリメラーゼが、本開示のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みに使用され得ることを示す。さらに、ポリＵポリメラーゼなどの鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを組み込むことができる。また、組み込みは、対応するポリメラーゼに典型的な、緩衝液および温度などの反応条件下で起こり得る。
実施例３．読み過ごし評価実験
Ｓｔａｓｅｖｓｋｉｊ ｅｔ ａｌ．によって実証された非天然な接合のポリメラーゼの読み過ごしは、発明者らの実験モデルにおいて（図１６のプロセススキーム）確認された。簡単に説明すると、特定のプライマーは、組み込まれたオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのポリメラーゼ読み過ごしが成功した場合にのみＰＣＲ産物を生成するように設計された。最初に、この特定の例において、第１のプライマーは、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれる最初のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドが連結されたデオキシヌクレオチドであるように、鋳型にアニーリングされる。次いで、反応混合物の１５％を別の反応混合物に移し、そこで第２のプライマーをアニーリングし、プライマー伸長のためにＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが添加される。次いで、伸長断片を２ｘ Ｍａｘｉｍａ ＨＳ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む）でＰＣＲ増幅する。正しい読み過ごし事象を確認するために、得られたＰＣＲ断片をクローン化し、サンガー配列決定を行った（データは示していない）。結果は、予想されるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込み位置、および連結されたオリゴヌクレオチドの５’－ヌクレオチドとオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドとの間のリンカーをポリメラーゼが読み過ごすことを示した。
上記のスキームのステップＩＩＩ（図１６）からの組み込まれたオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのポリメラーゼプライマー伸長／読み過ごし産物を、読み過ごし産物の３’末端に相補的な一本鎖Ｃｙ５ ２９ｎｔプライマーを含む別の短いＰＣＲ（図１７Ａ）において使用した。レーン６（図１７Ｂ）で観察されたように、Ｃｙ５伸長プライマーのサイズはＣｙ３プライマーと一致しており（両方の色素が観察された）、これは、連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされたプライマーを伸長する場合に、ポリメラーゼが連結されたヌクレオチドによって形成された非天然リンカーを正しく読み過ごすことができるという結論につながる。一実施形態において、ポリメラーゼは、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－である。
実施例４．ＮＧＳライブラリの調製
Ａ．プライマー伸長およびランダム終結による配列決定対応のライブラリの調製
概念実証（図３）実験を、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ゲノムＤＮＡおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ、ならびに試料入力としてＡＴＣＣ（商標）ＭＳＡ－１００２（商標）２０ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｖｅｎ Ｍｉｘ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＡＴＣＣ、ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。Ｍ１３ｍｐ１８遺伝子座を標的とする２つの特異的プライマーは、５’末端にユニバーサルプライミング部位（配列番号８および９の１～２１ｎｔ）を含むように設計された（図１８Ａ）。
配列番号８：５’－ＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＡＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴＣＴＴＧ－３’
配列番号９：５’－ＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣ－３’
両方のプライマーを以下の反応混合物中でＭ１３ｍｐ１８ ＤＮＡと混合した。１２５ｆｍｏｌの各配列番号８および配列番号９プライマー、１００ｆｍｏｌのＭ１３ｍｐ１８ ＤＮＡ、１．８ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰ（配列番号１）、１８ｐｍｏｌのｄＴＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＡＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＣＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＧＴＰ、４０ＵのＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、２μＬの反応緩衝液およびヌクレアーゼフリーの水を２０μＬの最終反応量にしたもの。プライマー伸長反応は、９５℃で３０秒間の変性および６０℃で２分間のアニーリング／伸長の１５サイクル、続いて６０℃で３０分間の最終伸長で実施された。核酸の固定化について製造元の指示に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２７０ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）で精製することにより、オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰを含む分子に対して反応産物を濃縮した。精製されたプライマー伸長産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）システム用のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）からの１０Ｘ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘを使用して、この実験ではＰＣＲサイクル数は３０であったことを除いて標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）の反応条件に従ってインデクシングＰＣＲに供し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）機器と互換性のある全長配列決定アダプターを導入した。あるいは、プライマー伸長反応量の半分を、中間精製ステップをしないでインデクシングＰＣＲに直接移した。インデクシングＰＣＲの後、Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してライブラリを精製した。得られた試料中に配列決定対応分子が存在することは、標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）プロトコルに従ったｑＰＣＲによって確認された。得られたライブラリは、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２，３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）で配列決定され、２Ｘ７５ｂｐペアエンドリードが実施された。配列決定リードのＭ１３ｍｐ１８参照へのアラインメントは、５’末端が固定された位置で始まる２つのゲノム遺伝子座の予想されるカバレッジを示し、オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰ組み込み遺伝子座に対応する３’末端、はランダムな部位で発生した（図１８Ｂ）。プライマー伸長反応後の精製の有無にかかわらず増幅された試料間で、配列決定結果に有意差はなかった。
ランダムデカマーは、全ゲノム配列決定用途においてオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを試験するために設計された。
配列番号１０：５‘－ＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’
配列番号１０のプライマーを以下の反応混合物中でＥ．ｃｏｌｉのｇＤＮＡと混合した。２０μＬの最終反応容量に対して、３５０ｐｇ～１００ｎｇのＥ．ｃｏｌｉのｇＤＮＡ、１０～１００ｐｍｏｌのランダムデカマー、１．８ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰ（配列番号：１）、１８ｐｍｏｌのｄＴＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＡＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＣＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＧＴＰ、４０ＵのＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、２μＬの反応緩衝液およびヌクレアーゼフリー水。プライマー伸長反応を以下のとおりに実施した。９２℃で３分間変性し、続いて１６℃に冷却し、１６℃で５分間インキュベーションし、０．１℃／ｓのランプ速度で６８℃に温度を上げ、６８℃で１５分間インキュベーションし、次いで９２℃で３０秒間の変性および６８℃で５分間のアニーリング／伸長を２５サイクルし、続いて６８℃で３０分間最終伸長した。精製されたプライマー伸長産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）システム用のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）からの１０Ｘ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘを使用して、この実験ではＰＣＲサイクル数は３５であったことを除いて標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）の反応条件に従ってインデクシングＰＣＲに供し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）機器と互換性のある全長配列決定アダプターを導入した。インデクシングＰＣＲの後、Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してライブラリを精製した。得られた試料中に配列決定対応分子が存在することは、標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）プロトコルに従ったｑＰＣＲによって確認された。得られたライブラリは、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２，３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）で配列決定され、２Ｘ１００ｂｐペアエンドリードが実施された。配列決定リードのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２参照へのアラインメントは、全Ｅ．ｃｏｌｉ染色体に沿ってリードが分布して、＞７５％のアラインメント率を示した（図１９）。
細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の末端を標的とし、外側を向いている特定のプライマーは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のゲノムコンテキストの分析に対するオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド技術の適用性を実証するために設計された（図２０Ａ－Ｃ）。この原理は、既知の特定の遺伝子座の近くにある未知の配列領域を調査することを目的とした任意の実験系に適用できる。
配列番号１１：ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＣＣＧ
配列番号１２：ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡＫＲＡＴＣＡＡＡＣＴＣＴ
配列番号１３：ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＡＴＴＣＴ
配列番号１４：ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＴＣＴ
配列番号１５：ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＡＴＣＧＡＡＣＣＣＴ
プライマー配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５をそれぞれ４：１：１：１のモル比で混合した。多重プライマー伸長反応を組み立てた。１μＬのＡＴＣＣ（商標）ＭＳＡ－１００２（商標）２０ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｖｅｎ Ｍｉｘ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＡＴＣＣ、ＶＡ，ＵＳＡ）、１２．５ｐｍｏｌの配列番号１１のプライマー、１２．５ｐｍｏｌの配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のプライマーミックス、１．８ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰ（配列番号１）、０．１８ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＣＴＰ（配列番号３）、１８ｐｍｏｌのｄＴＴＰ、１８ｐｍｏｌのｄＣＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＧＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＡＴＰ、４０ＵのＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、２μＬの反応緩衝液およびヌクレアーゼフリーの水を２０μＬの最終反応量にしたもの。反応条件は以下のとおりであった：９５℃で４分間の初期変性、１５サイクルの線形伸長／終結（９５℃で１分間、４５℃で３０秒間、７２℃で１分間）、６０℃で５分間の最終伸長。Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して反応産物を精製した。全長のＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）互換アダプターの最終増幅および導入は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）システム用のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）からの１０Ｘ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘを使用して、この実験ではＰＣＲサイクル数は２０であったことを除いて標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）の反応条件に従って実施された。インデクシングＰＣＲの後、Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してライブラリを精製した。
産生されたすべてのライブラリに配列決定対応分子が存在することは、標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）プロトコルに従ったｑＰＣＲによって確認された。得られたライブラリは、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２，３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）で配列決定され、２Ｘ１５０ｂｐペアエンドリードが実施された。
結果は、外向きのライブラリが複雑な細菌集団を特徴づけることができることを示した。２０個の予想される種のうち１７個が外向きの断片ライブラリ試料で同定された（図２１）。
Ｂ．転写産物の長さ全体をカバーする配列決定対応のライブラリの調製
概念実証（図２２）実験は、試料入力としてヒト全ＲＮＡを使用して実施された。最初に、１μｌのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）試料を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）の標準プロトコルに従って、オリゴ（ｄＴ）30プライマーを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡを、断片化したＲＮＡをクリーンアップするためのプロトコル（Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）マニュアルに記載）に従って、Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを使用して精製した。第２の鎖合成のために、以下の反応混合物を組み立てた。２０μＬの最終反応容量に対して、精製されたｃＤＮＡ、１ｐｍｏｌのランダムプライマー（配列番号１０）、１８ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰ（配列番号１）、１８０ｐｍｏｌのｄＴＴＰ、２００ｐｍｏｌのｄＡＴＰ、２００ｐｍｏｌのｄＣＴＰ、２００ｐｍｏｌのｄＧＴＰ、４０ＵのＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、２μＬの反応緩衝液およびヌクレアーゼフリー水。反応条件は、９５℃で３分間の変性、１６℃に冷却および１６℃で５分間のインキュベーション、５０℃で３０分間のプライマー伸長である。ランダムプライマー伸長の１サイクル後、核酸の固定化についての製造元の指示に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２７０ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）で精製することにより、オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰを含む分子に対して反応産物を濃縮した。精製されたプライマー伸長産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）システム用のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）からの１０Ｘ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘを使用して、標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）の反応条件（この実験ではＰＣＲサイクル数は２０であった）に従ってインデクシングＰＣＲに供し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）機器と互換性のある全長配列決定アダプターを導入した。得られた試料中に配列決定対応分子が存在することは、標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）プロトコルに従ったｑＰＣＲによって確認された。得られたライブラリは、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２，３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）で配列決定され、２Ｘ７５ｂｐペアエンドリードが実施された。データ分析により、ヒトゲノムへの９４．４～９７．２％のアラインメント率、９７．８～９８．７％の鎖特異性、転写産物全体にわたる遺伝子本体のカバレッジは、ｍＲＮＡ配列決定ライブラリに典型的な３’末端にわずかにバイアスがあることが明らかになった（図２３）。
Ｃ．転写産物の３’末端をカバーする配列決定対応のライブラリの調製
概念実証（図２４）実験は、試料入力としてヒト全ＲＮＡを使用して実施された。Ｔｏｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）試料は、オリゴ（ｄＴ）プライマー配列番号１６：５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’を使用して逆転写された。
逆転写反応混合物は、２０μＬの最終反応容量に対して、２０ｐｇ～１μｇの全ＲＮＡ、ＥＲＣＣ ＥｘＦｏｌｄ ＲＮＡスパイクイン（任意選択で、量は製造元の指示に従って選択、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、５０ｐｍｏｌの逆転写プライマー（配列番号１６）、１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰ（配列番号１）、１０ｐｍｏｌのｄＴＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＡＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＣＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＧＴＰ、１μＬの１００ｍＭのＤＴＴ、４μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）用の５Ｘ ＲＴ緩衝液、２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）およびヌクレアーゼフリーの水である。反応は５０℃で３０分間行った。核酸の固定化についての製造元の指示に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２７０ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）で精製することにより、オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰを含む分子に対して反応産物を濃縮した。次いで、タグ付けされたｃＤＮＡを、標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）の反応条件に従ってインデクシングＰＣＲに直接供し得る。この実験のＰＣＲサイクル数は、開始入力量に応じて２０～２５であり、インデクシングプライマーは次のとおりである。
配列番号１７：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣ－３’
配列番号１８：５‘－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３‘
あるいは、試料は、増幅に使用されるポリメラーゼよりも非定型リンカーの読み過ごしの高い効率を示すポリメラーゼを使用して線形に前増幅され得る。この場合、精製されたタグ付けされたｃＤＮＡを以下の反応に供した。２０μＬの最終反応容量に対して、ｃＤＮＡ、４μＬの５Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＨＦ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、１μＬのｄＮＴＰミックス（各２ｍＭ）、１．２ｐｍｏｌのｄｄＵＴＰにコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドに相補的なプライマー（配列番号１８）、２．５ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）およびヌクレアーゼフリー水。プライマー伸長を、９５℃で１分間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長を１０サイクルで実施した。次いで、断片化したＲＮＡをクリーンアップするためのプロトコル（Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）マニュアルに記載）に従って、Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを使用して反応産物を精製した。線形前増幅した後、試料を非対称的にＰＣＲ増幅し、全長配列決定アダプターの導入を完了した。５０μＬの最終反応容量に対して、２０μＬの精製された線形増幅産物、２５μＬのＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、４６ｐｍｏｌの配列番号１７のプライマー、４．６ｐｍｏｌの配列番号１９：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ－３’プライマーおよびヌクレアーゼフリー水。ＰＣＲ条件は、標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）プロトコルにおいて推奨されているとおりであったが、この実験のＰＣＲサイクル数は、開始入力量に応じて２０～２５であった。ＰＣＲ後、Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してライブラリを精製した。得られた試料中に配列決定対応分子が存在することは、標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）プロトコルに従ったｑＰＣＲによって確認された。得られたライブラリは、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２，３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）で配列決定され、ペアエンドリード（１０ｂｐのＲ１および７５ｂｐのＲ２）が実施された。データ分析は、ヒトゲノムへの＞９０％のアラインメント率、＞９９％の鎖特異性、および３’末端への強いバイアスを有する遺伝子本体カバレッジを示した（図２５）。
あるいは、５’ヘキシニル修飾を有するオリゴヌクレオチドを使用して合成された配列番号４のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを使用して、同等の品質の配列決定データを得た。逆転写反応条件および３’ｍＲＮＡ－ｓｅｑライブラリの下流処理は上記のとおりであった。得られたライブラリは、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込み部位から開始する配列決定リードにおいて期待される塩基組成を示した（図２６Ａ～２６Ｂ）。
ｍＲＮＡの３’末端をカバーする配列決定対応ライブラリは、複数の単一細胞からも調製され得る。ＨＥＫ２９３細胞およびＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の混合物を、細胞およびバーコード付けされたビーズの同時カプセル化に使用されたＮａｄｉａ（商標）機器（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｂｉｏ，Ｂｌａｃｋｔｒａｃｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｌｔｄ、Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）についての推奨に従って調製した。オリゴ（ｄＴ）３０プライマー（配列番号４０）、ビーズ特異的バーコード、および特有の分子同定子（ＵＭＩ）として機能するランダム化領域を含むバーコード付けされたビーズ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、ＭＡ，ＵＳＡ）を、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｂｉｏの推奨に従って調製し、それを使用して、ｃＤＮＡ合成をプライミングし、区画特異的および分子特異的タグを導入した。
カプセル化に続いて、エマルジョンを破壊し、Ｎａｄｉａ（商標）についての標準的なＤｒｏｐ－ｓｅｑのプロトコルにおける推奨のとおりにビーズを洗浄した。次に、ビーズを以下のとおりに実施した逆転写反応に供した。２２０μＬの最終容量に対して、４４μＬの５Ｘ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、３４４ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＣＴＰ（配列番号３）、５０ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、５０ｎｍｏｌのｄＣＴＰ、５０ｎｍｏｌのｄＧＴＰ、５０ｎｍｏｌのｄＴＴＰ、１１μＬの１００ｍＭのＤＴＴ、４４μＬの２０％のＦｉｃｏｌｌ（商標）ＰＭ４００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ，ＵＳＡ）、２２０ＵのＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）組換えリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、２２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、およびヌクレアーゼフリー水。ビーズを２００μＬの逆転写反応混合物に懸濁し、室温で３０分間インキュベーションした後、５０℃で１時間第２のインキュベーションを行った。次いで、Ｎａｄｉａ（商標）プロトコルの指示について標準のＤｒｏｐ－ｓｅｑに従ってビーズを洗浄し、線形増幅に供した。５０μＬの最終反応容量に対して、約２０００個のビーズ、１０μＬの５Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、５ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、５ｎｍｏｌのｄＣＴＰ、５ｎｍｏｌのｄＧＴＰ、５ｎｍｏｌのｄＴＴＰ、３００ｐｍｏｌの配列番号１８のオリゴヌクレオチド、６．２５ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、およびヌクレアーゼフリー水。線形増幅は、９５℃で１分間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を１０サイクルで実施された。次いで、Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して反応産物を精製し、このステップでビーズを廃棄した。次に、精製された線形増幅産物を、Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、４６ｐｍｏｌの配列番号１７のプライマーおよび４．６ｐｍｏｌの配列番号１９のプライマーを使用して増幅した。ＰＣＲサイクル数は２５であった。
得られたライブラリに配列決定対応分子が存在することは、標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）プロトコルに従ったｑＰＣＲによって確認された。次いで、ライブラリは、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２，３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）で配列決定され、ペアエンドリード（２１ｂｐのＲ１および７５ｂｐのＲ２）が実施された。データ分析は、細胞トランスクリプトームのタンパク質コード部分の予想される捕捉を示した（図２７Ａ～２７Ｄ）。
あるいは、細胞をバーコードビーズおよび液滴中のＲＴ／溶解混合物でカプセル化し得、逆転写反応後にエマルジョンを破壊し得る。
Ｄ．転写産物の５’末端をカバーする配列決定対応のライブラリの調製
概念実証（図２８）実験は、試料入力としてヒト全ＲＮＡを使用して実施された。最初に、ｔｏｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）試料を、オリゴ（ｄＴ）プライマー（配列番号９）および以下の配列の鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを使用して逆転写した。「Ｇ」の前の「ｒ」はリボヌクレオチド塩基を示す。
配列番号２０：５‘－ＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＧＡＴＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮｒＧｒＧｒＧ－３’
反応混合物は、１９μＬの最終容量に対して、１μｇの全ＲＮＡ、５０ｐｍｏｌの逆転写プライマー（配列番号１６）、４μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ用５Ｘ ＲＴ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、１μＬのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、１μＬの１００ｍＭのＤＴＴ、３μＬの５０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ－８０００、２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）およびヌクレアーゼフリー水である。逆転写反応を、５０℃で１０分間実施した。次いで、反応混合物に２０ｐｍｏｌの鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（配列番号２０）を補充し、５０℃でさらに１５分間インキュベーションした。次いで、断片化されたＲＮＡのクリーンアップについてのプロトコル（Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）マニュアルに記載）に従って、Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを使用してｃＤＮＡを精製した。転写産物の５’末端にタグ付けされた配列番号２０オリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡ領域に相補的な（下線を引いた）プライマー配列番号２１を使用して、第２の鎖合成を実施した。

Figure 2022537069000034
第２の鎖合成反応混合物は、２０μＬの最終反応容量に対して、精製されたｃＤＮＡ、１ｐｍｏｌの配列番号２１のプライマー、１．８ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰ（配列番号１）、１８ｐｍｏｌのｄＴＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＡＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＣＴＰ、２０ｐｍｏｌのｄＧＴＰ、４０ＵのＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、２μＬの反応緩衝液およびヌクレアーゼフリー水である。プライマー伸長反応は、９５℃で３分間の変性を１サイクル、次いで９５℃で３０秒間の変性および６０℃で２分間のアニーリング／伸長を１０サイクルを実施し、その後６０℃で５分間最終伸長を行った。核酸の固定化についての製造元の指示に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２７０ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）で精製することにより、オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＵＴＰを含む分子に対して反応産物を濃縮した。精製されたプライマー伸長産物を、配列番号１７または配列番号１８のプライマーを使用して、この実験ではＰＣＲサイクル数は２５であったことを除いて標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）の反応条件に従ってインデクシングＰＣＲに供し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）機器と互換性のある全長配列決定アダプターを導入した。インデクシング後、Ｃｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してＰＣＲライブラリを精製した。得られた試料中に配列決定対応分子が存在することは、標準のＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）プロトコルに従ったｑＰＣＲによって確認された。得られたライブラリは、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２，３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）で配列決定され、ペアエンドリード（１００ｂｐのＲ１および７５ｂｐのＲ２）が実施された。データ分析は、ヒトゲノムへの８３％のアラインメント率、９１．１％の鎖特異性、および５’末端へのバイアスを有する遺伝子本体カバレッジを示した（図２９）。
Ｅ．ＰＣＲフリーの配列決定対応ライブラリの調製
配列決定プラットフォームに統合されたポリメラーゼがコンジュゲーションリンカーを読み過ごすことができる限り、ＤＮＡ試料およびＲＮＡ試料の両方からＰＣＲフリーの配列決定対応ライブラリの調製が可能である。全長アダプターに対応する５’アンカーを有するプライマーを使用したワンステップのプライマー伸長、および第２の全長プラットフォーム特異的アダプター配列を有するオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みによる終結は、増幅ステップなしで配列決定に供され得る配列決定対応一本鎖ライブラリを完全に生成することができる。これは、必要なライブラリの調製のステップが少なくなるという利点を提供する。ＲＮＡ試料を使用する場合、そのような戦略は、５’および３’末端にアダプターを含む配列決定対応の一本鎖ＤＮＡを達成するために必要なのは、第１の鎖のｃＤＮＡの合成のみであるというさらなる利点を提供する。
以下の実験（対応するスキームは図３５Ａに提供される）は、入力としてＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して実施された。全長Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５アダプター（配列番号３４の１～５７ヌクレオチド）を含む逆転写プライマー（配列番号３４）を使用して、５００ｎｇのＲＮＡを逆転写した。
配列番号３４：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’
ＲＮＡを、５ｍＭのＤＴＴを補充した１Ｘ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ＲＴ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）中、５０ｐｍｏｌの逆転写プライマー、２０ｐｍｏｌのｄＮＴＰミックス、２ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＣＴＰ（配列番号３５）、２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素と混合した。反応容量は２０μＬであった。反応を５０℃で３０分間実施し、続いて８０℃で１０分間不活化した。
配列番号３５：ｄｄＣＴＰ－ＡｌｄＵ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＧＣＣＴＡＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’－ビオチン
不活化後、ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を反応混合物に添加して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖からＲＮＡ鎖を分解した。ＲＮａｓｅ Ｈでの反応を３７℃で２０分間インキュベーションした。オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドで標識されたｃＤＮＡは、核酸の固定化についての製造元の指示に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）で精製された。精製されたｃＤＮＡ断片を、ＭｉＳｅｑ Ｎａｎｏ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２，３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器で配列決定に直接供した（有利なことに、断片ライブラリはすでにｓｓＤＮＡ形式であるため、ＮａＯＨ変性ステップは必要なかった）。２５ｂｐ Ｒ１および１００ｂｐ Ｒ２のペアエンドリードが実施された。データ分析により、正しい構造のリードの存在が明らかになった（すなわち、オリゴヌクレオチドに連結されたジデオキシヌクレオチド内のＡｌｄＵ修飾に対応するＡＧヌクレオチドから始まるＲ２、およびｄｄＣＴＰ組み込み部位、図３５Ｂ）。そのようなリードの９３％は、タンパク質をコードする遺伝子に対応し、実験計画から予想されるように転写物の３’末端をカバーしていた（図３５Ｃ）。
同様の原理を、ＤＮＡ試料からのＰＣＲフリーのライブラリの調製にも採用し得る。全長アダプターハンドルは、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みが可能なＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る、任意のランダムまたは配列特異的プライマーの５’領域に付加され得る。一例として、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｅｑｕｅｎａｓｅまたはＰｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼを使用し得る。
Ｆ．ＤＮＡの線形増幅および配列決定対応のライブラリの調製
線形ＤＮＡ増幅は、Ｔ７プロモーター配列番号５から特異的にＲＮＡ合成を開始するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写を介して実施される。Ｔ７プロモーター配列のＤＮＡのタグ付けは、そのような配列を含むオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの組み込みによって達成される。
オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド（配列番号２２）からのインビトロ転写開始を実施して、そのような複合体のＲＮＡ合成の開始部位として機能する能力を試験した。配列番号２２のオリゴヌクレオチドが連結されたデオキシヌクレオチドは、配列番号２４のオリゴヌクレオチドの伸長により、オリゴヌクレオチド二本鎖配列番号２４＋配列番号２５に組み込まれた。
配列番号２４：５’－ＴＧＣＡＧＡＣＡＴＧＧＧＴＡＧＧＣＡＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡ－３’
配列番号２５：５’－ＧＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡ－３’
次いで、相補鎖（配列番号２６）を添加して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが二本鎖であることを確実にした。
配列番号２６：５’－ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＧＴＴＡＣＡＴＣＴＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＡ－３’
推奨されるＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）の反応条件に従って、インビトロ転写を実施し、インキュベーションを３７℃で一晩実施した。次いで、転写産物をＤＮａｓｅ Ｉで処理して鋳型を除去し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅＸＰ（商標）磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＲＮＡを精製した。得られた転写産物を、ＲＮＡ Ｐｉｃｏ６０００キットを使用してＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析した。結果は、ＲＮＡ転写産物の存在を示した（図３０）。結果は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドに含まれるＴ７プロモーター配列が機能的であり、インビトロ転写開始部位として機能し得、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの非天然リンカーを読み過ごすことができたことを示す。
実施例５．ＤＮＡ末端標識化
Ａ．核酸の５’末端のタグ付け
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ）または同様の構造に結合され得る（図３４）。この場合、オリゴヌクレオチドはその３’末端を介してヌクレオチドにコンジュゲートされる。そのようなオリゴヌクレオチドが連結されたキャッピングヌクレオチドは、インビトロ転写によるそれらのデノボ合成中の核酸の５’末端のタグ付けに有用である。オリゴヌクレオチドが連結されたキャッピングヌクレオチドは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、またはそのようなポリメラーゼの操作された変異体バリアントなどのＲＮＡポリメラーゼによって、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはキメラ転写物に組み込まれ得る。
いくつかの状況において、オリゴヌクレオチドは、その後の増幅のために、５’末端に事前に設計されたプライミング部位を提供する。３’末端の追加のプライミング部位は、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドでのタグ付け、ＴｄＴ、ＰＡＰまたはＰＵＰを使用したホモポリマー尾部の追加、または一本鎖アダプターのライゲーションを介して付加することができる。
Ｂ．鋳型非依存性ＤＮＡ末端標識化
末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によるオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド（ＯＴＤＤＮ）の組み込みを介して、事前に設計された配列での鋳型非依存性ＤＮＡ ３’末端標識化を達成し得る。標識化の第１のラウンドの後、コンジュゲーションリンカーを読み過ごすことができる任意のポリメラーゼによってジデオキシヌクレオチドにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドからのプライマー伸長時に相補鎖を合成し得る。次いで、新たに合成された鎖がアクセス可能な３’末端を有するため、ＤＮＡ末端標識化の第２のラウンドを実施し得る。
実験は、以下の配列の鋳型オリゴヌクレオチド（配列番号３６）を使用して実施された。
配列番号３６：リン酸－５’－ＧＣＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＧＴＴＧＴＡＡＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡ－３’
第１の３’末端標識化を、１Ｘ ＴｄＴ緩衝液中で、２ｐｍｏｌの鋳型オリゴヌクレオチド（配列番号３６）、１００ｐｍｏｌの配列番号４のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、４０ＵのＴｄＴ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。反応容量は３０μＬであった。反応混合物を３７℃で１．５時間インキュベーションし、続いて７０℃で１０分間反応を終結させた。タグ付けされた鋳型オリゴヌクレオチドをエタノール沈殿により精製し、第２の鎖合成に使用した。精製したＤＮＡを、１Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＧＣ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）中の３０ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、４ｐｍｏｌの標識されたプライマー（配列番号３７）および１６ｐｍｏｌの標識されていないプライマー（配列番号３８）、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド、および０．２ｍＭのｄＮＴＰミックスと混合した。
配列番号３７：Ｃｙ５－５’－ＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’
配列番号３８：５’－ＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’
反応混合物を、以下のサイクル条件を使用してサーマルサイクラーでインキュベーションした。９８℃で１分間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長を２０サイクル。反応産物をエタノール沈殿によって精製するか、Ｅｘｏ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）で３７℃で３０分間処理した。試料の一部をラムダエキソヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）で２、１０、または３０分間のいずれかで処理した（図３６Ｂ）。ラムダエキソヌクレアーゼを、８０℃で１０分間加熱することにより不活化した。Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ，７Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して遊離ヌクレオチドを除去し、エタノール沈殿によって試料を精製した。
ラムダエキソヌクレアーゼ処理により鋳型鎖が除去され、その後の標識のために第２の鎖のみが残った。ラムダエキソヌクレアーゼ処理が行われなかった場合、二本鎖の二本鎖は第２のラウンドの標識化に供された（図３６Ａ）。第１の標識化反応の産物を、１Ｘ ＴｄＴ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）中で、１００ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド配列番号４および３０ＵのＴｄＴ酵素と混合した。反応容量は１６μＬであった。反応混合物を３７℃で１．５時間インキュベーションし、続いて７０℃で１０分間不活化した。次に、反応産物を１５％ＴＢＥ－尿素ＰＡＧＥで分解した。
二重標識化産物はすべての場合に見られた。ｓｓＤＮＡはＴｄＴのより良い基質であるため、一本鎖の第２の鎖を第２の標識化反応の鋳型として使用した場合、標識化はより効率的であった（図３６Ｂ）。
Ｃ．鋳型依存性ＤＮＡ末端標識化
両方の末端でオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドによって標識された複数のＤＮＡ断片を作成することは、鋳型に依存する可能性があり、得られた断片を使用して、配列決定対応ライブラリを調製することができる。
実験は、図３７Ａに示される原理に従って実施された。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。５ｎｇのＤＮＡを、２０μＬの１Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）中で、２０ＵのＰｈｕｓｉｏｎエキソ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、１２．５ｐｍｏｌの特定のプライマー（配列番号３９）、０．４ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド配列番号４、４ｎｍｏｌのｄＮＴＰミックスと混合した。
配列番号３９：５’－ＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＣＣＧ－３’
プライマー伸長および終結反応は以下のように実施された。９８℃で３０秒間の初期変性、続いて９８℃で１分間の変性、４５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の伸長を１５サイクル、最終伸長は７２℃で１０分間実施された。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、反応産物を精製した。精製されたＤＮＡは、第１のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド領域からのプライマー伸長および終結によって第２のラウンドの標識化に供された。精製産物を、５０μＬの１Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）中で、２０ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）、１０ｐｍｏｌのプライマー配列番号１８、１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチド配列番号６、１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰミックスと混合した。反応条件は、プライマーアニーリングステップが６０℃で実施されたことを除いて、前の反応と同じであった。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、反応産物を精製した。二重にタグ付けされたＤＮＡ断片を、５０ｐｍｏｌのプライマー配列番号１７および５０ｐｍｏｌのプライマー配列番号１９を使用した１Ｘ Ｃｏｌｌｉｂｒｉ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）における増幅によって濃縮した。サイクル条件は以下のとおりであった。９８℃で３０秒間の初期変性、続いて９８℃で１０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長を２５サイクル、最終伸長は７２℃で１分間実施された。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、反応産物を精製した。得られたライブラリは、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２，３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器で配列決定され、２Ｘ１５０ｂｐペアエンドリードが実施された。データ分析により、正しい構造のリードの存在が明らかになった。すなわち、Ｒ１における第９の位置にＡヌクレオチド、およびＲ２における第１の位置にＡヌクレオチドを有するもであった（図３７Ａ～３７Ｂ）。それらのリードを、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにアラインメントした。
上記の原理は、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを組み込むことができ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅとの組み合わせを含むがこれに限定されないコンジュゲーションリンカーを読み過ごすことができるＤＮＡポリメラーゼの任意の組み合わせで実現され得る。各標識かステップで使用されるＯＴＤＤＮの量は、取得可能なＤＮＡ断片サイズの制御につながるように変更され得る。
実施例６．単一細胞分析のための核酸ライブラリを生成するためのワークフローの改善。
いくつかの実施形態において、例えば、細胞または核での単一細胞分析のワークフローの改善を容易にするために、もう１つのオリゴヌクレオチドが連結されたジドキシヌクレオチド（ＯＴｄｄＮＴＰ）を組み合わせバーコーディング反応において使用し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＯＴｄｄＮＴＰを、全トランスクリプトーム分析、全ゲノム分析、有向性ｍＲＮＡ分析、短いＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）分析、単一細胞タンパク質分析などの単一細胞ワークフローに組み込み得る。ほんの一例として、本明細書で提供されるのは、細胞集団内の単一細胞のトランスクリプトームを分析するためのワークフローである（図３８を参照されたい）。いくつかの実施形態において、方法は、細胞内の核酸およびタンパク質が無傷のままであり、それらの起源の細胞内に固定されるように、細胞集団内の細胞を固定化および透過化するステップを含み得る。同時に、透過化ステップは、試薬（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマーなど）が、例えば、逆転写、プライマー伸長、ライゲーション増幅反応などにおいて機能することができる細胞に入るのを可能にするように機能する。細胞を固定化および透過化する多くの方法が当技術分野において既知である。例として、本明細書に開示の実施形態において有用な細胞を固定化および透過化するための方法は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ（３６０）１７６－１８２，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、米国特許出願公開第２０１６／０１３８０８６号、および国際特許出願公開第２０１４／０６０８４３号に記載のものを含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、改善された組み合わせバーコーディングは、固定化／透過化された細胞を２つ以上の第１の部分（例えば、９６、３８４個、または任意の他の数の部分）に分割するステップを含み得る。各第１の部分を、第１の伸長プライマーと接触させ得る。第１の伸長プライマーは、第１のユニバーサルハンドル配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「ユニバーサル配列」という用語は、すべてのプライマーに存在する配列を指す。したがって、第１の伸長プライマーに存在する「第１のユニバーサルハンドル配列」という用語は、すべての第１の伸長プライマーに存在するハンドル配列を指す。
第１の（例えば、フォワード）伸長プライマーは、第１のバーコード配列を含み得る。プライマーはまた、第１のバーコードへの付加において目的のポリヌクレオチドへのランダムプライミングを可能にする３’配列（例えば、ランダムプライマー、ポリ（Ｔ）配列（例えば、３０－ｍｅｒのＴ）、または標的特異的配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第１のプライマーは、逆転写プライマーであり、第１のバーコードおよび３’ポリ（Ｔ）を含むプライマーと、第１のバーコードおよびランダムプライマー配列を含むプライマーとの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、逆転写プライマーは、５’末端にユニバーサルハンドルを含み得る。いくつかの実施形態において、逆転写プライマーは、特有の分子タグを含み得る。
いくつかの実施形態において、逆転写プライマーは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを含む。
逆転写プライマーに加えて、固定化／透過化された細胞を、逆転写が起こることを可能にする条件下で、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、および１つ以上のオリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰと接触させ得る。オリゴヌクレオチドが連結されたｄｄＮＴＰは、ｃＤＮＡの終結点が各ｍＲＮＡメッセージに対してランダムになるように、ｃＤＮＡに沿ってランダムに第１の鎖のｃＤＮＡ合成ステップに組み込まれ得る。そのため、ｃＤＮＡがその後増幅される場合、ランダムな終結点を使用して、どの増幅産物が単一のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡに由来するかを決定し得る。
いくつかの実施形態において、ｄｄＮＴＰに連結されたオリゴヌクレオチドは、３’末端にユニバーサルハンドルを含む。いくつかの実施形態において、その後、細胞を、結合することができ（例えば、相補的ヌクレオチド配列を介して）、非結合逆転写プライマーからの結合および／または伸長を阻害することができる１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させ得る。いくつかの実施形態において、その後、細胞を１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させない。
逆転写反応に続いて、固定化／透過化された細胞の部分をプールし、第２のラウンドのバーコード付加のために再び２つ以上の部分（例えば、９６、３８４個、または任意の他の数の部分）に分割し得る。
実施例７．ＯＴＤＤＮワークフロー対ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑワークフローの比較。ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑワークフローは、図３９に要約されているように、架橋、鋳型スイッチ、ライゲーションを介したバーコードの組み込み、およびＮｅｘｔｅｒａ断片化を使用する単一細胞または核トランスクリプトーム分析のための周知の方法である（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０，１７６－１８２（２０１８）を参照されたい）。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．に開示のプロトコルは、核酸配列決定およびトランスクリプトーム分析のためのヌクレオチドのライブラリを調製するのに最大１０時間以上かかる場合がある。さらに、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．に記載のプロトコルのようなｃＤＮＡおよびＤＮＡ配列にバーコードを付加するためにＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用することよりも、重合によるバーコードの付加（ＯＴＤＤＮに存在する３’オリゴの伸長）は、より顕著に効率的である。そのため、本明細書に記載のワークフローは、必要な時間および操作を低減し、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇプロトコルと比較して感度を顕著に向上させる可能性を提供する。オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチのドワークフロー（実施例６および図４０で説明されているようなＯＴＤＤＮワークフロー）は、複数のワークフローステップ（例えば、鋳型スイッチおよびＮｅｘｔｅｒａ断片化ステップなど）を回避して、ワークフロー時間を約４．５時間に顕著に低減できる。そのため、ＯＴＤＤＮ組み合わせバーコーディングは、従来のＳＰＬｉＴ－ｓｅｑプロトコルに必要な１０時間以上と比較して、ワークフロー時間を顕著に低減できる。
このＯＴＤＤＮワークフローにおいて、第１のＳ７－ＭＥ－ＲＴバーコード－Ｔ３０プライマーがｍＲＮＡのｐｏｌｙＡ尾部に結合し、逆転写（ＲＴ）を可能にする。Ｓ７配列は、増幅中にアダプターを付加するためのハンドルとして機能し、モザイク末端（ＭＥ）配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでの配列決定に使用される。さらに、図４０の代表的な方法において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定方法に特異的なアダプター（Ｐ７、Ｐ５、インデックス７、およびインデックス５）が付加されて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を可能にする。ただし、現在の方法では、特定のＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを追加する必要はなく、方法論はどの配列決定プラットフォームに対して適応性がある。
実施例８．特有のバーコードを使用した分割およびプールする方法
単一細胞の分解能は、フローサイトメトリーまたは液滴法による分離など、様々な方法でライブラリの調製において達成され得る。本明細書に開示の組成物および方法は、単一細胞分解能を生成するための組み合わせバーコーディングの改善された方法を提供し、試料由来の細胞または核は、分割され、バーコード付けされ、そして複数回プールされる。このようにして、特定の単一セルからの試料は、分割、バーコーディング、およびプールの複数のラウンドを介した種々のバーコードの導入に基づいて、複数のバーコードを受け取ることができる。このプロセスは、同じ元の試料にあった他の単一細胞と比較して、特有の複数のバーコードのセット（つまり、バーコードの組み合わせ）を有する単一細胞由来の試料をもたらす。
現在の分割－プール方法の力は、バーコーディング尺度が利用可能なバーコードの数に直接比例することである。分割プールはまた、細胞を大量に処理することを可能にし、本明細書に記載のとおり多重化に適している。
実施例９．単一セルまたは核の分解能のための代表的なＯＴＤＤＮベースの組み合わせバーコーディングワークフロー
この実施例では、ＯＴＤＤＮベースの組み合わせバーコーディングを使用して、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の単一細胞の分析のためのＮＧＳ対応核酸ライブラリを調製した実験について説明する。
ステップ１－細胞の調製。ＨＥＫ－２９３、ＮＩＨ－３Ｔ３、ｉＰＳＣ、またはＰＢＭＣは、ＲＮａｓｅ阻害剤の存在下で細胞を１％または２．５％のパラホルムアルデヒド／１％のＴｒｉｘｔｏｎＸ１００と３０分間インキュベーションすることで固定された。細胞を約５～１０ｘ１０5細胞／ｍＬに希釈し、Ｆｌｏｗｍｉ（商標）４０μ細胞ストレーナーで１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００および２００ＵまたはＳＵＰＥＲＡＳＥ（登録商標）ＲＮＡｓｅ阻害剤を含む細胞希釈緩衝液にろ過した……ｋｋｋｋｆｊｆ……Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）ＩＩセルカウンターを使用して細胞を二重にカウントした（１５μｌ細胞＋１５μｌトリパンブルー染色０．４％）。細胞密度が１ｘ１０6細胞／ｍＬより大きい場合、細胞を約５ｘ１０5に希釈し、次いでろ過した。
ステップ２：逆転写（ＲＴ）。表３に示すように、ＲＴマスターミックスを氷／コールドブロック上で調製した。
Figure 2022537069000035
ＲＴマスターミックスをウェル当たり２０μＬで９６ウェルＲＥＤ ＭｉｃｒｏＡｍｐ ＥｎｄｕｒａＰｌａｔｅに分注した。ＥｎｄｕｒａＰｌａｔｅの各ウェルには、５０ｐｍｏｌｅｓの第１の伸長プライマーが事前に充填されている。第１の伸長プライマーは、特有のバーコード（つまり、ウェル特異的バーコード）およびユニバーサルな第１のハンドル配列を含んだ。プレートを密封し、短時間ボルテックスし、遠心分離して液体を収集した。ＲＴマスターミックスに存在するＯＴＤＤＮのオリゴ薬は、第２のユニバーサルハンドル配列を含んだ。
逆転写を５０℃で３０分間実施し、続いて４℃で保持した。
ステップ３－連結されたオリゴ伸長 ステップ２からのＲＴ反応を事前に冷却した清潔な２５ｍＬリザーバーに混ぜ合わせ／プールして、よく混合し、２ｘ１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。チューブを８００ｘｇで３分間遠心分離した後、上清を除去した。
各チューブの内容物を、１Ｘ ＳＳＩＶ緩衝液および１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む１ｍＬ洗浄緩衝液で再懸濁し、ピペッティングにより混合した。試料を８００ｘｇで３分間遠心分離した後、上清を除去した。洗浄は、合計２回の洗浄で繰り返した。
各チューブの内容物を１ｍＬのＲＴ洗浄緩衝液で再懸濁し、ピペッティングにより混合した。細胞をＦｌｏｗｍｉ（商標）４０μｍ細胞ストレーナーで、事前に冷却した単一の２５ｍＬリザーバーにろ過した。表５に記載のオリゴ伸長マスターミックスをろ過した細胞混合物に加え、ピペッティングにより十分に混合した。
Figure 2022537069000036
２０μＬのプライマー伸長マスターミックス中のプールされた細胞を、第２のユニバーサルハンドル配列に相補的な領域である特有のバーコード（すなわち、ウェル特異的バーコード）、およびユニバーサル第３のハンドル配列を含む５０ｐｍｏｌｅｓのスプリントオリゴヌクレオチドを事前充填した９６ウェルのＢＬＵＥ ＭｉｃｒｏＡｍｐ ＥｎｄｕｒａＰｌａｔｅの各ウェルに添加した。スプリントを横断するオリゴ伸長を、５０℃で２０分間実施し、続いて４℃で保持した。
ステップ４細胞溶解。２Ｘ溶解緩衝液を３７℃に少なくとも１０分間予熱した。各ウェルに２μＬの０．５ＭのＥＤＴＡを添加し、ウェルを混合することにより、伸長反応を停止した。細胞を予冷したリザーバーにプールし、よく混合し、２本の１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。８００ｘｇで３分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去した。）。細胞ペレットを１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む１ｍＬの細胞洗浄緩衝液に再懸濁し、ピペッティングにより混合した。細胞洗浄を繰り返し、ペレットを７００μＬの細胞洗浄緩衝液中に混ぜ合わせた。試料を混合し、Ｆｌｏｗｍｉ（商標）４０μｍ細胞ストレーナーを通して新しい１．５ｍＬチューブにろ過した。２５μＬのろ過した細胞を、１００μｇのプロテイナーゼＫおよび２５μＬの２Ｘ溶解緩衝液を含む９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。
消化は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（登録商標）内で５５～５６℃、３００ｒｐｍで３０分間インキュベーションした。
ステップ５ Ａｍｐｕｒｅ（商標）ビーズ（ＳＰＲＩビーズの一種）を使用した伸長プライマーの精製。Ａｍｐｕｒｅビーズを室温に戻し、完全に混合した。各反応について、４５μＬのビーズを各ウェルにピペットで移し、製造元のプロトコルに従って精製した。ビーズを２５μｌの低ＴＥ緩衝液で再懸濁し、室温で２分間インキュベーションし、磁気ラックに戻した。ライブラリ増幅のために上清を採取した。
ステップ６ ライブラリの増幅。２０ＵのＰｆｕｓｉｏｎ（商標）エキソポリメラーゼを補充した２５μＬのＣｏｌｌｉｂｒｉ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。ＰＣＲマスターミックスを含む各ウェルに２４μｌのＬＴＥで溶出したｃＤＮＡを添加した。１μＬの５０μＭのバーコード付けられたＰＣＲプライマーを各ウェルに添加した。バーコード付けされたＰＣＲプライマーは、５’末端に配列決定アダプター、第１のハンドル配列に一致する配列を有するフォワードプライマーと、５’から３’方向、配列決定アダプター、特有の（ウェル特異的な）バーコード、および第３のハンドル配列に一致する配列を含むリバースＰＣＲプライマーとを含んだ。表８に記載のとおりＰＣＲを行った。
Figure 2022537069000037
ステップ７ ライブラリの精製。４０μＬのＡｍｐｕｒｅ（商標）ビーズを各ウェルにピペットで移し、反応混合物を製造元のプロトコルに従って精製し、最終容量に溶出した。２８μｌ ＬＴＥ
ステップ８ ライブラリの増幅および定量。バイオアナライザー（２５０～５５０塩基対）によって測定されたライブラリの収量が２ｎＭを超える場合、ライブラリの増幅はスキップされ、方法は直接配列決定に移行した。
表９に記載のとおり、ライブラリ増幅マスターミックスを調製した。
Figure 2022537069000038
１２μＬのマスターミックスを上から各ウェルライブラリウェルに分注した（溶出したライブラリをサイクルのために新しいウェルに移す必要はなかった）。表１０に記載のプログラムを使用して増幅を行った。
Figure 2022537069000039
ステップ９ ライブラリの精製。Ａｍｐｕｒｅビーズを室温に戻し、完全に混合した。各反応について、３２μＬのビーズを各ウェルにピペットで移し、製造元の指示に従って精製し、２５μＬの低ＴＥ緩衝液に溶出した。収量およびライブラリプロファイルをバイオアナライザーで評価した。
この時点で、ライブラリは配列決定の準備ができおり、配列決定は、様々な配列決定方法で実施され得る。ｃＤＮＡ増幅中に付加されたアダプターは、配列決定プラットフォームに特異的なものであり得る。
図４３Ａおよび４３Ｂは、バイオアナライザーを介して決定された、第１の増幅（それぞれ１．２ｎＭおよび３５０塩基対）および第２の増幅（４５ｎＭおよび３５０～４００塩基対）後の上記のプロトコルに従ってｉＰＳＣから調製された核酸ライブラリの平均収量および平均サイズを示す。
図４４は、上記のプロトコルに従ってＰＢＭＣから調製された核酸ライブラリの平均収量および平均サイズを示す。
図４５は、ＰＢＭＣがマスターミックスおよび乾燥プレートでも試験されたことを示す。第２のＰＣＲ増幅後、すべての反応が増幅され、産物のサイズおよび形状は正しいように見えた。本明細書に記載するＯＴＤＤＮ組み合わせバーコーディング方法の単一細胞分解能を試験するために、ＮＩＨ－３Ｔ３マウス細胞およびＨＥＫ－２９３ヒト細胞から調製された核酸ライブラリを混合し、製造元の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）で分析した。マップされたリードはバーコードで選別され、種ごとにプロットされた。図４５に示すように、Ｘ軸のバーコードはヒト配列のリード（ヒトリード）であり、Ｙ軸のバーコードはマウス配列のリード（マウスリード）である。したがって、軸上のバーコードは単一の細胞であり得るが、軸から外れたバーコードは、同じバーコードを共有する２つ以上の細胞が原因である。
図４５からのデータは、非単一細胞率が１，０００細胞で約０．５％であったことを示す。これらの値は、１，０００細胞で０．９％の１０Ｘ要求、および１，０００細胞で０．６％のＢＤ要求など、他の方法で要求される非単一細胞率で良好である。
単一細胞の分解能は、ＰＢＭＣおよびｉＰＳＣの試料を組み合わせて使用しても示された。表１４に示す結果は、２つの細胞型間の転写産物の重複がほとんどないことを示しており、各細胞型からのデータは、これらの細胞において発現することが知られている転写産物の存在を示す。
Figure 2022537069000040
実施例１４．実施形態
以下は、本明細書に記載の異なる実施形態の代表的なアイテムのリストである。
アイテム１．式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド
Figure 2022537069000041
 またはその塩であって、
式中、Ｘは、Ｈ、Ｎ3、またはＯＨであり、
ＮＢは、アデニン、７－デアザ－アデニン、シトシン、グアニン、７－デアザグアニン、チミン、ウラシルおよびイノシンから選択される核酸塩基を表し、
ＺおよびＹはリンカーであり、ＺおよびＹは、各々独立して、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの連結部位を含み、
クリックは、クリック反応の産物であり、
オリゴは、３～１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム２．クリックが、以下の対の官能基、
ｉ）アルキニルおよびアジド、
ｉｉ）アジドおよびアルキニル、
ｉｉｉ）チオールおよびアルキニル、
ｉｖ）アルキニルおよびチオール、
ｖ）チオールおよびアルケニル、
ｖｉ）アルケニルおよびチオール、
ｖｉｉ）アジドおよびシクロオクタニル、
ｖｉｉｉ）シクロオクタニルおよびアジド、
ｘｉ）ニトロンおよびシクロオクタニル、ならびに
ｘｉｉ）シクロオクタニルおよびニトロンのうちの１つの間のクリック反応の産物である、アイテム１に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム３．式（ＩＩ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド
Figure 2022537069000042
 またはその塩であって、
式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｎ3であり、
ＮＢは、アデニン、７－デアザ－アデニン、シトシン、グアニン、７－デアザグアニン、チミン、ウラシルおよびイノシンから選択される核酸塩基を表し、
ＺおよびＹはリンカーであり、ＺおよびＹは、各々独立して、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの連結部位を含み、
オリゴは、３～１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム４．Ｘが、ＯＨである、アイテム１～３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム５．Ｘが、Ｈである、アイテム１～３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム６．アルキレンが、Ｃ1－Ｃ6，アルキレンである、アイテム１～５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム７．アルケニレンが、Ｃ2－Ｃ6アルケニレンである、アイテム１～６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム８．アルキニレンが、Ｃ2－Ｃ6アルキニレンである、アイテム１～７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム９．ポリアルキレングリコールが、２～８個のグリコール単位を有する、アイテム１～８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム１０．オリゴヌクレオチドが、その５’末端でヌクレオチドに連結される、アイテム１～９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム１１．ＺおよびＹの一方が、トリアゾール環の１位に共有結合で結合し、ＺおよびＹの他方が、トリアゾール環の４位に共有結合で結合する、アイテム１～１０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム１２．Ｚが、トリアゾール環の１位に共有結合で結合し、Ｙが、トリアゾール環の１位に共有結合で結合する、アイテム１１に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム１３．Ｚが、トリアゾール環の４位に共有結合で結合し、Ｙが、トリアゾール環の１位に共有結合で結合する、アイテム１１に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム１４．式（ＩＩＩ）
Figure 2022537069000043
 またはその塩を有し、式中、
Ｌ1が、アルキレン、ポリアルキレングリコール、またはそれらの組み合わせを含むリンカーであり、
Ｌ2が、アルキニレンを含むリンカーである、アイテム１１に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム１５．Ｌ1が、２、４、または６個のアルケニレングリコール基を有するポリアルケニレングリコールを含む、アイテム１４に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム１６．ポリアルケニレングリコールが、ポリエチレングリコールである、アイテム１４または１５に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム１７．Ｌ1が、１～１２個の炭素原子を有するアルキレンを含む、アイテム１４に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム１８．アルキレンが、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、イソプロピレン、１－ブチレン、シス－－２－ブチレン、トランス－－２－ブチレン、イソブチレン、１－ペンチレン、シス－－２－ペンチレン、トランス－－２－ペンチレン、イソペンチレン、またはヘキシレンである、アイテム１７に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム１９．Ｌ2が、ヘキシニルである、アイテム１４に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム２０．核酸塩基が、ピリミジンであり、ピリミジンが、核酸塩基の５位でオリゴヌクレオチドに連結される、アイテム１～１９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム２１．核酸塩基が、プリンであり、プリンが、核酸塩基の７位でオリゴヌクレオチドに連結される、アイテム１～１９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム２２．塩が、四級アンモニウム塩である、アイテム１～２１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム２３．オリゴヌクレオチドが、バーコード配列、アダプター配列、特有の分子同定子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、アイテム１～２２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
アイテム２４．核酸にオリゴヌクレオチドをタグ付けするための方法であって、
タグ付けされる核酸を提供すること、
核酸を、アイテム１～２３のいずれか１つに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドおよびポリメラーゼと接触させ、それによってタグ付けされた核酸を産生すること、を含む、方法。
アイテム２５．プライマーを核酸にアニーリングすることをさらに含む、アイテム２４に記載の方法。
アイテム２６．核酸が、５’末端、３’末端、またはそれらの両方でタグ付けされる、アイテム２４または２５に記載の方法。
アイテム２７．核酸が、複数の位置でタグ付けされる、アイテム２６に記載の方法。
アイテム２８．核酸が、ニック翻訳またはギャップ充填反応中にオリゴヌクレオチドが連結されたオリゴヌクレオチドでタグ付けされる、アイテム２４～２７のいずれか１つに記載の方法。
アイテム２９．アダプター配列を核酸の３’末端にライゲーションすることをさらに含む、アイテム２４～２８のいずれか１つに記載の方法。
アイテム３０．タグ付けされた核酸をＰＣＲに供することをさらに含む、アイテム２４～２９のいずれか１つに記載の方法。
アイテム３１．核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、アイテム２４～３１のいずれか１つに記載の方法。
アイテム３２．ポリメラーゼが、Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｘ型ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素である、アイテム２４～３１のいずれか１つに記載の方法。
アイテム３３．ポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体である、アイテム２４～３２のいずれか１つに記載の方法。
アイテム３４．ポリメラーゼが、ＴｄＴである、アイテム２４～３２のいずれか１つに記載の方法。
アイテム３５．ヌクレオチドが、ジデオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、ジデオキシウリジン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、アイテム２４～３４のいずれか１つに記載の方法。
アイテム３６．ステップｃにおけるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの濃度が、１ｆｍｏｌ～１０μｍｏｌの範囲である、アイテム２４～３５のいずれか１つに記載の方法。
アイテム３７．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド対対応する天然のヌクレオチドのモル比が、１：１～１：１０００の範囲である、アイテム２４～３６のいずれか１つに記載の方法。
アイテム３８．少なくとも１つのクリーンアップステップを実施することをさらに含む、アイテム２４～３７のいずれか１つに記載の方法。
アイテム３９．ポリヌクレオチド試料から核酸のライブラリを生成するための方法であって、任意選択で、ポリヌクレオチド試料を断片化し、複数のポリヌクレオチド断片を生成することと、
第１のプライマーをポリヌクレオチド断片へアニーリングすることと、
複数のポリヌクレオチド断片を、核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドが連結されたオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを含む核酸鎖を形成することと、
第２のプライマーを連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングして、第２のアニーリングされた複合体を形成することと、
第２のアニーリングされた複合体を核酸ポリメラーゼと接触させて、連結されたオリゴヌクレオチドから核酸分子を生成することと、を含む、方法。
アイテム４０．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが、アイテム１～２３のいずれかの１つに記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドである、アイテム３９に記載の方法。
アイテム４１．第２のプライマーが、アダプター配列、バーコード配列、またはそれらの両方を含む、アイテム３９または４０に記載の方法。
アイテム４２．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが、親和性タグをさらに含む、アイテム３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
アイテム４３．第２のプライマーが、連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、アイテム３９～４２のいずれか１つに記載の方法。
アイテム４４．第１のプライマー、第２のプライマー、またはそれらの両方が、ユニバーサル配列を含む、アイテム３９～４３のいずれか１つに記載の方法。
アイテム４５．連結されたオリゴヌクレオチドが、アダプター配列、Ｔ７プロモーター配列、バーコード、ユニバーサル分子同定子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、アイテム３９～４４のいずれか１つに記載の方法。
アイテム４６．ポリメラーゼが、Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｘ型ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素である、アイテム３９～４５のいずれか１つに記載の方法。
アイテム４７．ポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体から選択される、アイテム３９～４６のいずれか１つに記載の方法。
アイテム４８．ヌクレオチドが、ジデオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、アイテム３９～４７のいずれか１つに記載の方法。
アイテム４９．ライブラリを増幅することをさらに含む、アイテム３９～４８のいずれかの方法。
アイテム５０．ステップ（ａ）におけるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの濃度が、１ｆｍｏｌ～１０μｍｏｌの範囲である、アイテム３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
アイテム５１．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド対対応する天然のヌクレオチドのモル比が、１：１～１：１０００の範囲である、アイテム３９～５０のいずれか１つに記載の方法。
アイテム５２．ステップ（ｃ）の後に少なくとも１つのクリーンアップステップを実施することをさらに含む、アイテム３９～５１のいずれか１つに記載の方法。
アイテム５３．核酸が、ＤＮＡである、アイテム３９～５２のいずれか一項に記載の方法。
アイテム５４．核酸が、ＲＮＡである、アイテム３９～５３のいずれか一項に記載の方法。
アイテム５５．ＲＮＡを逆転写して対応するｃＤＮＡを生成することをさらに含む、アイテム５４に記載の方法。
アイテム５６．アイテム１～２３のいずれか１つによるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを調製するための方法であって、
第２の官能基とのクリック反応を受けることができる第１の官能基に共有結合で結合したヌクレオチドを提供すること、クリック反応を受けてトリアゾール環を形成することができる第２の官能基に共有結合で結合したオリゴヌクレオチドを提供すること、
ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドと接触させてクリック反応産物を形成することを含み、第１および第２の官能基は、それぞれ、
ｉ）アルキニルおよびアジド、
ｉｉ）アジドおよびアルキニル、
ｉｉｉ）チオールおよびアルキニル、
ｉｖ）アルキニルおよびチオール、
ｖ）チオールおよびアルケニル、
ｖｉ）アルケニルおよびチオール、
ｖｉｉ）アジドおよびシクロオクタニル、
ｖｉｉｉ）シクロオクタニルおよびアジド、
ｘｉ）ニトロンおよびシクロオクタニル、ならびに
ｘｉｉ）シクロオクタニルおよびニトロンから選択される、方法。
アイテム５７．第１および第２の官能基が、それぞれ、ｉ）アルキニルおよびアジド、ならびにｉｉ）アジドおよびアルキニルから選択される、アイテム５６に記載の方法。
アイテム５８．ステップ（ｃ）が、銅触媒および銅（Ｉ）配位子の存在下でヌクレオチドをオリゴヌクレオチドと接触させて、１，２，３－トリアゾールを形成することを含む、アイテム５７に記載の方法。
アイテム５９．ヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである、アイテム５６～５８のいずれか１つに記載の方法。
アイテム６０．銅触媒が、銅（Ｉ）または銅（ＩＩ）を含み、触媒が銅（ＩＩ）である場合、還元剤が存在する、アイテム５８または５９に記載の方法。
アイテム６１．銅触媒がＣｕ（ＮＯ3）2Ｃｕ（ＯＡｃ）、ＣｕＳＯ4またはそれらの任意の組み合わせである、アイテム５８～６０のいずれか１つに記載の方法。
アイテム６２．還元剤が、アスコルビン酸塩、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２．４．６－トリクロロフェノール（ＴＣＰ）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ硫酸塩、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、印加電位、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈ、Ｗ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、アイテム６０または６１に記載の方法。
アイテム６３．還元剤が、アスコルビン酸ナトリウムを含む、アイテム６２に記載の方法。
アイテム６４．配位子が、トリス（ベンジルトリアゾリルメチル）アミンを含む、アイテム５８～６３のいずれか１つに記載の方法。
アイテム６５．配列決定ライブラリを作成するためのキットであって、
アイテム１～２１のいずれか１つによるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドと、
（ｉ）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵおよびＴヌクレオチド、
（ｉｉ）ポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）プライマーおよび／もしくはアダプター配列、
（ｉｖ）緩衝液、または
（ｖ）塩のうちの少なくとも１つと、を含む、キット。
アイテム６６．キットが、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵおよびＴヌクレオチドを含む、アイテム６５に記載のキット。
アイテム６７．キットが、ポリメラーゼを含む、アイテム６５または６６に記載のキット。
アイテム６８．ポリメラーゼが、野生型ポリメラーゼ、修飾されたポリメラーゼ、変異型ポリメラーゼ、操作されたポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせである、アイテム６７に記載のキット。
アイテム６９．ポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、およびＨＩＶ－１逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体である、アイテム６５～６８のいずれか１つに記載のキット。
アイテム７０．キットが、１つ以上のプライマー、アダプター、バーコード、または特有の分子同定子配列を含む、アイテム６５～６９のいずれか１つに記載のキット。
アイテム７１．キットが、少なくとも１つの緩衝液を含む、アイテム６５～７０のいずれか１つに記載のキット。
アイテム７２．キットが、少なくとも１つの塩を含む、アイテム６５～７１のいずれか１つに記載のキット。
アイテム７３．核酸ライブラリを調製する方法であって、ユニバーサル配列を含む第１のプライマーを核酸試料にアニーリングすることと、核酸試料を核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのヌクレオチド、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドと接触させて、鎖を終結させるオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む複数の核酸鎖を形成することと、
連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマーをアニーリングすることと、
ポリメラーゼで第２のアニーリングされたプライマーを伸長することと、
それにより、その末端にユニバーサル配列および連結されたオリゴヌクレオチド配列を含むヌクレオチドのライブラリを生成することと、を含む、方法。
実施例１５．さらなる実施形態
以下は、本明細書に記載の異なる実施形態の追加の代表的な実施形態のリストである。実施形態は、以下の番号付けられた項のいずれか一項に従ってもよい。
項１．核酸にオリゴヌクレオチドをタグ付けするための方法であって、
ａ．タグ付けされる核酸を提供すること、
ｂ．核酸をポリメラーゼおよび少なくとも１つの式（Ａ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド
Figure 2022537069000044
 またはその塩と接触させること、を含み、
式中、ＮＢは、核酸塩基であり、
オリゴは、３～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、
ＸおよびＱの各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｎ3、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、シアノ、アミノ、エステル、およびアミドから選択され、
ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択され、
ＣＸＮは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ケトン、カーボネート、エステル、エーテル、無水物、アミド、アミノ、アミノアルキレン、イミノ、イミド、ジアゾ、カルバメートエステル、ホスホジエステル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルホンアミド、および１～４個のＮ、Ｏ、Ｓ原子、またはそれらの組み合わせを含む複素環式基であって、任意選択で炭素、窒素、または硫黄原子において置換された複素環式基から選択され、それによって第１のタグ付けされた核酸を産生する、方法。
項２．接触が、核酸を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、およびポリメラーゼと接触させることを含む、項１に記載の方法。
項３．プライマーを核酸にアニーリングすることをさらに含む、項１または２に記載の方法。
項４．核酸が、５’末端、３’末端、またはそれらの両方でタグ付けされる、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
項５．核酸が、複数の位置でタグ付けされる、項２～４のいずれか一項に記載の方法。
項６．核酸が、ニック翻訳またはギャップ充填反応中にオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドでタグ付けされる、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
項７．核酸の３’末端にアダプター配列を付加することをさらに含む、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
項８．核酸が、二本鎖核酸であり、方法が、タグ付けされた核酸をＰＣＲに供することをさらに含む、項１～７のいずれか一項に記載の方法。
項９．ポリメラーゼが、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼである、項１～８のいずれか一項に記載の方法。
項１０．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチドであり、任意選択で、ジデオキシヌクレオチドが、ジデオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、ジデオキシウリジン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、項１～９のいずれか一項に記載の方法。
項１１．少なくとも１つのクリーンアップステップを実施することをさらに含む、項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項１２．
ａ．第１のタグ付けされた核酸鎖を産生した後、連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるプライマーをアニーリングすることと、
ｂ．第１のタグ付けされた核酸鎖およびアニーリングされたプライマーを、核酸ポリメラーゼおよび少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドと接触させることと、
ｃ．ポリメラーゼで、連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされたプライマーの３’ヒドロキシルから伸長し、第２の核酸鎖を形成することと、をさらに含む、項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
項１３．第２の核酸鎖を形成した後にタグ付けされた核酸鎖をエキソヌクレアーゼと接触させることをさらに含み、第１の核酸鎖がエキソヌクレアーゼによって分解される、項１２に記載の方法。
項１４．第２の核酸鎖を形成した後にタグ付けされた核酸鎖をエキソヌクレアーゼと接触させることをさらに含み、第１の核酸鎖が５’－リン酸を有し、エキソヌクレアーゼがラムダエキソヌクレアーゼである、項１２に記載の方法。
項１５．
ａ．少なくとも１つの第２の核酸鎖を提供すること、
ｂ．第２の核酸鎖を末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび少なくとも１つの式（Ａ）の第２のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド
Figure 2022537069000045
 またはその塩と接触させること、をさらに含み、
式中、ＮＢは、核酸塩基であり、
オリゴは、３～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、
ＸおよびＱの各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｎ3、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、シアノ、アミノ、エステル、およびアミドから選択され、
ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択され、
ＣＸＮは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ケトン、カーボネート、エステル、エーテル、無水物、アミド、アミノ、アミノアルキレン、イミノ、イミド、ジアゾ、カルバメートエステル、ホスホジエステル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルホンアミド、および１～４個のＮ、Ｏ、Ｓ原子、またはそれらの組み合わせを含む複素環式基であって、任意選択で炭素、窒素、または硫黄原子において置換された複素環式基から選択され、それによって５’および３’末端に異なるタグを有するタグ付けされた核酸を産生する、項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
項１６．１つ以上のポリヌクレオチドを含む試料から核酸のライブラリを生成するための方法であって、
ａ．第１のプライマーを１つ以上のポリヌクレオチドにアニーリングすることと、
ｂ．１つ以上のポリヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドに連結されていない少なくとも１つのヌクレオチド、および第１のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドと接触させて、第１のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを含む１つ以上の第１の核酸鎖を形成することと、
ｃ．第２のプライマーを連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングして、第２のアニーリングされた複合体を形成することと、
ｄ．第２のアニーリングされた複合体を核酸ポリメラーゼ、および、任意選択で、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドと接触させて、第２の核酸鎖を産生することと、を含む、方法。
項１７．１つ以上のポリヌクレオチドを含む試料から核酸のライブラリを生成するための方法であって、
ａ．第１のプライマーを１つ以上のポリヌクレオチドにアニーリングすることと、
ｂ．１つ以上のポリヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドに連結されていない少なくとも１つのヌクレオチド、および第１のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドと接触させて、第１のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを含む１つ以上の第１の核酸鎖を形成することと、
ｃ．スプリントオリゴヌクレオチドを連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングして、第２のアニーリングされた複合体を形成することと、
ｄ．第２のアニーリングされた複合体を核酸ポリメラーゼ、および、任意選択で、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドと接触させて、第２の核酸鎖を産生することと、を含む、方法。
項１８．１つ以上のポリヌクレオチドが、第１のプライマーのアニーリングの前に生成される複数のポリヌクレオチド断片を含む、項１６または１７に記載の方法。
項１９．１つ以上のポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含む、項１６または１８に記載の方法。
項２０．１つ以上のポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドが連結された結合剤（ＯＴＢＡ）を含む、項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
項２１．１つ以上のポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡと１つ以上のＯＴＢＡとの組み合わせを含む、項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
項２２．第２のアニーリングされた複合体を核酸ポリメラーゼと接触させた後、ポリメラーゼが、連結されたオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルからスプリントオリゴヌクレオチドを横断して伸長させる、項１６～２１のいずれかに記載の方法。
項２３．プライマーが、ユニバーサル配列、ランダム配列、および／または標的特異的配列を含む、項１２～２２のいずれか一項に記載の方法。
項２４．第１のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドであり、第１の核酸鎖が、その３’末端にオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む、項１６～２３のいずれか一項に記載の方法。
項２５．第２のアニーリングされた複合体と核酸ポリメラーゼとの接触が、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの存在下で行われ、第２の核酸鎖は、その３’末端でオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む、項１６および１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
項２６．第１のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドにおける連結されたオリゴヌクレオチドと、第２のオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドにおける連結されたオリゴヌクレオチドとは異なる、項１６および１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
項２７．１つ以上の核酸を含む試料から核酸のライブラリを生成するための方法であって、任意選択で、試料が複数の細胞を含み、
ａ．第１のプライマーを１つ以上の核酸にアニーリングすることと、
ｂ．１つ以上の核酸を、核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドと接触させ、それらの３’末端で、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む複数の核酸鎖を形成することと、
ｃ．連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマーをアニーリングすることと、
ｄ．ポリメラーゼで、連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされた第２のプライマーの３’ヒドロキシルから伸長し、それによって二本鎖核酸のライブラリを生成することと、を含む、方法。
項２８．１つ以上の核酸を含む試料から核酸のライブラリを生成するための方法であって、任意選択で、試料が複数の細胞を含み、
ａ．第１のプライマーを１つ以上の核酸にアニーリングすることと、
ｂ．１つ以上の核酸を、核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドと接触させ、それらの３’末端で、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む複数の核酸鎖を形成することと、
ｃ．連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングすることと、
ｄ．ポリメラーゼで、連結されたオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルから伸長し、それによって核酸のライブラリを産生することと、を含む、方法。
項２９．第１のプライマーが、ユニバーサル配列、ランダム配列、および／または標的特異的配列を含む、項２７または２８に記載の方法。
項３０．試料中の１つ以上の核酸が、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡを含む、項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
項３１．試料中の１つ以上の核酸が、ＯＴＢＡの連結されたオリゴヌクレオチドを含む、項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
項３２．ＯＴＢＡの連結されたオリゴヌクレオチドが、細胞マーカー結合剤インデックスを含む、項３１に記載の方法。
項３３．試料中の１つ以上の核酸が、ｍＲＮＡおよびＯＴＢＡを含む、項２７～２９または３２のいずれか一項に記載の方法。
項３４．細胞マーカーが、試料中の細胞の一部によって発現される、項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
項３５．細胞マーカーが、細胞表面マーカーである、項３４に記載の方法。
項３６．ＯＴＢＡの結合剤が、アプタマーもしくは抗体またはそれらの機能的断片を含む、項２０、２１、または３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
項３７．１つ以上の核酸を含む試料が、１つ超の細胞または細胞核を含み、細胞もしくは細胞核またはそれらの亜集団が、１つ以上の細胞マーカーを含み得、試料が、第１のプライマーをアニーリングするステップの前に２つ以上の第１の部分に分割され、各第１の部分は、元の試料の細胞または細胞核の亜集団を含む、項２８～３６のいずれか一項に記載の方法。
項３８．第１のプライマーが、５’末端の第１のユニバーサルハンドル配列および第１のバーコードを含む第１の伸長プライマーであり、該第１のバーコードは、各第１の部分における第１の伸長プライマー間で共通であるが、他の第１の部分における伸長プライマーに存在するバーコードとは異なり、
オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルハンドル配列を含み、
該第１の部分は、第１の伸長プライマーの伸長がオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む第１の核酸伸長産物を形成することを可能にする条件下で接触され、第１の核酸伸長産物の伸長は、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの組み込みによって終結される、項３７に記載の方法。
項３９．
ａ．第１の核酸伸長産物の形成後に第１の部分を混ぜ合わせることと、
ｂ．混ぜ合わされた第１の部分を２つ以上の第２の部分に分割することと、
ｃ。各第２の部分を、ポリメラーゼ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドではないヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレオチドと接触させることと、を含み、スプリントオリゴヌクレオチドは、
ｉ．伸長条件下で第１のユニバーサルハンドルにアニーリングできるオリゴヌクレオチド配列、
ｉｉ．各第２の部分の第２のバーコードは共通であるが、他の第２の部分の第２のバーコードとは異なる、第２のバーコードの鋳型である配列、ならびに
ｉｉｉ．第３のユニバーサルハンドルのための鋳型である配列であって、第１の伸長産物の連結されたオリゴヌクレオチドの３’ＯＨがスプリントオリゴヌクレオチドを横断して伸長され、第２のバーコード配列および第３のユニバーサルハンドル配列を含む第２の核酸伸長産物を生成する、第３のユニバーサルハンドルのための鋳型である配列を含む、項３８に記載の方法。
項４０．
ａ．第２の部分を混ぜ合わせること、
ｂ．混ぜ合わされた第２の部分を２つ以上の第３の部分に分割すること、
ｃ．各第３の部分を増幅プライマーと接触させること、をさらに含み、増幅プライマーが、第１のユニバーサルハンドルおよび第３のユニバーサルハンドルからの第２の伸長産物またはそれらの相補体にアニールし、横断して伸長し、増幅プライマーが、任意選択で、該核酸ライブラリを生成するために、それぞれ第３および／または第４のバーコード、ならびにそれぞれ第１および／または第２のアダプター配列を含み、第１、第２、および第３のバーコード配列（またはそれらの相補体）の組み合わせが、単一の細胞に由来する増幅産物に特有である、項３９に記載の方法。
項４１．第１のプライマー、第２のプライマー、増幅プライマー、またはスプリントオリゴヌクレオチドが、アダプター配列、バーコード配列、特有の分子同定子、インデックス配列、プロモーター配列、ユニバーサルハンドル、ユニバーサル配列、ランダム配列、標的特異的配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項１６～４０のいずれか一項に記載の方法。
項４２．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが、親和性タグをさらに含む、項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
項４３．第２のプライマーが、連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、項１６、１８～２７または２９～３９のいずれか一項に記載の方法。
項４４．第１のプライマー、第２のプライマー、またはそれらの両方が、ユニバーサル配列を含む、項１６～４３のいずれか一項に記載の方法。
項４５．連結されたオリゴヌクレオチドが、アダプター配列、Ｔ７プロモーター配列、バーコード、ユニバーサル分子同定子、ユニバーサルハンドル、ユニバーサル配列、アダプター配列、ランダム配列、標的特異的配列、プロモーター配列、インデックス配列またはそれらの任意の組み合わせを含む、項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
項４６．ポリメラーゼが、Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｘ型ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素である、項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
項４７．ポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体から選択される、項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
項４８．オリゴヌクレオチドが連結されたオリゴヌクレオチドが、ジデオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、ジデオキシウリジン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
項４９．ライブラリを増幅することをさらに含む、項２６～４８のいずれか一項に記載の方法。
項５０．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの濃度が、１ｆｍｏｌ～１０μｍｏｌの範囲である、項２６～４９のいずれか一項に記載の方法。
項５１．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド対対応するオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドのモル比が、１：１～１：１０００の範囲である、項２６～５０のいずれか一項に記載の方法。
項５２．１つ以上の核酸伸長または核酸増幅産物を形成した後に少なくとも１つのクリーンアップステップを実施することをさらに含む、項２６～５１のいずれか一項に記載の方法。
項５３．核酸が、ＤＮＡである、項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
項５４．核酸が、ＲＮＡである、項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
項５５．第１のプライマーをアニーリングする前に、または複数のポリヌクレオチド断片を生成する前に、ＲＮＡを逆転写して対応するｃＤＮＡを生成することをさらに含む、項５４に記載の方法。
項５６．第１のプライマーをアニーリングする前に、および／または試料を分割する前に、細胞を固定化および透過化することをさらに含む、項２６～５５のいずれか一項に記載の方法。
項５７．１つ以上の伸長および／または増幅産物を生成した後に細胞を溶解することをさらに含む、項２６～５６のいずれか一項に記載の方法。
項５８．第１の核酸伸長産物を生成した後、第１の部分または混ぜ合わされた第１の部分をブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させ、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の伸長プライマーの細胞の核酸へのハイブリダイゼーションを防止する、項３７～５７のいずれか一項に記載の方法。
項５９．第２の核酸伸長産物を生成した後、第３の部分を第２の伸長プライマーと接触させる前に、スプリントオリゴヌクレオチドを除去するステップをさらに含む、項３７～５８のいずれか一項に記載の方法。
項６０．スプリントオリゴヌクレオチドが結合部位を含み、方法が、第２の部分または混ぜ合わされた第２の部分を、同種の捕捉部位を含む化合物と接触させるステップを含む、項３７～５９のいずれか一項に記載の方法。
項６１．結合部位および同種捕捉部位が、ストレプトアビジンおよびビオチン、マルトースおよびマルトース結合タンパク質、グルタチオンおよびグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、キチンおよびキチン結合タンパク質、またはアプタマーおよびその抗原のうちの結合対から選択される結合対である、項６０に記載の方法。
項６２．同種の捕捉部位が、固体支持体上に固定化される、項６０または６１に記載の方法。
項６３．固体支持体が、ビーズを含む、項６２に記載の方法。
項６４．ビーズが、磁性または常磁性ビーズである、項６３に記載の方法。
項６５．第１のプライマーが、伸長条件下でｍＲＮＡにハイブリダイゼーションすることができる配列を含む、項３７～６４のいずれか一項に記載の方法。
項６６．第１のプライマーが、３’末端にポリ（Ｔ）を含む、項６５に記載の方法。
項６７．第１のプライマーが、３’末端にランダム配列を含む、項６５に記載の方法。
項６８．第１の部分を、第１のプライマーの混合物と接触させ、少なくとも１つの第１のプライマーが３’末端にポリ（Ｔ）配列を含み、少なくとも１つの第１のプライマーがランダム配列を含む、項６５に記載の方法。
項６９．式（Ａ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド
Figure 2022537069000046
 またはその塩であって、
式中、ＮＢは、核酸塩基であり、
オリゴは、３～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、
ＸおよびＱの各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｎ3、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、シアノ、アミノ、エステル、およびアミドから選択され、
ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択され、
ＣＸＮは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ケトン、カーボネート、エステル、エーテル、無水物、アミド、アミノ、アミノアルキレン、イミノ、イミド、ジアゾ、カルバメートエステル、ホスホジエステル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルホンアミド、および１～４個のＮ、Ｏ、Ｓ原子、またはそれらの組み合わせを含む複素環式基であって、任意選択で炭素、窒素、または硫黄原子において置換された複素環式基から選択される、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項７０．オリゴが
Figure 2022537069000047
 から選択され、オリゴ＊がオリゴ基由来の残りの２～９９ヌクレオチドであり、ＮＢ２が、核酸塩基である、項６８に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項７１．ＣＸＮが、各々が１～３個のヘテロ原子を有する５員複素環および６員複素環から選択される、項６９または項７０に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項７２．ＣＸＮが、ピロロ、チオフェニル、フラニル、ピロリジニル、チオラニル、テトラヒドロフラニル、イソキサゾリル、オキサゾロ、ピラゾロ、イミダゾリル、イソチアゾロ、チアゾリル、トリアゾロ、オキサジアゾロ、チアジアゾロ、ピラニル、チオピラニル、ピリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ヘキサヒドロピリダジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、モルフォリノ、チアジニル、オキサジノ、ジチアニル、トリアジニル、ジチアジノ、チアジアジノ、トリアジナニル、またはオキサチアジノから選択される、項６９～項７１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項７３．ＣＸＮが、クリックであり、クリックが、クリック反応の産物である、項６９～７２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項７４．ＣＸＮが、クリックであり、クリックが、以下の対の官能基、
ｉ）アルキニルおよびアジド、
ｉｉ）チオールおよびアルキニル、
ｉｉｉ）チオールおよびアルケニル、
ｉｖ）アジドおよびシクロオクタニル、ならびに
ｖ）シクロオクタニルおよびニトロンのうちの１つの間でのクリック反応の産物である、項６９～７３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項７５．ＣＸＮが、
Figure 2022537069000048
 である、項６９～７４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項７６．ＺおよびＹが、各々独立して、結合、アミノ、アミド、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、項６９～７５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項７７．Ｙが、アルキレンまたはアルキニレンである、項６９～７６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項７８．Ｚが、アルキニレン、アルキレン、エーテルおよびアミドのうちの１つ以上の組み合わせである、項６９～７７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項７９．－ＮＢ－Ｚ－が、ＮＢ－ＨＮ－Ｌ1－、ＮＢ－（ＣＨ－ＣＨ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2ＣＨ2）ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）5－Ｌ1、
Figure 2022537069000049
 であり、Ｌ1が、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、およびポリアルキレングリコールから選択される、項６９～７８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項８０．式（Ａ）の化合物が、式（Ｂ１）～（Ｂ４）の化合物
Figure 2022537069000050
 およびそれらの塩から選択され、式中、オリゴ＊は、オリゴ基由来の残りの２～９９ヌクレオチドであり、ＮＢ２は、核酸塩基であり、クリックは、クリック反応の産物であり、Ｌ1は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、およびポリアルキレングリコールから選択され、Ｌ2は、アルキレンまたはアルキニレンである、項６９に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項８１．Ｌ1が、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ２－Ｃ１２アルケニレン、Ｃ２－Ｃ１２アルキニレン、および２～８グリコール単位を有するポリアルキレングリコールから選択される、項７９または８０に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項８２．Ｌ1が、２グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ２）、４グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ４）、または６グリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ６）、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、イソプロピレン、１－ブチレン、シス－２－ブチレン、トランス－２－ブチレン、イソブチレン、１－ペンチレン、シス－２－ペンチレン、トランス－２－ペンチレン、イソペンチレン、およびヘキシレンから選択される、項７９～８１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項８３．Ｌ1が、－ＣＨ2－、－（ＣＨ2）3－、－（ＣＨ2）5－、ＰＥＧ２、およびＰＥＧ４から選択される、項７９～８２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項８４．Ｌ2が、Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルキニレンである、項８０～８３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項８５．Ｌ2－オリゴが、－（ＣＨ2）4－オリゴまたは－（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ－オリゴである、項８０～８４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項８６．Ｘが、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｎ3、およびアミノから選択される、項６９～８５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項８７．Ｘが、Ｈ、Ｎ3、およびＯＨから選択される、項６９～８６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項８８．Ｘが、ＯＨである、項６９～８７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項８９．Ｘが、Ｈである、項６９～８７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項９０．Ｑが、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ3である、項６９～８９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項９１．Ｑが、Ｈである、項６９～９０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項９２．オリゴまたはオリゴ＊が、その５’末端でＹに結合される、項６９～９１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項９３．ＮＢおよびＮＢ２が、独立して、アデニン、７－デアザ－アデニン、シトシン、グアニン、７－デアザグアニン、チミン、ウラシルおよびイノシンから選択される核酸塩基である、項６９～９２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項９４．ＮＢが、ピリミジンであり、ピリミジンが、核酸塩基の５位でオリゴヌクレオチドに連結される、項６９～９３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項９５．ＮＢが、プリンであり、プリンが、核酸塩基の７位でオリゴヌクレオチドに連結される、項６９～９３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項９６．式（Ａ）の化合物の塩が、四級アンモニウム塩である、項６９～９５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項９７．オリゴは、バーコード配列、アダプター配列、特有の分子同定子、ランダム配列、標的特異的配列、ユニバーサルハンドル、ユニバーサル配列、プロモーター配列、インデックス配列またはそれらの任意の組み合わせを含むオリゴヌクレオチドである、項６９～９６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
項９８．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが、項６９～９７のいずれか一項によるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドから選択される、項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
項９９．配列決定ライブラリを作成するためのキットであって、
ａ．項６９～９７のいずれか一項によるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドと、
（ｂ）
（ｉ）Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕおよび／またはＴヌクレオチド、
（ｉｉ）ポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）プライマーおよび／もしくはアダプター配列、
（ｉｖ）緩衝液、または
（ｖ）塩のうちの少なくとも１つと、を含む、キット。
項１００．キットが、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕおよび／またはＴヌクレオチドを含む、項９９に記載のキット。
項１０１．キットが、ポリメラーゼを含む、項９９または１００に記載のキット。
項１０２．ポリメラーゼが、野生型ポリメラーゼ、修飾されたポリメラーゼ、変異型ポリメラーゼ、操作されたポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせである、項１０１に記載のキット。
項１０３．ポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、Ｍａｘｉｍａ（商標）、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）Ｖ２．０、ＣｙｃｌｅＳｅｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｅｘｏ－、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｍａｘｉｍａ Ｈ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ融合ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、ＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータ複製酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、およびＨＩＶ－１逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体である、項９９～１０２のいずれか一項に記載のキット。
項１０４．キットが、１つ以上のプライマー、アダプター、バーコード、または特有の分子同定子配列を含む、項９９～１０３のいずれか一項に記載のキット。
項１０５．キットが、少なくとも１つの緩衝液を含む、項９９～１０４のいずれか一項に記載のキット。
項１０６．キットが、少なくとも１つの塩を含む、項９６～１０５のいずれか一項に記載のキット。
項１０７．核酸の組み合わせバーコーディングのためのキットであって、
ａ．項７１～９９のいずれか一項によるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドと、
（ｂ）
（ｉ）Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕおよび／またはＴヌクレオチド、
（ｉｉ）ポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）プライマーおよび／またはアダプター配列、
（ｉｖ）緩衝液、
（ｖ）複数の核酸バーコード、ならびに
（ｖｉ）１つ以上の細胞マーカー結合剤のうちの少なくとも１つと、を含む、キット。
項１０８．オリゴヌクレオチドに連結されたヌクレオチドのヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチドである、項１０７に記載のキット。
項１０９．オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが、ユニバーサルハンドル配列を含む、項１０７～１０８のいずれか一項に記載のキット。
項１１０．ポリメラーゼが、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの両方である、項１０７～１０９のいずれか一項に記載のキット。
項１１１．複数の核酸バーコードが、個々の区画において提供される第１の複数の核酸バーコードを含む、項１０７～１１０のいずれか一項に記載のキット。
項１１２．個々の区画において提供される第２および任意選択で第３、第４、第５、または第６の複数の核酸バーコードをさらに含む、項１１１に記載のキット。
項１１３．個々の区画が、マルチウェルプレートで提供される、項１１１～１１２のいずれか一項に記載のキット。
項１１４．複数の核酸バーコードが、凍結乾燥された形態である、項１１１～１１３のいずれか一項に記載のキット。
項１１５．複数の核酸バーコードが、溶液形態である、項１１１～１１４のいずれか一項に記載のキット。
項１１６．第１の複数のバーコードの核酸バーコードが、伸長プライマーを含み、各伸長プライマーが、５’から３’方向に第１のユニバーサルハンドルおよび第１の核酸バーコードを含む、項１１１～１１５のいずれか一項に記載のキット。
項１１７ 第２の複数のバーコード上の核酸バーコードが、スプリントオリゴヌクレオチドを含み、スプリントオリゴヌクレオチドが、５’から３’方向に第２のユニバーサルハンドルにアニーリングする配列、第２の核酸バーコードのための鋳型である配列、および第３のユニバーサルハンドルのための鋳型である配列を含む、項１１２～１１５のいずれか一項に記載のキット。
項１１８．第３の複数のバーコード上の核酸バーコードが、伸長プライマーを含み、伸長プライマーが、任意選択で、配列決定アダプター配列を含む、項１１２～１１６のいずれか一項に記載のキット。
項１１９．１つ以上の細胞マーカー結合剤をさらに含む、項１０７～１１８のいずれか一項に記載のキット。
項１２０．各細胞マーカー結合剤が、細胞マーカー結合剤に連結されたオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドが連結されたＯＴＢＡである、項１１９に記載のキット。
項１２１．項６９～９７のいずれか一項によるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドを調製するための方法であって、
ａ．第２の官能基とのクリック反応を受けることができる第１の官能基に共有結合で結合したヌクレオチドを提供すること、
ｂ．クリック反応を受けてトリアゾール環を形成することができる第２の官能基に共有結合で結合したオリゴヌクレオチドを提供すること、
ｃ．ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドと接触させてクリック反応産物を形成することを含み、
第１および第２の官能基は、それぞれ、
ｉ）アルキニルおよびアジド、
ｉｉ）アジドおよびアルキニル、
ｉｉｉ）チオールおよびアルキニル、
ｉｖ）アルキニルおよびチオール、
ｖ）チオールおよびアルケニル、
ｖｉ）アルケニルおよびチオール、
ｖｉｉ）アジドおよびシクロオクタニル、
ｖｉｉｉ）シクロオクタニルおよびアジド、
ｘｉ）ニトロンおよびシクロオクタニル、ならびに
ｘｉｉ）シクロオクタニルおよびニトロンから選択される、方法。
項１２２．第１および第２の官能基が、それぞれ、ｉ）アルキニルおよびアジド、ならびにｉｉ）アジドおよびアルキニルから選択される、項１２１に記載の方法。
項１２３．ステップ（ｃ）が、銅触媒および銅（Ｉ）配位子の存在下でヌクレオチドをオリゴヌクレオチドと接触させて、１，２，３－トリアゾールを形成することを含む、項１２１に記載の方法。
項１２４．ヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである、項１２１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
項１２５．銅触媒が、銅（Ｉ）または銅（ＩＩ）を含み、触媒が銅（ＩＩ）である場合、還元剤が存在する、項１２３または１２４に記載の方法。
項１２６．銅触媒が、Ｃｕ（ＮＯ3）2Ｃｕ（ＯＡｃ）、ＣｕＳＯ4またはそれらの任意の組み合わせである、項１２３～１２５のいずれか一項に記載の方法。
項１２７．還元剤が、アスコルビン酸塩、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２．４．６－トリクロロフェノール（ＴＣＰ）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ硫酸塩、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、印加電位、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈ、Ｗ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項１２５または１２６に記載の方法。
項１２８．還元剤が、アスコルビン酸ナトリウムを含む、項１２７に記載の方法。
項１２９．銅（Ｉ）配位子の配位子が、トリス（ベンジルトリアゾリルメチル）アミンまたはトリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミンを含む、項１２３～１２８のいずれか一項に記載の方法。
項１３０．核酸ライブラリの調製における項６９～９７のいずれかによるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの使用。
項１３１．核酸のタグ付けにおける項６９～９７のいずれかによるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの使用。
項１３２．バーコードの組み合わせでの核酸のタグ付けにおける項６９～９７のいずれかによるオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの使用。
本明細書に記載の実施例から、当業者は、本開示の本質的な原理を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、特定の使用および条件に適応する際に本開示の様々な修正および変更を行うことができる。

Claims (21)

  1. 核酸にオリゴヌクレオチドをタグ付けするための方法であって、
    ａ．タグ付けされる前記核酸を提供すること、
    ｂ．前記核酸をポリメラーゼおよび少なくとも１つの式（Ａ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド
    Figure 2022537069000051
     またはその塩と接触させること、を含み、
    式中、ＮＢは、核酸塩基であり、
    オリゴは、３～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、
    ＸおよびＱの各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｎ3、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、シアノ、アミノ、エステル、およびアミドから選択され、
    ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択され、
    ＣＸＮは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ケトン、カーボネート、エステル、エーテル、無水物、アミド、アミノ、アミノアルキレン、イミノ、イミド、ジアゾ、カルバメートエステル、ホスホジエステル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルホンアミド、および１～４個のＮ、Ｏ、Ｓ原子、またはそれらの組み合わせを含む複素環式基であって、任意選択で炭素、窒素、または硫黄原子において置換された複素環式基から選択され、それによって第１のタグ付けされた核酸を産生する、方法。
  2. 前記接触が、前記核酸を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、およびポリメラーゼと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. プライマーを前記核酸にアニーリングすることをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチドであり、任意選択で、前記ジデオキシヌクレオチドが、ジデオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、ジデオキシウリジン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ａ．第１のタグ付けされた核酸鎖を産生した後、前記連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるプライマーをアニーリングすることと、
    ｂ．前記第１のタグ付けされた核酸鎖およびアニーリングされたプライマーを、核酸ポリメラーゼおよび少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドと接触させることと、
    ｃ．ポリメラーゼで、前記連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされた前記プライマーの３’ヒドロキシルから伸長し、第２の核酸鎖を形成することと、をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ａ．第１のタグ付けされた核酸鎖を産生した後、前記連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングすることと、
    ｂ．前記第１のタグ付けされた核酸鎖およびアニーリングされたスプリントオリゴヌクレオチドを、核酸ポリメラーゼおよび少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチドと接触させることと、
    ｃ．ポリメラーゼで、前記連結されたオリゴヌクレオチドの前記３’ヒドロキシルからスプリントオリゴヌクレオチドを横断して伸長することと、をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  7. １つ以上の核酸を含む試料から核酸のライブラリを生成するための方法であって、任意選択で、前記試料が複数の細胞を含み、
    ａ．前記１つ以上の核酸に少なくとも部分的に相補的である第１のプライマーをアニーリングすることと、
    ｂ．前記１つ以上の核酸を、核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドと接触させ、それらの３’末端で、オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む複数の核酸鎖を形成することと、
    ｃ．前記連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマーをアニーリングすることと、
    ｄ．前記ポリメラーゼで、前記連結されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされた前記第２のプライマーの３’ヒドロキシルから伸長し、それによって核酸のライブラリを産生することと、を含む、方法。
  8. １つ以上の核酸を含む試料から核酸のライブラリを生成するための方法であって、任意選択で、前記試料が複数の細胞または細胞核を含み、
    ａ．前記１つ以上の核酸に少なくとも部分的に相補的である第１のプライマーをアニーリングすることと、
    ｂ．前記１つ以上の核酸を、第１の核酸ポリメラーゼ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに連結されていないヌクレオチド、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドと接触させ、３’末端で、前記オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドを含む複数の第１の伸長産物を形成することと、
    ｃ．前記第１の伸長産物の前記連結されたオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングすることと、
    ｄ．前記第１の伸長産物を核酸ポリメラーゼおよび１つ以上のヌクレオチドと接触させ、前記ポリメラーゼで、前記連結されたオリゴヌクレオチドの前記３’ヒドロキシルから前記アニーリングされたスプリントを横断して伸長し、第２の伸長産物を産生し、それによって核酸のライブラリを産生することと、を含む、方法。
  9. 前記試料中の前記１つ以上の核酸が、オリゴヌクレオチドが連結された結合剤（ＯＴＢＡ）のオリゴヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＯＴＢＡの前記連結されたオリゴヌクレオチドが、細胞マーカー結合剤インデックスを含み、前記ＯＴＢＡの結合剤が、アプタマーもしくは抗体、またはそれらの機能的断片を含む、請求項９に記載の方法。
  11. １つ以上の核酸を含む試料が、１つ超の細胞または細胞核を含み、前記細胞または細胞核が、１つ以上の細胞マーカーを含み得、前記試料が、ステップａの前に２つ以上の第１の部分に分割され、各第１の部分が、元の前記試料の細胞または細胞核の亜集団を含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第１のプライマーが、第１のユニバーサルハンドル配列および第１のバーコードを含み、前記第１のバーコードが、各第１の部分における前記第１のプライマー間で共通であるが、他の第１の部分における第１のプライマーにおいて存在する前記第１のバーコードとは異なり、前記オリゴヌクレオチドが連結されたジデオキシヌクレオチドの前記オリゴヌクレオチドが、第２のユニバーサルハンドル配列を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. ステップｃの前に、
    ａ．前記第１の核酸伸長産物の形成後に前記第１の部分を混ぜ合わせることと、
    ｂ．前記混ぜ合わされた第１の部分を２つ以上の第２の部分に分割することと、をさらに含み、前記第２の部分が、前記スプリントオリゴヌクレオチドを含み、前記スプリントオリゴヌクレオチドが、
    ｉ．前記連結されたオリゴヌクレオチド上の前記第２のユニバーサルハンドルにアニーリングするオリゴヌクレオチド配列、
    ｉｉ．第２のバーコードについての鋳型配列であって、各第２の部分の前記第２のバーコードは共通であるが、他の第２の部分の前記第２のバーコードとは異なる、第２のバーコードについての鋳型配列、および
    ｉｉｉ．第３のユニバーサルハンドルの鋳型配列を含み、
    前記第２の伸長産物が、前記第２のバーコードおよび第３のユニバーサルハンドルを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. ａ．前記第２の部分を混ぜ合わせること、
    ｂ．前記混ぜ合わされた第２の部分を２つ以上の第３の部分に分割すること、
    ｃ．各第３の部分を増幅プライマーと接触させること、をさらに含み、前記増幅プライマーが、前記第１のユニバーサルハンドルおよび前記第３のユニバーサルハンドルにハイブリダイゼーションし、そこから伸長することができ、前記増幅プライマーが、任意選択で、増幅産物を生成するために、それぞれ第３および／または第４のバーコード、ならびにそれぞれ第１および／または第２のアダプター配列を含み、前記増幅産物の前記第１、第２、および第３のバーコード配列（またはそれらの相補体）の組み合わせが、単一の細胞または核に由来する前記増幅産物に特有である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記プライマー、前記連結されたオリゴヌクレオチド、またはそれらの両方が、ランダム配列、標的特異的配列、またはそれらの両方を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記プライマー、前記連結されたオリゴヌクレオチド、または前記スプリントオリゴヌクレオチドのうちの１つ以上が、ユニバーサルハンドル、ユニバーサル配列、特有の分子同定子、アダプター配列、プロモーター配列、バーコード配列、インデックス配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 式（Ａ）のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド
    Figure 2022537069000052
     またはその塩であって、
    式中、ＮＢは、核酸塩基であり、
    オリゴは、３～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、
    ＸおよびＱの各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｎ3、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、シアノ、アミノ、エステル、およびアミドから選択され、
    ＺおよびＹの各々は、独立して、結合、アミノ、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオエーテル、スルホニル、スルホンアミド、エーテル、ケトン、カルボニル、無水物、エステル、イミド、尿素、ウレタン、およびそれらの組み合わせから選択され、
    ＣＸＮは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ケトン、カーボネート、エステル、エーテル、無水物、アミド、アミノ、アミノアルキレン、イミノ、イミド、ジアゾ、カルバメートエステル、ホスホジエステル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルホンアミド、および１～４個のＮ、Ｏ、Ｓ原子、またはそれらの組み合わせを含む複素環式基であって、任意選択で炭素、窒素、または硫黄原子において置換された複素環式基から選択される、オリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドまたはその塩。
  20. ＣＸＮがクリックであり、クリックが以下の対の官能基、
    ｉ）アルキニルおよびアジド、
    ｉｉ）チオールおよびアルキニル、
    ｉｉｉ）チオールおよびアルケニル、
    ｉｖ）アジドおよびシクロオクタニル、ならびに
    ｖ）シクロオクタニルおよびニトロンのうちの１つの間でのクリック反応の産物である、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチド。
  21. 核酸ライブラリの前記調製における、または核酸のタグ付けにおける使用のための、請求項１９または２０に記載のオリゴヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの使用。
JP2021576459A 2019-06-21 2020-06-22 次世代配列決定ライブラリを調製するための核酸の標識化に有用なオリゴヌクレオチドが連結された三リン酸ヌクレオチド Pending JP2022537069A (ja)

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