CN103589743A - Gibson组装载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及DNA合成领域，更具体而言涉及DNA大片段拼接，特别是用于DNA片段组装的载体。本发明提供了Gibson组装载体及其制备方法和应用。

Description

Gibson组装载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及DNA合成领域，更具体而言涉及DNA大片段拼接，特别是用于DNA片段组装的载体。

背景技术

随着DNA合成技术的发展，现阶段已达到能够简便、快速、高效合成DNA片段的程度，成为分子生物学研究必不可少的手段，并且已在基因工程、临床诊断和治疗、法医学等各个领域中日益发挥重要的作用。碍于寡核苷酸合成长度、精度和成本的限制，在进行基因合成甚至全基因组合成的时候需要对短片段寡核苷酸或者双链DNA进行逐级组装，因而开发高通量、低错误率、快速的DNA片段组装方法成为了合成生物学需要解决的另一个重要难题。在众多已开发的组装方法中，Daniel D Gibson等人开发了一种用于DNA大片段拼接的技术，称为Gibson组装策略，在合成生物学领域具有广泛的应用前景。该技术的主要思路是：对两段具有末端同源序列的DNA片段，通过核酸外切酶降解，切出粘性末端，两段DNA片段同源的粘性末端互补配对，再通过DNA聚合酶聚合、连接酶连接，便可将任意两段合适大小的DNA片段拼接起来（Daniel G Gibson,Lei Young,Ray-Yuan Chuang,JCraig Venter,Clyde A Hutchison III,Hamilton O Smith.Enzymaticassembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.NatureMethods,2009,6(5):343-345）。但是在将拼接好的DNA片段克隆到载体的过程中，每次都要重新设计DNA片段与载体之间的同源区，由于DNA片段以及载体的差异，同源区的性质差别很大，使得克隆过程变的繁琐并具有很大的不稳定性。

因此，有必要构建一个具有通用性的Gibson组装载体。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种Gibson组装载体，所述载体的序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4。

本发明的Gibson组装载体分别被命名为pSBGAA（SEQ ID No.3）和pSBGAK（SEQ ID No.4），它们的图谱分别为图1和图2。

在第二方面，本发明提供了一种构建Gibson组装载体的方法，所述方法包括步骤：

1）分别以质粒pSB1A3和pSB1K3为模版，用引物pSB-F和pSB-R进行PCR扩增，得到两端分别带有Gibson组装同源序列和BamHI酶切位点的线型载体，所述引物的序列分别是SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6；

2）经过BamHI酶切、连接反应，得到环状目标载体。

在一个实施方案中，所述载体的序列为SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4。

在第三方面，本发明提供了Gibson组装载体用于组装DNA长片段的用途。在一个实施方案中，所述Gibson组装载体的序列为SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4。

在第四方面中，用于Gibson组装载体的重叠区L和重叠区R，所述重叠区L和重叠区R分别是的随机DNA序列，例如20bp-100bp，优选30bp-50bp，特别是40bp，中间以BamHI酶切位点相连。在一个实施方案中，随机序列设计要求为：长度各为30bp-50bp（例如40bp），CG含量适中（40%-60%），无重复序列（连续5个或以上相同碱基，如AAAAA；连续四个或以上两碱基重复，如ATATATAT），单链DNA无明显二级结构（ΔG自由能<3kCal/mol），退火温度适中（60℃-70℃），与宿主细胞（大肠杆菌）基因组无近源序列，不易生成二聚体等。

在一个具体实施方案中，所述重叠区L的序列是SEQ ID No.1，重叠区R的序列是SEQ ID No.2。

在一个实施方案中，本发明还涉及两端含有上述重叠区L和重叠区R的Gibson组装载体。

在第五方面中，本发明涉及引物对pSB-F和pSB-R，其中pSB-F的序列是SEQ ID No.5，pSB-R的序列是SEQ ID No.6。

在Gibson组装实验中，将拼接好的DNA片段克隆到载体的过程中，每次都要重新设计DNA片段与载体之间的同源区，由于DNA片段以及载体的差异，同源区的差别，使得克隆过程变的繁琐并具有很大的不稳定性。因此，利用本发明中构建的通用载体，可以使Gibson组装的DNA片段设计更简单，组装结果更高效、更稳定。

附图说明

图1.质粒pSBGAA图谱。

图2.质粒pSBGAK图谱。

图3.酶切鉴定电泳图。M为表示DNA片段大小的标准物，名字就是λ-HindIII digest DNA Marker（购自宝生物工程（大连）有限公司，货号D3403A）；1为克隆1的双酶切鉴定结果；2为克隆2的双酶切鉴定结果。

图4.酶切鉴定电泳图。M为表示DNA片段大小的标准物，名字就是λ-HindIII digest DNA Marker（购自宝生物工程（大连）有限公司，货号D3403A）；1为克隆1的双酶切鉴定结果；2为克隆2的双酶切鉴定结果。

序列表说明

SEQ ID No.1-重叠区L

GGATCCAGCACTACATCAACTGACTACTGACTACTGACTGCCACC

SEQ ID No.2-重叠区R

GGATCCTGTGCATCACTTCTCACGTCTGAACCAAGATAGCTGTAC

SEQ ID No.3-pSBGAA序列

GATCCAGCACTACATCAACTGACTACTGACTACTGACTGCCACCGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATATAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGTACAGCTATCTTGGTTCAGACGTGAGAAGTGATGCACAG

SEQ ID No.4-pSBGAK序列

GATCCAGCACTACATCAACTGACTACTGACTACTGACTGCCACCGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTGGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGCTCGAGTGCCACTTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGTACAGCTATCTTGGTTCAGACGTGAGAAGTGATGCACAG

具体实施方式

本发明提供了两个通用的Gibson组装载体，并通过其在酵母基因组DNA组装中的应用，说明其通用性。

本发明所提供的Gibson组装通用载体，分别命名为pSBGAA和pSBGAK，由原核复制起始位点、抗性标记基因（分别为氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因）、基因间序列和两段组装同源区组成。所述载体的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

在本发明中，还提供了这样的Gibson组装载体，所述载体的序列符合如下条件的序列：

与SEQ ID No.3或SEQ ID No.4具有50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.9、99.9、99.99%的序列同一性，或者上述任意两个序列同一性之间的序列同一性；并且

所述序列具有组装DNA片段的功能。

在本发明中，还提供了用于Gibson组装载体的重叠区L和重叠区R，其中重叠区L的序列是这样的序列：

与SEQ ID No.1具有50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.9、99.9、99.99%的序列同一性，或者上述任意两个序列同一性之间的序列同一性；并且

所述序列为重叠区；

重叠区R的序列是这样的序列：

与SEQ ID No.2具有50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.9、99.9、99.99%的序列同一性，或者上述任意两个序列同一性之间的序列同一性；并且

所述序列为重叠区。

在本发明中，还提供了引物对pSB-F和pSB-R，其中pSB-F的序列包含

（1）BamHI酶切位点；（2）用于Gibson组装的通用同源序列；（3）小写部分为引物与模版载体的同源互补配对序列。

在一个实施方案中，其中pSB-R的序列包含

（1）BamHI酶切位点；（2）用于Gibson组装的通用同源序列；（3）小写部分为引物与模版载体的同源互补配对序列。

在一个实施方案中，所述通用同源序列包括：两段各20bp-100bp，优选30bp-50bp，特别是40bp，的随机DNA序列，中间以BamHI酶切位点相连。

在一个实施方案中，随机序列设计要求为：长度各为30bp-50bp（例如40bp），CG含量适中（40%-60%），无重复序列（连续5个或以上相同碱基，如AAAAA；连续四个或以上两碱基重复，如ATATATAT），单链DNA无明显二级结构（ΔG自由能<3kCal/mol），退火温度适中（60℃-70℃），与宿主细胞（大肠杆菌）基因组无近源序列，不易生成二聚体等。

在一个实施方案中，本发明还涉及两端含有上述引物对pSB-F和pSB-R的Gibson组装载体。

本发明所述的质粒pSBGAA、pSBGAK构建方法如下：

首先，分别以质粒pSB1A3、pSB1K3（由BioBricks Foundation提供；pSB1A3详见：

http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:pSB1A3，pSB1K3详见：http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:pSB1K3）为模版，设计引物pSB-F和pSB-R：

pSB-F（SEQ ID No.5）：

GAAGGATCCAGCACTACATCAACTGACTACTGACTACTGACTG CCACCgattacttcgcgttatgcag

pSB-R（SEQ ID No.6）：

CTTGGATCCTGTGCATCACTTCTCACGTCTGAACCAAGATAGC TGTACtgcctcgtgatacgccta

说明：大写斜体部分为BamHI酶切位点；大写下划线部分为设计用于Gibson组装的DNA同源序列，分别命名为重叠区L和重叠区R；小写部分为引物与模版载体的同源互补配对序列。该通用同源序列包括：两段各40bp随机DNA序列，中间以BamHI酶切位点相连。随机序列设计要求为：长度各为40bp，CG含量适中（40%-60%），无重复序列（连续5个或以上相同碱基，如AAAAA；连续四个或以上两碱基重复，如ATATATAT），单链DNA无明显二级结构（ΔG自由能<3kCal/mol），退火温度适中（60℃-70℃），与宿主细胞（大肠杆菌）基因组无近源序列，不易生成二聚体等。

然后，分别以载体pSB1A3、pSB1K3为模版，用设计好的引物进行PCR扩增，得到两端分别带有Gibson组装同源序列和BamHI酶切位点的线型载体，再经过BamHI酶切、连接反应，得到环状目标载体。参与Gibson组装的DNA片段的首、尾末端序列，与这两段40bp序列为同源序列，使目标片段可与通过BamH I酶切处理得到的线性化载体发生Gibson反应，从而实现一步组装，并将组装片段保存于带有抗性标记的改造载体中，方便阳性克隆筛选及扩增。

实施例1——制备载体pSBGAA和pSBGAK

具体实施方式如下：

1）以载体pSB1A3、pSB1K3为模版，进行PCR扩增：

反应体系包括：Ex Taq(5U/μL)0.25μL，10×PCR缓冲液2.5μL，引物pSB-F、pSB-R各1μL，dNTP(各2.5mM)2μL，DNA模版1μL，ddH₂O17.25μL。

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃后延伸5min。PCR产物用Qiagen PCR纯化试剂盒回收，方法参见其说明书。

2）BamHI酶切：

反应程序：BamHI(15U/μL)1μL，10×K缓冲液2μL，回收的PCR产物DNA1μg，加ddH2O补足20μL。30℃酶切3h。酶切产物使用Qiagen PCR纯化试剂盒回收，方法参见其说明书。

3）片段连接：

反应程序：T4DNA连接酶(350U/μL)1μL，10×缓冲液1μL，回收的酶切产物DNA15ng，加ddH2O补足10μL。16℃连接过夜。

4）转化：

反应程序：取50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰上融化，加入10μL连接产物，冰浴30min，42℃热激90sec，放回冰上，放置4min。加入700μL SOC培养基，37℃200rpm摇培45min。取200μL培养的菌液涂布LB平板（含对应的氨苄青霉素和卡那霉素50μg/mL），37℃培养过夜。

5）鉴定：

反应程序：挑单克隆，接种到4mL LB液体培养基中（含对应的氨苄青霉素和卡那霉素50μg/mL），37℃200rpm摇培过夜。使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，Nanodrop测定质粒浓度。

酶切鉴定：BamHI(15U/μL)0.5μL，10×K缓冲液1μL，回收的PCR产物DNA1μL，加ddH2O补足10μL。30℃酶切3h。

电泳检测：10μL酶切产物加1μL10×上样缓冲液，点3μL DL2000DNA Marker，1%Agarose胶，100V电压电泳40min。EB染色，凝胶成像系统照相。

测序鉴定：每个载体挑取2个酶切鉴定正确的菌株，使用M13通用引物进行Sanger测序验证。

构建完成的载体pSBGAA和pSBGAK质粒图谱分别见图1和图2。下面以酵母基因组人工合成DNA片段yeast_chr02_3_22.A2和yeast_chr02_3_22.A5的组装为例，对该载体的功能进行说明。实施例仅作说明使用，本发明的应用范围并不限于此。另外，实施例中无特殊说明的步骤，均按常规方法施行，所有试剂均可从商业途径获得。

实施例2——使用载体pSBGAA组装酵母DNA长片段

1）序列设计：

选取酵母2号染色体DNA片段，编号yeast_chr02_3_22.A2，长度约6.8kb左右，对其两端分别加上载体的重叠区R和重叠区L，然后将DNA片段分成3个2kb左右的片段，分别命名为yeast_chr02_3_22.A2.F1、yeast_chr02_3_22.A2.F2、yeast_chr02_3_22.A2.F3，中间有40bp的同源区。在片段末端加入XhoI酶切位点，送基因合成公司合成。

2）组装DNA片段和载体制备：

将合成的DNA片段和构建的载体分别酶切成线型DNA片段。

载体酶切：BamHI(15U/μL)1μL，10×K缓冲液2μL，pSBGAA1μg，加ddH₂O补足20μL；30℃酶切3h。

酵母DNA片段酶切：XhoI(10U/μL)1μL，10×H缓冲液2μL，含酵母DNA片段的质粒2μg，加ddH₂O补足20μL；37℃酶切3h。

将以上酶切产物分别用Qiagen PCR纯化试剂盒回收，用Nanodrop测定DNA浓度。

3）组装

5×ISO缓冲液配制：3mL1M Tris-HCl pH7.5，150μL2M MgCl₂，60μL100mM dATP，60μL100mM dTTP，60μL100mM dGTP，60μL100mM dCTP，300μL1M DTT，1.5g PEG8000，300μL100mM NAD，加ddH₂O至6mL；-20℃保存。

酶反应液配制：320μL5×ISO缓冲液，0.64μL T5外切酶（10U/μL），20μL Phusion DNA聚合酶（2U/μL），160μL Taq DNA连接酶（40U/μL），加ddH₂O至1.2mL；分装成15μL/管，-20℃保存。

组装反应体系：酶反应液15μL，yeast_chr02_3_22.A2.F150ng，yeast_chr02_3_22.A2.F250ng，yeast_chr02_3_22.A2.F350ng，pSBGAA25ng，加ddH₂O至20μL；50℃反应1h。

转化：取50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰上融化，加入10μL组装产物，冰浴30min，42℃热激90sec，放回冰上，放置4min。加入700μL SOC培养基，37℃200rpm摇培45min。12000rpm离心30sec，留200μL上清，混匀后涂布LB平板（含氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜。

4）鉴定：

挑单克隆，接种到4mL LB液体培养基中（含氨苄青霉素50μg/mL），37℃200rpm摇培过夜。

使用天根质粒小提试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP103-02）提取质粒，Nanodrop测定质粒浓度。

酶切鉴定：SfiI(10U/μL)0.5μL，BsoBI(10U/μL)0.5μL，10×M缓冲液2μL，质粒DNA2μL，、ddH2O15μL；37℃酶切3h。

电泳检测：5μL酶切产物加1μL10×上样缓冲液，点3μLλ-HindIII DNA Marker，1%Agarose胶，100V电压电泳1h。EB染色，凝胶成像系统照相。载体长度为2.1kb左右，组装的目的DNA片段长度为6.8kb左右，组装完成后整个质粒长度为8.9kb左右，双酶切的目的是切下目标DNA片段，所以应该得到两个条带，一条2.1kb左右的为组装载体条带，另一条6.8kb左右的为目标DNA片段条带。酶切鉴定电泳图见图3。

图3是组装后酶切鉴定的电泳图。A2F1、A2F2、A2F3这3个片段组装成chr02_A2这段DNA片段，连接到组装载体上，整个质粒长8.9kb左右。组装完成后挑2个克隆进行双酶切鉴定（即chr02_A2-1和chr02_A2-2）。使用限制性内切酶SfiI和BsoBI对组装后的质粒进行双酶切，酶切后跑电泳会出现两条带，其中一条为chr02_A2片段，长度6.8kb左右，剩下一条为组装载体，长为2.1kb左右。电泳中显示的条带大小与预期结果一致，说明组装是成功的。

实施例3——使用载体pSBGAK组装酵母DNA长片段

1）序列设计：

选取酵母2号染色体DNA片段，编号yeast_chr02_3_22.A5，长度约11kb左右，对其两端分别加上载体的重叠区R和重叠区L，然后将DNA片段分成5个2kb左右的片段，分别命名为yeast_chr02_3_22.A5.F1、yeast_chr02_3_22.A5.F2、yeast_chr02_3_22.A5.F3、yeast_chr02_3_22.A5.F4、yeast_chr02_3_22.A5.F5，中间有40bp的同源区。在片段末端加入XhoI酶切位点，送基因合成公司合成。

2）组装DNA片段和载体制备：

将合成的DNA片段和构建的载体分别酶切成线型DNA片段。

载体酶切：BamHI(15U/μL)1μL，10×K缓冲液2μL，pSBGAK1μg，加ddH₂O补足20μL；30℃酶切3h。

酵母DNA片段酶切：XhoI(10U/μL)1μL，10×H缓冲液2μL，含酵母DNA片段的质粒2μg，加ddH₂O补足20μL；37℃酶切3h。

将以上酶切产物分别用Qiagen PCR纯化试剂盒回收，用Nanodrop测定DNA浓度。

3）组装

5×ISO缓冲液配制：3mL1M Tris-HCl pH7.5，150μL2M MgCl₂，60μL100mM dATP，60μL100mM dTTP，60μL100mM dGTP，60μL100mM dCTP，300μL1M DTT，1.5g PEG8000，300μL100mM NAD，加ddH₂O至6mL；-20℃保存。

酶反应液配制：320μL5×ISO缓冲液，0.64μL T5外切酶（10U/μL），20μL Phusion DNA聚合酶（2U/μL），160μL Taq DNA连接酶（40U/μL），加ddH₂O至1.2mL；分装成15μL/管，-20℃保存。

组装反应体系：酶反应液15μL，yeast_chr02_3_22.A5.F150ng，yeast_chr02_3_22.A5.F250ng，yeast_chr02_3_22.A5.F350ng，yeast_chr02_3_22.A5.F450ng，yeast_chr02_3_22.A5.F550ng，pSBGAK25ng，加ddH₂O至20μL；50℃反应1h。

转化：取50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰上融化，加入10μL组装产物，冰浴30min，42℃热激90sec，放回冰上，放置4min。加入700μL SOC培养基，37℃200rpm摇培45min。12000rpm离心30sec，留200μL上清，混匀后涂布LB平板（含卡那霉素50μg/mL），37℃培养过夜。

4）鉴定：

挑单克隆，接种到4mL LB液体培养基中（含卡那霉素50μg/mL），37℃200rpm摇培过夜。

使用天根质粒小提试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP103-02）提取质粒，Nanodrop测定质粒浓度。

酶切鉴定：SfiI(20U/μL)0.5μL，BaeI(10U/μL)1μL，10×M缓冲液2μL，质粒DNA2μL，、ddH2O14.5μL；37℃酶切3h。

电泳检测：5μL酶切产物加1μL10×上样缓冲液，点3μLλ-HindIII DNA Marker，1%Agarose胶，100V电压电泳1h。EB染色，凝胶成像系统照相。载体长度为2.1kb左右，组装的目的DNA片段长度为11kb左右，组装完成后整个质粒长度为13kb左右，双酶切的目的是切下目标DNA片段，所以应该得到两个条带，一条2.1kb左右的为组装载体条带，另一条11kb左右的为目标DNA片段条带。酶切鉴定电泳图见图4。

图4是组装后酶切鉴定的电泳图。A5F1、A5F2、A5F3、A5F4、A5F5这5个片段组装成chr02_A5这段DNA片段，连接到组装载体上，整个质粒长13kb左右。组装完成后挑2个克隆进行双酶切鉴定（即chr02_A5-1和chr02_A5-2）。使用限制性内切酶SfiI和BaeI对组装后的质粒进行双酶切，酶切后跑电泳会出现两条带，其中一条为chr02_A5片段，长度11kb左右，剩下一条为组装载体，长为2.1kb左右。电泳中显示的条带大小与预期结果一致，说明组装是成功的。

Claims (12)

1.一种Gibson组装载体，所述载体的序列为SEQ ID No.3或SEQID No.4。

2.权利要求1的Gibson组装载体，它们的图谱分别为图1和图2。

3.一种构建Gibson组装载体的方法，所述方法包括步骤：

分别以载体pSB1A3和pSB1K3为模版，用一对引物SEQ ID No.5和SEQ ID No. 6进行PCR扩增，得到两端分别带有Gibson组装同源序列和BamHI酶切位点的线型载体，

经过BamHI酶切、连接反应，得到环状目标载体。

4.权利要求3的方法，所述Gibson组装载体的序列为SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4。

5.Gibson组装载体用于组装DNA片段的用途。

6.权利要求5的用途，所述Gibson组装载体的序列为SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4。

7.用于Gibson组装载体的重叠区L和重叠区R，其中重叠区L的序列是SEQ ID No.1，重叠区R的序列是SEQ ID No.2。

8.一对引物pSB-F和pSB-R，其中pSB-F的序列是SEQ ID No.5，pSB-R的序列是SEQ ID No. 6。

9.用于Gibson组装载体的重叠区L和重叠区R，所述重叠区L和重叠区R分别是的随机DNA序列，例如20bp-100bp，优选30bp-50bp，特别是40bp，中间以BamHI酶切位点相连。

10.两端含有权利要求9的重叠区L和重叠区R的Gibson组装载体。

11.引物对pSB-F和pSB-R，其中pSB-F和pSB-R中之一或两者的序列包含

（1）BamHI酶切位点；（2）用于Gibson组装的通用同源序列；（3）引物与模版载体的同源互补配对序列。

12.两端含有权利要求8或11的引物对pSB-F和pSB-R序列的Gibson组装载体。

Images