CN106893750B - 一种大分子dna的体外无缝组装方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大分子DNA的体外无缝组装方法，能通过“分段+分步酶促组装”模式实现大分子DNA的无缝组装的目标的方法，其有益效果在于：1、利用拼接碱基将大片段DNA分子分成若干个小片段，降低了PCR的难度，并由于拼接碱基的存在实现了分步无缝组装的目标。2、与传统的酶切连接方法相比，本发明不依赖于连接，几乎不受到酶切位点的限制。3、克服了传统酶切连接方法和位点特异性重组方法容易引入额外碱基的缺点，实现了分步无缝连接的目的。4、本发明的方法比多个片段一步克隆酶促组装具有更可控的组装成功率和更高的序列准确率。

Description

一种大分子DNA的体外无缝组装方法

技术领域

本发明涉及DNA的体外重组技术领域，具体涉及一种大分子DNA的无缝分步组装连接的方法。

背景技术

通过DNA体外重组技术合成大分子DNA片段在基因功能研究上的需求越来越多。大片段合成的一个最基本的要求就是将多个小的DNA片段按照一定的方向和精确的碱基顺序组装在一起形成较大的DNA分子。传统的方法依赖于限制性内切酶的酶切和DNA连接酶的连接。在载体构建中，这种方法一般适用于小于3kb的DNA片段的插入，一旦插入的DNA分子过大，常常会导致没有合适的酶切位点用来连接插入片段和载体，如果用稀有酶切位点来分段酶切和连接，又会引入不需要的酶切位点碱基，破坏了原来DNA序列的结构。位点特异性重组是一种不依赖于酶切位点的活体内重组方法，该方法依赖于小范围同源序列的联会，重组也只发生在两个特异的同源短序列的范围之内，但该方法如果应用于大分子DNA序列的分段组装同样也会在原来序列中引入重组所必须的特异位点碱基，这些特异位点碱基也破坏了原来DNA序列的结构。为了不破坏DNA序列的原有结构，研究人员又开发了一种不依赖连接(ligation-independent cloning，LIC)的克隆方法。LIC方法中，线性化的骨架质粒可以通过酶切或PCR获得，插入片段一般通过PCR获得，在设计插入片段的引物时，使线性化的质粒片段与插入片段之间具有15-35bp的同源末端，同源末端在核酸外切酶的作用下特异切割DNA的5’端序列产生互补配对的单链末端，通过退火使互补配对的单链末端两两结合在一起，再在DNA聚合酶作用下在形成有单碱基缺口的不稳定的环状DNA分子，将环状DNA分子转化到大肠杆菌后，可以在大肠杆菌体内修复缺口形成完整的环状质粒。该方法在两种酶的作用下，可以将多个片段一次组装到质粒中而不破坏原来DNA序列的结构，因此LIC方法又被称为一步克隆无缝酶促组装。由于酶促组装方法能一次无缝组装两个以上的片段，具有灵活，省时和省工的优势，使得该方法有逐步替代传统的酶切-连接方法的趋势，市场上也已经出现了多种商业化试剂盒，比如国外的Gibson

Cloning Kit、

HD Cloning Kit和国内北京全式金的pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit等。然而，在实际应用中一步克隆酶促组装法的成功率极易受组装片段数目的影响，Nick S.Berrow等报道一个质粒骨架片段和一个插入片段即两个片段的一步克隆酶促组装的成功率大于60％，一个质粒骨架片段和两个插入片段即三个片段的一步组装的成功率低于40％，而三个以上片段的一步酶促组装的成功率小于10％，即使在三个以上片段的一步组装反应中能获得几个组装成功的质粒，但往往由于被组装的DNA序列片段过长导致PCR过程中容易引入碱基错配，使得实验功亏一篑。因此，三个以上片段的一步酶促组装很难得到序列完全正确的组装质粒。由于两个片段酶促组装的成功率远大于三个及以上片段的一步酶促组装成功率，因此也可以将大分子DNA片段随机分成多个小片段，采用“两片段酶促组装+多个酶促反应步骤”的模式将长链DNA片段克隆到质粒上，这种模式不仅极大地提高了酶促组装的成功率，而且可以在第一个小片段组装成功后立即测序，获得序列完全正确的组装产物后再进行下一个片段的组装，更容易获得序列完全正确的最终酶促组装产物。但这种模式的酶促组装需要在上一次组装成功后恢复一个酶切位点用于产生下一次酶促组装的装配入口，同时被恢复的酶切位点的碱基序列又不能破坏原有的DNA序列结构。目前还没有相关的方法报导能通过“分段+分步酶促组装”模式实现大分子DNA的无缝组装的目标。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能通过“分段+分步酶促组装”模式实现大分子DNA的无缝组装的目标的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种基于酶切位点拼接策略的DNA分步无缝酶促组装方法，这个方法可以像堆积木一样将DNA小片段一个一个逐步无缝组装到骨架质粒中，形成最终所需要的质粒载体。包括以下步骤：

(1)分析被组装序列的酶切位点，获得所有不出现在被组装序列中的酶切位点；

(2)从上述不出现在被组装序列中的酶切位点对应的限制性内切酶中选择合适的一个酶切骨架载体，使载体线性化并产生组装入口。优先选用常用的限制性内切酶。线性化载体的两个末端分别包含酶切位点的部分碱基或一半碱基，命名为拼接碱基。例如粘性末端酶BamHI酶切载体补平末端后的5’-3’正义链两端分别残留碱基GGATC和GATCC，GGATC和GATCC称为BamHI的两个拼接碱基。而平端酶SmaI酶切载体后，5’-3’正义链两端分别残留CCC和GGG，CCC和GGG称为SmaI的两个拼接碱基。识别位点同为6个碱基的BamHI(GGATCC)和SmaI(CCCGGG)，粘性末端酶的拼接碱基为5个碱基，而平末端酶为3个碱基，拼接碱基的碱基数越少则它在序列中出现的频率越高，有利于后续的分段和引物设计，因此粘性末端酶和平端酶中优选平端酶。

(3)同一组装酶的两个拼接碱基在被组装序列中出现的频率和位置都不同，优选在被组装序列中出现频次高且大致均匀分布的拼接碱基。根据以上原则选择合适的拼接碱基并根据拼接碱基选择对应的组装方向，以BamHI为例，拼接碱基GGATC对应的组装方向为5′→3′，拼接碱基GATCC对应的组装方向为3′→5′。几种常用的限制性内切酶的拼接碱基及对应的组装方向见表1；

表1几种常用的限制性内切酶的拼接碱基及对应的组装方向

(4)选择合适数目的拼接碱基将大片段DNA分成几个小的DNA组装片段，设计一套重叠引物来扩增组装片段。拼接碱基的数目不宜过多也不能太少，过多则组装步骤多，太少则组装片段过长增加了PCR的难度，合适的组装片段长度为1.5-3.5kb。引物设计的原则如下：i，所有引物都包含重叠序列和片段特异序列，重叠序列是与相邻片段同源的序列，长度为15-25bp；为了获得特异PCR产物建议将片段特异序列长度设计为25-35bp，退火温度等于或大于68℃。ii，可以编辑与线性化载体同源的重叠序列，实现在扩增产物中移除和恢复原有酶切位点或引入新的酶切位点的目的。iii，每个组装片段的一对引物中，一条引物消除酶切位点，另一条通过拼接碱基与载体同源的重叠序列拼出一个酶切位点，该酶切位点可以通过限制性内切酶的切割产生装配入口用于下一步的酶促组装；

(6)用所设计重叠引物扩增组装片段，PCR反应程序为：①98℃预变性3min；②5循环(98℃10s，70℃3-5min)；30循环(98℃10s，68℃3-5min)③最后延伸68℃5min；④4℃保存；所用PCR酶为扩增长片段的高保真DNA聚合酶；

(7)琼脂糖凝胶回收线性化的载体和组装片段；

(8)通过酶促反应将第一个组装片段组装到载体中。装配产物将恢复一个酶切位点。酶促反应体系为：全式金2×Assembly Mix 5ul，线性化载体和插入片段各2.5ul，总体积10ul。反应条件：50℃，40min；

(9)重复(7)和(8)将所有组装片段一个接一个地通过多步酶促反应组装到载体上。

分步无缝酶促组装的关键原理是用出现在被组装大分子DNA中的拼接碱基将被组装的大分子DNA分成若干小的组装片段，在设计重叠引物时一条引物都通过拼接碱基与线性化载体的重叠区的拼接恢复原有的酶切位点，因此所扩增出来的每个组装片段装配到线性化载体后都能恢复原有的酶切位点，该酶切位点可以被切割产生装配入口用于下一次的酶促组装。下一次酶促组装完成后，前一个组装片段和后一个组装片段的分界点即为拼接碱基，由于拼接碱基本身存在于被组装序列中，所以前一个组装片段和后一个组装片段之间没有引入额外的碱基，实现了两个组装片段之间的无缝连接。

与现有技术相比，本发明提供的一种能通过“分段+分步酶促组装”模式实现大分子DNA的无缝组装的目标的方法，其有益效果在于：1、利用拼接碱基可以将大片段DNA分子分成若干个小片段，降低了PCR的难度，并由于拼接碱基的存在实现了分步无缝组装的目标。2、与传统的酶切连接方法相比，本发明不依赖于连接，几乎不受到酶切位点的限制。3、克服了传统酶切连接方法和位点特异性重组方法容易引入额外碱基的缺点，实现了分步无缝连接的目的。4、本发明的方法比多个片段一步克隆酶促组装具有更可控的组装成功率和更高的序列准确率。

附图说明

图1不出现在4.98kb DNA序列中的酶切位点

图2骨架载体pLDR

图3选取2个拼接碱基GGATC将4.98kb的DNA序列分成三个大小差不多的DNA片段，长度分别为1995bp,1657bp和1332bp

图4分步无缝组装4.98kb DNA序列，其中pLDR表示骨架载体的序列；BF1表示第一个片段的序列；BF2表示第二个片段的序列；BF3表示第三个片段的序列，方框中的序列

为BamHI的拼接碱基。A为第一轮酶促组装反应，将第一个片段BF1装配至骨架质粒pLDR中，形成中间质粒pLDR-BF1；B为第二轮酶促组装反应，将第二个片段BF2装配至质粒pLDR-BF1中，形成中间质粒pLDR-BF1～BF2；C为第三轮酶促组装反应，将第三个片段BF3装配至质粒pLDR-BF1～BF2中，形成最终质粒pLDR-BF1～BF3

图5 PCR筛选阳性单克隆，M为TAKARA 1kb DNA ladder。A：从24个单克隆中PCR筛选到21个阳性的pLDR-BF1质粒；B：从24个单克隆中PCR筛选到10个阳性的pLDR-BF1～BF2质粒；C：从24个单克隆中PCR筛选到15个阳性的pLDR-BF1～BF3质粒

图6对终载体pLDR-BF1～BF3进行酶切验证，其中M为TAKARAλ-HindIII digestDNA marker；1为BamHI酶切后能获得预期的14777bp条带；2为SalI酶切后能获得预期的12629bp和2148bp的条带

图7不出现在7.09kb DNA序列中的酶切位点

图8选取1个的拼接碱基GGG将7.09kb的DNA序列分成两个大小差不多的DNA片段，长度分别为3586bp和3507bp

图9分步无缝组装7.09kb DNA序列，其中，pLDR表示骨架载体的序列；PF1表示第一个片段的序列；PF2表示第二个片段的序列；方框中的序列

为SmaI的拼接碱基。A为第一轮酶促组装反应，将第一个片段PF1装配至骨架质粒pLDR中，形成中间质粒pLDR-PF1；B为第二轮酶促组装反应，将第二个片段PF2装配至质粒pLDR-PF1中，形成最终质粒pLDR-PF1～PF2

图10 PCR筛选阳性单克隆，M为TAKARA 1kb DNA ladder。A：从12个单克隆中PCR筛选到6个阳性的pLDR-PF1质粒；B：从12个单克隆中PCR筛选到7个阳性的pLDR-PF1～PF2质粒

图11对终载体pLDR-BP1～PF3进行酶切验证，其中M为TAKARAλ-HindIII digestDNA marker；1～5为KpnI酶切pLDR-BP1～PF3的第1号、3号、7号、8号和10号质粒，酶切后能获得预期的12615bp和4271bp的条带。

具体实施方式

实施例1

以产生粘性末端的限制性内切酶切割质粒产生组装入口的方式，从5′→3′方向组装日本晴的Chr.3:3700958-3705941的DNA序列(seq1)，序列长度为4.98kb。步骤如下：

1、用DNAssit 2.0的软件分析4.98kb的DNA序列的酶切位点，共有44个酶切位点不出现在该DNA序列中，其中包括4个常见的酶切位点，分别为BamHI，PstI，SpeI和XbaI(图1)。

2、选择BamHI酶切骨架载体pLDR(图2)，那么被组装序列的拼接碱基可以选择GGATC也可以选择GATCC，但由于GGATC比较均匀地分布在4.98kb的DNA序列中，故选择GGATC作为拼接碱基，对应的组装方向为5′→3′方向。

3、在4.98kb的DNA序列中共有6个GGATC的拼接碱基，挑选其中2个将4.98kb的DNA序列分成三个大小差不多的DNA片段BF1、BF2和BF3。三个DNA片段的长度分别为1995bp,1657bp和1332bp(图3)。

4、设计扩增三个DNA片段的重叠引物(表2)，其中在第一个片段BF1的正向引物B1-F的重叠序列中删除一个碱基C从而消除BamHI位点，反向引物B1-R则通过第一个拼接碱基GGATC与重叠序列中的碱基C拼出一个BamHI酶切位点，当BF1与线性化载体pLDR与组装后，第一轮组装产物pLDR-BF1将恢复一个BamHI位点用于产生第二轮酶促反应的组装入口。第二个片段BF2的正向引物B2-F位于第一个拼接碱基附近，包含BF2的特异序列和BF1末端15bp的同源序列，反向引物B2-R与第一个片段的反向引物B1-R设计类似。第三个片段的引物B3-F和B3-R设计原则类似于第二个片段。

表2组装4.98kb的DNA序列的重叠引物

5、用步骤3中设计的第一个片段的引物B1-F和B1-R从日本晴基因组DNA中通过PCR扩增出第一个片段BF1，PCR反应程序为：①98℃预变性3min；②5循环(98℃10s，70℃2min)；30循环(98℃10s，68℃2min)③最后延伸68℃5min；④4℃保存；所用PCR酶为KOD FX DNA聚合酶。并用琼脂糖凝胶电泳回收BF1和步骤2中酶切获得的线性化载体pLDR。

6、将回收的BF1和线性化载体pLDR各2.5ul与5ul全式金2×Assembly Mix混合，于50℃条件下酶促反应40min，将第一个片段BF1组装到质粒pLDR(图4A)。酶促反应后将酶促产物通过热击方式转化到大肠杆菌感受态细胞，转化产物涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上过夜培养。第二天挑取单菌落用引物B1-F和B1-R进行菌落PCR检测，24个单克隆中PCR检测呈阳性的单克隆有21个，说明BF1组装成功的质粒pLDR-BF1有21个(图5A)。将pLDR-BF1-1、pLDR-BF1-2和pLDR-BF1-3三个PCR检测呈阳性的单克隆送测序公司测序，其中质粒pLDR-BF1-2中的第一个片段BF1序列测序完成正确，其他两个质粒的BF1序列都有碱基突变，可能为PCR过程中由碱基错配引入的突变。留选质粒pLDR-BF1-2用于第二轮的酶促组装。

7、正确组装第一个片段BF1后，重复步骤5和6将第二个片段BF2组装到质粒pLDR-BF1-2(图4B)，经PCR检测获得10个阳性质粒pLDR-BF1～BF2(图5B)，经测序其中pLDR-BF1～BF2-7的序列完全正确，留选用于第三轮的酶促组装。

8、正确组装第二个片段后，重复步骤5和6将第三个片段BF3组装到质粒pLDR-BF1～BF2-7(图4C)，经PCR检测获得15个阳性质粒pLDR-BF1～BF3(图5C)，经测序其中pLDR-BF1～BF3-1的序列完全正确。对终载体pLDR-BF1～BF3进行酶切验证，其中BamHI酶切后能获得预期的14777bp条带，SalI酶切后能获得预期的12629bp和2148bp的条带(图6)，说明4.98kb的DNA序列被正确组装到质粒载体pLDR中。

实施例2

以产生平端的限制性内切酶切割质粒产生组装入口的方式，从3’→5’方向组装日本晴的Chr.9:16782917-16790009的DNA序列(seq2)，序列长度为7.09kb。步骤如下：

1、用DNAssit 2.0的软件分析4.98kb的DNA序列的酶切位点，共有26个酶切位点不出现在该DNA序列中，其中包括8个平端酶切位点，分别为FspAI、PmeI、SmaI、SnaBI、SrfI、SspI、SwaI和XmnI(图7)。

2、选择常用的SmaI酶切骨架载体pLDR，那么被组装序列的拼接碱基可以选择CCC也可以选择GGG，由于组装方向为3’→5’方向，故选择GGG作为拼接碱基。

3、在7.09kb的DNA序列中共有多个GGG的拼接碱基，在序列的中部挑选其中1个拼接碱基将7.09kb序列分成两个大小差不多的DNA片段PF1和PF2，两个DNA片段的长度分别为3586bp和3507bp(图8)。设计扩增两个DNA片段的重叠引物，其中在第一个片段PF1的正向引物P1-F中通过第一个拼接碱基GGG与重叠序列中的碱基CCC拼出一个SmaI酶切位点，当PF1与线性化载体pLDR与组装后，第一轮组装产物pLDR-PF1将恢复一个SmaI位点用于产生第二轮酶促反应的组装入口；反向引物P1-R的重叠区因为无拼接碱基故不能拼接出SmaI位点。第二个片段PF2的正向引物P2-F与P1-F设计类似；反向引物P2-R位于第一个拼接碱基附近，包含PF2的特异序列和PF1末端15bp的同源序列(表3)。

表3组装7.09kb的DNA序列的重叠引物

4、用步骤3中设计的扩增第一个片段的引物P1-F和P1-R从日本晴基因组DNA中通过PCR扩增出第一个片段PF1，PCR反应程序为：①98℃预变性3min；②5循环(98℃10s，70℃3.5min)；30循环(98℃10s，68℃3.5min)③最后延伸68℃5min；④4℃保存；所用PCR酶为KODFX DNA聚合酶。并用琼脂糖凝胶电泳回收PF1和步骤2中酶切获得的线性化载体pLDR。

5、将回收的PF1和线性化载体pLDR各2.5ul与5ul全式金2×Assembly Mix混合，于50℃条件下酶促反应40min，将第一个片段PF1组装到质粒pLDR(图9A)。酶促反应后将酶促产物通过热击方式转化到大肠杆菌感受态细胞，转化产物涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上过夜培养。第二天挑取单菌落用引物P1-F和P1-R进行菌落PCR检测，12个单克隆中PCR检测呈阳性的单克隆有6个，说明PF1组装成功的质粒pLDR-PF1有6个(图10A)。将pLDR-PF1-4、pLDR-PF1-5、pLDR-PF1-6、pLDR-PF1-8和pLDR-PF1-9五个PCR检测呈阳性的单克隆送测序公司测序，其中质粒pLDR-PF1-5和pLDR-PF1-8两个质粒中的第一个片段PF1序列测序完成正确。留选质粒pLDR-PF1-5用于第二轮的酶促组装。

6、正确组装第一个片段后，重复步骤4和5将第二个片段PF2组装到质粒pLDR-PF1(图9B)，经PCR检测和测序获得最终的载体pLDR-PF1～PF2(图3)。经PCR检测获得7个阳性质粒pLDR-PF1～PF2(图10B)，经测序其中第1号、3号、7号、8号和10号的序列完全正确。用KpnI对上述五个测序正确的质粒进行酶切验证，酶切后能获得预期的12615bp和4271bp的条带(图11)，说明7.09kb的DNA序列被正确组装到质粒载体pLDR中。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南杂交水稻研究中心;湖南农业大学

<120> 一种大分子DNA的体外无缝组装方法

<130> 20161207-2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4984

<212> DNA

<213> 水稻种（Oryza）

<400> 1

ggacaagatc ttgaaagtgc tcgacgtcaa ttgcttgacc gaggacgcag cgccatccgc 60

caatctgctc ggcagcaatg gcgtcgtcaa ctgcggcgtc gggctgtgga tcttgccggc 120

gttcatcaac cactcgtgcc accccaacgc ccggcgcacc cacgtcggcg accacgccat 180

tgtccacgcg tcaagggaca tcaaagccgg ggaggagatc acattcgcct acttcgacgt 240

gctcaccccg gcgagcaagc gcagggaggc agcgagagcg tggggcctcg aatgccaatg 300

cgatcggtgc aggttcgaag ccagcgacgc cattgttggg caagaactca caaaacttga 360

gaacgaattg gtcaatggcc gaggaggaga catgggagca ctggtggtga ggctggagga 420

gaggatgaga aagtccatgg tgaaggagag gaggaaggcg ttcttgcgcg cgtcgttctg 480

gagcgcgtac tccgcgctgt tcgactccga caagctggtg aggaagtggg ggaggcgcgt 540

ccccggtgag gccgccgtcg cagagagcgt cgccggcgca atcggcggga acgagagcgt 600

gctgagggca atgctgaggg gtgccgacaa tggcaacggc tgcggcaatc ggctcgaggt 660

ggaagacaag gtggtgagga ttgggagggc tacctatggc agggtagtga agaggcaggc 720

aatgagagct ctcttcagac ttacattgga tgctgacagt aacaaaagcc tgtaggtttt 780

gatactcttg attgattgtt tatttagtta cctagtatct tcagtaacag atgagagatt 840

tattcagcaa atgctccggt ttgctcgaag gttgtaataa gagtgtgggc aagaatcaag 900

gtcaatccat aagagcacta ttttcatgct cttctgatct tggtttcaga cttgtttcag 960

tgttgacatt ggttatttct caattcattc gagtatttgt tgttacatca caaaggataa 1020

gttctataga aaaaatcttc cttttcaagt gatgttcttt aattttctgt agaattgtgc 1080

cctgcaattt ctcaaatctt tgatagatgg cttatttgta ttgactggaa aagaaattag 1140

ttgtcaataa ctagaagctt tagagatgca aagtattgga tatatcttgg caatagtatt 1200

ttatattgct tgtttatgtg agaatgtttt aactagatgg caactgattt ctgggacaaa 1260

atcgcttcta caatagcatt ttatggaact cgtactcgtc gatagcattt cttggatttg 1320

ggtgtttgta aatggcattt cttggatttt ctcttcatta aaatagccta ttcagatgaa 1380

gtagaattca ggtgaagtag aaaccaacta ctttgggttc acaatttata tttcttttga 1440

ggatacccca tttcatttta gttgtcatca aagactagac aatatcgaca gaaaatggta 1500

agcctggttt cagttggtga caatttaaca gaattcagat ggatatggtt ctgatattag 1560

aaggtggcat acctttagtc gctgcaaacg cttcagttat ctgaacaaaa caacgaactt 1620

ggctgagcag gggaaaaaaa tactgtagca ttcattttgt gtttacatga gtaacgattc 1680

ttttctaggt ggacagatca caaaaagaaa actaaagcta agatccaact cctaagggtg 1740

ttaggttagg gacaccatat gaatgagaca atcttaattc ttggtcacac aaagattgtc 1800

tcaaggttgg tagcatcagt gcccaatata tcacctaact atgccatcca aaatgctaca 1860

tagcatctct tgtagactga acccttcatg aagagcccca tggaggaagc tcatgcaatg 1920

ccagtgacat cattcttccc agtagcagga atccacaagc tcatagctat cttccttgtt 1980

gtcctctcat ggatcttggt ccacaagtgg agcctgagga accagaaagg gccaagatca 2040

tggccaatca tcggcgcgac agtggagcaa ctgaagaact accacaggat gcatgactgg 2100

cttgtcgagt acttgtcgaa ggacaggacg gtgaccgtcg acatgccttt cacctcctac 2160

acctacattg ccgacccggt gaacgtcgag catgtcctga agaccaactt caccaattac 2220

cccaaggtaa aagaaccata ggatcttcag tgtactgtaa aatgtgcctt gcacagtact 2280

aacactgaca caaaaaatgt ctgaaaatat gcagggtgaa gtgtacaggt cttacatgga 2340

tgtgctgctc ggtgatggca tattcaatgc cgacggcgag atgtggagga agcaaaggaa 2400

gacggcgagc ttcgagtttg cctccaagaa cttgagagac ttcagcactg tggtgttcag 2460

ggagtactcc ctgaagctat caagcattct gagccaagca tgcaaggccg gcagagttgt 2520

agacatgcag gtaaccaact gaattccttg cctaatacct aaacatttct tgagaaacca 2580

aattgttcag aattctgatg caagaactaa ccaaaattca ggaattgttc atgaggatga 2640

cactggactc gatctgcaag gtcgggtttg gggttgagat cgggacgctg tcacctgatc 2700

tcccggagaa cagctttgcc caggcattcg acgctgccaa catcatcgtc acgctgcggt 2760

tcatcgatcc tctgtggcgt ctgaagaagt tcttgcacgt cggatcagag gctctcctcg 2820

agcagagcat gaagctggtt gatgacttca cctacagcgt gatccgccgc cgcaaggctg 2880

agatcttgca ggctcgagcc agcggcaagc aagagaaggt gatccttcct ctcttgctca 2940

aagaatcagt agaactgaac tgacatggta atggtgatga tcagatcgga aaaggttttg 3000

tttcttgata tcgttgattt gtaatggcga gcagatcaag cacgacatac tgtcgcggtt 3060

catcgagctc ggggaggccg gcggcgacga ggggggcggc agcttcgggg acgacaagag 3120

cctccgcgac gtggtgctca acttcgtgat cgccgggcgt gacacgacgg cgacgacgct 3180

gtcgtggttc acgtacatgg cgatgacgca cccggccgtc gccgacaagc tccggcgcga 3240

gctggccgcg ttcgaggatg agcgcgcgcg cgaggagggc gtcgcgctcg ccgacgccgc 3300

cggcgaggcg tcgttcgcgg cgcgcgtggc gcagttcgcg tcgctgctga gctacgacgc 3360

ggtggggaag ctggtgtacc tgcacgcgtg cgtgacggag acgctccgcc tctacccggc 3420

ggtgccgcag gaccccaagg ggatcgtgga ggacgacgtg ctccccgacg gcaccaaggt 3480

gcgcgccggc gggatggtga cgtacgtgcc ctactccatg gggaggatgg agtacaactg 3540

gggccccgac gcggcgagct tccggccgga gcggtggctc agcggcgacg gcggcgcgtt 3600

ccggaacgcg tcgccgttca agttcaccgc gttccaggcc gggccgcgga tctgcctcgg 3660

caaggactcc gcctacctcc agatgaagat ggcgctcgcc atcctcttcc gcttctacac 3720

cttcgacctc gtcgaggacc accccgtcaa gtaccggatg atgaccatcc tctccatggc 3780

tcacggcctc aaggtccgcg tctccacctc cgtctgaccc ccgccgccgc tcgccggcag 3840

ccgcgccgcc gccgcccgta tcgcttaccg gagtagtaaa taagcctatg taatctggtt 3900

tgaatttgaa atttgaatgt accatgtttg attctaggat ttgttggtcc tagaccctgc 3960

ttgaaacggt gcgaatttca tctaaatggt tgagaaattt tatcgaaagc tgttccattc 4020

tacgctacaa atggtgggac tggatttaaa cattggcgac gtggacaagg ccgtatcacc 4080

atgtttgcac atttttaaac ctgtaatctg gtttgaattt gaatgtacca tgacaccatg 4140

tttgcaaaac tttacatgaa tgtttgagaa aaaatatgga gaactgttca attagtatgc 4200

gtttaaaatg ggactggatt taaacattgg cgacgtggac aaggctagtg gactgagact 4260

ctgagatgtt gcggaagtcg gggacgcagc ggcggcagcc gccggcgtgg cggcggtgcc 4320

ggagcctgcg acacatcaag cagatgcacg cggtgatggc gctccggggc ttcctctccg 4380

atccctccga gctccgcgag ctccttttcg cctccgccgt cgcggtccgc ggcgccatcg 4440

cgcacgccta cctcgtgttc gaccaaatac cccgcccgga ccgcttcatg tacaacaccc 4500

tcatccgcgg cgccgcccac acggccgcgc cccgggacgc tgtctccctg tacacgcgca 4560

tgctgcggcg cggcggcggc ggcggcgtga ggcccgacaa gctcacgttc ccgttcgtgc 4620

tccgcgcttg caccgccatg ggcgcggggg acaccggggt tcaggtgcac gcccacgttg 4680

tgaaggctgg ctgcgagtcc gacgcgttcg tcaagaacgc gctcattggc atgcacgcga 4740

gctgcgggaa tttgggcatt gcggctgctc tgttcgatgg cagagctcgt gaggatgccg 4800

tggcttggtc ggcgatgatc acggggtgtg caaggcgagg ggacattggt gctgcacggg 4860

acctgttcga cgaatgtcct gtgaaggacc tcgtgtcctg gaatgtgatg atcaccgcgt 4920

atgcgaagcg gggagatatg gcattggcaa gggagctatt cgaccaggta cccgagcgag 4980

atgt 4984

<210> 2

<211> 7093

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza）

<400> 2

gtcatgcatt cagccgtcag aaaggctcag atttatttcc gtggaataaa cagaaatctc 60

caaaagacaa ctctagcctt ggagttaaca agtggatggt gcttactgat tctgcttgga 120

agattggagc aaaaggacta gaaagtgcat tcttgaaggt tctttgtgat cctctttatt 180

attattttcc tttgtatccc tccagttttt ctttttcttt tgactaattc agtttttttt 240

ccttgaaggg tggtagtgca ttgactctga aaatgatcta tgaatcggta ggtatactgt 300

tttatgaagt tagattgatt ttactttttc ttacagcatc attagacatt aatggactta 360

tcatcatggt agttagccaa gagactatct ggaaagctgc tcatggaggc tggtaaatat 420

gagataaaga aagaacttct aaagcaggta tatgtatttt agttgatatc tgtaagcaat 480

ttttcctgat tttattattt gctcatctca taattctttt aacagaataa tagatatact 540

catgttctgg ccccacctga aaaatgcagt agcatagctt gatacacaga tcatatacac 600

aagctgtaac tattttttta attgttataa taaatatcct ttgggagtac tgaggtttgc 660

catctgcagg gtggacgatt agctgctgtt aatctggagt ctcgagctgg tttgcttgca 720

gctaggcagg taacattctc atctgtcagc agctacttcc atgcataatt ggtatattat 780

gctcccagta ttatctgaaa aactgcacat tttagatggt cgtttgaata atcctcttga 840

atgtatgcat gcagggtttg gcacgtgcag catctagata tgttggtctt aggagtgtca 900

tgacgtttct tggaccaatg tatgtttctg ctaatatatc tggaatctgt ttgttgctgt 960

atttttttaa atcaataata cactatcagg tttccgcatg tttctataaa aaatttgacc 1020

tcttttcctt tttggtcaat agtaggttct tatggttaat ttatttttgg gtgcatgatg 1080

tattcatgtt ttgctacttc aacttgctgt tctgagttta ctgtttgtca gatctacttt 1140

ttaagtaatg attcattcac aataagcttc ttcaaatgct ttgttgtgtt gaattttgag 1200

cagactataa atcagttact gactcttctg ttctacaact tcttgctgca tagaatgtgg 1260

gggacactct tggctgacat tgtgatccaa atgcttggga cagactatgc tagaattgtg 1320

caggcaatct atgcttttgc tcaggtgagc ttctgattgt tcagtttttc gtccagtaac 1380

tcactgtcca tccattgagt tcacatctta gcctttctaa cagattcggc tgactaggac 1440

atcttacata gaatctcatg aagaataatc aacagtggga catttctggt ctggactaac 1500

agggcattct gggcccatag tgtacattct gatcatgcag aacatttttg gttgagtgct 1560

ggcgcaattc tcccaagagg actcgaggac agtaagttca tactttcaca gaagttgtgc 1620

agctgatgta aatgcataga agttagatga cagaacaatt gatagatgct aggtaggata 1680

gatggtacag atgacacaca aatcatctat gcttttgaat tctccaaggt ttaaggctgc 1740

tgcttaagtg agagcttgtt atacattcca ggaaaaatta atttactgcc actatagaat 1800

ggtgtaattg tatttaagaa atagctcaca atgaccatta gggccaccta ctctctaaac 1860

gcggtagttg tgaatgaata tacatccact tcacacttcc acgagggccc gaagttgtag 1920

accatgcatt ccattctgct ccagttaatt atgcaacaaa acggttcccc tgatcttaaa 1980

ctattgcccc cctaacattc agttaggcaa ggcatacttc attgacatta gtccatgctt 2040

atcccagcca tatgttacag atatgcttac gtgtaaacac cagggcataa tttgcatgtt 2100

gcaccctgct tattcccctt atcaaaacac tagcaactaa tttatcagta caggctagat 2160

atcattattc aaaatcgcaa caagtatggt atactcacat taccaaaact tgccatactt 2220

catttagcta acatgtctaa catgtggcca acaaaattaa agccacactt tagccatagg 2280

agagtaaact tgccacactt ttatgtgcca atgacatgta ggacccacat catggtgaag 2340

gaatcttgtt aaaagtgtgg caccaaccaa acgaatgcct aactaagtca aacctggcta 2400

acttgagttg tggcatgatg aggcaaattg tggtagtgaa ccaaacaacc ccttaatatc 2460

tacttcctcc gtttcaggtt ataagacttc attgcctaca ttcatataga tgttaacgaa 2520

tctagacaca tttatataaa tgtgtctaga ttcgttaaca tctatatgaa tgtatataaa 2580

tgtgtctaga ttcgttaaac atctatatga atgtgggcaa tactagaaat tcttataacc 2640

tgaaatggat gtagtactag attgtgtaac aattcagata gctagtgcaa ttggtgattg 2700

attaatttta cagtccttat gtatttggag gtatcataat cttaagtgtt aatttgtgat 2760

acctcctggt cctcaacact agagagatac taagtggtaa cactgcaaaa tgtggcatct 2820

cctggtacct tttaagtacc aaatgcacta ggtgcctttg cgcaaaattc ccagatgaga 2880

ggacccaatt tgtgatcgtg tgcgacatgt ctagaagggt ggcccattgt ttacattcct 2940

tcaccagatc gccgaagctt tctaaatcgc gggcacttaa cgcgtgagaa gcccaatgag 3000

acctccaaat gctaacctta aaatcgcagc gctgcacggc gacatggtct cctagctagc 3060

tgcctagctt ctcggcgacg ttgattggca gcaactagct agctcgccgt ccggccggcc 3120

ggccatggcg cctaagatgg tgatcagcct ggggagctcg cggcggcgga agcgcggcga 3180

gatgctgttc cggttcgagg ccttctgcca gcccggctac ccggcgaact tcgccggcgc 3240

cggcggcttc agggacaacg tgaggacgct gctcggcttc gcgcacctgg aggccggcgt 3300

ccacggcgag accaagtgct ggtcgttcca gctcgagctg caccgccacc cccccaccgt 3360

cgtgaggctc ttcgtcgtcg aggaggaggt cgccgcctcg ccgcaccgcc agtgccacct 3420

ctgccgccat attggtccgt cgaacaaact acaattaatc aatcaacctt tacataggat 3480

tgatccgatc gatgccatgg tgttgtaggg tgggggaggc atctgatatg cagcaagagg 3540

tatcacttct tgctgccgag gagggaatcg gcggcggaag ccgacggcct gtgcttcgcg 3600

atcaaccacg gcggcggcgg tggcgcggag aaagcgtcgt cgaaagggac gacgacgacg 3660

gcctccagca gaggccacct gctacacggc gtcgtgcacc tcaacggcta cggccacctc 3720

gtcgccctcc acggcctcga gggcggctcc gacttcgtct ccggccacca gatcatggac 3780

ctctgggacc gcatttgctc agccttgcac gtaaggtagt agtagtatac atgtgcgtgt 3840

gcatgcatgc aagcaatgca acgatgtcgg gctgcgtgtg agaacatttg cttgggcatg 3900

gtgtggtgta tgcaaggacg gtgagcctgg tggacacggc gaggaagggc cacatggagc 3960

tgaggctgct gcacggcgtc gcgtacggcg agacgtggtt cgggcggtgg gggtacaggt 4020

acggccggcc gagctacggc gtcgcgctgc cgtcgtaccg gcagtcgctg cacgtgctcg 4080

gctccatgcc gctctgcgtg ctggtgccgc acctgtcgtg cttcagccag gagctcccca 4140

tggtggtcac caagtaccag gccatcagcg gccacaagct gctcagcctc ggcgacctcc 4200

tccgcttcat gctcgagctg cgcgcccgcc tgccggccac ctccgtcacg gccatggact 4260

accggggcat catgtcggag gcctcgtgcc ggtggtcggc gaagcgcgtc gacatggcgg 4320

cgcgcgccgt cgtggacgcg ctccgccgcg ccgagccggc ggcgcggtgg gtcacgcggc 4380

aggaggtgcg cgacgcggcg cgcgcctaca tcggcgacac gggcctcctc gacttcgtgc 4440

tcaagtccct cggcaaccac atcgtcggca actacgtcgt gcgccgcacc atgaacccgg 4500

tgaccaaggt gctcgagtac tgcctcgagg acgtctccag cgtgctcccg gcggtcgccg 4560

ccggcggcgg cgtgccggcg cagggcaaga tgagggtgag gttccagctc acgcgtgcgc 4620

agctcatgag ggacctggtg cacctgtacc ggcacgtgct caaggagccc agccaggcgc 4680

tcaccggcgg cgcgttcggc gcgatcccgg tggcggtgcg gatggtcctg gacatcaagc 4740

acttcgtcaa agattaccac gaaggacaag ccgcggcgag cagcaatggc ggtggcggat 4800

tcgggcatcc ccacatcaac ctgtgctgca cgctgctcgt gagcaacggg agcccggagc 4860

tagctccacc gtacgagacg gtgaccctgc cggcgcacgc gacggtgggc gagctgaagt 4920

gggaggcgca gagggtgttc agcgagatgt acctcggcct gaggagcttc gcggcggact 4980

ccgtcgtcgg ggtcggcgcc gaccaggagg gcctcccggt gctcgggctg gtcgacgtcg 5040

gaagcgccgt cgtggtgcaa gggagcgtgg gcgagcagat aaacggggag gaccacgaga 5100

ggaaggagga ggcggcggcg gcggccgtgt gcgaggggag cggcggcggc gagcgcgtcg 5160

tggactgcgc gtgcggcgcg gtggacgacg acggcgagcg catggcgtgc tgcgacatct 5220

gcgaggcgtg gcagcacacg cggtgcgccg ggatcgcgga caccgaggac gcgccgcacg 5280

tcttcctctg cagccggtgc gacaacgacg tcgtgtcgtt cccgtccttc aactgttaga 5340

tgtgatgctg ctgctgctac tgctactact actgcctctg ctgctatata tgatgctacc 5400

tagtacaagt gatcgagaat tcaatttgtt ttctcggcaa aaccaaaatg aaaacgaagg 5460

taaaaccaag tgaacttcag atcaattcag acttctcaac tttcctccca agagaaaaaa 5520

aagaatatga aaaaccatcg agcccactta atgtgggccg gtgtttgttt attccagccc 5580

aggaggatcc atggttagaa tcacccaatc aggccaggag cccaggacaa catcttctaa 5640

caaatgggtc tcctagaggt gaattacggc tataccatga tgggctgggc cgtgaccatg 5700

taacctacct gaaatgaggt gcccatgaat tttattgctt ccaagttcaa ctcatcttca 5760

taagatagtt ttcttcaact gtgtgattat tatgtcagtg gcttagagca ggagaggctt 5820

gatgaccagc ttaagggttg cacctaatgt ctaatgacta agttaagtac ctatcaggta 5880

acagtgctac taaactggca agtgaccacc aaaagatgag ctattcacat ggcctgcttg 5940

gaggggccca cttggtggtg tcatgaaagg ccttttagga aaggggcttc cctacactgt 6000

ggacactgct gctgctacta ctatcctatt cctactccac gtttgcatgc atccatggga 6060

gaagggagaa gctagccatg gtttctggtt ggaagcatcc aactaacatc ctgaatgatt 6120

catgtctagc tttgatggca agaaacatgc tttagcccac caacgcaaaa gctaaactga 6180

acctgcaaca atgtgctccc catcgtgctt gcacgcttaa ttacctttca gatgcttgag 6240

atttgagatc ctcactttct ttccttactg ttagaacagt gaacagatca ttctccattt 6300

tatctcttcc aaaagccaag tggctgctga gtagtgatta gcaagaaggt agaaatttca 6360

gtagaaaaag ggactagtac atagtgacat actgcacact ttgaccattg caacagcaaa 6420

gaagtgggaa ttgttctgaa gaagaacaaa gcaagaagaa acaaatgact tatcattgaa 6480

gcaatgaaaa gagagggagg aaagttgttt tgcttttatc tctctcactg tcactctctc 6540

tgccagtaga gggactccat ttgtcctgtg tccctagtga gacaacctag ctagcctttt 6600

cttttcccct ctctctttct gttcttttgc agttttgcat tgcaaggact gaaggccccc 6660

tttgttaggg ctctttcact caccctgatg agatgcctgt ttctctctcc atctttttcc 6720

cgtctctttt tgtttcatta atctgtctct gacatgttga ggtgatccac cactatggtg 6780

tgagggcgat aggggcacat ggtctggtgg ctcggctaaa aagggactca tcaactaaaa 6840

ggaagggagc aagtagctta agctagcaac agagtgaaga taggaagatc gatgtggaag 6900

tgactagaga acggcatctt ggaagcaagc cagcaagagg agctactaac tgcttttgct 6960

ccgttttctg actaataatg tgctcatttg ccactctcat tttgcctagt tcaggacact 7020

ctctgaagct cttactaact aattcaaaag caacattaat tttaattact ggccacctcc 7080

acagtccaca tgc 7093

Claims (7)

1.一种大分子DNA的无缝分步组装连接的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一）分析被组装序列的酶切位点，获得不出现在被组装序列中的限制性内切酶的酶切位点并选择其中一个限制性内切酶作为组装酶；组装酶酶切载体使载体线性化后，线性化载体两个末端所残留的部分酶切位点识别序列分别作为该组装酶的两个拼接碱基，根据两个拼接碱基在被组装序列中的分布情况选用合适的拼接碱基并根据所选用的拼接碱基确定对应的组装方向；

步骤二）选择合适数目的拼接碱基将被组装序列分为两个或两个以上DNA组装片段；设计一套PCR扩增DNA组装片段的重叠引物对；所述重叠引物包括重叠序列和片段特异序列；重叠序列为与相邻片段同源的序列，重叠序列的长度为15-25bp；重叠引物对中的一条引物中的特异片段序列包含拼接碱基，该拼接碱基能与重叠序列中相邻的碱基拼接出一个新的所述组装酶的酶切位点；另一条引物不含有拼接碱基序列而消除了一个的组装酶酶切位点；

步骤三）用组装酶线性化骨架载体，用步骤二设计的重叠引物对进行PCR扩增，获得所需要的组装片段；回收酶切获得的线性化骨架载体和PCR获得的组装片段，并通过粘性末端酶的酶促组装反应将第一个片段装配到骨架载体中；所述粘性末端酶为核酸外切酶；

步骤四）重复步骤三，根据确定的组装连接顺序将DNA组装片段分步组装到骨架载体上，形成最终所需要的载体。

2.如权利要求1所述的大分子DNA的无缝分步组装连接的方法，其特征在于，步骤一所述组装酶为限制性内切酶；每一限制性内切酶对应两个特定的拼接碱基；每一拼接碱基又对应特定的组装方向，两个拼接碱基分别对应5´→3´方向和3´→5´方向。

3.如权利要求1所述的大分子DNA的无缝分步组装连接的方法，其特征在于，步骤一所述组装方向根据所选用的拼接碱基而确定；同一组装酶的两个拼接碱基在被组装序列中出现的频率和位置都不同，选择在被组装序列中出现频次高且分布较均匀的拼接碱基。

4.如权利要求1所述的大分子DNA的无缝分步组装连接的方法，其特征在于，步骤二所述组装片段的数目根据组装片段的长度而定，组装片段的长度为1.5kb-3.5kb。

5.如权利要求1所述的大分子DNA的无缝分步组装连接的方法，其特征在于，所述特异序列长度为28-35bp，重叠引物的退火温度等于或大于68℃。

6.如权利要求1所述的大分子DNA的无缝分步组装连接的方法，其特征在于，步骤三扩增所述组装片段的PCR反应程序为：①98℃预变性 3min；②5次循环，条件为：98℃ 10s，70℃ 3-5min；30次循环，条件为98℃ 10s，68℃ 3-5min③最后延伸 68℃ 5min ；④4℃保存；所用DNA聚合酶为扩增长片段的高保真DNA聚合酶。

7.如权利要求1所述的大分子DNA的无缝分步组装连接的方法，其特征在于，步骤三所述酶促组装反应为：在核酸外切酶的作用下，两个片段的同源末端形成互补配对的单链末端，互补配对的单链末端通过退火形成环状双链，从而使两个片段连接。

Images