CN113462718A - 方便快捷的植物基因编辑工具p-XCHBCC3试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方便快捷的通用植物基因编辑工具p‑XCHBCC3的试剂盒开发。其制作过程首先是在原通用载体pKI1.1R的基础上,加入了改造过的无PaqCI酶切识别位点的抗除草剂Bar基因，构造出了中间载体p‑XCHB2；再在p‑XCHB2基础上，将空载体目标靶点的插入位置序列座上加入了ccdB大肠杆菌自杀基因和CmR氯霉素抗性基因这两个筛选标记，制作出了最终目标空载体p‑XCHBCC3；并且，还进一步描述了该编辑工具的具体实验室用法和商业化用法。本发明优点在于：作为一款通用植物基因编辑工具，能克服当今市面流通的一些载体的各种缺点并能集成它们的各种优点，操作简单，过程迅速，能大大减低科研工作量，对基础研究和应用研究都将大有裨益，具有很好的推广前景和价值。

Description

方便快捷的植物基因编辑工具p-XCHBCC3试剂盒
技术领域
本发明涉及一种方便快捷的植物基因编辑工具p-XCHBCC3试剂盒。
背景技术
CRISPR-Cas9是现阶段最先进的基因编辑系统。利用这套系统，已在许多物种上实现了人类精确操控的遗传信息修改，大大促进了基础科学的发展和医学及育种学等领域的进步。拟南芥作为模式生物，是植物学等领域最完美的遗传学研究材料。当前已有一些拟南芥的CRISPR-Cas9编辑载体可供使用，在帮助我们工作的同时，却各有各的缺点：比如，它们或者需要和别的载体配合使用，或者所需用到的限制性内切酶过于昂贵，或者酶切效率不高导致连接不理想和克隆筛选困难，或者表达效果不理想，或者只能利用了潮霉素(Hygromycin)或卡那霉素(Kanamycin)作为筛选剂导致筛选幼苗工作繁琐，或者不容易在短时间内从T2代子株中筛选到既是纯合编辑个体，又不包含大片段外源性DNA插入(T-DNA插入)的植株后代。因此，开发一款载体工具或试剂盒，若能同时集成各种优点并克服上述缺点，便显得更受欢迎。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方便快捷的植物基因编辑工具p-XCHBCC3试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种方便快捷的植物基因编辑工具p-XCHBCC3试剂盒，由以下步骤制作而成：
1)以适量pKI1.1R载体为底物，利用限制性内切酶BamHI对其进行酶切，得到酶切产物，并对酶切后片段进行纯化；
2)以载体pB2GW7为模板，扩增包含抗除草剂基因Bar的PCR片段；由于原始的Bar基因序列包含了同裂酶PaqCI的识别序列，会对后期工作产生严重影响，因此，需要通过设计引物，修改编辑PaqCI的识别位点，使最终的Bar基因序列对PaqCI不再敏感；设计合成两对引物，带有重组位点的抗除草剂基因正向引物392F1(5’-GACGTCGGGCCCTCTAGAGGATCCTATCATACATGAGAATTAAGGGAG-3’)和反向引物BarMR2(5’-ggacttcaggagatgggtgtagagcgtggagccca-3’)，以及BarMF2(5’-tctacacccatctcctgaagtccctggaggcacag-3’)和带有重组位点的392R1(5’-ATAATTCGCGGTACCCGGGGATCCATCAGCTTGCATGCCGGTCGATCT-3’)，以载体pB2GW7为模板，用高保真酶Pfusion做PCR反应扩增带有NOS启动子，NOS终止子,以及抗除草剂基因开放阅读框的整个Bar抗性基因PCR片段392A和392B；
3)检测PCR产物，并将正确片段长度的PCR产物392A和392B加入限制性内切酶dpnI降解模板后纯化；
4)将纯化后的pKI1.1R酶切片段和纯化后的PCR产物392A和392B按比例混合，加入重组酶
Figure BDA0003136480690000021
MultiS和buffer，配制成反应体系，37度恒温反应半小时；
5)将反应好的重组产物导入大肠杆菌TOP10感受态细胞,加入适量SOC液态培养基，37度摇床200rpm/min孵育1小时后，涂抹适量该生长液于含有奇霉素的固体LB培养基平板上，并放入37度生长箱过夜培养；
6)设计一条位于pKI1.1R骨架上潮霉素基因内的正向引物HygBR1(5’-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3’),以及一条位于PCR产物序列上的反向引物BarF1(5’-AGTCGACCGTGTACGTCTCC-3’),用于对单克隆的检测；
7)培养皿平板上长出适当大小的克隆后，挑取部分单克隆溶于20ul水中，取其中1.5ul作为样品模板，利用设计好的一对检测引物，配制成20ul PCR反应体系，对这些克隆进行检测；若PCR能扩增出预期大小的正确片段1602bp，则说明重组反应可能成功；
8)挑取能扩增出预期正确片段的单克隆接种于5ml含奇霉素的LB液体培养基中，37度摇床200rpm/min过夜培养；
9)利用试剂盒提取单克隆质粒；
10)将提取好的单克隆质粒进行测序检验，若测序结果和理论设计完全一致，则证明中间产品p-XCHB2开发成功，保存该质粒，留作下面步骤使用；
11)以适量p-XCHB2载体为底物，利用同裂酶PaqCI对其进行酶切，得到酶切产物，并对酶切后片段进行纯化；
12)设计合成以下引物，CCDBF2(5’-ATTGAAATGCAGGTGACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAAC-3’),CCDBF3(5’-CAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGAAATGCAGGTGACAAG-3’),CCDBR2(5’-AAACTTATGCAGGTGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAAC-3’),CCDBR3(5’-ACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTTATGCAGGTGACCAC-3’),用于扩增包含ccdB大肠杆菌自杀基因和CmR氯霉素抗性基因这两个筛选标记的PCR片段393B；
13)以载体pB2GW7为模板，CCDBF2、CCDBR2、CCDBF3、CCDBR3为引物，利用高保真聚合酶Pfusion扩增PCR片段393B；
14)检测PCR产物，并将正确片段长度的PCR产物393B加入限制性内切酶dpnI降解模板后切胶纯化；
15)将纯化后的p-XCHB2酶切片段和纯化后的393B按比例混合，加入重组酶
Figure BDA0003136480690000031
MultiS和buffer，配制成反应体系，37度恒温反应半小时；
16)将反应好的重组产物导入大肠杆菌DB3.1感受态细胞,加入适量SOC液态培养基，37度摇床200rpm/min孵育1小时后，涂抹适量该生长液于含有奇霉素和氯霉素的固体LB培养基平板上，并放入37度生长箱过夜培养；
17)挑取大小正常的单克隆接种于5ml含奇霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37度摇床200rpm/min过夜培养；
18)利用试剂盒提取单克隆质粒；
19)将提取好的单克隆质粒进行测序检验，若测序结果和理论设计完全一致，则证明目标空载体p-XCHBCC3开发成功，保存该质粒，留作后面步骤使用；
20)若只需编辑基因组的单靶点，将适量p-XCHBCC3载体和复性后的识别靶位点的序列互补的正反引物产物，按比列混合，加入PaqCI同裂酶和T4连接酶，以及两种酶分别对应的buffer，配成反应体系，PCR仪器上37度酶切10分钟，16度连接4分钟，重复这两个步骤20个循环，将多数的空载体转化成最终目标编辑载体；将反应产物导入Top10大肠杆菌内，由于空载体带有自杀基因ccdB，因而包含了残留空载体的Top10大肠杆菌不能在选择培养基平板上生长，而只有通过插入目标序列替换掉了ccdB-CmR片段的目标载体转化了的Top10大肠杆菌能在奇霉素选择培养基上生长，通过挑取这样的单克隆测序检测，很容易就得到大量目标编辑最终载体；
21)若需同时编辑基因组的两个靶点，或者删除同一染色体上的较大片段，可通过设计一条包含左侧重组序列和第一个靶点序列的正引物，及另一条包含右侧重组序列和第二个靶点序列的反向引物，利用我们另行单独提供的模板，以高保真酶扩增PCR片段R1-Target1-U6-26t-U6-29P-Target2-R2(重组位点1-靶点1-U6-26终止子-U6-29启动子-靶点2-重组位点2)，并将纯化的PCR片段与适量p-XCHBCC3空载体混合，加入同裂酶PaqCI和重组酶
Figure BDA0003136480690000032
MultiS，以及对应的两种buffer，37度酶切和重组1-2个小时，得到最终双靶点编辑载体；将反应产物导入Top10大肠杆菌内，由于空载体带有自杀基因ccdB，因而包含了残留空载体的Top10大肠杆菌不能在选择培养基平板上生长，而只有通过插入目标序列替换掉了ccdB-CmR片段的目标载体转化了的Top10大肠杆菌能在奇霉素选择培养基上生长，通过挑取这样的单克隆测序检测，可得到大量需要的最终双靶点编辑载体。
作为一种优选方案，所述步骤2)中反向引物BarMR2(5’-ggacttcaggagatgggtgtagagcgtggagccca-3’)包含修改位点且与BarMF2部分反向互补；BarMF2(5’-tctacacccatctcctgaagtccctggaggcacag-3’)包含修改位点且与BarMR2部分反向互补。
作为一种优选方案，所述步骤13)中CCDBF2和CCDBR2均为正常用量的10％。
本发明优点在于：作为一款通用植物基因编辑工具，能克服当今市面流通的一些载体的各种缺点并能集成它们的各种优点，操作简单，过程迅速，能大大减低科研工作量，对基础研究和应用研究都大有裨益，具有很好的推广前景和价值。
附图说明
图1是p-XCHBCC3载体结构图。
图2是p-XCHBCC3载体制作流程示意图。
具体实施方式
下面用具体实施例说明本发明，并不是对本发明的限制。
实施例
一种方便快捷的植物基因编辑工具p-XCHBCC3试剂盒，由以下步骤制作而成：
1)以适量pKI1.1R载体为底物，利用限制性内切酶BamHI对其进行酶切，得到酶切产物，并对酶切后片段进行纯化；
2)以载体pB2GW7为模板，扩增包含抗除草剂基因Bar的PCR片段；由于原始的Bar基因序列包含了同裂酶PaqCI的识别序列，会对后期工作产生严重影响，因此，需要通过设计引物，修改编辑PaqCI的识别位点，使最终的Bar基因序列对PaqCI不再敏感；设计合成两对引物，带有重组位点的抗除草剂基因正向引物392F1(5’-GACGTCGGGCCCTCTAGAGGATCCTATCATACATGAGAATTAAGGGAG-3’)和反向引物BarMR2(5’-ggacttcaggagatgggtgtagagcgtggagccca-3’)，以及BarMF2(5’-tctacacccatctcctgaagtccctggaggcacag-3’)和带有重组位点的392R1(5’-ATAATTCGCGGTACCCGGGGATCCATCAGCTTGCATGCCGGTCGATCT-3’)，以载体pB2GW7为模板，用高保真酶Pfusion做PCR反应扩增带有NOS启动子，NOS终止子,以及抗除草剂基因开放阅读框的整个Bar抗性基因PCR片段392A和392B；
3)检测PCR产物，并将正确片段长度的PCR产物392A和392B加入限制性内切酶dpnI降解模板后纯化；
4)将纯化后的pKI1.1R酶切片段和纯化后的PCR产物392A和392B按比例混合，加入重组酶
Figure BDA0003136480690000041
MultiS和buffer，配制成反应体系，37度恒温反应半小时；
5)将反应好的重组产物导入大肠杆菌TOP10感受态细胞,加入适量SOC液态培养基，37度摇床200rpm/min孵育1小时后，涂抹适量该生长液于含有奇霉素的固体LB培养基平板上，并放入37度生长箱过夜培养；
6)设计一条位于pKI1.1R骨架上潮霉素基因内的正向引物HygBR1(5’-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3’),以及一条位于PCR产物序列上的反向引物BarF1(5’-AGTCGACCGTGTACGTCTCC-3’),用于对单克隆的检测；
7)培养皿平板上长出适当大小的克隆后，挑取部分单克隆溶于20ul水中，取其中1.5ul作为样品模板，利用设计好的一对检测引物，配制成20ul PCR反应体系，对这些克隆进行检测；若PCR能扩增出预期大小的正确片段1602bp，则说明重组反应可能成功；
8)挑取能扩增出预期正确片段的单克隆接种于5ml含奇霉素的LB液体培养基中，37度摇床200rpm/min过夜培养；
9)利用试剂盒提取单克隆质粒；
10)将提取好的单克隆质粒进行测序检验，若测序结果和理论设计完全一致，则证明中间产品p-XCHB2开发成功，保存该质粒，留作下面步骤使用；
11)以适量p-XCHB2载体为底物，利用同裂酶PaqCI对其进行酶切，得到酶切产物，并对酶切后片段进行纯化；
12)设计合成以下引物，CCDBF2(5’-ATTGAAATGCAGGTGACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAAC-3’),CCDBF3(5’-CAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGAAATGCAGGTGACAAG-3’),CCDBR2(5’-AAACTTATGCAGGTGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAAC-3’),CCDBR3(5’-ACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTTATGCAGGTGACCAC-3’),用于扩增包含ccdB大肠杆菌自杀基因和CmR氯霉素抗性基因这两个筛选标记的PCR片段393B；
13)以载体pB2GW7为模板，CCDBF2、CCDBR2、CCDBF3、CCDBR3为引物，利用高保真聚合酶Pfusion扩增PCR片段393B；
14)检测PCR产物，并将正确片段长度的PCR产物393B加入限制性内切酶dpnI降解模板后切胶纯化；
15)将纯化后的p-XCHB2酶切片段和纯化后的393B按比例混合，加入重组酶
Figure BDA0003136480690000051
MultiS和buffer，配制成反应体系，37度恒温反应半小时；
16)将反应好的重组产物导入大肠杆菌DB3.1感受态细胞,加入适量SOC液态培养基，
37度摇床200rpm/min孵育1小时后，涂抹适量该生长液于含有奇霉素和氯霉素的固体LB培养基平板上，并放入37度生长箱过夜培养；
17)挑取大小正常的单克隆接种于5ml含奇霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37度摇床200rpm/min过夜培养；
18)利用试剂盒提取单克隆质粒；
19)将提取好的单克隆质粒进行测序检验，若测序结果和理论设计完全一致，则证明目标空载体p-XCHBCC3开发成功，保存该质粒，留作后面步骤使用；
20)若只需编辑基因组的单靶点，将适量p-XCHBCC3载体和复性后的识别靶位点的序列互补的正反引物产物，按比列混合，加入PaqCI同裂酶和T4连接酶，以及两种酶分别对应的buffer，配成反应体系，PCR仪器上37度酶切10分钟，16度连接4分钟，重复这两个步骤20个循环，将多数的空载体转化成最终目标编辑载体；将反应产物导入Top10大肠杆菌内，由于空载体带有自杀基因ccdB，因而包含了残留空载体的Top10大肠杆菌不能在选择培养基平板上生长，而只有通过插入目标序列替换掉了ccdB-CmR片段的目标载体转化了的Top10大肠杆菌能在奇霉素选择培养基上生长，通过挑取这样的单克隆测序检测，很容易就得到大量目标编辑最终载体；
21)若需同时编辑基因组的两个靶点，或者删除同一染色体上的较大片段，可通过设计一条包含左侧重组序列和第一个靶点序列的正引物，及另一条包含右侧重组序列和第二个靶点序列的反向引物，利用我们另行单独提供的模板，以高保真酶扩增PCR片段R1-Target1-U6-26t-U6-29P-Target2-R2(重组位点1-靶点1-U6-26终止子-U6-29启动子-靶点2-重组位点2)，并将纯化的PCR片段与适量p-XCHBCC3空载体混合，加入同裂酶PaqCI和重组酶
Figure BDA0003136480690000061
MultiS，以及对应的两种buffer，37度酶切和重组1-2个小时，得到最终双靶点编辑载体；将反应产物导入Top10大肠杆菌内，由于空载体带有自杀基因ccdB，因而包含了残留空载体的Top10大肠杆菌不能在选择培养基平板上生长，而只有通过插入目标序列替换掉了ccdB-CmR片段的目标载体转化了的Top10大肠杆菌能在奇霉素选择培养基上生长，通过挑取这样的单克隆测序检测，可得到大量需要的最终双靶点编辑载体。
作为本实施例的较为优选方案，所述步骤2)中反向引物BarMR2(5’-ggacttcaggagatgggtgtagagcgtggagccca-3’)包含修改位点且与BarMF2部分反向互补；BarMF2(5’-tctacacccatctcctgaagtccctggaggcacag-3’)包含修改位点且与BarMR2部分反向互补。
作为本实施例的较为优选方案，所述步骤13)中CCDBF2和CCDBR2均为正常用量的10％。
本发明在具体实施时，选取了一款缺点最少的已有载体pKI1.1R作为骨架,对其只能使用潮霉素做筛选剂的缺点进行了升级改造，通过加入抗除草剂基因Bar,制作出了中间产品p-XCHB2。并针对pKI1.1R载体在被插入目标靶点序列时，阳性克隆比列受酶切效率高低影响较大，不易筛选的缺点，在p-XCHB2基础上，将空载体目标靶点的插入位置序列座上加入了ccdB大肠杆菌自杀基因和CmR氯霉素抗性基因这两个筛选标记，制作出了最终目标空载体p-XCHBCC3。利用这款工具，不但制作最终目标载体时更方便简单，而且既能在MS培养基平板上使用潮霉素筛选阳性株幼苗，也能在土壤中直接使用廉价易得的除草剂(PPT/Basta)筛选阳性株幼苗，从而杜绝了真菌感染幼苗的弊端，并省略掉培养基上的无菌操作以及后期移苗的繁琐工作，还能保证筛选纯合编辑T2代个体与剔除外源DNA序列(通过观察T2种子种皮是否有RFP荧光信号)同时进行，大大加速选择进程。同时，本发明开发的这款载体，通过提前加入同裂酶PaqCI制作成试剂盒出售，既可以使用户通过商业化购买高效便捷的使用，也可以杜绝用户随意扩增复制和传播本发明的试剂盒产品，可以像杂交水稻品种或p-ENTR-D入门载体试剂盒一样，进行可持续获利的商业活动。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.方便快捷的植物基因编辑工具p-XCHBCC3试剂盒，其特征在于，由以下步骤制作而成：
1)以适量pKI1.1R载体为底物，利用限制性内切酶BamHI对其进行酶切，得到酶切产物，并对酶切后片段进行纯化；
2)以载体pB2GW7为模板，扩增包含抗除草剂基因Bar的PCR片段；由于原始的Bar基因序列包含了同裂酶PaqCI的识别序列，会对后期工作产生严重影响，因此，需要通过设计引物，修改编辑PaqCI的识别位点，使最终的Bar基因序列对PaqCI不再敏感；设计合成两对引物，带有重组位点的抗除草剂基因正向引物392F1(5’-GACGTCGGGCCCTCTAGAGGATCCTATCATACATGAGAATTAAGGGAG-3’)和反向引物BarMR2(5’-ggacttcaggagatgggtgtagagcgtggagccca-3’)，以及BarMF2(5’-tctacacccatctcctgaagtccctggaggcacag-3’)和带有重组位点的392R1(5’-ATAATTCGCGGTACCCGGGGATCCATCAGCTTGCATGCCGGTCGATCT-3’)，以载体pB2GW7为模板，用高保真酶Pfusion做PCR反应扩增带有NOS启动子，NOS终止子,以及抗除草剂基因开放阅读框的整个Bar抗性基因PCR片段392A和392B；
3)检测PCR产物，并将正确片段长度的PCR产物392A和392B加入限制性内切酶dpnI降解模板后纯化；
4)将纯化后的pKI1.1R酶切片段和纯化后的PCR产物392A和392B按比例混合，加入重组酶
Figure FDA0003136480680000011
MultiS和buffer，配制成反应体系，37度恒温反应半小时；
5)将反应好的重组产物导入大肠杆菌TOP10感受态细胞,加入适量SOC液态培养基，37度摇床200rpm/min孵育1小时后，涂抹适量该生长液于含有奇霉素的固体LB培养基平板上，并放入37度生长箱过夜培养；
6)设计一条位于pKI1.1R骨架上潮霉素基因内的正向引物HygBR1(5’-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3’),以及一条位于PCR产物序列上的反向引物BarF1(5’-AGTCGACCGTGTACGTCTCC-3’),用于对单克隆的检测；
7)培养皿平板上长出适当大小的克隆后，挑取部分单克隆溶于20ul水中，取其中1.5ul作为样品模板，利用设计好的一对检测引物，配制成20ul PCR反应体系，对这些克隆进行检测；若PCR能扩增出预期大小的正确片段1602bp，则说明重组反应可能成功；
8)挑取能扩增出预期正确片段的单克隆接种于5ml含奇霉素的LB液体培养基中，37度摇床200rpm/min过夜培养；
9)利用试剂盒提取单克隆质粒；
10)将提取好的单克隆质粒进行测序检验，若测序结果和理论设计完全一致，则证明中间产品p-XCHB2开发成功，保存该质粒，留作下面步骤使用；
11)以适量p-XCHB2载体为底物，利用同裂酶PaqCI对其进行酶切，得到酶切产物，并对酶切后片段进行纯化；
12)设计合成以下引物，CCDBF2(5’-ATTGAAATGCAGGTGACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAAC-3’),CCDBF3(5’-CAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGAAATGCAGGTGACAAG-3’),CCDBR2(5’-AAACTTATGCAGGTGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAAC-3’),CCDBR3(5’-ACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTTATGCAGGTGACCAC-3’),用于扩增包含ccdB大肠杆菌自杀基因和CmR氯霉素抗性基因这两个筛选标记的PCR片段393B；
13)以载体pB2GW7为模板，CCDBF2、CCDBR2、CCDBF3、CCDBR3为引物，利用高保真聚合酶Pfusion扩增PCR片段393B；
14)检测PCR产物，并将正确片段长度的PCR产物393B加入限制性内切酶dpnI降解模板后切胶纯化；
15)将纯化后的p-XCHB2酶切片段和纯化后的393B按比例混合，加入重组酶
Figure FDA0003136480680000021
MultiS和buffer，配制成反应体系，37度恒温反应半小时；
16)将反应好的重组产物导入大肠杆菌DB3.1感受态细胞,加入适量SOC液态培养基，37度摇床200rpm/min孵育1小时后，涂抹适量该生长液于含有奇霉素和氯霉素的固体LB培养基平板上，并放入37度生长箱过夜培养；
17)挑取大小正常的单克隆接种于5ml含奇霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37度摇床200rpm/min过夜培养；
18)利用试剂盒提取单克隆质粒；
19)将提取好的单克隆质粒进行测序检验，若测序结果和理论设计完全一致，则证明目标空载体p-XCHBCC3开发成功，保存该质粒，留作后面步骤使用；
20)若只需编辑基因组的单靶点，将适量p-XCHBCC3载体和复性后的识别靶位点的序列互补的正反引物产物，按比列混合，加入PaqCI同裂酶和T4连接酶，以及两种酶分别对应的buffer，配成反应体系，PCR仪器上37度酶切10分钟，16度连接4分钟，重复这两个步骤20个循环，将多数的空载体转化成最终目标编辑载体；将反应产物导入Top10大肠杆菌内，由于空载体带有自杀基因ccdB，因而包含了残留空载体的Top10大肠杆菌不能在选择培养基平板上生长，而只有通过插入目标序列替换掉了ccdB-CmR片段的目标载体转化了的Top10大肠杆菌能在奇霉素选择培养基上生长，通过挑取这样的单克隆测序检测，很容易就得到大量目标编辑最终载体；
21)若需同时编辑基因组的两个靶点，或者删除同一染色体上的较大片段，可通过设计一条包含左侧重组序列和第一个靶点序列的正引物，及另一条包含右侧重组序列和第二个靶点序列的反向引物，利用我们另行单独提供的模板，以高保真酶扩增PCR片段R1-Target1-U6-26t-U6-29P-Target2-R2(重组位点1-靶点1-U6-26终止子-U6-29启动子-靶点2-重组位点2)，并将纯化的PCR片段与适量p-XCHBCC3空载体混合，加入同裂酶PaqCI和重组酶
Figure FDA0003136480680000031
MultiS，以及对应的两种buffer，37度酶切和重组1-2个小时，得到最终双靶点编辑载体；将反应产物导入Top10大肠杆菌内，由于空载体带有自杀基因ccdB，因而包含了残留空载体的Top10大肠杆菌不能在选择培养基平板上生长，而只有通过插入目标序列替换掉了ccdB-CmR片段的目标载体转化了的Top10大肠杆菌能在奇霉素选择培养基上生长，通过挑取这样的单克隆测序检测，可得到大量需要的最终双靶点编辑载体。
2.根据权利要求1所述的方便快捷的植物基因编辑工具p-XCHBCC3试剂盒，其特征在于：所述步骤2)中反向引物BarMR2(5’-ggacttcaggagatgggtgtagagcgtggagccca-3’)包含修改位点且与BarMF2部分反向互补；BarMF2(5’-tctacacccatctcctgaagtccctggaggcacag-3’)包含修改位点且与BarMR2部分反向互补。
3.根据权利要求1所述的方便快捷的植物基因编辑工具p-XCHBCC3试剂盒，其特征在于：所述步骤13)中CCDBF2和CCDBR2均为正常用量的10％。
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