CN105400809A - 一种克隆载体及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种克隆载体及其制备与应用。本发明公开了一种克隆载体pUC57-ccdB，为在pUC57载体的多克隆位点插入有ccdB基因的改造载体，所述ccdB基因含有平末端限制性内切酶酶切识别位点。本发明利用CcdB蛋白对不含F质粒的大肠杆菌的致死作用，通过分子生物学技术在pUC57质粒上插入ccdB(含限制性内切酶Sma？I酶切位点)基因，获得载体pUC57-ccdB。通过Sma？I酶切产生平末端，再连接需要克隆的基因，可以实现需克隆基因的插入，同时避免含空载体菌落的出现。本发明的载体将在分子生物学与基因工程领域中发挥重要作用。

Description

一种克隆载体及其制备与应用
技术领域
本发明涉及一种克隆载体及其制备与应用，属于基因工程领域。
背景技术
PCR技术的发明是分子生物学与基因工程领域的重大突破。PCR技术诞生之后，将PCR产物克隆入载体(通常为质粒)的技术也获得发展。目前已经发展出多种构建克隆的方法，如限制性内切酶消化连接(restrictionenzymedigestionandligation)，不需连接的克隆(ligation-independentcloning,LIC)，体内连接(invivoligation)和位点特异性重组系统(site-specificrecombinationsystems)等。但是这些方法需要用到限制性酶处理PCR产物和载体，或者需要特殊的菌株或某些特殊的酶，因而操作复杂且繁琐，难以进行高通量操作。
除了上述构建克隆的方法之外，还有两种常用且相对简单的克隆方法：TA克隆和平末端连接。由Taq酶扩增出的PCR产物含有dAMP尾巴，在T4连接酶的作用下，可以和含有T末端的载体(T载体)连接，这就是TA克隆。而高保真DNA聚合酶通常含有3’-5’核酸外切酶活性，它们扩增出的PCR产物为平末端，将这些片段与切成平末端的载体在T4连接酶的作用下连接就是平末端连接。这两种方法的共同特点是不需要事先用特殊的酶对PCR产物进行处理，而是直接连入载体，具有简单易操作的特性。虽然这两种方法也存在缺点(片段插入方向随机，无法做到定向克隆)，但因为其简单易操作的特性，因而在分子生物学实验中得到了广泛的应用，尤其是比较适合进行高通量操作。
这两种直接连接的克隆方法相比较，平末端连接比TA克隆更具优势。这是因为：一，Taq酶保真性差，用它来PCR扩增片段，容易引入突变。一种折衷的方案是，用高保真DNA聚合酶扩增片段，然后给PCR产物加上dAMP尾巴，这需要增加一步反应。二，TA克隆的效率取决于T载体的质量，目前仅有少数生物技术公司能够提供高质量的T载体且售价高昂，一般实验室需要购买T载体，这增加了实验成本。
相比较之下，平末端连接方法采用高保真NA聚合酶扩增片段，也不象T克隆那样需要高质量的载体，因而简单也更经济。但因为载体被切成平末端，两个平末端自身连接(载体自连)就无法避免。在不采取措施的情况下，连接反应得到的大多数是自连的载体，而不是插入片段的载体，将插入片段的载体筛选出来就需要非常大的工作量。因此，载体自连的问题就成为平末端连接这种克隆方法的瓶颈。
目前，有两种策略可用来克服载体自连带来的困扰。一种策略是，使用碱性磷酸酶对切成平端的载体进行去磷酸化处理，使之无法自我连接，这种策略的缺点是增加了操作的复杂性，另外也无法100％去磷酸化，仍不能避免空载体的产生。另一种策略是，利用一定的筛选方案将空载体与有插入片段的载体分开，从而提高平末端连接这种克隆方法的效率。
蓝白斑筛选是最常用的将空载体和有插入片段的载体相分开的一种筛选方案。在这种方法中，报告基因LacZα作为蓝白斑筛选的标记基因，但蓝白斑筛选需要用到X-gal和IPTG这样一些昂贵且有毒性的化学物质。也有报道采用荧光蛋白基因来作为报告基因，但仍需要加IPTG诱导荧光蛋白的表达。
CcdB是一个由ccdB基因编码的小分子量蛋白质，它能够结合DNA促旋酶并使其失活。在缺失DNA促旋酶的情况下，胞内DNA无法复制，最终导致细胞死亡，因而CcdB是一种细胞毒素蛋白。
由于CcdB蛋白的毒性，克隆有ccdB基因的普通大肠杆菌菌株(如DH5α，Top10等)无法生长。国外公司筛选出一种大肠杆菌突变株，命名为大肠杆菌DB3.1，在这一菌株中，编码DNA促旋酶的基因发生了突变，使得DNA促旋酶的氨基酸序列发生改变，突变后的DNA促旋酶不再与CcdB蛋白结合。因此在该菌株中，DNA正常复制，克隆体生长。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种新的克隆载体及其应用。
本发明一方面提供了一种克隆载体pUC57-ccdB，为在pUC57载体的多克隆位点插入有ccdB基因的改造载体，所述ccdB基因含有平末端限制性内切酶酶切识别位点。
进一步的，所述平末端限制性内切酶为SmaI。
ccdB基因在插入pUC57载体后需保证读框正确。在载体中插入基因并保证读框正确是本领域技术人员熟悉掌握的常规技术。
ccdB基因插入pUC57载体多克隆位点的具体位置并无特别限定。如本发明实施例列举的，ccdB基因插入pUC57载体多克隆位点的EcoRI和HindIII酶切识别位点之间。
进一步的，所述ccdB基因开放阅读框与pUC57载体Lac启动子方向一致。
进一步的，如实施例具体列举的，所述ccdB基因的ORF(开放阅读框)序列为SEQIDNO：1。
本发明所述克隆载体pUC57-ccdB可在含F质粒的宿主菌中扩增。
在本发明的一个实施例中，所述含有F质粒的宿主菌为大肠杆菌Top10F'。
本发明第二方面还提供了所述克隆载体pUC57-ccdB的制备方法，为将ccdB基因克隆入pUC57载体的多克隆位点获得。
本发明第三方面还提供了所述克隆载体pUC57-ccdB在基因工程领域的用途。
本发明第四方面提供了一种基因克隆方法，为将目标基因克隆入本发明的克隆载体pUC57-ccdB的多克隆位点获得克隆有目标基因的载体，再将所述克隆有目标基因的载体导入不含F质粒的宿主菌中增殖。
可以将目标基因与利用SmaI酶切的克隆载体pUC57-ccdB连接以获得克隆有目标基因的载体。
所述宿主菌优选大肠杆菌。如实施例列举的，不含F质粒的宿主菌可选用E.coliDH5α。
本发明是以商品化质粒pUC57为出发载体进行改良后的载体。本发明利用CcdB蛋白对不含F质粒的大肠杆菌的致死作用，通过分子生物学技术在pUC57质粒上插入ccdB(含SmaI酶切位点)基因，获得载体pUC57-ccdB。通过平末端连接插入需要克隆的基因，当插入片段后可以破坏载体上ccdB基因，因而可以在不含F质粒的大肠杆菌中增殖，从而可以避免分子克隆中空载体的出现。随着蛋白互作研究和转录调控分析等的发展，在分子生物学领域与基因工程领域迫切需要一种简单、廉价的高通量克隆构建方法和载体。本发明有望在这方面发挥作用。
附图说明
图1是本发明中pUC57-ccdB载体的结构示意图
图2是pUC57-ccdB载体的构建过程
具体实施方式
本发明利用ccdB基因来构建平末端连接方法的克隆筛选方案，原理是在ccdB基因中设计平末端酶切位点，只有当PCR产物克隆进酶切位点，破坏CcdB蛋白的表达，转化菌(不含F质粒)才可以长成菌落。而含有ccdB基因的质粒的增殖则通过转化大肠杆菌菌株Top10F'来实现。这种方法相比较其它方法具有阳性率高，不需另外不需要添加额外的化学物质，比如X-gal，IPTG等。
含有F质粒的大肠杆菌菌株如Top10F'能够抵抗CcdB蛋白的毒性，这可能是因为F质粒上同时含有ccdA基因的缘故。在自然界中，ccdA和ccdB一起构成F质粒的ccdAB系统(controlofcelldivisionordeathsystem)。ccdA基因编码另一种小分子量蛋白质CcdA，CcdA蛋白具有拮抗CcdB蛋白的作用，使之不能与DNA促旋酶结合。
pUC57是在大肠杆菌中常用的克隆载体，是一个小的双链环状质粒，载体上有两个启动子，一个为AmpRpromoter，启动氨苄抗生素基因的表达，另一个为Lacpromoter，多克隆位点位于Lac启动子的下游，当克隆入基因ccdB时，只有开放阅读框与启动子方向一致时才能达到预期效果。否则ccdB基因只有很少一部分的表达，不会对大肠杆菌产生致死作用，只能抑制其生长(长出小的菌落)。
实施例采用如下技术方案构建pUC57-ccdB载体：
pUC57-ccdB载体的构建：ccdB基因的ORF序列为SEQIDNO：1，利用重叠延伸PCR合成基因序列为SEQIDNO：2。将重叠延伸PCR所得完整的ccdB基因以NdeI/HindIII酶切位点插入载体pET24a中，转化E.coliTop10F'感受态细胞，挑斑提取重组质粒pET24a-ccdB，测序鉴定；以测序正确的质粒pET24a-ccdB为模板，以引物SEQIDNO：11和SEQIDNO：12PCR获得的基因ccdB插入载体pUC57中，抽提质粒双酶切鉴定。
将鉴定正确的阳性质粒pUC57-ccdB转化E.coliDH5α，无菌落生长，表明载体构建成功。
重叠延伸PCR合成SEQIDNO：2需要的引物分别为：ccdB-1(SEQIDNO：3)、ccdB-2(SEQIDNO：4、ccdB-3(SEQIDNO：5)、ccdB-4(SEQIDNO：6)、ccdB-5(SEQIDNO：7)、ccdB-6(SEQIDNO：8)、ccdB-7(SEQIDNO：9)、ccdB-8(SEQIDNO：10)。其中，引物SEQIDNO：3含有NdeI酶切位点，引物SEQIDNO：10含有HindIII酶切位点。引物SEQIDNO：11含有HindIII酶切位点，并携带起始密码子ATG，引物SEQIDNO：12含有EcoRI酶切位点。
下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。应明了，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1：载体pUC57-ccdB的构建
1.1ccdB基因的合成
利用重叠延伸PCR合成该基因，首先以ccdB-1、ccdB-2、ccdB-3、ccdB-4为第一组引物，ccdB-3、ccdB-4、ccdB-5、ccdB-6为第二组引物，ccdB-5、ccdB-6、ccdB-7、ccdB-8为第三组引物PCR获得三个小的ccdB基因片段，然后以这三个片段的混合物为模板，以引物ccdB-1和ccdB-8PCR获得完整ccdB基因。获得的基因经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用生工(生物工程)股份有限公司提供的“SanPrep柱式胶回收试剂盒”回收目的片段，得到ccdB基因合成产物。
合成ccdB基因的引物序列如下：
ccdB-1(SEQIDNO:3)：
5’-cggcaattccatatgcaatttaaggtgtatacctacaaacgtgaatctcg-3’(含NdeI)
ccdB-2(SEQIDNO:4)：
5’-gtcgatgatgtcagactgcacgtcaacgaacagacggtaacgagattcac-3’
ccdB-3(SEQIDNO:5)：
5’-catcatcgacaccccgggtcgtcgtatggttatcccgctggcgtctgccc-3’(含SmaI)
ccdB-4(SEQIDNO:6)：
5’-ccgggtacagttcacgagaaactttgtcagagagcagacgggcagacgc-3’
ccdB-5(SEQIDNO:7)：
5’-ctgtacccggtcgttcacatcggcgatgaatcttggcgcatgatgaccacc-3’
ccdB-6(SEQIDNO:8)：
5’-cttcttcaccgataacagataccggaacgctcgccatgtcggtggtcatc-3’
ccdB-7(SEQIDNO:9)：
5’-ggtgaagaagttgcggacctgtctcaccgtgaaaacgacatcaagaacgc-3’
ccdB-8(SEQIDNO:10)：
5’-gcgaagcttatcagataccccagaacatcaggttgatcgcgttcttgatg-3’(含HindIII)
1.2载体pUC57-ccdB的构建
将实施例1.1中得到的ccdB基因片段经NdeI和HindIII双酶切，连入经同样酶切后的pET24a载体，转化大肠杆菌Top10F'感受态细胞，经过质粒提取，双酶切和PCR鉴定后，送样品测序。
最初设计引物ccdB-F(SEQIDNO：13):5’-cggaattcatgcaatttaaggtgtatacctacaaac-3’(下划线为EcoRI酶切位点，粗体为起始密码子)，ccdB-R(SEQIDNO：14):5’-cccaagcttttatcagataccccagaacatcagg-3’(下划线为HindIII酶切位点)，以这两个引物为上下游引物，以测序正确的pET24a-ccdB质粒为模板，PCR获得ccdB基因，经EcoRI/HindIII双酶切后连入经相同酶切的pUC57载体中，转化大肠杆菌Top10F'，挑斑，提取质粒，取测序正确质粒转化大肠杆菌DH5α，发现此质粒转化还可以生长(长出小的菌落)，分析其原因由于插入ccdB基因的ORF与Lac启动子方向不一致，所以为了使ccdB基因的ORF受控于Lac启动子，重新设计引物，在上游引物中加入起始密码子与HindIII酶切位点，引物序列为:ccdB-F(SEQIDNO：11):5’-cccaagcttatgcaatttaaggtgtatacctacaaac-3’(下划线为HindIII酶切位点，粗体为起始密码子)，ccdB-R(SEQIDNO：12):5’-cggaattcttatcagataccccagaacatcagg-3’(下划线为EcoRI酶切位点)，以这两个引物为上下游引物，以测序正确的pET24a-ccdB质粒为模板，PCR获得ccdB基因，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收目的基因。将纯化产物经EcoRI和HindIII酶切后，连入经相同酶切的pUC57载体中，提取质粒，酶切鉴定后测序验证正确。
实施例2：载体pUC57-ccdB的应用
利用高保真酶PCR扩增得到的目的片段，回收后与载体pUC57-ccdB混合，加入SmaI限制性内切酶，T4DNA连接酶等，22℃下酶切连接过夜。分别以长度约为800bp(限制性内切酶SphI基因)，1200bp(限制性内切酶XmnI基因)，2500bp(TaqDNA聚合基因)三种不同长度的基因为例说明。
2.1pUC57-ccdB-SphI的构建
利用Pfu酶PCR获得SphI基因，1％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用胶回收试剂盒纯化PCR产物，纯化后利用酶标仪测定浓度为65ng/μL。
酶切连接体系如下：
22℃，连接过夜。取连接产物10μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取10个单菌落于LB培养基，37℃，220rpm振荡培养12h后，收集菌体，提取质粒，经EcoRI和HindIII双酶切鉴定均为阳性克隆。
2.2pUC57-ccdB-XmnI的构建
利用Pfu酶PCR获得XmnI基因，1％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用胶回收试剂盒纯化PCR产物，纯化后利用酶标仪测定浓度为60ng/μL。
酶切连接体系如下：
22℃，连接过夜。取连接产物10μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取10个单菌落于LB培养基，37℃，220rpm振荡培养12h后，收集菌体，提取质粒，经EcoRI和HindIII双酶切鉴定是均为阳性克隆。
2.3pUC57-ccdB-Taq的构建
利用Pfu酶PCR获得TaqDNA聚合酶基因，1％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用胶回收试剂盒纯化PCR产物，纯化后利用酶标仪测定浓度为45ng/μL。
酶切连接体系如下：
22℃，连接过夜。取5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取10个单菌落于LB培养基，37℃，220rpm振荡培养12h后，收集菌体，提取质粒，经EcoRI和HindIII双酶切鉴定是均为阳性克隆。
在本实施例中，利用pUC57-ccdB载体对三种不同长度的DNA片段进行克隆，各提取10管质粒，双酶切鉴定后统计其阳性率均为100％，能达到避免出现空载体的作用。

Claims (10)

1.一种克隆载体pUC57-ccdB，为在pUC57载体的多克隆位点插入有ccdB基因的改造载体，所述ccdB基因含有平末端限制性内切酶酶切识别位点。
2.如权利要求1所述克隆载体pUC57-ccdB，其特征在于，所述平末端限制性内切酶为SmaI。
3.如权利要求1所述克隆载体pUC57-ccdB，其特征在于，ccdB基因插入pUC57载体多克隆位点的EcoRI和HindIII酶切识别位点之间。
4.如权利要求1所述克隆载体pUC57-ccdB，其特征在于，所述ccdB基因开放阅读框与pUC57载体Lac启动子方向一致。
5.如权利要求1所述克隆载体pUC57-ccdB，其特征在于，克隆载体pUC57-ccdB中，所述ccdB基因的ORF序列为SEQIDNO：1。
6.如权利要求1-5任一权利要求所述克隆载体pUC57-ccdB的制备方法，为将ccdB基因克隆入pUC57载体的多克隆位点获得。
7.如权利要求1-5任一权利要求所述克隆载体pUC57-ccdB在基因工程领域的用途。
8.一种基因克隆方法，为将读框正确的目标基因克隆入权利要求1-5任一权利要求所述的克隆载体pUC57-ccdB的多克隆位点获得克隆有目标基因的载体，再将所述克隆有目标基因的载体导入不含F质粒的宿主菌中增殖。
9.如权利要求8所述的基因克隆方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。
10.如权利要求8所述的基因克隆方法，其特征在于，将读框正确的目标基因与利用SmaI酶切后的克隆载体pUC57-ccdB连接以获得克隆有目标基因的载体。
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