CN108130338A - 一种前t载体及其组成的t载体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种前T载体，所述启动子区域中的‑35区至‑10区之间的核酸序列替换为对宿主有毒性的表达元件。本发明T载体能够克服由于采用蓝白筛选的载体存在强启动子启动外源基因的转录或翻译产物可能对宿主有毒性而导致无法克隆的问题，可以避免载体在酶切位点缺失1‑2bp导致基因移码突变产生假阳性克隆的缺陷，可以消除由于外源DNA片段较小并且外源DNA的插入没有改变基因的读码框，造成的假阴性现象。

Description

一种前T载体及其组成的T载体和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种前T载体及其组成的T载体和应用，具体涉及一种前T载体、T载体、克隆载体、带有所述T载体的宿主细胞及其应用。
背景技术
PCR技术的发明是分子生物学与基因工程领域的重大突破。PCR技术诞生之后，将PCR产物克隆入载体(通常为质粒)的技术也获得发展。常用且相对简单的克隆方法包括TA克隆和平末端连接。由Taq酶扩增出的PCR产物含有dAMP尾巴，在T4连接酶的作用下，可以和含有T末端的载体(T载体)连接，这就是TA克隆。而高保真DNA聚合酶通常含有3’-5’核酸外切酶活性，它们扩增出的PCR产物为平末端，将这些片段与切成平末端的载体在T4连接酶的作用下连接就是平末端连接。这两种方法的共同特点是不需要事先用特殊的酶对PCR产物进行处理，而是直接连入载体，具有简单易操作的特性。
目前商业化的T载体和可以用于平末端克隆的载体通常是基于蓝白斑筛选的原理，蓝白斑筛选是最常用的将空载体和有插入片段的载体相分开的一种筛选方案。在这种方法中，报告基因LacZα作为蓝白斑筛选的标记基因，然而基于蓝白斑筛选原理的载体在克隆时有以下问题：(1)由于使用强启动子，能够大量启动外源基因的转录、翻译，导致了某些结构复杂的外源基因转录或翻译产物对宿主有毒性而无法克隆；(2)由于反复冻融等因素使得T载体在末端缺失1-2碱基，导LacZα基因的移码突变，使得不含外源基因的克隆由于LacZα基因的移码突变而显白色，导致产生大量假阳性克隆；(3)在克隆外源DNA小片段并且外源DNA的插入没有改变lacZα基因的读码框时会造成平板都是蓝斑的假阴性现象。此外，蓝白斑筛选还需要用到X-gal和IPTG等昂贵且有毒性的化学物质。
The use of the ccdB lethal gene for constructing a zero backgroundvector in order to clone blunt-end PCR Products.Hu L-L,Zhang S-S,Li X-X,WangB-L..Molecular Biology.2010；44(1):161-4.；和Lethal ccdB gene-based zero-background vector for construction of shotgun libraries.Miyazaki K.Journal ofbioscience and bioengineering.2010Sep；110(3):372-3.公开了应用ccdB致死基因构建不需要蓝白斑筛选的载体，其效果显著，筛选更加简单方便。
CN105400809A公开的一种克隆载体及其制备与应用，其公开了一种克隆载体pUC57-ccdB，为在pUC57载体的多克隆位点插入有ccdB基因的改造载体，所述ccdB基因含有平末端限制性内切酶酶切识别位点。利用ccdB蛋白对不含F质粒的大肠杆菌的致死作用，通过分子生物学技术在pUC57质粒上插入ccdB(含限制性内切酶Sma I酶切位点)基因，获得载体pUC57-ccdB。通过Sma I酶切产生平末端，再连接需要克隆的基因，可以实现需克隆基因的插入，同时避免含空载体菌落的出现。然而上述的技术方案仍然存在一定的问题：(1)由于使用强启动子，能够大量启动外源基因的转录、翻译，导致了某些结构复杂的外源基因转录或翻译产物对宿主有毒性而无法克隆；(2)由于反复冻融等因素使得T载体在末端缺失1-2碱基，导致ccdB“致死基因”的移码突变，使得不含外源基因的克隆由于ccdB“致死基因”的移码突变而“幸存”下来，导致产生大量假阳性克隆；(3)在克隆外源DNA小片段并且外源DNA的插入没有改变ccdB“致死基因”的读码框时会造成平板没有菌落的假阴性现象。
任何一段能够独立与转录因子结合并起始转录的DNA序列都可以被称为启动子。在启动子中，能够被σ因子识别的区域具有非常保守的序列特征。其中，在转录起始位点(+1)上游大约10nt以及35nt处的两段序列(称为-10区与-35区)对于σ因子的识别具有决定性的作用，因此这两段序列也被称作狭义启动子或核心启动子。除这段核心启动子区域之外，-35区的上游序列也可能对转录的强度产生影响，这些序列被称作UP元件(UPelement)。
在启动子位置进行改造，从而能够提高筛选的效率，避免筛选时的假阳性和假阴性，是一个关键的难点。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中制备的T载体无法克隆，或产生大量假阳性或假阴性克隆，从而提供一种前T载体及其组成的T载体和应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种前T载体，所述启动子区域中的-35区至-10区之间的核酸序列替换为对宿主有毒性的表达元件。
本发明中，原核生物中-35区至-10区之间核酸数目的变动会影响基因转录活性的高低，将启动子区域的-35区至-10区之间的核酸序列进行突变，从而能够被核酸内切酶识别，克隆时，将对宿主有毒性的表达元件替换掉启动子区域中的-35区至-10区之间的核酸序列，使得启动子调控表达的基因活性下降，表达量下降，进而发挥功能。
本发明中，通过在-35区至-10区之间进行突变，可以避免假阳性和假阴性的出现，可以避免载体在酶切位点缺失1-2bp导致基因移码突变产生假阳性克隆的缺陷，可以消除由于外源DNA片段较小并且外源DNA的插入没有改变基因的读码框，造成假阴性现象。
根据本发明，所述对宿主有毒性的表达元件为转录或翻译产物能够导致宿主无法生长或增殖的基因。
根据本发明，所述对宿主有毒性的表达元件为致死基因表达元件和/或限制性内切酶基因表达元件，本申请所述对宿主有毒性的表达元件选自但不限于致死基因、限制性内切酶基因。
所述限制性内切酶基因为宿主本身不带相应甲基化酶的限制性内切酶基因，其对宿主的基因会产生酶切破坏作用。
根据本发明，所述致死基因表达元件为ccdB表达元件。
根据本发明，所述ccdB表达元件的核酸序列如SEQ ID NO.28所示，所述SEQ IDNO.28所示的核酸序列如下：
Tgttatccgctcacaattccacacaacatacgaggacattctgtcgaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataattaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctggacatacagtcaaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactc.
根据本发明，所述对宿主有毒性的表达元件含有诱导性启动子。
本发明中，所述诱导性启动子为可以进行诱导表达的启动子均是可行的，本领域技术人员可以根据需要进行选择，本申请选用β-半乳糖苷酶启动子作为其诱导性启动子。
本发明中，通过诱导性启动子调控所述对宿主有毒性的表达元件，当平板中含有相应的诱导剂，那么残留的前T载体的对宿主有毒性的基因能够表达，导致含有非重组子的大肠杆菌不能够生长，因此能够有效避免含有酶切残留的非重组子的大肠杆菌造成的假阳性现象。
根据本发明，由于所述对宿主有毒性的表达元件其还可以带有酶切位点等一系列元件，所述前T载体插入对宿主有毒性的表达元件后形成两个酶切位点。
根据本发明，所述启动子为β-半乳糖苷酶启动子，所述β-半乳糖苷酶的启动子区域中的-35区至-10区之间的核酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，所述SEQ ID NO.2-3所示的核酸序列如下：
SEQ ID NO.2：5’-TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTT-3’；
SEQ ID NO.3：5’-CTTTATGCTTCCGGCTCG-3’；
本发明中，RNA聚合酶Ⅱ的结合部位通常在-35区至-10区，这两个部位都很重要:RNA聚合酶能和-35和-10序列中的碱基和DNA主链中的磷酸基相接触；离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱；而发明人发现，通过突变-35区至-10区中的序列，尤其是SEQ IDNO.2所示的序列，能够插入外源基因，使得lacZα基因的表达量显著下降。
本发明中，所述载体本领域技术人员可以根据需要进行选择，载体的选择不会对启动子的功能造成影响，所述克隆载体用于克隆所述目的基因，所述克隆载体例如可以选择高拷贝克隆载体pUC18、pUC19、pUC57，低拷贝克隆载体pCA、pCK、pCC或单拷贝克隆载体pCC1，其都可以作为骨架构建本申请的载体，从而进行后续试验，对载体本身并不造成影响，带上本申请启动子的载体仍然是高拷贝克隆载体、低拷贝克隆载体或单拷贝克隆载体。
根据本发明，所述克隆载体上的lacZα基因替换为对宿主有毒性的基因。
根据本发明，所述对宿主有毒性的基因为转录或翻译产物能够导致宿主无法生长或增殖的基因，所述对宿主有毒性的基因为致死基因和/或限制性内切酶基因。
优选地，所述致死基因为ccdB基因，所述ccdB基因的核酸序列所述SEQ ID NO.1所示，所述的SEQ ID NO.1所示的核酸序列如下：
ATGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCCGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAA.
优选地，所述宿主为野生型大肠杆菌。
第二方面，本发明提供一种T载体，采用核酸内切酶酶切第一方面所述的前T载体，得到所述T载体。
根据本发明，所述核酸内切酶本领域技术人员可以根据需要进行选择，可以根据突变的启动子区域的序列的不同从而选择不同的核酸内切酶识别位点，本申请选自但不限于AhdI、XcmI、BciVI或BmrI中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述T载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将对宿主有毒性的基因替换载体上的lacZα基因；
(2)将原启动子-35区至-10区突变后插入对宿主有毒性的表达元件形成前T载体；
(3)将所述前T载体采用核酸内切酶酶切，得到所述T载体。
根据本发明，步骤(1)之前还包括将对宿主有毒性的基因进行密码子优化。
根据本发明，所述对宿主有毒性的基因为致死基因和/或限制性内切酶基因。
根据本发明，所述致死基因为ccdB基因，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明，所述核酸内切酶本领域技术人员可以根据需要进行选择，可以根据突变的启动子区域的序列的不同从而选择不同的核酸内切酶识别位点，本申请选自但不限于AhdI、XcmI、BciVI或BmrI中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供一种克隆载体，包括如第一方面所述的前T载体和或第二方面所述的T载体。
第五方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第一方面所述的前T载体和/或如第四方面所述的克隆载体。
根据本发明，所述宿主细胞为大肠杆菌。
第六方面，本发明提供一种基因克隆的方法，包括：
将外源基因的3’端添加1个A碱基，添加A碱基的外源基因与第二方面所述T载体连接，导入宿主细胞中，在合适的条件下，培养所述宿主细胞，以便获得阳性克隆。
根据本发明，所述外源基因的3’端添加1个A碱基通过使用Taq DNA聚合酶扩增得到。
根据本发明，所述宿主细胞为对Top10F’、DH5α、EPI400、Top10、stbl2、stbl3、Jm109、Jm110或TG1中的任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的前T载体、第二方面所述的T载体、第四方面所述的克隆载体或第五方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
根据本发明，所述试剂盒用于基因克隆。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述的T载体在进行T-A克隆时将外源DNA片段克隆至载体的β-半乳糖苷酶启动子区域的-35区与-10区之间，使得即使在IPTG诱导的条件下β-半乳糖苷酶启动子活性也极低，使得对宿主有毒性的基因表达量极低，进而使得含有外源DNA片段的重组载体的宿主可以正常生长，而由于载体末端缺失1-2个碱基未连接外源DNA片段发生自连的空载体，由于其强启动子仍然具有很强的活性，并且筛选基因没有发生移码突变，能够启动对宿主有毒性基因的大量表达，进而使得携带不含外源DNA片段的载体的宿主不能生长，能够避免筛选基因由于移码突变产生假阳性克隆的问题；
(2)本发明所述的T载体在进行T-A克隆时将外源DNA片段克隆至载体的β-半乳糖苷酶启动子区域的-35区与-10区之间，不仅克服常见的由于采用蓝白筛选的载体存在强启动子启动外源基因的转录或翻译产物可能对宿主有毒性而导致无法克隆的问题，而且可以消除由于外源DNA片段较小并且外源DNA的插入没有改变lacZα基因的读码框，造成平板都是蓝斑的假阴性现象；
(3)本发明所述的前T载体，由于含有受诱导型启动子调控的对宿主有毒性的表达元件，因此，如果平板中含有相应的诱导剂，那么残留的前T载体的对宿主有毒性的基因能够表达，导致含有非重组子的大肠杆菌不能够生长，因此能够有效避免酶切残留的非重组子的大肠杆菌造成的假阳性现象；
(4)本发明所述的T载体的构建方法简单，易操作，效率高，可以在短时间内完成所述克隆载体的构建；
(5)本发明所述的T载体在基因克隆领域的用途，所述T载体摒除强启动子对外源基因的转录，容易克隆外源DNA大片段。
附图说明
图1为本申请实施例2的菌落PCR鉴定的电泳图，其中，DNA marker大小为0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、5kb；
图2为本申请实施例4的菌落PCR鉴定的电泳图，其中，DNA marker大小为0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、5kb；
图3为本申请实施例5的菌落PCR鉴定的电泳图，其中，DNA marker大小为0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、5kb。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
术语解释：
LacZ基因：广泛用于基因表达调控研究中的一种基因，编码的β一半乳糖苷酶(简称β-gal)是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解.Beta-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色，便于检测和观察，LacZ基因的诸多优点使它成为基因工程实验中的一个常用标记基因，比如常用于转化菌株筛选，β-半乳糖苷酶显色反应选择法，即，蓝白筛选；
LacZα基因：编码β-半乳糖苷酶(lacZ)N端α片段，可以通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝；
核酸内切酶：在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶；
PCR技术：聚合酶链式反应，是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
材料：
实施例1：高拷贝克隆载体的构建及功能验证
高拷贝克隆载体的构建方法，包括如下具体步骤：
I)采用ccdB基因替换pUC57(卡那霉素抗性)的lacZα基因，具体如下：
(1)全基因合成ccdB基因(苏州金唯智生物科技有限公司合成)，所述ccdB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCCGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAA；
(2)具有卡那霉素抗性的pUC57质粒为模板，以SEQ ID NO.4-5为引物进行PCR扩增反应，具体序列如下：
SEQ ID NO.4(正向引物)：TTATAGGTGTAAACCTTAAACTGCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC；
SEQ ID NO.5(反向引物)：ATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAATTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACAC；
PCR反应体系如下表1所示：
表1
其中，一组以水为样本的阴性对照；
反应条件如下表2所示：
表2
(3)将步骤(2)获得的PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物；
(4)使用GibsonMaster Mix试剂盒将步骤(3)所得的PCR纯化产物与步骤(1)基因合成的ccdB基因进行连接反应，连接反应体系如下表3所示：
表3
连接反应条件为：50℃连接反1h；
(5)将上述步骤(4)中获得的连接产物转化Top10F’感受态细胞，最终涂布卡那霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日挑取单克隆并进行Sanger测序，保留测序正确的质粒，并将质粒命名为pUC57-ccdB；
II)将pUC57-ccdB质粒的β-半乳糖苷酶启动子区域的-35区与-10区之间的序列进行突变后插入一个ccdB的表达元件形成前T载体，使得β-半乳糖苷酶启动子区域在插入表达元件后形成两个相同的AhdI酶切位点序列，具体如下：
(1)以步骤I)构建成功的pUC57-ccdB质粒为模板，以引物F-vector-MU、R-vector-MU(SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.7)为引物进行PCR扩增反应，PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物。
SEQ ID NO.6(F-vector-MU)：GCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTC；
SEQ ID NO.7(R-vector-MU)：GTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCA；
具体的PCR反应体系如表1所示，反应条件如表2所示；
(2)基因合成ccdB表达元件(由苏州金唯智生物科技有限公司合成)，ccdB表达元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，ccdB由β-半乳糖苷酶启动子调控表达；
SEQ ID NO.28(ccdB表达元件的核苷酸序列)：
Tgttatccgctcacaattccacacaacatacgaggacattctgtcgaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataattaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctggacatacagtcaaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactc；
(3)使用GibsonMaster Mix试剂盒将步骤(1)纯化的PCR产物与步骤(2)基因合成的ccdB表达元件进行连接反应，连接反应体系如下表4所示：
表4
连接反应条件：50℃连接反应1小时；
(4)将步骤(3)中获得的连接产物转化Top10F’感受态细胞，最终涂布卡那霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日挑取单克隆进行Sanger测序，保留测序正确的质粒构建，并将质粒命名为pUC57-ccdB-toxic。
III)制备T载体
使用AhdI核酸内切酶酶切步骤Ⅱ)构建的前T载体pUC57-ccdB-toxic，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化载体片段即得到T载体pUC57-ccdB-T。
Ⅳ)T载体克隆实验
(1)合成两条24bp引物，两条引物中有23bp的序列反向互补，退火后能形成3’端突出一个A碱基的dsDNA，两条24bp引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9所示，具体如下：
SEQ ID NO.8：GCACCGGGATAACACGCTCACCAA；
SEQ ID NO.9：TGGTGAGCGTGTTATCCCGGTGCA；
(2)以λDNA为模板，F-λDNA-200bp+R-λDNA-200bp为引物进行PCR扩增，PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物，所述引物F-λDNA-200bp、R-λDNA-200bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.11所示，具体如下：
SEQ ID NO.10(F-λDNA-200bp)：GTTGAATGGGCGGATGCTAATTACTATCTCCCG；
SEQ ID NO.11(R-λDNA-200bp)：TTATGCTCTATAAAGTAGGCATAAACACCCAGC；
PCR反应体系如表5所示，
表5
PCR扩增程序如表6所示：
表6
(3)将步骤(1)退火形成3’端突出一个A的dsDNA、步骤(2)纯化得到的PCR产物分别与步骤III)纯化的pUC57-T载体进行连接反应，连接反应体系如下表7所示：
表7
外源DNA 约90ng，3μL
酶切后的载体 约30ng，1μL
10×缓冲液 1μL
T4DNA连接酶 1μL
灭菌去离子H2O 4μL
连接反应条件：22℃连接反应1小时；
(4)将上述步骤(3)中获得的连接产物分别转化Top10F’感受态细胞，最终涂布含IPTG及X-gal的卡那霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日从克隆约200bp DNA片段的平板上挑取24个单克隆进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系如表8所示：
表8PCR反应体系
菌液模板 3μL
F-λDNA-200bp 10pM，0.5μL
R-λDNA-200bp 10pM，0.5μL
dNTP 5mM each，0.5μL
10×Taq buffer 5μL
Taq DNA聚合酶 5U/μL，0.5μL
H2O 40μL
PCR扩增程序如表9所示：
表9
PCR鉴定结果如图1所示，图1结果显示所有克隆均为阳性克隆，从24个菌检阳性的克隆中随机挑选12个克隆，同时，从克隆约24bp外源DNA片段的平板上挑取12个单克隆分别进行Sanger测序，测序结果显示所有克隆的序列均正确，实验结果表明，本发明的T载体可以用于克隆不小于24bp的外源DNA。
实施例2pUC57-T载体克服假阳性克隆的实验验证
构建pUC57-ccdB-T-MU-1、pUC57-ccdB-T-MU-2、pUC57-ccdB-T-MU-3、pUC57-ccdB-T-MU-4质粒模拟pUC57-ccdB-T载体在酶切位点两端缺失1-2碱基并发生自连，构建步骤如下：
(1)以实施例1中构建的质粒pUC57-ccdB-T为模板，分别以F-MU-1+R-MU-1、F-MU-2+R-MU-2、F-MU-3+R-MU-3、F-MU-4+R-MU-4为引物进行PCR扩增反应，所述引物F-MU-1、R-MU-1、F-MU-2、R-MU-2、F-MU-3、R-MU-3、F-MU-4、R-MU-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.12-SEQ IDNO.19所示，具体如下：
SEQ ID NO.12(F-MU-1)：ACATACGAGGACATCAGTCAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCT；
SEQ ID NO.13(R-MU-1)：TTACACTTTGACTGATGTCCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG；
SEQ ID NO.14(F-MU-2)：AACATACGAGGACACAGTCAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCT；
SEQ ID NO.15(R-MU-2)：TTACACTTTGACTGTGTCCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGA；
SEQ ID NO.16(F-MU-3)：ACATACGAGGACATAGTCAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTA；
SEQ ID NO.17(R-MU-3)：TTTACACTTTGACTATGTCCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG；
SEQ ID NO.18(F-MU-4)：AACATACGAGGACAAGTCAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTA；
SEQ ID NO.19(R-MU-4)：TTTACACTTTGACTTGTCCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGA；
PCR反应体系如实施例1中表1所示，PCR扩增程序如表2所示；
(2)将步骤(1)获得的PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物，然后分别使用GibsonMaster Mix(NEB)试剂盒进行连接反应，连接反应体系如表10所示；
表10
连接反应条件：50℃连接反应1小时；
(3)将步骤(2)中获得的连接产物分别转化Top10F’感受态细胞，最终涂布卡那霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日从每个平板分别挑取4个单克隆进行Sanger测序，保留测序正确的质粒，分别命名为pUC57-ccdB-T-Mim-1、pUC57-ccdB-T-Mim-2、pUC57-ccdB-T-Mim-3、pUC57-ccdB-T-Mim-4；
(4)将步骤(3)正确的pUC57-ccdB-T-Mim-1、pUC57-ccdB-T-Mim-2、pUC57-ccdB-T-Mim-3、pUC57-ccdB-T-Mim-4质粒分别转化Top10F’感受态细胞，最终将复苏的菌液分别均分为两份，分别涂布含IPTG及不含IPTG的卡那霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日检查发现转化pUC57-ccdB-T-Mim-1、pUC57-ccdB-T-Mim-2、pUC57-ccdB-T-Mim-3、pUC57-ccdB-T-Mim-4质粒在含IPTG的平板均没有长斑，在不含IPTG的平板上菌落形态、数量均正常。
实验结果表明：在IPTG诱导的条件下，pUC57-ccdB-T-Mim-1、pUC57-ccdB-T-Mim-2、pUC57-ccdB-T-Mim-3、pUC57-ccdB-T-Mim-4的β-半乳糖苷酶启动子仍有很强的活性，能够大量表达ccdB，导致菌落无法生长，即在IPTG的诱导条件下，本发明的T载体在末端缺失1-2个碱基发生自连的情况下不会产生假阳性克隆。
实施例3：低拷贝T载体的构建及功能验证
低拷贝T载体的构建方法，包括如下具体步骤：
I)采用ccdB基因替换pCK(卡那霉素抗性)的lacZα基因，具体如下：
(1)以具有卡那霉素抗性的pCK质粒为模板，以SEQ ID NO.20-21为引物进行PCR扩增反应，具体序列如下：
SEQ ID NO.20(正向引物)：TTATAGGTGTAAACCTTAAACTGCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC；
SEQ ID NO.21(反向引物)：TTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAATTAAGCCAGCCCCGAGTAGCTAGACAGG；
PCR反应体系如实施例1的表1所示，反应条件如是实施例1表2所示；
(2)将步骤(1)获得的PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物；
(3)使用GibsonMaster Mix试剂盒将步骤(2)所得的PCR纯化产物与实施例1步骤(1)基因合成的ccdB基因进行连接反应，连接反应体系如实施例1表3所示，连接反应条件为：50℃连接反1h；
(4)将上述步骤(3)中获得的连接产物转化Top10F’感受态细胞，最终涂布卡那霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日挑取单克隆并进行Sanger测序，保留测序正确的质粒，并将质粒命名为pCK-ccdB；
II)将pCK-ccdB质粒的β-半乳糖苷酶启动子区域的-35区与-10区之间的序列进行突变后插入一个ccdB的表达元件形成前T载体，使得β-半乳糖苷酶启动子区域在插入表达元件后形成两个相同的AhdI酶切位点序列，具体如下：
(1)以步骤I)构建成功的pCK-ccdB质粒为模板，以引物F-vector-MU、R-vector-MU(SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.7)为引物进行PCR扩增反应，PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物，具体的PCR反应体系如实施例1表1所示，反应条件如实施例1表2所示；
(2)使用GibsonMaster Mix试剂盒将步骤(1)纯化的PCR产物与实施例1步骤(2)基因合成的ccdB表达元件进行连接反应，连接反应体系如实施例1表4所示，连接反应条件：50℃连接反应1小时；
(3)将步骤(2)中获得的连接产物转化Top10F’感受态细胞，最终涂布卡那霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日挑取单克隆进行Sanger测序，保留测序正确的质粒构建，并将质粒命名为pCK-ccdB-toxic。
III)制备T载体
使用AhdI核酸内切酶酶切步骤Ⅱ)构建的前T载体pCK-ccdB-toxic，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化载体片段即得到T载体pCK-ccdB-T。
Ⅳ)T载体克隆实验
(1)合成两条24bp引物，两条引物中有23bp的序列反向互补，退火后能形成3’端突出一个A碱基的dsDNA，两条24bp引物核苷酸序列如实施例1中的SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9所示；
(2)以λDNA为模板，F-λDNA-200bp+R-λDNA-200bp为引物进行PCR扩增，PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物，所述引物F-λDNA-200bp、R-λDNA-200bp的核苷酸序列如实施例1中的SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.11所示，PCR反应体系如实施例1表5所示，PCR扩增程序如实施例1表6所示；
(3)将步骤(1)退火形成3’端突出一个A碱基的dsDNA、步骤(2)纯化得到的PCR产物分别与步骤III)纯化pCK-T载体进行连接反应，连接反应体系如实施例1表7所示，连接反应条件：22℃连接反应1小时；
(4)将上述步骤(3)中获得的连接产物分别转化Top10F’感受态细胞，最终涂布含IPTG的卡那霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日从克隆约200bp DNA片段的平板上挑取24个单克隆进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系如实施例1表8所示，PCR扩增程序如实施例1表9所示。
PCR鉴定结果如图2所示，图2结果显示所有克隆均为阳性克隆，从24个菌检阳性的克隆中随机挑选12个克隆，同时，从克隆约24bp外源DNA片段的平板上挑取12个单克隆分别进行Sanger测序，，测序结果显示所有克隆的序列均正确，实验结果表明，本发明的T载体可以用于克隆不小于24bp的外源DNA。
实施例4：单拷贝T载体的构建级功能验证
单拷贝T载体的构建方法，包括如下具体步骤：
Ⅰ)对pCC1质粒进行点突变以去除AhdI限制酶识别序列
(1)以具有氯霉素抗性的pCC1质粒为模板，以SEQ ID NO.22-23为引物进行PCR扩增反应，具体序列如下：
SEQ ID NO.22(正向引物)：CAAGGGCAAGTATTCACATGTCGTCGTAACCTGTAGAACGGAG；
SEQ ID NO.23(反向引物)：TTACGACGACATGTGAATACTTGCCCTTGACAGGCATTGATGG；
PCR反应体系如实施例1的表1所示，反应条件如表11所示；
表11
(2)将步骤(1)获得的PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物；
(3)使用GibsonMaster Mix试剂盒将步骤(2)所得的PCR纯化产物进行连接反应，连接反应体系如表12所示：
表12
连接反应条件为：50℃连接反1h；
(4)将上述步骤(3)中获得的连接产物转化Top10F’感受态细胞，最终涂布含IPTG及X-gal的氯霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日挑取蓝色单克隆并进行Sanger测序，保留测序正确的质粒，并将质粒命名为pCC1-MU；
Ⅱ)采用ccdB基因替换pCC1-MU质粒的lacZα基因，具体如下：
(1)以具有氯霉素抗性的pCC1-MU质粒为模板，以SEQ ID NO.24-25为引物进行PCR扩增反应，具体序列如下：
SEQ ID NO.24(正向引物)：TTATAGGTGTAAACCTTAAACTGCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC；
SEQ ID NO.25(反向引物)：ATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAATTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACAC；
PCR反应体系如实施例1的表1所示，反应条件如表11所示；
(2)将步骤(1)获得的PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物；
(3)使用GibsonMaster Mix试剂盒将步骤(2)所得的PCR纯化产物与实施例1步骤(1)基因合成的ccdB基因进行连接反应，连接反应体系如表13所示：
表13
连接反应条件为：50℃连接反1h；
(4)将上述步骤(3)中获得的连接产物转化Top10F’感受态细胞，最终涂布氯霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日挑取单克隆并进行Sanger测序，保留测序正确的质粒，并将质粒命名为pCC1-MU-ccdB；
Ⅲ)将pCC1-MU-ccdB质粒的β-半乳糖苷酶启动子区域的-35区与-10区之间的序列进行突变后插入一个ccdB的表达元件形成前T载体，使得β-半乳糖苷酶启动子区域在插入表达元件后形成两个相同的AhdI酶切位点序列，具体如下：
(1)以步骤Ⅱ)构建成功的pCC1-MU-ccdB质粒为模板，以引物F-vector-MU、R-vector-MU(SEQ ID NO.26-SEQ ID NO.27)为引物进行PCR扩增反应，PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物。
SEQ ID NO.26(F-vector-MU)：GCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTC；
SEQ ID NO.27(R-vector-MU)：GTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCA；
具体的PCR反应体系如实施例1表1所示，反应条件如表11所示；
(2)使用Gibson Master Mix试剂盒将步骤(1)纯化的PCR产物与实施例1步骤(2)基因合成的ccdB表达元件进行连接反应，连接反应体系如表14所示：
表14
连接反应条件：50℃连接反应1小时；
(3)将步骤(2)中获得的连接产物转化Top10F’感受态细胞，最终涂布氯霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日挑取单克隆进行Sanger测序，保留测序正确的质粒构建，并将质粒命名为pCC1-MU-ccdB-toxic。
Ⅳ)制备T载体
使用AhdI核酸内切酶酶切步骤Ⅲ)构建的前T载体pCC1-MU-ccdB-toxic，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化载体片段即得到T载体pCC1-ccdB-T。
Ⅴ)T载体克隆实验
(1)合成两条24bp引物，两条引物中有23bp的序列反向互补，退火后能形成3’端突出一个A碱基的dsDNA，两条24bp引物核苷酸序列如实施例1的SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9所示。
(2)以λDNA为模板，F-λDNA-200bp+R-λDNA-200bp为引物进行PCR扩增，PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化得到PCR扩增产物，所述引物F-λDNA-200bp、R-λDNA-200bp的核苷酸序列如实施例1中的SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.11所示，PCR反应体系如实施例1表5所示，PCR扩增程序如实施例1表6所示；
(3)将步骤(1)退火形成3’端突出一个A碱基的dsDNA、步骤(2)纯化得到的PCR产物分别与步骤Ⅳ)纯化pCC1-ccdB-T载体进行连接反应，连接反应体系如实施例1表7所示，连接反应条件：22℃连接反应1小时；
(4)将上述步骤(3)中获得的连接产物分别转化Top10F’感受态细胞，最终涂布含IPTG的氯霉素抗性的LB平板并37℃培养过夜，次日从克隆约200bp DNA片段的平板上挑取24个单克隆进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系如实施例1表8所示，PCR扩增程序如实施例1表9所示。
PCR鉴定结果如图3所示，图3结果显示所有克隆均为阳性克隆，从24个菌检阳性的克隆中随机挑选12个克隆，同时，从克隆约24bp外源DNA片段的平板上挑取12个单克隆分别进行Sanger测序，测序结果显示所有克隆的序列均正确，实验结果表明，本发明的T载体可以用于克隆不小于24bp的外源DNA。
综上所述，本发明通过将其β-半乳糖苷酶启动子区域的-35区与-10区之间的序列进行突变后插入一个ccdB的表达元件形成前T载体，使得β-半乳糖苷酶启动子区域在插入ccdB表达元件后形成两个相同AhdI酶切位点序列，使用AhdI酶切前T载体经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化载体片段即得到T载体。克隆时由于外源基因插入T载体的β-半乳糖苷酶启动子，使得β-半乳糖苷酶启动子的活性明显下降，进而使得lacZα基因的表达量显著下降；本发明通过上述方法克服了常见的由于采用蓝白筛选的载体存在强启动子启动外源基因的转录或翻译产物可能对宿主有毒性而导致无法克隆的问题，而且可以避免载体在酶切位点缺失1-2bp导致lacZα基因移码突变产生假阳性克隆的缺陷，并且可以消除由于外源DNA片段较小并且外源DNA的插入没有改变lacZα基因的读码框，造成平板都是蓝斑的假阴性现象。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 苏州金唯智生物科技有限公司
<120> 一种前T载体及其组成的T载体和应用（TA克隆-ccdB）
<130> 2017
<141> 2017-12-29
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 1
atgcagttta aggtttacac ctataaaaga gagagccgtt atcgtctgtt tgtggatgta 60
cagagtgata ttattgacac gcccgggcga cggatggtga tccccctggc cagtgcacgt 120
ctgctgtcag ataaagtctc ccgtgaactt tacccggtgg tgcatatcgg ggatgaaagc 180
tggcgcatga tgaccaccga tatggccagt gtgccggtct ccgttatcgg ggaagaagtg 240
gctgatctca gccaccgcga aaatgacatc aaaaacgcca ttaacctgat gttctgggga 300
atataa 306
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 2
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 30
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 3
ctttatgctt ccggctcg 18
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 4
ttataggtgt aaaccttaaa ctgcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atcc 54
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 5
attaacctga tgttctgggg aatataatta agccagcccc gacacccgcc aacac 55
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 6
gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 7
gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 30
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 8
gcaccgggat aacacgctca ccaa 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 9
tggtgagcgt gttatcccgg tgca 24
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 10
gttgaatggg cggatgctaa ttactatctc ccg 33
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 11
ttatgctcta taaagtaggc ataaacaccc agc 33
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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acatacgagg acatcagtca aagtgtaaag cctggggtgc ct 42
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 13
ttacactttg actgatgtcc tcgtatgttg tgtggaattg tg 42
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 14
aacatacgag gacacagtca aagtgtaaag cctggggtgc ct 42
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 15
ttacactttg actgtgtcct cgtatgttgt gtggaattgt ga 42
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 16
acatacgagg acatagtcaa agtgtaaagc ctggggtgcc ta 42
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 17
tttacacttt gactatgtcc tcgtatgttg tgtggaattg tg 42
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 18
aacatacgag gacaagtcaa agtgtaaagc ctggggtgcc ta 42
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 19
tttacacttt gacttgtcct cgtatgttgt gtggaattgt ga 42
<210> 20
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 20
ttataggtgt aaaccttaaa ctgcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atcc 54
<210> 21
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 21
ttaacctgat gttctgggga atataattaa gccagccccg agtagctaga cagg 54
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 22
caagggcaag tattcacatg tcgtcgtaac ctgtagaacg gag 43
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 23
ttacgacgac atgtgaatac ttgcccttga caggcattga tgg 43
<210> 24
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 24
ttataggtgt aaaccttaaa ctgcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atcc 54
<210> 25
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 25
attaacctga tgttctgggg aatataatta agccagcccc gacacccgcc aacac 55
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 26
gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 27
gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 30
<210> 28
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 28
tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgaggacatt ctgtcgaaag cgggcagtga 60
gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 120
gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 180
ctatgcagtt taaggtttac acctataaaa gagagagccg ttatcgtctg tttgtggatg 240
tacagagtga tattattgac acgcccgggc gacggatggt gatccccctg gccagtgcac 300
gtctgctgtc agataaagtc tcccgtgaac tttacccggt ggtgcatatc ggggatgaaa 360
gctggcgcat gatgaccacc gatatggcca gtgtgccggt ctccgttatc ggggaagaag 420
tggctgatct cagccaccgc gaaaatgaca tcaaaaacgc cattaacctg atgttctggg 480
gaatataatt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 540
gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctggacatac agtcaaagtg taaagcctgg 600
ggtgcctaat gagtgagcta actc 624

Claims (10)

1.一种前T载体，其特征在于，所述启动子区域中的-35区至-10区之间的核酸序列替换为对宿主有毒性的表达元件。
2.根据权利要求1所述的前T载体，其特征在于，所述对宿主有毒性的表达元件为转录或翻译产物能够导致宿主无法生长或增殖的基因；
优选地，所述对宿主有毒性的表达元件为致死基因表达元件和/或限制性内切酶基因表达元件；
优选地，所述致死基因表达元件为ccdB表达元件；
优选地，所述ccdB表达元件的核酸序列如SEQ ID NO.28所示；
优选地，所述对宿主有毒性的表达元件含有诱导性启动子；
优选地，所述前T载体插入对宿主有毒性的表达元件后形成两个酶切位点。
3.根据权利要求1或2所述的前T载体，其特征在于，所述启动子为β-半乳糖苷酶启动子；
优选地，所述β-半乳糖苷酶的启动子区域中的-35区至-10区之间的核酸序列如SEQ IDNO.2-3所示；
优选地，所述克隆载体为pUC18、pUC19、pUC57、pCA、pCK、pCC或pCC1中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述克隆载体上的lacZα基因替换为对宿主有毒性的基因；
优选地，所述对宿主有毒性的基因为转录或翻译产物能够导致宿主无法生长或增殖的基因；
优选地，所述对宿主有毒性的基因为致死基因和/或限制性内切酶基因；
优选地，所述致死基因为ccdB基因，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述宿主为野生型大肠杆菌。
4.一种T载体，其特征在于，采用核酸内切酶酶切权利要求1-3中任一项所述的前T载体，得到所述T载体；
优选地，所述核酸内切酶为AhdI、XcmI、BciVI或BmrI中的任意一种或或两种的组合。
5.一种如权利要求4所述的T载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将对宿主有毒性的基因替换载体上的lacZα基因；
(2)将原启动子-35区至-10区突变后插入对宿主有毒性的表达元件形成前T载体；
(3)将所述前T载体采用核酸内切酶酶切，得到所述T载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)之前还包括将对宿主有毒性的基因进行密码子优化；
优选地，所述对宿主有毒性的表达元件为致死基因表达元件和/或限制性内切酶基因表达元件；
优选地，所述致死基因表达元件为ccdB基因表达元件；
优选地，所述核酸内切酶为AhdI、XcmI、BciVI或BmrI中的任意一种或至少两种的组合。
7.一种克隆载体，其特征在于，包括如权利要求1-3中任一项所述的前T载体和/或如权利要求4所述的T载体。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求1-3中任一项所述的前T载体和/或如权利要求7所述的克隆载体；
优选地，所述宿主细胞为野生型大肠杆菌。
9.一种基因克隆的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将外源基因的3’端添加1个A碱基，添加A碱基的外源基因与权利要求4所述T载体连接，导入宿主细胞中，在合适的条件下，培养所述宿主细胞，以便获得阳性克隆；
优选地，所述外源基因的3’端添加1个A碱基通过使用Taq DNA聚合酶扩增得到；
优选地，所述宿主细胞为对Top10F’、DH5α、EPI400、Top10、stbl2、stbl3、Jm109、Jm110或TG1中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的前T载体、权利要求4所述的T载体、如权利要求7所述的克隆载体或权利要求8所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述试剂盒用于基因克隆。
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