CN104087610A - 穿梭质粒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

穿梭质粒载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用。该穿梭质粒载体，穿梭质粒载体能够在酵母及大肠杆菌中穿梭，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的该穿梭质粒载体，与现有技术相比，该质粒载体实现了在酵母、细菌内穿梭，同时具备酵母中同源重组克隆、自我复制、重组子筛选的能力，以及在细菌中稳定性复制和保持、便于DNA纯化分离操作的特质。

Description

穿梭质粒载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用。
背景技术
由于细胞生命过程涉及到复杂的生理生化反应，在大多数情况下受多基因或基因簇的控制，这些调控往往与几百甚至几千kb的DNA片段遗传信息密切相关，为了更好的对这些基因或基因簇的功能进行分析，研究细胞生命现象中的生物学规律和意义，这就需要新的技术来选择性地分离或人工合成改造一些大于20kb的基因组DNA片段，以全面加速基因组学和基因组功能区段的研究进程。
目前，聚合酶链式反应(PCR)是实验室用于从复杂的基因组中分离得到目的基因片段的最直接有效的技术手段。尽管PCR方法应用广泛，但是仍存在一个关键的技术性瓶颈：PCR得到的DNA片段的大小一般难以超过20kb。为了克服该技术瓶颈，在20世纪90年代发展了一项新的技术，即转化介导的重组(TAR)克隆方法。TAR克隆的原理是利用酵母体内重组系统对DNA大片段进行拼接合成。具体的方法是：将具有同源末端的基因组DNA片段和线性化的TAR载体共同转染到酵母原生质体中，利用酵母细胞中高效的重组系统，使载体与基因组DNA的同源序列间进行重组，即可产生带有目的DNA片段的酵母人工染色体(YACs)克隆。近年来，研究者们不断对转化介导的克隆方法进行优化，同时致力于利用其在基因组DNA大片段人工合成中的应用探索。
现在利用最优化条件下的重组介导的克隆方法不仅能够在两周内拼接合成大至250kb的基因组DNA片段，其精确度与PCR方法相近，并且能够得到30％的阳性克隆率。更为引人注目的是，2008年，Venter JC团队用改进后的重组介导的克隆方法成功地合成了一种原核生物(生殖支原体Mycoplasma genitalium)的基因组DNA，将人类人工全合成DNA大片段的记录刷新至近600kMb，这标志着重组介导的克隆方法在目前的DNA大片段人工合成技术领域占据着重要地位。
在相关技术中，具体的，为了实现在酵母细胞中的有效重组，利用转化介导的克隆方法通常需要特殊的载体，这种载体的构成核心元件一般包括酵母的中心粒序列(yeast centromere sequence，CEN)、筛选标记(如HIS3、URA3、LUE2等)、维持重组质粒在酵母中自主复制和稳定遗传的复制起始位点(autonomouslyreplicating sequence，ARS)以及与目的片段两端序列同源的同源臂序列。但是，由于酵母人工染色体质粒在酵母细胞中不稳定，同时通过琼脂糖凝胶分离纯化获得的质粒DNA的质量和数量均达不到后期分子生物学、细胞学实验的要求；因此，提供一种能够在酵母和细菌之间穿梭，且同时具备在酵母中重组克隆、自我复制、重组子筛选，且还能够在细菌稳定的复制和保存，便于DNA纯化与分离的穿梭质粒载体是本领域技术人员亟待解决的一个技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种穿梭质粒载体，以解决上述的技术问题。本发明的另一个目的在与提供上述穿梭质粒载体的构建方法。
在本发明的实施例中提供了穿梭质粒载体，所述穿梭质粒能够在酵母及大肠杆菌中穿梭，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该穿梭质粒载体通过对现有的载体进行改造，其将核心元件(酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3)加入到具备DNA大片段容纳性的细菌人工染色体(bacteria artificial chromosomes，BAC)中，进而获得穿梭质粒载体。与现有技术相比，该质粒载体实现了在酵母、细菌内穿梭，同时具备酵母中同源重组克隆、自我复制、重组子筛选的能力，以及在细菌中稳定性复制和保持、便于DNA纯化分离操作的特质。另外，其用于合成改造的DNA长片段序列信息不受限制性内切酶位点的限制；此外，其可对经人工改造设计的DNA基因组全长进行拼接合成，合成产物可用于病毒载体疫苗和原核生物能源工程的研究利用，并可主要应用于DNA大片段(>30kb)的人工合成拼接、大DNA病毒全基因组人工合成及反向遗传系统构建等领域，其克服了现有技术中的载体，由于酵母人工染色体质粒在酵母细胞中不稳定，同时通过琼脂糖凝胶分离纯化获得的质粒DNA的质量和数量均达不到后期分子生物学、细胞学实验的要求，以及现有技术中的载体自身不能在酵母和细菌中穿梭，并且不能同时具备酵母中同源重组克隆、自我复制、重组子筛选的能力及在细菌中稳定性复制和保持等技术问题。
可选的，所述穿梭质粒为将酵母质粒元件插入到细菌人工染色体组合而成；其中：所述酵母质粒元件包括位于4555～5073的复制起始位点ARS4和酵母中心粒CEN6、位于5451～6300的编码营养缺陷型标记基因HIS3及其启动子序列；所述细菌人工染色体包括F因子复制子、质粒分配因子partA/B/C、高拷贝复制起点oriV及细菌筛选标记氯霉素抗性基因chl。
上述穿梭质粒载体在DNA大片段的人工合成拼接、DNA病毒全基因组人工合成及反向遗传操作系统的构建领域中的应用。
一种上述穿梭质粒载体的构建方法，包括以下步骤：
1)、以黏粒pRS313载体为模板，通过设定引物进行PCR,获得核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的HIS3筛选元件；2)、合成CEN6-ARSH4酵母复制序列，并在其两端分别引入限制性内切酶位点BamH I和EcoR I后连接到pUC19质粒中；3)、将含有CEN6-ARSH4酵母复制序列的pUC19质粒利用BamH I和EcoR I进行双酶切处理，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的CEN6-ARSH4酵母复制元件；4)、以所述HIS3筛选元件和所述CEN6-ARSH4酵母复制元件作为模板，进行两轮PCR扩增，得到酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3；5)、将环化pCC1BAC质粒利用内切酶Afe I进行酶切处理，得到线性化的pCC1BAC质粒；在所述酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的两端引入与所述线性化的pCC1BAC质粒末端相对应的同源序列，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3；6)、将所述线性化的pCC1BAC质粒和所述末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3共同转化导入到酵母菌VL6-48的原生质体中，通过酵母自身的同源重组系统，使酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3片段插入到pCC1BAC质粒的酶切位点Afe I处，得到穿梭质粒载体。
可选的，在步骤1)中：所用的引物为YF1和YR1，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
可选的，在步骤4)中，具体包括：
以所述HIS3筛选元件和所述CEN6-ARSH4酵母复制元件作为模板进行第一轮PCR扩增，得到第一扩增产物；
以所述第一扩增产物为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的特异性引物YF2以及核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示引物YR1作为引物进行扩增，得到酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3。
可选的，在步骤5)中：所述在所述酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的两端引入与所述线性化的pCC1BAC质粒末端相对应的同源序列，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的步骤中，具体包括：
以所述酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3为模板，以序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的TAR-F1和TAR-R1为引物进行扩增，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3。
可选的，在步骤3)中：所述双酶切处理的反应体系包括：10×K buffer5μl、BamH I2.5μl、EcoR I2.5μl、pUC19质粒5μl、ddH2O35μl；反应温度为37℃、反应时间为1小时。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例一提供的穿梭质粒载体的物理图谱；
图2为本发明实施例二提供的穿梭质粒载体构建方法的流程图；
图3为本发明实施例的质粒载体(pGF)的BamH I酶切鉴定(左)及CEN6-ARSH4-HIS3元件PCR鉴定电泳图(右)；
图4为本发明实施例的穿梭质粒载体(pGF)进行DNA长片段合成酶切电泳鉴定图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本发明中的具体实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
在本发明的实施例中提供了穿梭质粒载体，所述穿梭质粒能够在酵母及大肠杆菌中穿梭，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(其物理图谱请参考图1)。具体的，所述穿梭质粒为将酵母质粒元件插入到细菌人工染色体组合而成；其中：所述酵母质粒元件包括位于4555～5073的复制起始位点ARS4和酵母中心粒CEN6、位于5451～6300的编码营养缺陷型标记基因HIS3及其启动子序列；所述细菌人工染色体包括F因子复制子、质粒分配因子partA/B/C、高拷贝复制起点oriV及细菌筛选标记氯霉素抗性基因chl。
该穿梭质粒载体通过对现有的载体进行改造，其将核心元件(如：酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3)加入到具备DNA大片段容纳性的细菌人工染色体(bacteria artificial chromosomes，BAC)中，进而获得，穿梭质粒载体。与现有技术相比，该质粒载体实现了在酵母、细菌内穿梭，同时具备酵母中同源重组克隆、自我复制、重组子筛选的能力，以及在细菌中稳定性复制和保持、便于DNA纯化分离操作的特质。另外，其用于合成改造的DNA长片段序列信息不受限制性内切酶位点的限制；此外，其可对经人工改造设计的DNA基因组全长进行拼接合成，合成产物可用于病毒载体疫苗和原核生物能源工程的研究利用，并可主要应用于DNA大片段(>30kb)的人工合成拼接、大DNA病毒全基因组人工合成及反向遗传系统构建等领域，其克服了现有技术中的载体，由于酵母人工染色体质粒在酵母细胞中不稳定，同时通过琼脂糖凝胶分离纯化获得的质粒DNA的质量和数量均达不到后期分子生物学、细胞学实验的要求，以及现有技术中的载体自身不能在酵母和细菌中穿梭，并且不能同时具备酵母中同源重组克隆、自我复制、重组子筛选的能力及在细菌中稳定性复制和保持等技术问题。
为了使得本发明上述实施例的穿梭质粒载体得到更好的应用，更加有效应用到生物技术领域中，本发明还在上述内容的基础之上提供了实施例一，实施例一给出了上述穿梭质粒载体的构建方法，现做详细的阐述和解释，请参考图2。
实施例一
本发明实施例提供的这种穿梭质粒载体的构建方法，请参考图2，包括以下步骤：
步骤101：以黏粒pRS313载体为模板，通过设定引物进行PCR,获得核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的HIS3筛选元件；
在步骤101中，依据GenBank(U03439)上的核苷酸序列信息结合黏粒pRS313的信息，设定特定的引物，并且通过PCR操作获得HIS3筛选元件；其序列如SEQ ID NO.2所示。
步骤102：合成CEN6-ARSH4酵母复制序列，并在其两端分别引入限制性内切酶位点BamH I和EcoR I后连接到pUC19质粒中；
步骤103：将含有CEN6-ARSH4酵母复制序列的pUC19质粒利用BamH I和EcoR I进行双酶切处理，得到核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的CEN6-ARSH4酵母复制元件；
通过步骤102和步骤103，即可实现CEN6-ARSH4酵母复制元件的获取，通过人工合成CEN6-ARSH4酵母复制序列，并在其两端引入限制性内切酶位点BamH I和EcoR I；然后再连接到pUC19质粒中将重组质粒进行双酶切处理，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的CEN6-ARSH4酵母复制元件。
步骤104：以所述HIS3筛选元件和所述CEN6-ARSH4酵母复制元件作为模板，进行两轮PCR扩增，得到酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3；
步骤104实现了酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的构建，具体的，通过回收PCR扩增的目的条带，再将其载入pTA2载体(购自TOYOBO公司)中，转化大肠杆菌DH5α，挑单克隆子进行测序，进而验证测序结果与所设计序列的吻合性。
步骤105：将环化pCC1BAC质粒利用内切酶Afe I进行酶切处理，得到线性化的pCC1BAC质粒；在所述酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的两端引入与所述线性化的pCC1BAC质粒末端相对应的同源序列，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3；
将环化的pCC1BAC质粒利用内切酶Afe I进行酶切处理，得到线性化的pCC1BAC质粒，具体的，单酶切反应的过程中，其总体积为20μl：具体包括：10×O酶切缓冲液2μl；Afe I2μl；质粒(pCC1BAC-1)2μl；ddH2O14μl，37℃2h；65℃20min。一次同时做20个反应，共得400μl酶切产物；酶切产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离验证，将验证正确的目的条带凝胶切下后用OMEGA回收试剂盒对其进行回收浓缩。另外，通过在酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的两端引入与所述线性化的pCC1BAC质粒末端相对应的同源序列，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3，进而便于后续重组拼接操作。
步骤106：将所述线性化的pCC1BAC质粒和所述末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3共同转化导入到酵母菌VL6-48的原生质体中，通过酵母自身的同源重组系统，使酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3片段插入到pCC1BAC质粒的酶切位点Afe I处，得到穿梭质粒载体。
为了使得本发明上述实施例的构建方法得到更好的应用，更加有效应用该穿梭质粒载体的构建中，本发明还在上述实施例的基础之上提供了实施例二，实施例二给出了上述实施例的构建方法进一步细化或者增加，现做详细的阐述和解释：
实施例二
在本实施例中，穿梭质粒载体的制备方法包括以下步骤：
S1：与上述步骤101一致，具体的，所用的引物为YF1和YR1，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
具体的，引物YF1和YR1(其中上游引物YF1前23bp与酵母复制元件CEN6-ARSH4末端序列同源，如下粗体下划线部分所示)。
YF1:GTTACAGGCAAGCGATCCGTCCGGAAACCATTATTATCATGACATTAACCT；
YR1:TCCCCCGGGACGCATCTGTGCGGTATTTC。
PCR的具体条件为：
反应总体积为25μl：包括10×KOD-PLUS缓冲液2.5μl；2mMdNTPs2.5μl；25mM MgSO41.2μl；模板pRS3131μl；引物YF11μl；引物YR11μl；KOD-PLUS聚合酶0.5μl；ddH2O15.3μl；反应程序为：94℃2min；94℃15sec，59℃25sec，68℃2min，30循环；68℃5min延伸；4℃5min；PCR扩增后产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳结果在理论值大小位置出现了单一的特异性条带，将含目的条带的凝胶切下，用OMEGA回收试剂盒对其进行回收，回收产物进行测序，测序结果与已报告的序列相吻合。
S2：与上述步骤102一致。
S3：与上述步骤103一致。具体的，所述双酶切处理的反应体系包括：10×K buffer5μl、BamH I2.5μl、EcoR I2.5μl、pUC19质粒5μl、ddH2O35μl；反应温度为37℃、反应时间为1小时。
S4：以所述HIS3筛选元件和所述CEN6-ARSH4酵母复制元件作为模板进行第一轮PCR扩增，得到第一扩增产物；
具体的，在第一轮PCR扩增的过程中，反应总体积为25μl：包括10×KOD-PLUS缓冲液2.5μl；2mM dNTPs2.5μl；25mMMgSO41.2μl；模板HIS1.5μl；模板CEN6-ARSH41.5μl；KOD-PLUS聚合酶0.5μl；ddH2O15.3μl；反应程序为：94℃2min；94℃15sec，55℃25sec，68℃2min，35循环；68℃5min延伸；4℃5min。
S5：以所述第一扩增产物为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的特异性引物YF2以及核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示引物YR1作为引物进行扩增，得到酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3；
具体的，取第一扩增产物为模板，用引物YF2和YR1对酵母复制筛选原件CEN6-ARSH4-HIS3进行特异扩增。反应总体积为25μl：10×KOD-PLUS缓冲液2.5μl；2mM dNTPs2.5μl；25mMMgSO41.2μl；模板1μl；引物YF21μl；引物YR11μl；KOD-PLUS聚合酶0.5μl；ddH2O15.3μl；反应程序为：94℃2min；94℃15sec，58℃25sec，68℃2min，28循环；68℃5min延伸；4℃5min。
S6：将环化pCC1BAC质粒利用内切酶Afe I进行酶切处理，得到线性化的pCC1BAC质粒；在所述酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的两端引入与所述线性化的pCC1BAC质粒末端相对应的同源序列，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3；
具体的，在S6中，所述在所述酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的两端引入与所述线性化的pCC1BAC质粒末端相对应的同源序列，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的步骤中，具体包括：
以所述酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3为模板，以序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的TAR-F1和TAR-R1为引物进行扩增，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3。
在扩增的过程中，反应的总体积为25ul：包括10×KOD-PLUS缓冲液2.5μl；2mM dNTPs2.5μl；25mM MgSO41.2μl；模板1μl；引物TAR-F11μl；引物TAR-R11μl；KOD-PLUS聚合酶0.5μl；ddH2O15.3μl；反应程序为：94℃2min；94℃15sec，58℃25sec，68℃2min，28循环；68℃5min延伸；4℃5min。一次同时做6个反应，共得150μl。
另外，在利用Afe I进行酶切处理的过程中，反应总体积为20μl：10×O酶切缓冲液2μl；Afe I2μl；质粒(pCC1BAC-1)2μl；ddH2O14μl，37℃2h；65℃20min。一次同时做20个反应，共得400μl。
S7：将所述线性化的pCC1BAC质粒和所述末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3共同转化导入到酵母菌VL6-48的原生质体中，通过酵母自身的同源重组系统，使酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3片段插入到pCC1BAC质粒的酶切位点Afe I处，得到穿梭质粒载体；
步骤S7为用酵母转化介导的重组克隆拼接法构建BAC穿梭质粒载体pGF的操作。具体的，其包括如下步骤：
A、酵母原生质粒的制备
挑新制备的VL6-48单克隆(直径2-3mm)至50ml YPA液体培养基中,30℃,250rpm过夜培养(15h)；用50ml离心管收集菌体，1600g,4℃,3min，弃上清；用50ml灭菌的ddH2O重悬细胞，1600g，4℃，3min弃上清；用20ml1M SORBITOL溶液重悬细胞，4℃放置>4h；用1600g，4℃，3min，弃上清，收集菌体。
B、转化介导的同源重组拼接
用20ml预冷的SPE solution重悬细胞，加入40μl破壁酶溶液，40μl14mMβ-巯基乙醇，混匀，50rpm，30℃,40min(此时在37℃培养箱内预热SORB-HIS平板)；在重悬液中加入1MSORBITOL溶液至45ml，轻摇混匀，1600g，4℃，5min；弃上清，加入45ml1M SORBITOL溶液，轻摇混匀,1600g，4℃，5min；弃上清,加入2ml STC溶液，轻轻重悬沉淀；取200μl重悬液，室温静置10min；加入≤40μl转化DNA(所要拼接的线性DNA片段)，室温静置10min；加入1ml PEG/CaCl2溶液，勿大力吹打，室温静置20min；1500g，4℃，8min；弃上清，加入800μl SOS溶液重悬，30℃，恒温孵育30min；在孵育的30min里，融化分装上层琼脂糖培养基至50ml离心管(12ml/管)，80℃水浴保存备用；待分装的SORB-TOP-HIS上层培养基充分冷却(但不能凝固)，加入孵育产物，充分混匀后平铺至预热的SORB-HIS平板上；30℃，恒温孵育3-4天，通过HIS氨基酸营养缺陷筛选，出现酵母单克隆。
C、用牙签挑选12个酵母单克隆至SD/-HIS缺陷培养基上，30℃，恒温孵育3-4天，再次筛选。从中选取长势良好的菌斑转入5ml SD/-HIS液体缺陷培养基中培养18-24h，用TIANGEN酵母质粒小提试剂盒小量提取质粒。
D、以上述酵母小提重组质粒为模板，用引物TAR-F1和TAR-R1对CEN6-ARSH4-HIS3片段进行特异性检测。将经0.8％琼脂糖凝胶电泳验证正确后的重组质粒载体pGF热击转化大肠杆菌EPI300。
E、挑取12个单克隆，转入5ml LB/(12.5μg/ml氯霉素)液体培养基中培养16-22h，用OMEGA试剂盒提取质粒，通过BamHI进行单酶切验证(如附图3)。将鉴定结果与理论符合的克隆子进行测序，测序结果与所设计序列吻合，如序列SEQ ID No.1所示。
另外，本实施例还提供了利用上述的穿梭质粒载体(pGF)进行DNA长片段噬藻体PP(PartABC)的合成拼接的具体操作，包括如下步骤：
1、待拼接片段及拼接用BAC穿梭质粒载体pGF的准备；
请参考图1，以噬藻体PP的基因组中约31kb片段为待拼接模板，将之分为PratA(12kb)、PartB(12kb)及PartC(7kb)三个片段。将PartA(12kb)分为长3kb的片段共4个，PartB(12kb)分为长3kb的片段共4个，PartC(7kb)分为长约3.5kb的片段共2个，设计引物从PP基因组中PCR获得这些待拼接片段；以本发明实施例所述的穿梭质粒载体pGF为模板，设计引物XAF及XAR，利用PCR的方法获得具有同源序列末端的线性化载体pGF；
具体的，在PCR的过程中，反应总体积为25μl：10×KOD-PLUS缓冲液2.5μl；2mM dNTPs2.5μl；25mM MgSO41.2μl；模板pRS3131μl；引物XAF1μl；引物XAR1μl；KOD-PLUS聚合酶0.5μl；ddH2O15.3μl；反应程序为：94℃2min；94℃15sec，59℃25sec，68℃2min，30循环；68℃5min延伸；4℃5min。利用上述同样的方法拼接PartB及PartC。
2、酵母转化介导的同源重组拼接如实施例一中S6部分所述，其中片段及载体的摩尔浓度比控制在1：1到2：1。
3、用牙签挑选12个酵母单克隆至SD/-HIS缺陷培养基上，30℃，恒温孵育3-4天，再次筛选。从中选取长势良好的菌斑转入5ml SD/-HIS液体缺陷培养基中培养18-24h，用TIANGEN酵母质粒小提试剂盒小量提取质粒。
4、以上述酵母小提重组质粒为模板，用引物对相应片段进行特异性检测。反应总体积和反应程序同前S6所述。将经0.8％琼脂糖凝胶电泳验证正确后的插入PartA、PartB或PartC的重组质粒电转化大肠杆菌EPI300；
5、挑取12个单克隆，转入5ml LB/(12.5μg/ml氯霉素)液体培养基中培养16-22h，用OMEGA试剂盒提取质粒。将克隆子进行测序，保留拼接中间体PartA、PartB及PartC测序结果与所设计序列吻合的重组菌；
6、将转化于大肠杆菌EPI300中鉴定正确的拼接中间体PartA、PartB及PartC以Not I酶切释放出具有同源末端序列的三个片段。单酶切反应总体积为20μl：包括10×H酶切缓冲液2μl；Not I2μl；质粒2μl；ddH2O14μl，37℃2h；65℃20min。一次同时做20个反应，共得400μl。同时，以本发明所述的BAC穿梭质粒载体pGF为模板，利用正向引物(XAF)与反向引物XAR以PCR方法获得具有同源末端序列的线性化载体pGF，PCR方法如上所述。
7、再次进行酵母转化介导的同源重组拼接如实施例一中S6部分所述，其中片段及载体的摩尔浓度比控制在1：1到2：1。
8、用牙签挑选12个酵母单克隆至SD/-HIS缺陷培养基上，30℃，恒温孵育3-4天，再次筛选。从中选取长势良好的菌斑转入5ml SD/-HIS液体缺陷培养基中培养18-24h，用TIANGEN酵母质粒小提试剂盒小量提取质粒。
9、以上述酵母小提重组质粒为模板，用引物对插入片段进行特异性检测。反应总体积和反应程序同前2.2所述。将经0.8％琼脂糖凝胶电泳验证正确后的重组质粒电转化大肠杆菌EPI300。
10、挑取12个单克隆，转入5ml LB/(12.5μg/ml氯霉素)液体培养基中培养16-22h，用OMEGA试剂盒提取质粒，通过EcoRI或Not I进行单酶切验证(如附图4)。将鉴定结果与理论符合的克隆子进行测序，测序结果与所设计序列吻合。
综上，本发明实施例提供的这种穿梭质粒载体，其可以实现DNA大片段(>30kb)拼接，同时具备在酵母中重组克隆、自我复制、重组子筛选的能力，以及在细菌中稳定复制和保持、便于DNA纯化分离操作的特质；另外，拼接合成的目的DNA片段长度可远大于一般聚合酶链式反应(PCR)合成的上限；合成改造的DNA大片段序列信息不受限制性内切酶位点的限制。
另外，本发明实施例提供的这种穿梭质粒载体在DNA大片段的人工合成拼接、DNA病毒全基因组人工合成及反向遗传操作系统的构建领域中的应用也理应属于本发明的保护范围。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种穿梭质粒载体，其特征在于，所述穿梭质粒载体能够在酵母及大肠杆菌中穿梭，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的穿梭质粒载体，其特征在于，所述穿梭质粒为将酵母质粒元件插入到细菌人工染色体组合而成；
其中，所述酵母质粒元件包括位于4555～5073的复制起始位点ARS4和酵母中心粒CEN6、位于5451～6300的编码营养缺陷型标记基因HIS3及其启动子序列；
所述细菌人工染色体包括F因子复制子、质粒分配因子partA/B/C、高拷贝复制起点oriV及细菌筛选标记氯霉素抗性基因chl。
3.权利要求2所述的穿梭质粒载体在DNA大片段的人工合成拼接、DNA病毒全基因组人工合成及反向遗传操作系统的构建领域中的应用。
4.一种根据权利要求2所述的穿梭质粒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、以黏粒pRS313载体为模板，通过设定引物进行PCR,获得核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的HIS3筛选元件；
2)、合成CEN6-ARSH4酵母复制序列，并在其两端分别引入限制性内切酶位点BamH I和EcoR I后连接到pUC19质粒中；
3)、将含有CEN6-ARSH4酵母复制序列的pUC19质粒利用BamH I和EcoR I进行双酶切处理，得到核苷酸序列如SEQID NO.3所示的CEN6-ARSH4酵母复制元件；
4)、以所述HIS3筛选元件和所述CEN6-ARSH4酵母复制元件作为模板，进行两轮PCR扩增，得到酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3；
5)、将环化pCC1BAC质粒利用内切酶Afe I进行酶切处理，得到线性化的pCC1BAC质粒；在所述酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的两端引入与所述线性化的pCC1BAC质粒末端相对应的同源序列，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3；
6)、将所述线性化的pCC1BAC质粒和所述末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3共同转化导入到酵母菌VL6-48的原生质体中，通过酵母自身的同源重组系统，使酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3片段插入到pCC1BAC质粒的酶切位点Afe I处，得到穿梭质粒载体。
5.根据权利要求4所述的穿梭质粒载体的构建方法，其特征在于，在步骤1)中：所用的引物为YF1和YR1，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
6.根据权利要求5所述的穿梭质粒载体的构建方法，其特征在于，在步骤4)中，具体包括：
以所述HIS3筛选元件和所述CEN6-ARSH4酵母复制元件作为模板进行第一轮PCR扩增，得到第一扩增产物；
以所述第一扩增产物为模板，以核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的特异性引物YF2以及核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示引物YR1作为引物进行扩增，得到酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3。
7.根据权利要求6所述的穿梭质粒载体的构建方法，其特征在于，在步骤5)中：所述在所述酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的两端引入与所述线性化的pCC1BAC质粒末端相对应的同源序列，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3的步骤中，具体包括：
以所述酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3为模板，以序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的TAR-F1和TAR-R1为引物进行扩增，得到末端延长的酵母复制筛选元件CEN6-ARSH4-HIS3。
8.根据权利要求7所述的穿梭质粒载体的构建方法，其特征在于，在步骤3)中：
所述双酶切处理的反应体系包括：10×K buffer5μl、BamH I2.5μl、EcoR I2.5μl、pUC19质粒5μl、ddH2O35μl；反应温度为37℃、反应时间为1小时。
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