CN103232994B - 一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法 - Google Patents
一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103232994B CN103232994B CN201310029904.2A CN201310029904A CN103232994B CN 103232994 B CN103232994 B CN 103232994B CN 201310029904 A CN201310029904 A CN 201310029904A CN 103232994 B CN103232994 B CN 103232994B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- thiooxidans
- plasmid
- starkey
- bacterium
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，采用构建目标基因的敲除质粒和携带I-SceI基因的诱导质粒，通过接合转移导入嗜酸性氧化硫硫杆菌中，使用抗性标记筛选单交换子，使用蓝白筛选初筛双交换子。本发明首次建立了嗜酸性氧化硫硫杆菌的无标记基因敲除方法，首次将β-半乳糖苷酶蓝白筛选应用于双交换子的筛选，不仅能快速、稳定、高效地敲除目标基因，而且克服了已有无标记基因敲除流程中因缺少选择压力造成的筛选困难这一瓶颈，缩短了双交换子筛选时间、提高了筛选效率、减少了筛选成本，为嗜酸性氧化硫硫杆菌稳定的遗传改造提供了便利的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于同源重组原理的无标记基因敲除方法和基于β-半乳糖苷酶活性的双交换子菌落筛选方法，尤其涉及一种高效筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌（A.thiooxidans）无标记基因敲除菌株的方法。
背景技术
嗜酸性氧化硫硫杆菌（Acidithiobacillus thiooxidans，简称A.thiooxidans）是一种极端嗜酸性、革兰氏阴性、专性化能自养细菌，能利用各种还原性或部分还原性无机硫化物（RISCs）获得生长繁殖所需的能量，通过卡尔文循环固定空气中的CO2作为主要碳源。在细菌冶金、煤的脱硫等方面发挥了重要作用，作为一种重要的浸矿微生物，与嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（A.ferrooxidans）联合浸矿能显著提高后者对硫化矿的浸出效率。但是由于A.thiooxidans的营养类型为专性化能自养菌，具有生长缓慢、代时长和细胞得率低的特点，且对矿物中所含的某些重金属离子缺乏抗性，不仅限制了A.thiooxidans的基础研究，而且限制了A.thiooxidans的实际应用。为了深入研究A.thiooxidans的基因功能、代谢途径及其各种抗逆机制，构建高效浸矿工程菌，提高A.thiooxidans的应用效能，必须使用分子生物学方法对其进行遗传改造，因此，构建能对A.thiooxidans进行稳定遗传改造的体系是当下亟待解决的问题。
发明人的实验室在国际上率先在A.thiooxidans中建立了基于接合转移原理的遗传转移系统，将具有接合转移功能的广泛宿主范围质粒从大肠杆菌中转入A.thiooxidans中（Jin SM,YanWM and Wang ZN，Appl.Environ.Microbiol.,1992,Vol.58.No.1,429-430），并成功实现了外源基因在A.thiooxidans中的异源表达，提高了A.thiooxidans外源有机质的利用能力（Tian,KL,.Lin JQ,Liu XM,Liu Y,Zhang CK and Yan WM,Biotechnol.Lett.,2003,Vol.25,No.10,749-754）。但是以质粒形式携带外源基因在A.thiooxidans中进行表达的遗传改造方法存在以下不足：稳定性差，必需使用抗生素保证质粒稳定存在于A.thiooxidans中；质粒上携带的外源基因有限，不能对同一种菌多个遗传性状进行改造。无标记基因敲除——这一染色体水平稳定的遗传操作技术不仅能解决上述问题，还将为A.thiooxidans的遗传改造提供一种新方法。
基因敲除技术是深入研究基因的功能、生长代谢途径关键酶和稳定改良生物遗传性状的重要遗传操作手段。发明人在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Wang H,Liu X,Liu S,Yu Y,Lin J,Lin J,Pang X,Zhao J，Appl.Environ.Microbiol.，2012,Vol.78,No.6,1826-1835，刘相梅，王慧妍，于洋洋，刘双双，林建群，林建强，庞昕，极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法，国家发明专利，专利号ZL201110188474.X，授权公告日2013,01,09）以及发明人的实验室在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性喜温硫杆菌（林建群，吴燕，张成家，林建强，嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法，国家发明专利，申请号201210089108.3，申请公布日2012,07,25）中已经建立了基于同源重组原理的无标记基因敲除方法,使用该方法敲除靶基因后，染色体上不存在抗生素抗性基因的残留，可适合基因组中多基因敲除和置换的研究。但是，在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性氧化硫硫杆菌中还没有无标记基因敲除技术的报道，阻碍了该菌的遗传改造和应用研究，而且在嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除技术中，双交换子失去了抗生素抗性基因，由于缺少选择压力以及同源重组频率低，存在双交换子筛选非常困难的问题，成为整个敲除流程中的瓶颈，需要通过分离纯化获得大量的单菌落，并对每个单菌落逐一进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测筛选和验证，不仅耗时、耗力、效率低，还增加了实验的成本。
发明内容
针对以上嗜酸性氧化硫硫杆菌中尚未建立无标记基因敲除技术以及嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除技术中存在筛选效率低和工作量大的问题，本发明提供了一种高效筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌（A.thiooxidans）无标记基因敲除菌株的方法。
本发明所述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌（A.thiooxidans）无标记基因敲除菌株方法的技术方案是：
构建含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点、oriColE1复制原点、能进行接合转移的敲除质粒骨架，分别选择目标敲除基因上、下游长度为0.5～2.0kb的同源序列作为上、下游同源臂，设计引物进行PCR扩增，经限制性内切酶酶切后，按照在基因组上的方向分别克隆到敲除质粒骨架的多克隆位点中，构建目标基因的敲除质粒，将目标基因的敲除质粒转化具有接合转移功能的E.coli S17-1λpir作为供体菌，通过接合转移进入A.thiooxidans受体菌中，在含卡那霉素的平板上获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的A.thiooxidans单交换子，通过以X-gal作为底物，对单交换子进行蓝色菌落验证，进一步设计引物对蓝色菌落的单交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证，构建含有酵母核酸内切酶I-SceI基因、链霉素抗性基因以及接合转移功能的广泛宿主范围特性的质粒作为诱导质粒，将诱导质粒转化具有接合转移功能的E.coli S17-1λpir作为供体菌，通过接合转移导入A.thiooxidans单交换子中，在含链霉素的平板上获得导入诱导质粒的接合转移子，I-SceI基因的表达产物I-SceI核酸内切酶能够切断染色体上的I-SceI位点，诱导第二次同源重组，以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛，进一步设计引物对白色菌落的双交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，筛选和验证发生了双交换的突变株，对验证的目标基因敲除突变株在不添加抗生素的无选择压力条件下转接3～5次连续传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株。
上述敲除质粒骨架携带大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ，用于双交换子的高效筛选；携带酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点，用于诱发第二次同源重组；携带多克隆位点MCS，便于同源臂的插入；携带接合转移所需的元件oriT区，使得质粒能够通过接合转移进入A.thiooxidans细胞中；携带酸性条件下对A.thiooxidans稳定有效的卡那霉素抗性基因，用于单交换子筛选；携带oriColE1复制原点，能在大肠杆菌中复制、而不能在A.thiooxidans中复制。
上述目标基因的敲除质粒是通过将要敲除目标基因上、下游长度为0.5～2.0kb的上、下游同源臂，按照在基因组上的方向分别克隆至敲除质粒骨架的多克隆位点MCS中获得。
上述目标基因的敲除质粒是通过细菌转化方法转入具有接合转移功能的大肠杆菌E.coliS17-1λpir作为供体菌，通过接合转移的方法进入A.thiooxidans受体菌中。
上述含目标基因敲除质粒的供体菌与A.thiooxidans受体菌接合培养条件选28～32℃，5～9天，筛选发生了第一次同源重组的A.thiooxidans单交换子选含80～150ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板，28～32℃培养10～15天。
上述验证A.thiooxidans单交换子的方法是向卡那霉素抗性平板上的单菌落表面滴加0.5～1.5uL浓度为5～20mg/mL的无菌X-gal溶液，28～35℃孵育20～40min；挑取蓝色菌落至10～20uL无菌水中，取0.5～1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证。
上述诱导质粒携带酵母核酸内切酶I-SceI基因，能在A.thiooxidans中表达出有活性的I-SceI，用于切割A.thiooxidans单交换子染色体上的I-SceI特异识别作用位点，诱发第二次同源重组；携带广泛宿主范围特性的复制原点，能在大肠杆菌和A.thiooxidans中高拷贝自主稳定复制，增加I-SceI酶的表达量，提高第二次同源重组的频率；携带接合转移必需的oriT区，能通过接合转移导入A.thiooxidans中；携带在酸性条件下对A.thiooxidan稳定有效的链霉素抗性基因，便于导入诱导质粒接合转移子的筛选。
上述诱导质粒是通过细菌转化方法转入具有接合转移功能的大肠杆菌E.coli S17-1λpir作为供体菌，通过接合转移的方法进入A.thiooxidans单交换子中。
上述含诱导质粒的供体菌与A.thiooxidans单交换子受体菌接合培养条件选28～32℃，48～72h，筛选导入诱导质粒的A.thiooxidans接合转移子选含80～150ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板，28～32℃培养10～15天。
上述初筛A.thiooxidans双交换子的方法是挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含250～400ug/mL链霉素的Starkey-S0液体培养基中，28～32℃培养5～7天，按5～10%的接种量转接20mL上述液体培养基中，28～32℃培养5～7天，取菌液稀释后涂布已涂布80～150uL的5～20mg/mL X-gal的含80～150ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，28～32℃培养10～15天，获得发生第二次同源重组的白色双交换子。
上述筛选和验证A.thiooxidans目标基因敲除突变株的方法是挑取链霉素平板上的白色双交换子单菌落至10～20uL无菌水中，取0.5～1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证发生了双交换的突变株。
上述获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株的方法是将验证的目标基因敲除突变株稀释后涂布Starkey-Na2S2O3培养基平板，28～32℃培养10～15天，挑取平板上的单菌落接种到20mL Starkey-S0液体培养基中，28～32℃培养5～7天；再继续如上转接3～5次连续传代培养，挑取单菌落至10～20uL无菌水中，取0.5～1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证质粒丢失。
上述Starkey-Na2S2O3无机盐溶液配方为：(NH4)2SO46.0g/L，KH2PO26.0g/L，MgSO4﹒7H2O1.0g/L，CaCl2﹒2H2O0.5g/L，pH4.8，121℃灭菌20min。
上述Starkey-Na2S2O3固体培养基配方为：A液：(NH4)2SO40.6g，KH2PO20.6g，MgSO4﹒7H2O1.0g，CaCl2﹒2H2O0.05g，蒸馏水100mL，pH4.8，121℃灭菌20min；B液：琼脂粉2g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；C液：Na2S2O32.0，FeSO4﹒7H2O0.006g溶解至10mL蒸馏水中，过滤除菌；A液和B液高压灭菌后冷却至80℃混合，再加入C液混合，制备固体平板。
上述Starkey-Na2S2O3固体接合培养基配方为：在上述Starkey-Na2S2O3固体培养基配方A液中加入0.05％酵母粉。
上述Starkey-S0液体培养基配方为：(NH4)2SO42.0g/L，KH2PO23.0g/L，MgSO4﹒7H2O0.5g/L，CaCl2﹒2H2O0.25g/L，FeSO4﹒7H2O0.01g/L，浓H2SO4调节至pH2.5，121℃灭菌20min；硫粉放入试剂瓶中密闭，煮沸3h灭菌，接种后按10g/L加入培养基中。
上述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法中：
所述敲除质粒骨架优选插入大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ、oriColE1复制原点的大肠杆菌质粒pKIT。
所述目标基因敲除质粒的构建优选将目标基因上、下游长度为0.9～1.1kb的上、下游同源臂，按照在基因组上的方向分别克隆至敲除质粒骨架的多克隆位点MCS中。
所述含目标基因敲除质粒的供体菌与A.thiooxidans受体菌接合培养条件优选30℃，7天，筛选发生了第一次同源重组的A.thiooxidans单交换子优选含100ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板，30℃培养12天，A.thiooxidans单交换子的复苏条件优选含300μg/mL卡那霉素的Starkey-S0液体培养基，30℃培养6天。
所述以X-gal作为底物，对A.thiooxidans单交换子进行蓝色菌落验证优选向卡那霉素抗性平板上的单菌落表面滴加1.0uL的12mg/mL的无菌X-gal溶液，30℃孵育30min。
所述诱导质粒优选插入I-SceI基因的广泛宿主范围特性质粒pJRD215。
所述含诱导质粒的供体菌与受体菌A.thiooxidans单交换子的接合培养条件优选30℃，60h，筛选导入诱导质粒的A.thiooxidanss接合转移子优选含100μg/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板，30℃培养12天。
所述以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛优选挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含300ug/mL链霉素的Starkey-S0液体培养基中，30℃培养6天，按7%的接种量转接20mL上述液体培养基中，30℃培养6天，取菌液稀释后涂布已涂布100uL的12mg/mL X-gal的含100ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，30℃培养12天，获得发生第二次同源重组的白色双交换子。
所述获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株优选通过不加链霉素的Starkey-S0液体培养30℃培养6天和Starkey-Na2S2O3固体平板30℃培养12天，连续转接4次传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株。
本发明针对A.thiooxidans中尚未建立无标记基因敲除技术以及嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除技术中存在筛选效率低和工作量大的问题，提出了一种A.thiooxidans无标记基因敲除方法和利用β-半乳糖苷酶蓝白筛选高效筛选A.thiooxidans无标记基因敲除菌株的方法。本发明在国际上率先将无标记基因敲除技术应用于A.thiooxidans，尤其率先将基于β-半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法应用于A.thiooxidans无标记基因敲除方法中，实现了通过菌落颜色简便、快捷筛选双交换子的目的，克服了嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除流程中因缺少选择压力造成的双交换子筛选困难这一瓶颈，从而大大缩短了双交换子筛选的时间、提高了双交换子筛选的效率、减少了筛选的成本。本发明建立的无标记基因敲除技术第一次同源重组的频率为2.46±1.21×10-7；转接2次后发生第二次同源重组的频率为1.21±0.3×10-2。
本发明能快速、稳定、高效地敲除A.thiooxidans的基因，尤其能利用β-半乳糖苷酶蓝白筛选高效筛选A.thiooxidans基因敲除突变菌株，为A.thiooxidans中未知基因功能的研究和代谢途径中关键酶作用机制的探索提供了便利，由于所得突变株不携带任何抗生素抗性基因，可适合该菌株多基因的敲除和遗传改造研究，为今后深入研究A.thiooxidans，构建高效浸矿A.thiooxidans基因工程菌安全地用于大规模工业生产提供了新途径。
附图说明
图1为用于基因敲除的敲除质粒骨架pZK19的结构示意图。
图2为A.thiooxidans多铜氧化酶基因（cueO）敲除流程图。
图3为含有酵母核酸内切酶I-SceI基因的诱导质粒pJRD215-I-SceI的结构示意图。
图4为利用β-半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法筛选获得白色A.thiooxidans双交换子。
图5为A.thiooxidans cueO基因敲除菌株的PCR验证图。
图中：M,Tans2K PlusII DNA Marker,从上到下大小依次为8,000bp、5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,000bp、750bp、500bp；W，野生型A.thiooxidans基因组DNA为模板，扩增片段大小为3.86kb；S，A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子基因组DNA为模板，扩增片段大小为2.7kb；D，A.thiooxidans cueO基因敲除菌基因组DNA为模板，扩增片段大小为11.4kb；引物是CueOoutF和CueOoutR。
图6为A.thiooxidans cueR基因敲除流程图。
图7为A.thiooxidans copA基因敲除流程图。
具体实施方式
一般性说明：
本发明所用极端嗜酸性氧化硫硫杆菌标准菌株A.thiooxidans ATCC19377购自ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心)。所述质粒pKIT来源见Wang H,Liu X,Liu S,Yu Y,Lin J,Lin J,Pang X,Zhao J.Appl.Environ.Microbiol.，2012,Vol.78,No.6,1826-1835。所述质粒pUC19RP12的来源见Gyorgy Posfai,Vitaliy Kolisnychenko,Zsuzsa Bereczki,Frederick R Blattner.NucleicAcids Research,1999,27:4409～4415。所述质粒pJRD215来源见Davison J,Heusterspreute M,Chevalier M,Ha-Thi V,Brunel F.Gene,1987,Vol.51,No.2-3,275-280。所述质粒pUC19购自上海生工生物工程技术有限公司。所述大肠杆菌菌株JM109和K12购自TaKaRa公司。所述大肠杆菌菌株S17-1λpir购自济南鑫兴生物科技有限公司。所用琼脂糖凝胶回收试剂盒GelExtraction Kit、质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I和细菌基因组提取试剂盒Bacterial DNA Kit均购自Omega生物技术有限公司。所用DNA聚合酶rTaq DNA Polymerase和PrimerSTARHS DNA Polymerase购自TAKARA公司，TranStart FastPfu DNA Polymerase和TranFast TaqDNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司。所用限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购自TAKARA公司。所用X-gal购自上海生工生物工程技术有限公司。Tans2K PlusII Marker购自北京全式金生物技术有限公司。
实施例1：极端嗜酸性氧化硫硫杆菌多铜氧化酶基因（cueO）的无标记敲除
1．敲除质粒骨架pZK19的构建
（1）质粒pK19的构建
根据质粒pUC19的序列信息设计引物扩增其复制原点oriColE1部分：
19F：5′-CAGCGAGCTCGGGATAACGCAGGAAAGA-3′
19R：5′-CAAAGGGCCCTAATAGACTGGATGGAGGCG-3′
引物19F的5’端加入Sac I酶切位点，引物19R的5’端加入Apa I酶切位点。两引物以质粒pUC19为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增获得带有pUC19oriColE1的片段。PCR反应体系(25uL)组成如下：5×PrimerSTAR Buffer(Mg2+plus)5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物19F(10uM)0.25uL；引物19R(10uM)0.25uL；质粒pUC19模板0.25uL；PrimerSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/uL)0.25uL；水17uL。
PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸1min10s，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增产物大小为1.11kb。
根据质粒pKIT的序列信息设计引物扩增其多克隆位点MCS、接合转移元件oriT、卡那霉素抗性基因Kmr及酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点部分：
KITF：5′-ATACGAGCTCCACCGCGGTG-3′
KITR：5′-CGCGGGGCCCCGATCTCAAGAAGATCATC-3′
引物KITF5’端加入Sac I酶切位点，引物KITR5’端加入Apa I酶切位点。两引物以质粒pKIT为模板，通过PCR扩增获得带有pKIT的多克隆位点MCS、接合转移元件oriT、卡那霉素抗性基因Kmr及酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点的片段。PCR反应体系(25uL)组成如下：5×PrimerSTAR Buffer(Mg2+plus)5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物KITF(10uM)0.25uL；引物KITR(10uM)0.25uL；质粒pKIT模板0.25uL；PrimerSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/uL)0.25uL；水17uL。PCR反应条件同上，扩增产物大小为1.52kb。
将以上两种PCR扩增产物分别用琼脂糖凝胶分离后，用Gel Extraction Kit纯化回收，再用Sac I和Apa I两种限制性内切酶进行酶切，用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得2.6kb的中间质粒pK19。
（2）敲除质粒骨架pZK19的构建
根据NCBI上E.coli K12MG1655基因组中β-半乳糖苷酶基因（lacZ）序列信息，设计该基因上、下游引物扩增lacZ基因：
lacZ-F：5′-TTAGGTACCCATTAGGCACCCCAGGCT-3′
lacZ-R：5′-GGTAGGTACCGCGAAATACGGGCAGACAT-3′
在两引物的5’端都加入了Kpn I酶切位点，以E.coli K12的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得带有lacZ基因的片段。PCR反应体系（25uL）组成如下：5×TranStart FastPfuBuffer5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物lacZ-F(10uM)0.5uL；引物lacZ-R(10uM)0.5uL；E.coli K12基因组DNA模板1uL；5×PCR Stimulant2.5uL；TranStart FastPfu DNAPolymerase0.5uL；水13uL。
PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min40s，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增产物大小为3.17kb。
将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶分离后用Gel Extraction Kit纯化回收，用Kpn I限制性内切酶进行酶切，同时将中间质粒pK19也用Kpn I酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得5.77kb的敲除质粒骨架pZK19（图1）。
2．A.thiooxidans多铜氧化酶基因（cueO）敲除质粒pZKC19的构建
A.thiooxidans多铜氧化酶基因（cueO）敲除流程图见图2。
根据NCBI上公布的A.thiooxidans标准菌株ATCC19377的基因组序列信息，设计引物分别扩增cueO基因上、下游部分片段作为敲除该基因的上、下游同源臂：
CUHF：5′-GAGAAGCTTGAAGATGCCATTCACTCCG-3′
CUHR：5′-ATAAGGATCCCAGTGGGTGGTTGTGCTCT-3′
CDHF：5′-GACGGATCCATCATTGCCACATGCTGGAACAC-3′
CDHR：5′-GATTCTAGATACAGTTTAATCCAGCCTATGCAGC-3′
在引物CUHF的5’端加入Hind III酶切位点，在引物CUHR和CDHF的5’端加入BamHI酶切位点，在引物CDHR的5’端加入Xba I酶切位点。引物对CUHF/CUHR和CDHF/CDHR，分别以A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于敲除cueO基因的上、下游同源臂片段。PCR反应体系(25uL)组成如下：5×PrimerSTAR Buffer(Mg2+plus)5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物对CUHF/CUHR或CDHF/CDHR(10uM)各0.25uL；A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA模板0.25uL；PrimerSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/uL)0.25uL；水17uL。
PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，58℃(引物对CUHF/CUHR)或55℃(引物对CDHF/CDHR)退火10s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增的上、下游同源臂产物大小都为0.93kb。
将以上PCR产物用Gel Extraction Kit纯化后，上游同源臂片段用Hind III和BamH I酶切，同时质粒pZK19也用这两种酶进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coliJM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19-CUH。然后将下游同源臂用BamH I和Xba I酶切，同时将重组质粒pZK19-CUH也用BamH I和Xba I酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得cueO基因敲除质粒pZKC19。
3．A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子的获得
（1）质粒pZKC19导入A.thiooxidans ATCC19377
将质粒pZKC19转化E.coli S17-1λpir，E.coli S17-1λpir(pZKC19)作为接合转移供体菌，野生型A.thiooxidans ATCC19377作为接合转移受体菌。将受体菌培养在Starkey-S0液体培养基中，30℃，180rpm，6天至对数后期，3,000rpm离心30s去除硫粉，10,000rpm离心2min收集菌体；供体菌37℃，150rpm培养4h至对数中期，8,000rpm离心1min收集菌体。收集的菌体分别用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液洗涤两次，按供体菌:受体菌1:1.5的比例混匀,涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培养基平板的0.22um滤膜上，30℃培养7天。
用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的接合菌液洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含100ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板上，30℃培养12天，平板上长出单菌落。
（2）发生第一次同源重组的A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子的验证
发生第一次同源重组的A.thiooxidans单交换子染色体上含有来自质粒pZKC19的卡那霉素抗性基因，因此在含100ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板上长出的单菌落即是A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子。
向平板上的单菌落表面滴加1.0uL浓度为12mg/mL的无菌X-gal溶液，30℃孵育30min，菌落呈蓝色。挑取蓝色菌落至10～20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证。分别用以下引物：
Plasmid-F：5′-CGGATTGACCGTAATGGGAT-3′
CueOinR：5′-CATTGATGAGAAAGCGGTTACC-3′
验证I型单交换子，PCR扩增产物大小为2.05kb（图2）。
CueOinF：5′-GCACGGAAATCTGGGAAGTC-3′
Plasmid-R：5′-CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3′
验证II型单交换子，PCR扩增产物大小为1.59kb（图2）。
PCR反应体系(25uL)组成如下：10×PCR Buffer(Mg2+plus)2.5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物对Plasmid-F/CueOinR或CueOinF/Plasmid-R(10uM)各0.3uL；菌液模板1uL；rTaq DNA Polymerase(5U/uL)0.125uL；水18.775uL。
PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。
根据计数抗性平板上的单菌落数，获得质粒pZKC19转入A.thiooxidans ATCC19377并整合在其染色体上的接合转移频率，即第一次同源重组的频率约为2.46±1.21×10-7。
4．诱导质粒pJRD215-I-SceI的构建
用EcoR I和Sal I酶切质粒pUC19RP12，琼脂糖凝胶电泳分离后用Gel Extraction Kit纯化回收0.82kb的条带，该片段含有酵母核酸内切酶I-SceI基因，与同样经EcoR I和Sal I酶切的质粒pJRD215连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pJRD215-I-SceI，见图3。
5．A.thiooxidans cueO基因敲除突变株的获得
（1）质粒pJRD215-I-SceI导入A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子
将质粒pJRD215-I-SceI转化E.coli S17-1λpir，E.coli S17-1λpir(pJRD215-I-SceI)作为接合转移供体菌，A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子作为接合转移受体菌。受体菌培养在Starkey-S0液体培养基中，30℃，180rpm，6天至对数后期，3,000rpm离心30s去除硫粉，10,000rpm离心2min收集菌体；供体菌37℃，150rpm培养4h至对数中期，8,000rpm离心1min收集菌体。将收集的菌体分别用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液洗涤两次，按供体菌:受体菌1:1.5的比例混匀,涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培养基平板的0.22um滤膜上，30℃培养60h。
用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的接合菌液洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含100ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板上，30℃培养12天，平板上长出单菌落。
（2）发生第二次同源重组的A.thiooxidans cueO基因敲除突变株的初筛和验证
诱导质粒上携带链霉素抗性基因，在链霉素培养基平板上长出的单菌落是导入了诱导质粒的接合转移子，诱导质粒上的I-SceI基因表达产生酵母核酸内切酶I-SceI，诱导发生第二次同源重组，同时交换下来整合在染色体上的lacZ基因和卡那霉素抗性基因。所以，双交换子没有β-半乳糖苷酶活性，也失去了卡那霉素抗性选择压力。
挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含300ug/mL链霉素的Starkey-S0液体培养基中，30℃培养6天，按7%的接种量转接至20mL上述液体培养基中，30℃培养6天，取菌液稀释后涂布已涂布100uL12mg/mL X-gal的含100ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，30℃培养12天，白色菌落即是发生了第二次同源重组的双交换子（图4）。传代2次后发生第二次同源重组的频率为1.21±0.3×10-2。
双交换子中包括回复为野生型和cueO基因敲除突变株两种类型（原理见图2），挑取初筛为双交换子的白色菌落至10～20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证cueO基因敲除突变株（图5）。用以下引物：
CueOoutF：5′-CCCTTCATTTCCGTTCATCTG-3′
CueOoutR：5′-ACGGATTTCCTGAAGAACCC-3′
PCR反应体系(25uL)组成如下：10×TransFast Taq Buffer2.5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物CueOoutF(10uM)0.25uL引物CueOoutR(10uM)0.25uL；菌液模板1uL；TansFastTaq DNA Polymerase(2.5U/uL)0.25uL；水18.75uL。
PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性5s，56℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。
PCR扩增产物大小：cueO基因敲除突变株为2.7kb，野生菌菌株为3.86kb（图5）。
（2）A.thiooxidans cueO基因敲除突变株中诱导质粒的丢失
将PCR扩增验证正确的cueO基因敲除突变株稀释后涂布不含抗生素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，30℃培养12天，挑取平板上的单菌落接种到20mL Starkey-S0液体培养基中，30℃培养6天，再继续如上转接4次连续传代培养，挑取单菌落至10～20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证质粒丢失。用以下引物：
SceIF：5′-GGTCCGAACTCTAAACTGCTG-3′
SceIR：5′-GGGATCAGGTACGGTTTGATC-3′
PCR反应体系(25uL)组成如下：10×PCR Buffer(Mg2+plus)2.5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物SceIF(10uM)0.25uL引物SceIR(10uM)0.25uL；菌液模板1uL；rTaq DNAPolymerase(5U/ul)0.125uL；水18.875uL。
PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，30
个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增诱导质粒上I-SceI基因片段，产物大小为0.62kb，电泳检测若无该扩增条带，则证明质粒已丢失。获得质粒丢失的A.thiooxidanscueO基因敲除突变株。
实施例2：嗜酸性氧化硫硫杆菌MerR家族调控蛋白基因（cueR）的无标记敲除
1．A.thiooxidans cueR基因敲除质粒的构建
A.thiooxidans cueR基因敲除流程图见图6。敲除质粒骨架pZK19的构建同实施例1（略）。
根据NCBI上公布的A.thiooxidans标准菌株ATCC19377的基因组序列信息，设计引物分别扩增cueR基因上、下游部分片段作为敲除该基因的上、下游同源臂：
RUHF：5′-AAGTCGACCGTGCGTGATGTGGGTTAT-3′
RUHR：5′-CCAAGCTTGACTGAATTTTCACGCTCC-3′
RDHF：5′-CCAAGCTTTGGGATGTGAGTCGGGATC-3′
RDHR：5′-TTTCTAGAGGGTCACCAGCGCGGGAAC-3′
在引物RUHF的5’端加入Sal I酶切位点，在引物RUHR和RDHF的5’端加入Hind III酶切位点，在引物RDHR的5’端加入Xba I酶切位点。引物对RUHF/RUHR和RDHF/RDHR，分别以A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于敲除cueR基因的上、下游同源臂片段。PCR反应体系(25uL)组成如下：5×PrimerSTAR Buffer(Mg2+plus)5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物对RUHF/RUHR或RDHF/RDHR(10uM)各0.25uL；A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA模板0.25uL；PrimerSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/uL)0.25uL；水17uL。
PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，59℃退火10s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增的上、下游同源臂产物大小都为0.93kb。
将以上PCR产物用Gel Extraction Kit纯化后，上游同源臂片段用Sal I和Hind III酶切，同时质粒pZK19也用这两种酶进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coliJM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19-RUH。然后将下游同源臂用Hind III和Xba I酶切，同时将重组质粒pZK19-RUH也用Hind III和Xba I酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得cueR基因敲除质粒pZKR19（图6）。
2．A.thiooxidans cueR基因敲除单交换子的获得
（1）质粒pZKR19导入A.thiooxidans ATCC19377
将质粒pZKR19转化E.coli S17-1λpir，E.coli S17-1λpir(pZKR19)作为接合转移供体菌，野生型A.thiooxidans ATCC19377作为接合转移受体菌。接合转移子的获得与实施例1相同（略）。
（2）发生第一次同源重组的A.thiooxidans cueR基因敲除单交换子的验证
发生第一次同源重组的A.thiooxidans cueR基因敲除单交换子的验证同实施例1（略），其中设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证的引物如下：
Plasmid-F：5′-CGGATTGACCGTAATGGGAT-3′（同实施例1）
CueRinR：5′-GTCAGGGAAAAACCCAGATTC-3′
验证I型单交换子，PCR扩增产物大小为1.87kb（图6）。
CueRinF：5′-CGGCCATGGTTCAGTAGAC-3′
Plasmid-R：5′-CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3′（同实施例1）
验证II型单交换子，PCR扩增产物大小为1.46kb（图6）。
3．A.thiooxidans cueR基因敲除突变株的获得
诱导质粒pJRD215-I-SceI的构建、诱导质粒pJRD215-I-SceI转入A.thiooxidans cueR基因敲除单交换子、使用基于β-半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法初筛发生了第二次同源重组的双交换子等原理与操作与实施例1相同（略）。
双交换子中包括回复为野生型和cueR基因敲除突变株两种类型，挑取初筛为双交换子的白色菌落至10～20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证cueR基因敲除突变株。PCR反应体系的组成和PCR反应条件同实施例1（略）。其中使用的引物为：
CueRoutF：5′-CGGGGTCGCATTACTGGTT-3′
CueRoutR：5′-CTACAGCAACCAGCATTGAAGGC-3′
PCR扩增产物大小：cueR基因敲除突变株为1.15kb，野生菌菌株为1.65kb（图6）。
A.thiooxidans cueR基因敲除突变株中诱导质粒的丢失操作及验证与实施例1相同（略）。
实施例3：嗜酸性氧化硫硫杆菌copA基因的无标记敲除
1．A.thiooxidans copA基因敲除质粒的构建
A.thiooxidans copA基因敲除流程图见图7。敲除质粒骨架pZK19的构建见实施例1（略）。
根据NCBI上公布的A.thiooxidans标准菌株ATCC19377的基因组序列信息，设计引物分别扩增copA基因上、下游部分片段作为敲除该基因的上、下游同源臂：
AUHF：5′-TATGTCGACCGATCCAGTGCCATTTCCAG-3′
AUHR：5′-GTGAAGCTTCTGCAGGAAGCACAGGTCATC-3′
ADHF：5′-CTCAAGCTTCGTTTGAAGTGGCTGCGTC-3′
ADHR：5′-CTTTCTAGAAGCCAGGTTGCCAGACCATC-3′
在引物AUHF的5’端加入Sal I酶切位点，在引物AUHR和ADHF的5’端加入Hind III酶切位点，在引物ADHR的5’端加入Xba I酶切位点。引物对AUHF/AUHR和ADHF/ADHR，分别以A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于敲除copA基因的上、下游同源臂片段。PCR反应体系组成及PCR反应条件与实施例2相同（略）。
上、下游同源臂片段克隆至敲除质粒骨架pZK19上获得copA基因敲除质粒pZKA19（同实施例2，略）（图7）。
2．A.thiooxidans copA基因敲除单交换子的获得
copA基因敲除质粒pZKA19导入A.thiooxidans ATCC19377获得接合转移子的操作与实施例1相同（略）。
发生第一次同源重组的A.thiooxidans copA基因敲除单交换子的筛选和验证（同实施例1，略），其中设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证的引物如下：
Plasmid-F：5′-CGGATTGACCGTAATGGGAT-3′（同实施例1）
CopAinR：5′-CTCAAATTCACGCTGGCCTG-3′
验证I型单交换子，PCR扩增产物大小为2.87kb（图7）。
CopAinF：5′-GGATTTCAGCTGAATCCCATGC-3′
Plasmid-R：5′-CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3′（同实施例1）
验证II型单交换子，PCR扩增产物大小为1.95kb（图7）。
3．A.thiooxidans copA基因敲除突变株的获得
诱导质粒pJRD215-I-SceI的构建、诱导质粒pJRD215-I-SceI转入A.thiooxidans copA基因敲除单交换子、使用基于β-半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法初筛发生了第二次同源重组的双交换子等原理与操作与实施例1相同（略）。
双交换子中包括回复为野生型和copA基因敲除突变株两种类型，挑取初筛为双交换子的白色菌落至10～20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证copA基因敲除突变株。PCR反应体系的组成和PCR反应条件同实施例1（略）。其中使用的引物为：
CopAoutF：5′-CGATATGCCGGTCTTGAAAC-3′
CopAoutR：5′-CGTAAAATGGTGACATCACTGC-3′
PCR扩增产物大小：copA基因敲除突变株为3.15kb，野生菌菌株为5.51kb（图7）。
A.thiooxidans copA基因敲除突变株中诱导质粒的丢失操作及验证与实施例1相同（略）。
以上具体描述了本发明技术方案的操作实例，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件的等同替换，均在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，步骤包括：
(1)构建含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点、oriColE1复制原点、能进行接合转移的敲除质粒骨架，其中所述构建含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点、oriColE1复制原点、能进行接合转移的敲除质粒骨架的方法是：选择含有卡那霉素抗性基因、含有多克隆位点MCS便于同源臂的插入、含有接合转移元件oriT区便于通过接合转移进入A.thiooxidans细胞、含有18bp的酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点便于诱发第二次同源重组、含有oriColE1复制原点、不能在A.thiooxidans中自主复制的大肠杆菌质粒，插入大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ获得敲除质粒骨架；
(2)分别选择目标敲除基因上、下游长度为0.5～2.0kb的同源序列作为上、下游同源臂，设计引物进行PCR扩增，经限制性内切酶酶切后，按照在基因组上的方向分别克隆到敲除质粒骨架的多克隆位点中，构建目标基因的敲除质粒；
(3)将目标基因的敲除质粒转化具有接合转移功能的E.coli S17-1λpir作为供体菌，分别收集培养至对数中期的供体菌细胞和对数后期的A.thiooxidans受体菌细胞，按照供体菌:受体菌为1:1～1:2的比例混匀，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培养基平板的滤膜上，28～32℃培养5～9天，用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含80～150μg/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板上，28～32℃培养10～15天，获得具有卡那霉素抗性的接合转移子即A.thiooxidans单交换子；
(4)以X-gal作为底物，对单交换子进行蓝色菌落验证，进一步设计引物对蓝色菌落的单交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证，证明单交换子发生了第一次同源重组使目标基因的敲除质粒整合到受体菌染色体上；
(5)构建含有酵母核酸内切酶I-SceI基因、链霉素抗性基因以及接合转移功能的广泛宿主范围特性的质粒，作为诱导质粒，其中所述构建含有酵母核酸内切酶I-SceI基因、链霉素抗性基因以及接合转移功能的广泛宿主范围特性的质粒，作为诱导质粒的方法是：选择具有广泛宿主范围特性的复制原点、能在E.coli和A.thiooxidans中均能自主稳定复制、拷贝数相对较高、携带链霉素抗性基因和接合转移元件oriT区的质粒；导入酵母核酸内切酶I-SceI基因，构成携带I-SceI基因的诱导质粒；
(6)将诱导质粒转化具有接合转移功能的E.coli S17-1λpir作为供体菌，以A.thiooxidans单交换子作为受体菌，分别收集培养至对数中期的供体菌细胞和对数后期的受体菌细胞，按照供体菌:受体菌为1:1～1:2的比例混匀，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培养基平板的滤膜上，28～32℃培养48～72h后，用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含80～150μg/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板上,28～32℃培养10～15天，获得导入诱导质粒的接合转移子；
(7)以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛，进一步设计引物对白色菌落的双交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳筛选验证，获得发生第二次同源重组且实现目标基因敲除的A.thiooxidans突变株；
(8)对验证的目标基因敲除突变株在不添加抗生素的无选择压力条件下转接3～5次连续传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株，其中所述对验证的目标基因敲除突变株在不添加抗生素的无选择压力条件下转接3～5次连续传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株的方法是：将验证的目标基因敲除突变株稀释后涂布Starkey-Na2S2O3培养基平板，28～32℃培养10～15天，挑取平板上的单菌落接种到20mL Starkey-S0液体培养基中，28～32℃培养5～7天；再继续如上转接3～5次连续传代培养，挑取单菌落至10～20uL无菌水中，取0.5～1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证质粒丢失；
上述Starkey-Na2S2O3无机盐溶液配方为：(NH4)2SO46.0g/L，KH2PO26.0g/L，MgSO4﹒7H2O1.0g/L，CaCl2﹒2H2O0.5g/L，pH4.8，121℃灭菌20min；
上述Starkey-Na2S2O3固体培养基配方为：A液：(NH4)2SO40.6g，KH2PO20.6g，MgSO4﹒7H2O1.0g，CaCl2﹒2H2O0.05g，蒸馏水100mL，pH4.8，121℃灭菌20min；B液：琼脂粉2g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；C液：Na2S2O32.0g，FeSO4﹒7H2O0.006g溶解至10mL蒸馏水中，过滤除菌；A液和B液高压灭菌后冷却至80℃混合，再加入C液混合，制备固体平板；
上述Starkey-Na2S2O3固体接合培养基配方为：在上述Starkey-Na2S2O3固体培养基配方A液中加入0.05％酵母粉；
上述Starkey-S0液体培养基配方为：(NH4)2SO42.0g/L，KH2PO23.0g/L，MgSO4﹒7H2O0.5g/L，CaCl2﹒2H2O0.25g/L，FeSO4﹒7H2O0.01g/L，浓H2SO4调节至pH2.5，121℃灭菌20min；硫粉放入试剂瓶中密闭，煮沸3h灭菌，接种后按10g/L加入培养基中；
其特征是：
步骤(4)所述以X-gal作为底物，对单交换子进行蓝色菌落验证，进一步设计引物对蓝色菌落的单交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证，证明单交换子发生了第一次同源重组使目标基因的敲除质粒整合到受体菌染色体上的方法是：将1μL的12mg/mL无菌X-gal溶液，滴加到卡那霉素抗性平板上的单菌落表面，30℃放置30min，挑取蓝色菌落至10～20μL无菌水中，取0.5～1.5μL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证；将验证正确的菌液接种到20mL含250～400μg/mL卡那霉素的Starkey-S0液体培养基中，28～35℃培养5～7天后转接到100mL含250～400μg/mL卡那霉素的Starkey-S0液体培养基中，28～32℃培养5～7天；
步骤(7)所述以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛，进一步设计引物对白色菌落的双交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳筛选验证，获得发生第二次同源重组且实现目标基因敲除的A.thiooxidans突变株的方法是：挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含250～400μg/mL链霉素的Starkey-S0液体培养基中，28～32℃培养5～7天，按5～10％的接种量转接20mL上述液体培养基中，28～32℃培养5～7天，取菌液稀释后涂布已涂布80～150μL的5～20mg/mL X-gal的含80～150μg/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，28～32℃培养10～15天，挑取白色菌落至10～20μL无菌水中，取0.5～1.5μL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证发生了双交换的突变株；将验证的突变株菌液接种到20mL Starkey-S0液体培养基中，28～32℃培养5～7天，获得发生第二次同源重组且实现目标基因敲除的A.thiooxidans突变株。
2.根据权利要求1所述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，其特征是：步骤(7)所述以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛选挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含300μg/mL链霉素的Starkey-S0液体培养基中，30℃培养6天，按7％的接种量转接20mL上述液体培养基中，30℃培养6天，取菌液稀释后涂布已涂布100μL的12mg/mL X-gal的含100μg/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，30℃培养12天，获得发生第二次同源重组的白色双交换子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310029904.2A CN103232994B (zh) | 2013-01-25 | 2013-01-25 | 一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310029904.2A CN103232994B (zh) | 2013-01-25 | 2013-01-25 | 一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103232994A CN103232994A (zh) | 2013-08-07 |
| CN103232994B true CN103232994B (zh) | 2015-01-28 |
Family
ID=48881061
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310029904.2A Active CN103232994B (zh) | 2013-01-25 | 2013-01-25 | 一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103232994B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103898140B (zh) * | 2014-04-14 | 2017-03-22 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种简便高效的基因编辑方法 |
| CN104017766B (zh) * | 2014-06-17 | 2016-07-06 | 山东大学 | 一株嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌及其应用 |
| CN115772552A (zh) * | 2022-08-02 | 2023-03-10 | 内蒙古农业大学 | 一种高效的利用蓝斑筛选的基因敲除方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102260699A (zh) * | 2011-07-06 | 2011-11-30 | 山东大学 | 极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法 |
| CN102604929A (zh) * | 2012-03-29 | 2012-07-25 | 山东大学 | 嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法 |
-
2013
- 2013-01-25 CN CN201310029904.2A patent/CN103232994B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102260699A (zh) * | 2011-07-06 | 2011-11-30 | 山东大学 | 极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法 |
| CN102604929A (zh) * | 2012-03-29 | 2012-07-25 | 山东大学 | 嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 副溶血弧菌LacZ报告基因融合实验方法的建立与应用;杜德艳等;《生物技术通讯》;20120731;第23卷(第4期);摘要部分 * |
| 极端嗜酸性专性化能自养硫细菌有机质代谢的研究进展;刘相梅等;《生物工程学报》;20080125;第24卷(第1期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103232994A (zh) | 2013-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105671070B (zh) | 一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法 | |
| CN105543193A (zh) | 一种n-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌 | |
| CN104087610A (zh) | 穿梭质粒载体及其构建方法和应用 | |
| CN113881586B (zh) | 耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株及构建方法和应用 | |
| CN106755037A (zh) | 一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I‑B‑sv14型CAS基因编辑系统 | |
| CN102260699B (zh) | 极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法 | |
| CN109706148A (zh) | 一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、gRNA组合物以及电转方法 | |
| CN103232994B (zh) | 一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法 | |
| CN105296534B (zh) | 黑果枸杞遗传转化体系建立的方法及其应用 | |
| CN103131718B (zh) | 来源产甘油假丝酵母新型耐高渗功能基因CgHog1的克隆及其应用 | |
| WO2020134427A1 (zh) | sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用 | |
| CN105002129B (zh) | 高接合转移率的希瓦氏菌wp3菌株及其构建方法和应用 | |
| CN107686845A (zh) | 一种水稻高效转化载体pCXUN‑Cas9‑sgRNA及其构建方法 | |
| CN109371048A (zh) | 一种利用CRISPRCas9技术敲除大肠杆菌中多粘菌素耐药基因mcr-1的方法 | |
| CN110106191A (zh) | 人工合成的透明颤菌血红蛋白基因及相应工程菌株和应用 | |
| Kujoth et al. | Gene editing in dimorphic fungi using CRISPR/Cas9 | |
| CN104975043A (zh) | 构建重组mva病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体 | |
| CN109266676A (zh) | 一种电击转化暹罗芽孢杆菌的方法 | |
| CN104611285B (zh) | 一种提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法 | |
| CN104878031B (zh) | 一种海藻酸裂解酶sha-2基因及其表达载体 | |
| CN104388462B (zh) | 一种小麦转化双t超毒载体及应用 | |
| CN104017766B (zh) | 一株嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌及其应用 | |
| CN106754605B (zh) | 一种提高枯草芽孢杆菌发酵液中α‑淀粉酶活的方法 | |
| CN105602914A (zh) | 一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其应用 | |
| CN111334523A (zh) | 一种大尺度dna的体内多轮迭代组装方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |