CN104017766B - 一株嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，该菌株于2014年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.9286。本发明所述的工程菌是通过将嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的copB_Af基因整合到嗜酸性氧化硫硫杆菌的基因组上获得。本发明还公开了所述工程菌在生物浸矿中的应用。实验证实，本发明的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌较野生型嗜酸性氧化硫硫杆菌具有更高的抗铜特性，且遗传稳定，预示在铜矿的生物浸出领域具有很大的应用价值。

Description

一株嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株嗜酸性氧化硫硫杆菌及其应用，尤其涉及一株能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜工程菌及其在生物浸矿中的应用。

背景技术

嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans，A.thiooxidans)在生物浸矿、重金属污染治理和生物脱硫等领域具有十分重要的作用，但是在生物浸出和重金属污染治理过程中，尤其是在铜矿的生物浸出过程中，铜离子浓度往往很高，一般为30～90mM，有些浸矿环境中甚至高达300mM，而A.thiooxidans的铜离子最小抑制浓度(MIC)通常低于上述环境中的铜离子浓度，例如，本实验保藏的A.thiooxidansATCC19377的铜离子MIC约为25mM远低于浸矿环境中的铜离子浓度，因此限制了其应用范围。

目前，在嗜酸性硫杆菌属(Acidithiobacillussp.)中，科研工作者仅通过导入重组质粒的形式来提高或增加该属菌的某些生物特性；但是以质粒形式构建的基因工程菌稳定性差，在无抗生素压力下，工程菌中的质粒容易丢失，从而使得工程菌中某种生物特性降低甚至丧失，因此，为了提高工程菌中质粒的稳定性，必须在其生存的环境中添加抗生素；嗜酸性硫杆菌主要应用于生物浸矿、重金属污染治理等领域，向上述环境中添加抗生素一方面会对环境造成危害，另一方面价格不菲的抗生素无疑会增加工业成本，不利于该种基因工程菌的大规模应用。如果将某些具有特殊生物活性的基因通过遗传操作的方法整合到嗜酸性硫杆菌的染色体上将会克服上述弊端。经对国内外文献的检索，目前还没有任何有关通过基因整合的方法构建能够稳定遗传的嗜酸性硫杆菌基因工程菌的报道，尤其是通过基因整合的方法构建能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌高铜抗性基因工程菌的报道，基于此，构建能够稳定遗传的A.thiooxidans高抗铜基因工程菌是当下亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中对嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜能力遗传改良方法的空白，本发明的目的是提供一株能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜工程菌及其应用。

本发明所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，其特征在于：所述菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af，该菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.9286。

本发明所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌的构建方法，步骤是：

(1)从嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)ATCC23270基因组上PCR扩增含有启动子的铜离子外排P型ATPase基因copB_Af，构建到嗜酸性氧化硫硫杆菌整合型质粒pZK19-IngUH-IngDH上获得重组质粒pZK19-copB_Af，利用转化方法将该重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichiacoli)S17-1λpir中；

(2)以野生型A.thiooxidansATCC19377菌株作为受体菌，含重组质粒pZK19-copB_Af的大肠杆菌E.coliS17-1λpir作为供体菌，通过接合转移的方法将含有copB_Af基因的整合型质粒pZK19-copB_Af转入嗜酸性氧化硫硫杆菌菌株ATCC19377中；将接合菌液稀释后涂布到含150μg/mL卡那霉素的Starkey-Na₂S₂O₃固体平板上，30℃培养10天长出单菌落；将1.0μL12mg/mL的无菌X-gal溶液滴加单菌落上，生成的蓝色单菌落即是筛选获得的copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证确认；

(3)以copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株作为受体菌，含pMSD1-PTSceI质粒的E.coliSM10作为供体菌，通过接合转移的方法将诱导质粒pMSD1-PTSceI转入copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株中；将接合菌液稀释后涂布到含12mg/mLX-gal溶液和150μg/mL链霉素的Starkey-Na₂S₂O₃固体平板上，30℃培养10天获得发生第二次同源重组的白色单菌落；挑取白色菌落进行菌落PCR筛选获得A.thiooxidanscopB_Af基因整合的基因工程菌，该菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af。

本发明所述的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌在生物浸矿中的应用。

其中：嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌铜离子MIC的测定方法是：将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af菌株在Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养至对数后期(约5～7天)，按照菌浓为10⁶～10⁷个/mL的接种量将A.thiooxidanscopB_Af接种到100mL含0～100mMCuSO₄的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养；培养期间2或3天从每瓶菌中取1mL菌悬液用于测定OD₆₀₀，并绘制A.thiooxidanscopB_Af在不同铜离子浓度培养下的生长曲线，确定A.thiooxidanscopB_Af菌株的铜离子MIC。

由A.thiooxidanscopB_Af菌株的在不同铜离子浓度下的生长曲线可以看出该菌的铜离子MIC大于80mM，并且浸矿环境中的铜离子浓度通常为30-90mM，提示，该菌株的高铜抗性将有利于其在生物浸出中的应用。

其中：所述嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌用于生物浸矿的方法是：

(1)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af在铜矿粉中的驯化：将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af菌株在Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养至对数后期(约5～7天)，按照菌浓为10⁶～10⁷个/mL的接种量将A.thiooxidanscopB_Af接种到200mL含2％(W/V)黄铜矿矿粉﹙粒径＜0.20mm)和1％(W/V)硫粉的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0～6.0×10⁸个/mL；将在2％(W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidanscopB_Af接种到200mL含4％(W/V)黄铜矿矿粉和1％(W/V)硫粉的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0～6.0×10⁸个/mL；将在4％(W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidanscopB_A.f接种到200mL含5％(W/V)黄铜矿矿粉和1％(W/V)硫粉的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0～6.0×10⁸个/mL。

(2)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af生物浸矿：将上述步骤(1)中获得的适应5％(W/V)铜矿粉的A.thiooxidanscopB_Af以10⁷～10⁸个/mL接种至200mL含4g/L[Fe²⁺]，30mMCuSO₄和5％(W/V)黄铜矿矿粉的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养，另外，用含4g/L[Fe²⁺]，30mMCuSO₄和5％(W/V)黄铜矿矿粉的Starkey-S⁰液体培养基作为空白对照；在A.thiooxidanscopB_Af的生物浸矿期间，每隔5～10天取样，用原子吸收色谱测定上清液中的铜离子含量(g/L)。

本发明通过基因工程手段，将嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)ATCC23270中一个具有高排铜能力的P型铜外排ATPase的基因(copB_Af)整合到嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)ATCC19377的基因组上，获得了整合copB_Af基因的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af，该基因工程菌在铜离子浓度为80mM下的生长状况与野生型A.thiooxidansATCC19377在20mM的生长状况类似，因此，本发明的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af在铜抗性方面比野生型嗜酸性酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)ATCC19377提高了60mM。浸矿环境中的铜离子浓度通常在30～90mM，而野生型A.thiooxidansATCC193777菌株的铜离子MIC只有25mM，因此，在铜离子浓度高于25mM的浸矿环境中，野生型A.thiooxidansATCC193777菌株的生长将严重受到抑制；但是本发明所构建的A.thiooxidanscopB_Af菌株的铜离子MIC大于80mM，因此，在铜离子浓度为30～90mM的浸矿环境中，本发明的A.thiooxidanscopB_Af菌株的生长不会或很少受到抑制。这将扩大嗜酸性氧化硫硫杆菌在高铜含量金属硫化矿生物浸出中的应用范围，并且国外研究表明高抗铜菌株的生物浸出效率高于低抗铜菌株(Das,A.,Modak,J.,andNatarajan,K.A.,AntonievanLeeuwenhoek.,1998,Vol.73,No.3,215–22)，因此，本发明所构建的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af菌株应具有更高的浸矿效率，预示本申请所构建的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌A.thiooxidanscopB_Af具有巨大的应用价值。

附图说明

本发明所述嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.9286。

图1.嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af菌株PCR验证图。

其中：L，Tans2KPlusIIDNAMarker,从上到下大小依次为8.0kb、5.0kb、3.0kb、2.0kb、1.0kb、0.75kb、0.5kb、0.25kb、0.10kb；W，野生型A.thiooxidans菌株基因组DNA为模板；S，copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株基因组DNA为模板；M，嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af菌株基因组DNA为模板。所用引物对列于琼脂糖凝胶电泳图上方，依次为：IngoutF/IngoutR、InginF/InginR、copB-F/copB-R、Km-F/Km-R。

图2.嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af菌株在不同铜离子浓度下的生长曲线。

其中：培养所用铜离子浓度分别为：0mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM。

具体实施方式

一般性说明：

本发明所用嗜酸性氧化硫硫杆菌标准菌株A.thiooxidansATCC19377和嗜酸性氧化亚铁硫杆菌标准菌株A.ferrooxidansATCC23270购自ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心)；所述大肠杆菌菌株JM109购自TaKaRa公司；所述大肠杆菌菌株S17-1λpir和SM10购自济南鑫兴生物科技有限公司。所述质粒pZK19和pMSD1-PTsceI来源见QingWen,XiangmeiLiu,HuiyanWang,JianqunLin:AversatileandefficientmarkerlessgenedisruptionsystemforAcidithiobacillusthiooxidans:applicationforcharacterizingacoppertolerancerelatedmulticopperoxidasegene.EnvironmentalMicrobiology,DOI:10.1111/1462-2920.12494。所述pUC19质粒和X-gal购自上海生工生物工程技术有限公司。Tans2KPlusIIMarker购自北京全式金生物技术有限公司。所用质粒提取试剂盒PlasmidMiniKitI、琼脂糖凝胶回收试剂盒GelExtractionKit和细菌基因组提取试剂盒BacterialDNAKit均购自Omega生物技术有限公司。所用PrimerSTARHSDNAPolymeraseDNA聚合酶和rTaqDNAPolymerase购自TAKARA公司，TranFastTaqDNAPolymerase购自北京全式金生物技术有限公司。所用限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购自TAKARA公司。

所用Starkey-Na₂S₂O₃无机盐溶液配方为：6.0g/LKH₂PO₂，6.0g/L(NH₄)₂SO₄，1.0g/LMgSO₄﹒7H₂O，0.5g/LCaCl₂﹒2H₂O，浓硫酸调节至pH4.8，121℃高压灭菌20min。

所用Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基配方为：A液：0.6gKH₂PO₂，0.6g(NH₄)₂SO₄，1.0gMgSO₄﹒7H₂O，0.05gCaCl₂﹒2H₂O，蒸馏水100mL，浓硫酸调节至pH4.8，121℃灭菌20min；B液：2g琼脂粉，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；C液：2.0gNa₂S₂O₃，0.006gFeSO₄﹒7H₂O溶解至10mL蒸馏水中，过滤除菌；A液和B液高压灭菌后冷却至80℃混合，再加入C液混合，制备固体平板。

所用Starkey-Na₂S₂O₃固体接合培养基配方为：在上述Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基配方A液中加入0.05％酵母粉。

所用Starkey-S⁰液体培养基配方为：3.0g/LKH₂PO₂，2.0g/L(NH₄)₂SO₄，0.5g/LMgSO₄﹒7H₂O，0.01g/LFeSO₄﹒7H₂O，0.25g/LCaCl₂﹒2H₂O，浓硫酸调节至pH2.5，121℃高压灭菌20min；硫粉放入试剂瓶中密闭，煮沸3h灭菌，接种后按10g/L加入培养基中。

实施例1：抗铜基因copB_Af整合质粒pZK19-copB_Af的构建及鉴定

1.构建用于A.thiooxidansATCC19377基因整合的质粒骨架pZK19-IngUH-IngDH

在A.thiooxidansATCC19377的基因组上选取转录方向相反的两个基因的间隔区域作为外源基因插入的位点；设计引物扩增插入位点上、下游约1.0kb的片段作为同源重组的同源臂：

IngUHF：5’-CTGTCGACGGGGATAGATGACATTC-3’

IngUHR：5’-GTAAGCTTGCCTGATCAGCTCACGGT-3’

IngDHF：5’-TTATGGATCCGGCTTCAGGCATCGCCGT-3’

IngDHR：5’-GGCGCTCTAGACTCTTAATGGTCCTATTCCGAG-3’

在引物IngUHF的5’端加入SalI酶切位点，在引物IngUHR的5’端加入HindIII酶切位点，在引物IngDHF的5’端加入BamHI酶切位点,在引物IngDHR的5’端加入XbaI酶切位点。引物对IngUHF/IngUHR和IngDHF/IngDHR，分别以A.thiooxidansATCC19377基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于基因整合的上、下游同源臂片段。

PCR反应体系(25μL)组成如下：5×PrimerSTARBuffer(Mg²⁺plus)5μL；dNTPMixture(各2.5mM)2μL；引物IngUHF/IngUHR或IngDHF/IngDHR(10μM)各0.25μL；A.thiooxidansATCC19377基因组DNA模板0.25μL；PrimerSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL)0.25μL；水18μL。

PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增产物大小：IngUHF/IngUHR引物对为997bp，IngDHF/IngDHR引物对为985bp。

将以上PCR产物用GelExtractionKit纯化后，IngUHF/IngUHR引物对的扩增产物用SalI和HindIII酶切，同时将质粒pZK19用相同的内切酶酶切，将酶切产物过柱纯化后用T4DNA连接酶连接，转化E.coliJM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19-IngUH。然后将IngDHF/IngDHR引物对的扩增产物用BamHI和XbaI酶切，同时将重组质粒pZK19-IngUH用相同的内切酶酶切，将酶切产物过柱纯化后用T4DNA连接酶连接，转化E.coliJM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19-IngUH-IngDH，该重组质粒用于后续A.thiooxidansATCC19377中基因整合的质粒骨架。

2.构建用于copB_Af基因整合的重组质粒pZK19-copB_Af

设计引物扩增嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)ATCC23270基因组上基因编号为AFE_2021的基因，该基因功能注释为：copper-translocatingP-typeATPase：

2021-F：5’…CTAAGCTTGTACTCCGGGGTGTCGAAATC…3’

2021-R：5’…CTAAGCTTCAGCCCCTCCACAAAAGCCTTC…3’

在2021-F引物和2021-R引物的5’端均引入HindIII酶切位点，引物对2021-F/2021-R以A.ferrooxidansATCC23270基因组DNA为模板，通过PCR获得copB_Af基因片段。

PCR反应体系(25μL)组成如下：5×PrimerSTARBuffer(Mg²⁺plus)5μL；dNTPMixture(各2.5mM)2μL；引物IngUHF/IngUHR或IngDHF/IngDHR(10μM)各0.25μL；A.ferrooxidansATCC23270基因组DNA模板0.25μL；PrimerSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL)0.25μL；水18μL。

PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增产物大小为3.03kb。

将以上PCR产物用GelExtractionKit纯化，经HindIII酶切后，连入同样经HindIII酶切的A.thiooxidansATCC19377基因整合质粒骨架pZK19-IngUH-IngDH中，获得携带copB_Af基因的整合型重组质粒pZK19-copB_Af。然后将该质粒转化可进行接合转移的E.coliS17-1λpir中。

实施例2：嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌的构建及鉴定

1.构建copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株

分别收集对数中期的大肠杆S17-1λpir(pZK19-copB_Af)作为供体菌和对数后期的嗜酸性氧化硫硫杆菌ATCC19377作为受体菌，并按照供体菌：受体菌为1:1.5的比例混匀,涂在放置于Starkey-Na₂S₂O₃接合培养基平板的0.22um滤膜上，30℃培养7天；用Starkey-Na₂S₂O₃无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，并涂布到含有150μg/mL卡那霉素的Starkey-Na₂S₂O₃固体平板上，30℃培养12天；然后将1.0μL的12mg/mL的无菌X-gal溶液滴加到上述单菌落上，30℃放置30min后挑取蓝色菌落进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证，从而获得copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株，所用引物如下：

InginF：5’-GCTGGAAAGACACCTTGCTG-3’

InginR：5’-CTACAGTTTCGGGGTGTGGAC-3’

copB-F：5’-CGGATACCGTGGATCAAAACAC-3’

copB-R：5’-GTCTGCTGCAAATCGCCAGTG-3’

Km-F：5’-GAACAAGATGGATTGCACGCAG-3’

Km-R：5’-GAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3’

(1)引物对InginF/InginR的PCR反应体系(25μL)组成如下:10×TransFastTaqBuffer2.5μL；dNTPMixture(各2.5mM)2μL；引物对InginF/InginR(10μM)各0.25μL；菌液模板1μL；TansFastTaqDNAPolymerase(2.5U/μL)0.25μL；水19μL。

引物对InginF/InginR的PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸1min，33个循环后72℃延伸5min，4℃保存。

引物对InginF/InginR扩增产物大小：野生型A.thiooxidansATCC19377菌株为0.35kb，copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株为3.3kb和0.35kb，见图1。

(2)引物对copB-F/copB-R的PCR反应体系(25μL)组成如下：10×PCRBuffer(Mg²⁺plus)2.5μL；dNTPMixture(各2.5mM)2μL；引物对copB-F/copB-R(10μM)各0.25μL；菌液模板1μL；rTaqDNAPolymerase(5U/μL)0.125μL；水19μL。

引物对copB-F/copB-R的PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，33个循环后72℃延伸5min，4℃保存。

引物对copB-F/copB-R扩增产物大小：野生型A.thiooxidansATCC19377菌株为0kb；copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株为1.46kb，见图1。

(3)引物对Km-F/Km-R的反应体系(25μL)组成如下：10×PCRBuffer(Mg²⁺plus)2.5μL；dNTPMixture(各2.5mM)2μL；引物对Km-F/Km-R(10μM)各0.25μL；菌液模板1μL；rTaqDNAPolymerase(5U/μL)0.125μL；水19μL。

引物对Km-F/Km-R的PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，33个循环后72℃延伸5min，4℃保存。

引物对Km-F/Km-R扩增产物大小：野生型A.thiooxidansATCC19377菌株为0kb；copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株为0.78kb，见图1。

将获得的copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株接种于20mLStarkey-S⁰液体培养基中，30℃条件下，静置培养3天，然后180rpm摇瓶培养6天。

2.构建嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af基因工程菌

分别收集对数中期的大肠杆SM10(pMSD1-PTSceI)作为供体菌和对数后期的copB_Af基因整合的A.thiooxidans单交换菌株作为受体菌，按照供体菌：受体菌为1:1.5的比例混匀供受体菌，涂在放置于Starkey-Na₂S₂O₃接合培养基平板的0.22μm滤膜上，30℃培养48～72h，用Starkey-Na₂S₂O₃无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，并经无机盐溶液梯度稀释后涂布到含有12mg/mLX-gal溶液和150μg/mL链霉素的Starkey-Na₂S₂O₃固体平板上，30℃培养12天长出蓝、白分明的单菌落；挑取白色菌落进行菌落PCR，筛选获得嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af基因工程菌(所述A.thiooxidanscopB_Af基因组上copB_Af基因及其部分上下游序列如SEQIDNo.15所示)，所用引物如下：

InginF：5’-GCTGGAAAGACACCTTGCTG-3’

InginR：5’-CTACAGTTTCGGGGTGTGGAC-3’

copB-F：5’-CGGATACCGTGGATCAAAACAC-3’

copB-R：5’-GTCTGCTGCAAATCGCCAGTG-3’

IngoutF：5’-CCCTTCATTTCCGTTCATCTG-3’

IngoutR：5’-ACGGATTTCCTGAAGAACCC-3’

(1)引物对InginF/InginR的PCR反应体系和PCR反应条件见实施例2的步骤1。

引物对InginF/InginR扩增产物大小：野生型A.thiooxidansATCC19377为0.35kb；A.thiooxidanscopB_Af基因工程菌为3.3kb，见图1。

(2)引物对copB-F/copB-R的PCR反应体系和PCR反应条件见实施例2的步骤1。

引物对copB-F/copB-R扩增产物大小：野生型A.thiooxidansATCC19377为0kb；A.thiooxidanscopB_Af基因工程菌为1.46kb，见图1。

(3)引物对IngoutF/IngoutR的PCR反应体系(25uL)组成如下:10×TransFastTaqBuffer2.5μL；dNTPMixture(各2.5mM)2μL；引物对InginF/InginR(10μM)各0.25μL；菌液模板1μL；TansFastTaqDNAPolymerase(2.5U/μL)0.25μL；水19μL。

引物对IngoutF/IngoutR的PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸3min30s，33个循环后72℃延伸5min，4℃保存。

引物对IngoutF/IngoutR扩增产物大小：野生型A.thiooxidansATCC19377菌株为3.9kb；A.thiooxidanscopB_Af基因工程菌菌株为6.8kb，见图1。

将获得的A.thiooxidanscopB_Af基因工程菌单菌落接种于20mLStarkey-S⁰液体培养基中，30℃条件下，静置培养3天，然后180rpm摇瓶培养6天。该菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.9286。

实施例3：A.thiooxidanscopB_Af(CGMCCNo.9286)基因工程菌在生物浸矿中的应用

1.A.thiooxidanscopB_Af(CGMCCNo.9286)在含铜培养基中的生长测定

将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af菌株在Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养至对数后期(约5～7天)，按照菌浓为10⁶～10⁷个/mL的接种量将A.thiooxidanscopB_A.f接种到100mL含0～100mMCuSO₄的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养；培养期间2或3天从每瓶菌中取1mL菌悬液用于测定OD₆₀₀，并绘制A.thiooxidanscopB_Af在不同铜离子浓度培养下的生长曲线(见图2)，确定A.thiooxidanscopB_Af菌株的铜离子MIC。由A.thiooxidanscopB_Af菌株的在不同铜离子浓度下的生长曲线可以看出该菌的铜离子MIC大于80mM，并且浸矿环境中的铜离子浓度通常为30-90mM，因此，该菌株的高铜抗性将有利于其在生物浸出中的应用。

2.将A.thiooxidanscopB_Af(CGMCCNo.9286)用于浸出铜矿

(1)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af在铜矿粉中的驯化：将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af菌株在Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养至对数后期(约5～7天)，按照菌浓为10⁶～10⁷个/mL的接种量将A.thiooxidanscopB_Af接种到200mL含2％(W/V)黄铜矿矿粉﹙粒径＜0.20mm)和1％(W/V)硫粉的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0～6.0×10⁸个/mL；将在2％(W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidanscopB_A.f接种到200mL含4％(W/V)黄铜矿矿粉和1％(W/V)硫粉的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0～6.0×10⁸个/mL；将在4％(W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidanscopB_Af接种到200mL含5％(W/V)黄铜矿矿粉和1％(W/V)硫粉的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0～6.0×10⁸个/mL。

(2)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af生物浸矿：将上述步骤(1)中获得的适应5％(W/V)铜矿粉的A.thiooxidanscopB_Af以10⁷～10⁸个/mL接种至200mL含4g/L[Fe²⁺]，30mMCuSO₄和5％(W/V)黄铜矿矿粉的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm摇瓶培养，另外，用含4g/L[Fe²⁺]，30mMCuSO₄和5％(W/V)黄铜矿矿粉的Starkey-S⁰液体培养基作为空白对照；在A.thiooxidanscopB_Af的生物浸矿期间，每隔5～10天取样，用原子吸收色谱测定上清液中的铜离子含量(g/L)。

综上所述，由上述实施例3中可以看出，整合copB_Af基因的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af(CGMCCNo.9286)，该基因工程菌在铜离子浓度为80mM下的生长状况与野生型A.thiooxidansATCC19377在20mM的生长状况类似，因此，本发明的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af(CGMCCNo.9286)在铜抗性方面比野生型嗜酸性酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)ATCC19377提高了60mM。浸矿环境中的铜离子浓度通常在30～90mM，而野生型A.thiooxidansATCC193777菌株的铜离子MIC只有25mM，因此，在铜离子浓度高于25mM的浸矿环境中，野生型A.thiooxidansATCC193777菌株的生长将严重受到抑制；但是本发明所构建的A.thiooxidanscopB_Af菌株的铜离子MIC大于80mM，因此，在铜离子浓度为30～90mM的浸矿环境中，该A.thiooxidanscopB_Af菌株的生长不会或很少受到抑制。这将扩大嗜酸性氧化硫硫杆菌在高铜含量金属硫化矿生物浸出中的应用范围，并且国外研究表明高抗铜菌株的生物浸出效率高于低抗铜菌株(Das,A.,Modak,J.,andNatarajan,K.A.,AntonievanLeeuwenhoek.,1998,Vol.73,No.3,215–22)，因此，本发明所构建的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af菌株应具有更高的浸矿效率，预示本申请所构建的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌A.thiooxidanscopB_Af(CGMCCNo.9286)具有巨大的应用价值。

Claims (1)

1.一株稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，其特征在于：所述菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)copB_Af，该菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.9286。