CN101372695B - 喜温硫杆菌的电转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法，步骤包括构建的含有外源基因的质粒提取及质粒浓度校正，喜温硫杆菌感受态细胞的培养和收集，电转化，平板筛选，阳性转化子鉴定和检测；其中：所述电转化参数为：电压10,500V/cm；电阻400Ω；电容：25μF。本发明首次实现了喜温硫杆菌的电转化，并确立了喜温硫杆菌复苏培养方案及筛选方法；为喜温硫杆菌的基因工程育种、遗传学及分子生物学研究提供了方便、快速和高效的基因导入方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种将外源基因导入自养微生物的新方法，尤其涉及一种将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的高效电转化方法。
背景技术
喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caduls，简称A.caduls)，是嗜酸性专性自养硫氧化细菌，是生物冶金浸矿细菌中的优势种群。一般情况下，反应良好的浸矿液中，喜温硫杆菌占20-30％。然而，由于浸矿液中常常含有毒性重金属离子，对其具有抑制作用，有必要用基因工程的方法构建重金属离子抗性菌株，以适应实际生产的需求。喜温硫杆菌由于其细胞特性和生长环境特殊，目前常用的基因转移方法都未取得成功：用CaCl2法制备感受态细胞困难，化学转化法未取得成功；该菌也没有发现噬菌体，因此，外源基因转导的方法也不可行。
发明人的实验室在国际上率先使用接合转移的方法将外源基因通过大肠杆菌转移到喜温硫杆菌体内(Liu X，Lin J，Zhang Z，et al.，J.Microbiol.Biotechnol.，2007，Vol.17，No.1，162-167)。但接合转移需要特殊的质粒载体，构建过程比较繁琐，并且不同类型的质粒接合转移效率差别很大。
电转化是一种高效的将外源基因导入宿主的方法，在许多细菌、酵母和动植物细胞中有成功的应用。由于喜温硫杆菌细胞壁致密，细胞吸附生长时细胞周围有粘性多糖等物质产生，电转化困难；并且该菌以无机物氧化获得能量，生长缓慢并受有机物抑制，电转化后的细胞复苏也有难度，鉴于此，电转化方法在本专利申请日之前一直未见有成功的报道。
发明内容
针对喜温硫杆菌细胞壁致密，并且在以硫粉为能源物质进行培养细胞吸附生长时细胞壁周围产生粘性多糖等物质，电转时细胞壁难以被击穿；生长周期长，有机物抑制生长，复苏困难等问题，本发明提出了一种将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的高效电转化方法。
本发明所述将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法，步骤包括构建的含有外源基因的质粒提取及质粒浓度校正，喜温硫杆菌感受态细胞的培养和收集，电转化，平板筛选，阳性转化子鉴定和检测；其特征在于：所述提取获得的质粒浓度应不小于70ng/μL；所述喜温硫杆菌感受态细胞的培养和收集的方法是：菌种于Starky-S0液体培养基中，100～150r/min，35～39℃振荡培养4～7天至指数生长后期，12,000r/min，10min，4℃离心收集细胞；无机盐洗涤液重悬细胞，2,000r/min，5min，4℃离心除去细胞悬液中Starky-S0培养基带入的硫粉；取上清，5,000r/min，5min，4℃收集细胞；再以由5,000r/min向3,000r/min离心转速逐级降低的方式并用渗透压逐渐降低的清洗液重复清洗细胞，制备电转化感受态细胞；所述电转化参数为：电压10,500V/cm；电阻400Ω；电容：25μF；电转化中质粒与菌体混合的体积比为：1：40～55，其中感受态细胞悬液的OD600值是1.0；所述平板筛选是将电转后的菌悬液加入到Starky-S0液体培养基中，39℃，60r/min培养24小时后加入链霉素使其终浓度达200μg/ml，然后提高转速至120r/min，再培养24小时后，进行平板筛选；所述阳性转化子鉴定采用PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测实现；
上述无机盐洗涤液配方：
(NH4)2SO4：0.6g；KH2PO4：0.6g；MgSO4·7H2O：0.1g；CaCl2·2H2O：0.05g；加蒸馏水至200mL，自然pH，15磅/cm2，灭菌20min。
上述将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法中：所述提取获得的质粒浓度优选是112ng/μL。
上述将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法中：所述喜温硫杆菌感受态细胞的培养优选方法是：菌种于Starky-S0液体培养基中，120r/min，39℃振荡培养5.5天。
上述将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法中：所述喜温硫杆菌感受态细胞的收集优选方法是：12,000r/min，10min，4℃离心收集细胞；无机盐洗涤液重悬细胞，2,000r/min，5min，4℃离心除去细胞悬液中Starky-S0培养基带入的硫粉；取上清，5,000r/min，5min，4℃收集细胞；无机盐洗涤液再次重悬细胞，5,000r/min，5min，4℃收集细胞；高pH磷酸缓冲液重悬细胞，4,000r/min，5min，4℃收集细胞；冰浴的超纯水重悬清洗细胞，4,000r/min，5min，4℃收集细胞；冰浴的超纯水再次重悬清洗细胞，3,000r/min，5min，4℃收集细胞，最后用冰浴的超纯水稀释细胞，使OD600达到1.0；
上述高pH磷酸缓冲溶液配方：
NaCl：8g，KCl0.2g，Na2HPO4：1.44g，KH2PO4：0.24g，溶于800ml高纯水中，HCl调pH至7.4，用纯水定容至1L；高压灭菌，4℃保存。
上述将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法中：所述电转化中质粒与菌体混合的体积比优选为1:50，其中感受态细胞悬液的OD600值是1.0，质粒浓度是112ng/μL。
本发明利用特定细胞培养、收集和处理方法使细胞处于电转化感受态，通过电转化参数的优化，使外源基因能够利用电转化方法导入喜温硫杆菌。本电转化方法可以弥补目前使用的接合转移方法的不足，为喜温硫杆菌的基因工程育种、遗传学及分子生物学研究提供方便、快速和高效的基因导入方法。
本发明创建了一套高效、快速、完整的喜温硫杆菌电转化方法，在国际上首次利用电转化的方法将源基因通过电转化方法高效地导入喜温硫杆菌中(即将质粒(pJRD215)成功地导入到喜温硫杆菌中)，电转化效率达到3.5×104个/μg DNA。并且电转化子经过复苏培养，可在筛选平板上获得较多转化子菌落。
附图说明
图1.喜温硫杆菌电转化子菌落PCR验证结果：
PCR模板分别为：1～7，筛选平板上的A.caduls电转化子菌落；C-，对照平板上的A.caduls菌落；C+，E.coli SM10(pJRD215)菌落；M，DNA Marker，从上到下大小依次为2,000bp、1,000bp、750bp。
图2.喜温硫杆菌电转化子质粒的提取结果：
C+，E.coli SM10(pJRD215)；S，A.caduls(pJRD215)；C-，A.caduls；M，DNA Marker，从上到下大小依次为15,000bp、10,000bp、7,500bp。
具体实施方式
实施例1
1、将E.coli SM10(p JRD215)(市售)接种Luria-Bertani培养基(LB培养基)，链霉素使用浓度100μg/ml，200r/min振荡培养12～14小时，收集细胞，利用TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0试剂盒(货号：DV801A)提取质粒，利用Eppendorf公司的紫外分光光度计(BioPhotometer plus)准确测定质粒浓度为112ng/μL。
2、将喜温硫杆菌MTH-04(本实验室从云南腾冲温泉酸性水样分离得到，保藏编号为CGMCCNO.1742；刘缨，齐放军，林建群等.一株中度嗜热嗜酸硫氧化杆菌的分离和系统发育分析.微生物学报，2004，44(3)：382-385)接种于Starky-S0液体培养基中，120r/min，39℃振荡培养5.5天，12,000r/min，10min，4℃离心收集细胞；无机盐洗涤液重悬细胞，2,000r/min，5min，4℃离心除去细胞悬液中Starky-S0培养基带入的硫粉；取上清，5,000r/min，5min，4℃收集细胞；无机盐洗涤液再次重悬细胞，5,000r/min，5min，4℃收集细胞；高pH磷酸缓冲液重悬细胞，4,000r/min，5min，4℃收集细胞；冰浴的超纯水重悬清洗细胞，4,000r/min，5min，4℃收集细胞；冰浴的超纯水再次重悬清洗细胞，3,000r/min，5min，4℃收集细胞，最后用冰浴的超纯水稀释细胞，使OD600达到1.0。
在上述细胞的清洗过程中，清洗液的渗透压逐渐降低，细胞壁逐渐膨胀，为防止离心过程中离心力过大导致细胞壁破裂，采取了随着清洗的过程离心转速逐步降低，保证制备细胞壁完整、生理状态良好的感受态细胞。
3、取8μl质粒与400μl菌体混合，冰上放置10min，然后加入到0.2cm冰浴的电转化杯中，使用Bio-Rad MicroPulserTM型电击仪，设置电转化参数：电压10,500V/cm；电阻400Ω；电容：25μF，将冰浴的电转化杯放到电转化槽中，按照设置的电转化参数，进行电击。
4、取出电转化杯，吸出菌悬液，加入到20ml Starky-S0液体培养基中，39℃，60r/min培养24小时后加入链霉素使其终浓度达200μg/ml，提高转速至120r/min，再培养24小时后，进行平板筛选。(复苏培养时间通过优化确定为48小时为宜，时间太短转化子生长不充分，时间太长未转化的野生菌大量生长，占据了优势，筛选效率不高)。
5、取400μl电转化细胞，用无机盐洗涤液梯度稀释：100，10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分别涂布于含有50μg/ml链霉素的Starky-Na2S2O3固体筛选平板和不含有链霉素的对照平板，同时设置未电转的喜温硫杆菌涂布抗性平板和对照平板。37℃倒置培养8～10天。
6、在无菌操作台中，用灭菌的牙签挑取筛选平板上的喜温硫杆菌菌落溶于15μl超纯水，同时挑取对照平板上的未电转喜温硫杆菌菌落做为负对照，并且挑取LB固体平板上的E.coli SM10(pJRD215)菌落作为正对照。分别取上述样品5μl作为模板，使用链霉素抗性基因(针对质粒pJRD215上的链霉素抗性基因)的PCR引物序列(Str sen：5’TGGCAGGAGGAACAGGA；Str anti-sen：5’GGAAAGGCACCCATAAGC)进行PCR。
菌落PCR反应体系和反应程序：
PCR反应体系：模板5μl，引物2μl(20μM)，Premix Taq(TaKaRa公司货号：DRR003A)25μl，超纯水18μl。
PCR反应程序：
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，正对照所在的泳道会产生1343bp的PCR产物条带；负对照在相应的区域则无PCR产物条带；挑取的验证样品中，若在相应区域产生与正对照相似的条带，说明为阳性转化子，若无条带产生与负对照相似，说明为假阳性(见图1)。
7、将鉴定为阳性转化子的剩余10μL菌溶液接种到链霉素终浓度为200μg/mL的20ml Starky-S0培养基中培养4～5天，再转接200mL Starky-S0液体培养基，39℃，120r/min培养5天，提取质粒电泳检测(结果见图2)。
上述LB培养基配方：
蛋白胨：10g，酵母粉：5g，NaCl：10g，用2N NaOH溶液调pH至7.0～7.5，加蒸馏水至1000mL，固体培养基加1.8％琼脂粉，15磅/cm2高压蒸汽灭菌20min。
上述喜温硫杆菌Starky-S0液体培养基配方：
(NH4)2SO4：2g；KH2PO4：3g；MgSO4·7H2O：0.5g；FeSO4·7H2O：0.01g；CaCl2·2H2O：0.25g；加800mL自来水溶解，用浓H2SO4调pH2.5～3.5，用自来水补足体积至1000mL。15磅/cm2，蒸汽灭菌20min。硫磺粉放于干燥的三角瓶中，用塑料膜将瓶口封紧，常压蒸煮灭菌2小时以上。临用前，用灭菌的药匙取一定量的硫磺粉加入Starky无机盐培养基中，至终浓度20g/L。
上述喜温硫杆菌Starky-Na2S2O3固体培养基配方：
A：(NH4)2SO4：0.6g；KH2PO4：0.6g；MgSO4·7H2O：0.1g；CaCl2·2H2O：0.05g；加蒸馏水至100mL。自然pH4.8，15磅/cm2，灭菌20min。
B：琼脂粉：2g；蒸馏水：100mL；15磅/cm2，灭菌20min。
C：Na2S2O3：2g；FeSO4·7H2O：O.006g；蒸馏水10ml，过滤除菌。
A和B分别煮沸后冷却至80℃混合，然后加入C混匀，制备固体平板。
上述无机盐洗涤液配方：
(NH4)2SO4：0.6g；KH2PO4：0.6g；MgSO4·7H2O：0.1g；CaCl2·2H2O：0.05g；加蒸馏水至200mL，自然pH，15磅/cm2，灭菌20min。
上述高pH磷酸缓冲溶液配方：
NaCl：8g，KCl0.2g，Na2HPO4：1.44g，KH2PO4：0.24g，溶于800ml高纯水中，HCl调pH至7.4，用纯水定容至1L；高压灭菌，4℃保存。
Claims (5)
1.一种将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法，步骤包括构建的含有外源基因的质粒提取及质粒浓度校正，喜温硫杆菌感受态细胞的培养和收集，电转化，平板筛选，阳性转化子鉴定和检测；其特征在于：所述提取获得的质粒浓度应不小于70ng/μL；所述喜温硫杆菌感受态细胞的培养和收集的方法是：菌种于Starky-S0液体培养基中，100～150r/min，35～39℃振荡培养4～7天至指数生长后期，12,000
r/min，10min，4℃离心收集细胞；无机盐洗涤液重悬细胞，2,000r/min，5min，4℃离心除去细胞悬液中Starky-S0培养基带入的硫粉；取上清，5,000r/min，5min，4℃收集细胞；再以由5,000r/min向3,000r/min离心转速逐级降低的方式并用渗透压逐渐降低的清洗液重复清洗细胞，制备电转化感受态细胞；所述电转化参数为：电压10,500V/cm；电阻400Ω；电容：25μF；电转化中质粒与菌体混合的体积比为：1∶40～55，其中感受态细胞悬液的OD600值是1.0；所述平板筛选是将电转后的菌悬液加入到Starky-S0液体培养基中，39℃，60r/min培养24小时后加入链霉素使其终浓度达200μg/ml，然后提高转速至120r/min，再培养24小时后，进行平板筛选；所述阳性转化子鉴定采用PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测实现；
上述喜温硫杆菌是喜温硫杆菌MTH-04，保藏编号为CGMCC NO.1742；
上述无机盐洗涤液配方：(NH4)2SO4：0.6g；KH2PO4：0.6g；MgSO4·7H2O：0.1g；CaCl2·2H2O：0.05g；加蒸馏水至200mL，自然pH，15磅/cm2，灭菌20min。
2.如权利要求1所述将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法，其特征在于：所述提取获得的质粒浓度是112ng/μL。
3.如权利要求1所述将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法，其特征在于：所述喜温硫杆菌感受态细胞的培养方法是：菌种于Starky-S0液体培养基中，120r/min，39℃振荡培养5.5天。
4.如权利要求1所述将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法，其特征在于：所述喜温硫杆菌感受态细胞的收集方法是：12,000r/min，10min，4℃离心收集细胞；无机盐洗涤液重悬细胞，2,000r/min，5min，4℃离心除去细胞悬液中Starky-S0培养基带入的硫粉；取上清，5,000r/min，5min，4℃收集细胞；无机盐洗涤液再次重悬细胞，5,000r/min，5min，4℃收集细胞；高pH磷酸缓冲液重悬细胞，4,000r/min，5min，4℃收集细胞；冰浴的超纯水重悬清洗细胞，4,000r/min，5min，4℃收集细胞；冰浴的超纯水再次重悬清洗细胞，3,000r/min，5min，4℃收集细胞，最后用冰浴的超纯水稀释细胞，使OD600达到1.0；
上述高pH磷酸缓冲溶液配方：
NaCl：8g，KCl 0.2g，Na2HPO4：1.44g，KH2PO4：0.24g，溶于800ml高纯水中，HCl调pH至7.4，用纯水定容至1L；高压灭菌，4℃保存。
5.如权利要求1所述将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法，其特征在于：所述电转化中质粒与菌体混合的体积比为1∶50，其中感受态细胞悬液的OD600值是1.0，质粒浓度是112ng/μL。
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