CN103952431B - 一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法 - Google Patents
一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103952431B CN103952431B CN201410172134.1A CN201410172134A CN103952431B CN 103952431 B CN103952431 B CN 103952431B CN 201410172134 A CN201410172134 A CN 201410172134A CN 103952431 B CN103952431 B CN 103952431B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protoplast
- transformant
- agrobacterium
- potential
- flat board
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法，包括：制备葡萄座腔菌的原生质体，并对原生质体进行恢复培养；将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；将农杆菌与原生质体混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；确认潜在转化子基因组中是否含有目的基因，从而获得遗传稳定转化子。本发明以原生质体为转化材料，利用农杆菌介导将目的基因转入葡萄座腔菌内，并整合到基因组中。并且原生质体在共培养前，需要进行恢复培养，当恢复培养时间为2～6h时，每管转化材料可获得20～30个潜在转化子，当恢复培养时间超过6h或低于2h，转化效率迅速下降，只能获得少数潜在转化子甚至难以得到潜在转化子。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法。
背景技术
葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是一种常见的全球分布的重要真菌，具有重要的开发利用价值。这类真菌有的可以腐生在各种腐木上，有的在多种木本植物上寄生，引起木本植物的病害，有的与植物形成共生体，是许多植物的内生真菌。在腐木上营腐生生活的葡萄座腔菌可以将木本植物残体分解，在生态系统的物质循环和能量循环中具有重要作用；同时，这类真菌还可以被开发以生产木质素酶和纤维素酶，具有很好的经济开发前景。而属于内生真菌的菌株可以作为生物反应器，如从北非雪松中分离的一株真菌可以产生15种新的化合物，其中有3种具有抗病原真菌、抗氧化功能。
作为植物病原菌的葡萄座腔菌菌株也有开发价值，是重要的待开发生物资源。植物病原菌要成功侵染寄主植物，就必须能够克服植物的防卫反应，还要能够穿过植物表皮等植物的物理保护屏障。因此，植物病原菌往往能够产生比腐生菌更多的胞外降解酶和其他效应子，使植物的防卫反应下降，并将植物表皮细胞壁成分进行必要的降解。
一些真菌的基因组序列分析结果也表明，与腐生真菌相比，植物病原真菌的基因组中含有更多的细胞壁降解酶基因，而内生真菌的基因组中含有的细胞壁降解酶基因最少。因此，植物病原菌可以开发成生产胞壁降解酶类的生物资源，如降解作物秸秆或林木残体，在环境保护、生物质能源开发方面具有很好的应用前景。作为植物病原菌的葡萄座腔菌菌株还可以用于生物转化生产特定的功能化合物，如诺卡酮(Nootkatone)是重要的工业原料，葡萄座腔菌可以将巴伦西亚橘烯转化为诺卡酮Nootkatone，在减肥产品、增强免疫力的保健产品和美容产品。
随着现代生物技术的发展，分子生物学技术已经与传统生物学技术结合在一起，大大促进了生物学研究和生物产业的发展，无论是对生物细胞进行分子改造，还是克隆有用的基因，都需要建立外源基因转化进入细胞的转化体系，这是对细胞进行分子改造和研究的前提。针对葡萄座腔菌这种具有重要经济意义的真菌，截止目前，我们还没有见到如何针对该菌进行基因转化的报道。
发明内容
本发明提供了一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法，首次建立了针对葡萄座腔菌的基因转化体系。
一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法，包括以下步骤：
(1)制备葡萄座腔菌的原生质体，并对原生质体进行恢复培养；
(2)将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；
(3)将步骤(2)得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤(1)中恢复培养后的原生质体混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；
(4)确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子。
本发明以原生质体作为转化材料，利用农杆菌介导技术将外源目的基因转入葡萄座腔菌的细胞内，并整合到葡萄座腔菌的基因组中。如未作特殊说明，本发明所述潜在转化子是指，能在筛选平板上生长但未确定目的基因是否稳定存在于其基因组的转化子。
并且，本发明的原生质体在共培养前，需要进行恢复培养，保证原生质体再生率，从而提高获得稳定遗传转化子的几率。试验发现，若原生质体未进行恢复培养即与农杆菌共培养，或者直接采用菌丝作为转化材料，则几乎难以获得潜在转化子。
具体地，一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法，包括以下步骤：
(1)制备葡萄座腔菌的原生质体，并对原生质体进行恢复培养；葡萄座腔菌原生质体的制备方法可参见文献(高静，李艳波，柯希望，康振生，黄丽丽.PEG介导的苹果腐烂病菌原生质体转化.微生物学报，2011，51(9):1194～1199)中公开的相关内容，本发明的原生质体制备方法在该公开内容的基础上稍作调整，将文献中的“酶解液浓度50mg/mL Driselase+10mg/mL Lysing Enzymes情况下，按10mL酶液/0.5g湿菌体比例，酶解2h”改为：“酶解液浓度10mg/mL Driselase+10mg/mL Lysing Enzymes情况下，按10mL酶液1g湿菌体比例，28℃酶解3h”。
所述恢复培养的条件优选为：在25～28℃下恢复培养2～10h；更优选为在25～28℃下恢复培养2～8h；最优选为在25～28℃下恢复培养2～6h。当恢复培养时间为2～6h时，每管转化材料(原生质体个数约为4×105～107cfu)可获得20～30个潜在转化子，当恢复培养时间超过6h或低于2h，转化效率迅速下降，只能获得少数几个潜在转化子甚至难以得到潜在转化子。这是因为若恢复培养时间太短，则原生质体再生率低，存活率低；若恢复培养时间太长，则原生质体的细胞壁生长过度，难以实现目的基因的转化。
(2)将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；
本发明中，将外源目的基因连接到pKO1质粒中，获得所述的质粒载体，再利用冻融法将质粒载体转化到农杆菌中。pKO1质粒作为一种大肠杆菌-农杆菌穿梭表达载体(pKO1质粒的结构参见：李海娇，卢建平，刘小红，张莉林，林福呈.适用于稻瘟病菌基因敲除、过表达和荧光融合蛋白表达载体的构建和使用.农业生物技术学报，2012，20(1)：94～104.)，其带有GFP基因，GFP基因可作为荧光标记基因，鉴定外源目的基因是否整合到葡萄座腔菌中。
冻融法操作简便，不需要其他仪器就可以完成农杆菌的转化。
本发明中，所述农杆菌为AGL-1。与其他农杆菌菌株相比，AGL-1更适用于子囊菌的基因转化。
(3)将步骤(2)得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤(1)中恢复培养后的原生质体混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；
农杆菌与原生质体的混合比例优选为：OD600为0.5～0.6的农杆菌100μL与浓度为2×106～108cfu/mL(更优选为4×106cfu/mL)的原生质体200μL混合。该混合比例下，每管转化材料在一个平板上最多长出20-30个转化子，由于葡萄座腔菌的菌丝生长速度快，过多的转化子可能出现菌丝生长覆盖，致使难以挑取单个转化子。
诱导平板一般是采用含有乙酰丁香酮(AS)的农杆菌生长培养基制成的，筛选平板一般是采用含有筛选物质(具体筛选物质视不同的外源目的基因而定)的葡萄座腔菌生长培养基制成的。
乙酰丁香酮能够诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进T-DNA的加工与转移，使农杆菌中携带外源目的基因的T-DNA更易进入葡萄座腔菌基因组并与其整合。
作为优选，所述诱导平板中含有0.1～0.3mM的乙酰丁香酮。作为进一步优选，所述诱导平板中含有0.2mM的乙酰丁香酮。AS浓度过高会对原生质体产生毒害作用，影响转化效率。
以目的基因为潮霉素抗性基因和绿色荧光霉素基因为例，相应的诱导平板是在100mL冷却至50℃左右的IM固体培养基中加入乙酰丁香酮储备液(100mM)200μL，卡那霉素储备液(50mg/mL)100μL，混匀后倒入培养皿制成的。在诱导平板中加入卡那霉素是因为农杆菌的质粒上含有卡那霉素抗性基因，加入卡那霉素是为了抑制除农杆菌以外的其它杂菌生长，防止杂菌污染。
相应的筛选平板则是在100mL冷却至50℃左右的PDA固体培养基中加入乙酰丁香酮储备液(100mM)200μL，头孢霉素储备液(400mg/mL)100μL，链霉素储备液(10mg/mL)100μL，卡那霉素储备液(50mg/mL)100μL，潮霉素储备液(50mg/mL)20μL，混匀后倒入培养皿制成的。在筛选平板中加入头孢霉素、链霉素、卡那霉素这3种抗生素是为了抑制细菌的生长。
农杆菌与原生质体在诱导平板上共培养的条件是影响转化效率的重要因素，本发明中，共培养的条件优选为22℃下共培养45～50h；更优选为22℃下共培养48h。
诱导平板的表面覆盖有一层硝酸纤维素膜，农杆菌与原生质体的混合物是涂布到该硝酸纤维素膜表面上的。如此共培养完成后，将硝酸纤维素膜切成约0.5cm宽的条带，并将各条带(涂布有混合物的一面朝下)转移至筛选平板上，条带之间间隔约0.5cm，置于28℃下培养7天，可见条带之间的培养基上有菌丝长出，长出的菌丝即为本发明所述潜在转化子。
(4)确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子。
对于如何确认外源目的基因是否转化成功，一般是先将潜在转化子接种至无筛选压的培养基上培养，传代若干次后再转接至含筛选压的培养基上培养，能够正常生长的潜在转化子即为遗传稳定的转化子。
筛选压是与目的基因相对应的，以目的基因是潮霉素抗性基因为例，筛选压即为潮霉素。
除此之外，还能通过PCR扩增检测潜在转化子的基因组DNA中是否含有外源目的基因。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明以原生质体作为转化材料，利用农杆菌介导技术将外源目的基因转入葡萄座腔菌的细胞内，并整合到葡萄座腔菌的基因组中。并且，本发明的原生质体在共培养前，需要进行恢复培养，保证原生质体再生率，从而提高获得稳定遗传转化子的几率。试验发现，当恢复培养时间为2～6h时，每管转化材料可获得20～30个潜在转化子，当恢复培养时间超过6h或低于2h，或者直接采用菌丝作为转化材料，转化效率迅速下降，只能获得少数几个潜在转化子甚至难以得到潜在转化子。
附图说明
图1a为转化子的绿色荧光检测结果图(图中标尺＝10μm)；
图1b为另一转化子的绿色荧光检测结果图(图中标尺＝10μm)；
图1c为野生型菌株FY-31的绿色荧光检测结果图(图中标尺＝10μm)；
图2为转化子的PCR扩增结果图；其中，M表示DNA分子量标准，P表示质粒模板，1～6表示随机挑取的6个转化子模板，W表示野生型菌株FY-31模板。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的方法作进一步详细说明。
1、葡萄座腔菌原生质体制备
(1)试剂和培养基的制备
①0.7M氯化钠溶液：40.95g氯化钠(NaCl)溶解在1000mL水中，定容后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。
②1M Tris-Cl,pH＝7.5：三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为Tris)121.14溶于600mL重蒸水中，用浓盐酸调整pH＝7.5,然后用重蒸水定容至1L，进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)，备用。
③细胞壁降解酶液：在天平上称取100mg的崩溃酶(Driselase)和100mg的溶壁酶(Lysing Enzyme)，溶解在10mL的0.7M氯化钠溶液中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，现配现用。
④100mL的STC溶液：称取21.8604g的山梨醇(Sorbitol)，0.735g的氯化钙加水约60mL溶解后，加入配好的1M Tris-Cl(pH＝7.5)1mL，然后定容至100mL。
⑤马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)：将马铃薯200g切成小块，加水煮沸15min，然后2层纱布过滤后，弃去马铃薯块，在过滤液中加入葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。
⑥马铃薯葡萄糖液体培养基(potato dextrose broth,PDB)：将马铃薯200g切成小块，加水煮沸15min，然后2层纱布过滤后，弃去马铃薯块，在过滤液中加入葡萄糖20g，加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。
(2)原生质体制备
①将本实验室保存的葡萄座腔菌菌株FY-31接种到PDA平板上，25℃培养5天后，用挑针挑取5-8块约3×3mm2的菌丝块，接种到100mL的PDB液体培养基中，25℃培养2天。
②在超净工作台中，用四层纱布过滤菌丝，然后用0.7M NaCl冲洗菌丝3次，用灭菌的滤纸和吸水纸滤干水分，称取1g菌丝置于50mL灭菌离心管中，加入10mL配好的细胞壁降解酶液，在28℃的摇床上以80转/min的转速酶解3.5小时。
③用灭菌的两层擦镜纸过滤酶解液，再用0.7M NaCl冲洗残留在擦镜纸上的原生质体两次，每次用10mL。除去残渣，将过滤液转移到50ml离心管中，置于离心机中，在4℃条件下，用3000rpm离心10min。
④小心弃上清，加入10-20mL STC，轻轻晃动离心管以悬浮沉淀。
⑤将50ml离心管置于离心机中，在4℃条件下，用3000rpm离心10min。
⑥小心弃上清，加入1mL STC，轻轻晃动离心管以悬浮沉淀。
⑦用血球计数板对原生质体计数，根据计数结果，加入适量STC溶液，调整原生质体的浓度为107个/mL。
⑧将获得的原生质体分装到已经灭菌的1.5mL离心管中，每管100μl，-80℃保存备用。
2、农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化
(1)培养基和溶液配制
①农杆菌培养基(IM)：0.8mL1.25K-Phosphate-buffer pH4.8(用KH2PO4和K2HPO4配制)；20mL MN-buffer(30g/l MgSO4·7H2O，15g/L NaCl)；1mL1％CaCl2·2H2O(w/v)；10mL0.01％FeSO4(w/v)；5mL spore elements(100mg/L ZnSO4·7H2O，100mg/L CuSO4·H2O，100mg/L H3BO3，100mg/L Na2MoO4·2H2O)(过滤灭菌)；2.5mL20％NH4NO3(w/v)；10mL50％glycerol(v/v)；40mL1M MES pH5.5(用NaOH调pH值)；20％glucose(w/v)，液体培养基中加10mL，固体培养基加5mL；加水至1L，固体培养基加1.5％琼脂粉。
②100mM乙酰丁香酮储备液(Acetosyringone，AS)：1.962g乙酰丁香酮用二甲基亚砜(DMSO)溶解，定容到100mL，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
③农杆菌诱导培养基(AIM)：在100mL的IM培养基中加入乙酰丁香酮储备液200μL，使乙酰丁香酮的终浓度为200μM。
④恢复培养基(Yeast extract Peptone Sucrose，YPS)：蛋白胨(Peptone)5g,酵母提取物(Yeast extract)3.5g，葡萄糖(Glucose(10g，蔗糖(Sucrose)342.3g，水1000mL，pH＝7.0。常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。
⑤卡纳霉素储备液(50mg/mL)：将1g氯霉素溶解在20mL的无水乙醇中，备用。
⑥链霉素储备液(10mg/mL)：将100mg链霉素溶解在10mL的灭菌水中，备用。
⑦头孢霉素储备液(400mg/mL)：将2g头孢霉素溶解在5mL的灭菌水中，备用。
⑧潮霉素储备液：50mg/mL，由生工生物技术有限公司购买。
⑨LB固体培养基：胰蛋白胨(Trypone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，氯化钠(NaCl)10g，琼脂15g,水1000mL，pH＝7.0。常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。
⑩LB液体培养基：LB固体培养基中不加琼脂，其他相同。
(2)葡萄座腔菌菌株FY-31对潮霉素的敏感性检测
①将本实验室保存的葡萄座腔菌菌株FY-31接种到PDA平板上，25℃培养5天。
②取5个装有20mL的PDA培养基的50mL三角瓶，融化培养基后室温冷却到50℃，标记为1-5号。用移液器吸取50mg/mL的潮霉素，按表1中所示的量加入各个瓶中，配成相应的浓度，然后倒入直径6cm的一次性塑料培养皿中，每个瓶中的培养基倒一个培养皿。
表120mL的PDA培养基含有潮霉素的浓度
| 瓶号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 加入潮霉素的量(μL) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 |
| 潮霉素的浓度(μg/mL) | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 |
③从培养好的葡萄座腔菌菌株FY-31的菌落边缘挑取3×3mm2的菌丝块，放到步骤(2)中制备的含有潮霉素的PDA平板上，25℃培养5天。
④观察菌株FY-31的生长情况，结果发现，在1号瓶倒的平板和2号瓶倒的平板上，菌株FY-31可以生长，其他的平板上没有菌丝生长。说明葡萄座腔菌菌株FY-31对潮霉素比较敏感，在高于10μg/mL潮霉素的PDA培养基上不能生长。
(3)质粒载体制备
①用限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切质粒pCB1003，切下1.4kb的潮霉素抗性基因并胶回收。
②用限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切质粒pKO1(其上带有绿色荧光蛋白(GFP)表达基因)，胶回收并用碱性磷酸化酶处理。
③将步骤(1)和(2)中处理好的片段用T4连接酶连接后，转化大肠杆菌。
④提取转化大肠杆菌后的克隆中的质粒，用限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切质粒，在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，电泳图谱上含约8.7kb和1.4kb两条带的是正确质粒，记为pKO1-Hygr。
⑤将质粒pKO1-Hygr的浓度调整到0.25μg/μL。
(4)用冻融法将pKO1-Hygr转化到农杆菌中
①将农杆菌菌株AGL1在LB平板上划线活化，28℃培养2天；然后将1个单菌落转到5mL LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
②将2mL上述培养液转移到装有50mL的LB液体培养基的三角瓶中，28℃振荡培养6小时，测定其吸光度，当OD600＝0.5～1.0时停止培养。
③将培养好的菌液放置在冰上，然后转移到50mL离心管中，在4℃条件下，3000g离心5min。
④弃去上清液，沉淀用1mL预冷的20mM CaCl2溶液悬浮，分装到预冷的1.5mL离心管中，每管0.1mL。
⑤取4μL pKO1-Hygr质粒(0.25μg/μL)加入到含有0.1mL农杆菌的1.5mL离心管中，盖好盖子，轻轻混匀，然后迅速放到液氮中冷冻。
⑥取出1.5mL离心管，置于37℃水浴中保温5min，解冻。
⑦在1.5mL离心管中加入1mL的LB培养液，28℃下，100rpm轻摇培养2～4h。
⑧将离心管放入离心机中，12000rpm离心2min，弃去1mL培养液，然后将沉淀悬浮，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，28℃培养2～4天。
(5)农杆菌介导转化葡萄座腔菌菌株FY-31
①从新鲜培养的LB平板(含50μg/mL卡那霉素)上挑选农杆菌单菌落接种于5mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，200r/min，28℃过夜培养。
②第二天，取400μL培养液转移到5mL含50g/mL卡那霉素的诱导液体培养基(AIM)中，OD600值约0.15，28℃培养5～6个小时，使菌液的OD600达到0.5～0.6。
③葡萄座腔菌菌株FY-31转化材料的优化：在含有100μL原生质体的1.5mL离心管中加入400μL的恢复培养基，按表2所示的培养时间，在25℃下进行恢复培养。
以菌丝为转化材料作对照：菌株FY-31在PDA培养基上生长5天，用灭菌的牙签将菌丝刮下，转移到1.5mL离心管中，加灭菌水200μL备用。
④将100mL的IM固体培养基融化后，在室温冷却到50℃，然后加入乙酰丁香酮储备液200μL，卡那霉素储备液100μL，轻轻摇动混匀后，倒入6cm一次性塑料培养皿中，制成诱导平板；待培养皿中的培养基凝固后，将一张直径5cm的灭菌纤维素膜覆盖在培养基表面。
⑤取100μL培养好的农杆菌AGL-1(含载体)菌液和200μL转化材料混合，混合液均匀涂于诱导平板上的硝酸纤维素膜表面，22℃共培养48h。
⑥将100mL的PDA固体培养基融化后，在室温冷却到50℃，然后加入乙酰丁香酮储备液200μL，头孢霉素储备液100μL，链霉素储备液100μL，卡那霉素储备液100μL，潮霉素储备液20μL，轻轻摇动混匀后，倒入6cm一次性塑料培养皿中，制成筛选平板；将诱导平板上的硝酸纤维素膜切成约0.5cm的条带，转移到筛选平板上，条带之间相隔约0.5cm，置于在28℃培养7天，可以见到有菌丝长到硝酸纤维素膜条带之间的培养基上。
⑦挑取长出的菌丝，转移到含有10μg/mL潮霉素的PDA平板上，28℃培养5天，确认是否转化成功。如果能够生长，可确认转化成功。
转化结果如表2，共得到76个葡萄座腔菌的转化子。
表2转化材料的状态对转化效果的影响
由表2可见，菌株FY-31的原生质体经过2-6小时的恢复培养，可以进行有效的农杆菌介导的真菌转化。若果培养时间超过6小时，转化效率降低。而直接用菌丝作为转化材料没有转化成功。
(5)转化子的检测
1)遗传稳定性检测
从获得的转化子中随机挑选了6个转化子，在PDA培养基平板上28℃转接培养5次，然后再转接在含有1010μg/mL潮霉素的PDA平板上，28℃培养5天，结果这6个转化子都可以生长，说明转化子的遗传稳定性好，转入的抗性基因稳定存在。
2)绿色荧光检测
将以上随机选择的6个转化子接种在PDA平板上，28℃培养5天。用挑针挑取少量菌丝，置于载玻片上，制成观察玻片，放到显微镜的载物台上。打开紫外光(450～490nm)，观察绿色荧光。结果发现这6个转化子的菌丝都能发出绿色荧光，说明外源基因转化后可以进行稳定表达(图1)。
3)PCR检测
①将随机挑选的6个转化子菌株在PDA平板上25℃生长7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300μL提取缓冲液的1.5mL离心管中；
提取缓冲液：1M KCl,100mM Tris-HCl,10mM EDTA，pH＝8.0。
②用电磨机将挑取的菌丝磨碎，然后再加入300μL提取缓冲液，剧烈震荡2min；
③10000rpm离心10min；
④吸取上清至另一离心管中，弃沉淀；
⑤加入等体积的异丙醇(分析纯)，沉淀核酸，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心10min；
⑥轻轻倒去上清液，在吸水纸上排干水分；
⑦加入300μL70％乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心2min；
⑧轻轻倒去上清液，在吸水纸上吸干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；
⑨用50μL ddH2O重悬沉淀，得到各转化子的基因组DNA，浓度达到30ng/μL。
⑩以各转化子的基因组DNA为模板，分别利用引物HYg1/HYg2进行PCR扩增，引物序列如下：
上游引物(HYg1)为：5′-TAGTGGAGGTCAACAATGAATG-3′；
下游引物(HYg2)为：5′-CATCTACTCTATTCCTTTGCCC-3′；
PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行，其中，PCR反应体系(50μL)：上下游引物各2μM，dNTPs200μM，Mg2+1.5mM，10×PCRbuffer5μL，模版DNA2μL，Taq酶2U。
PCR反应条件：94℃预变性2min，然后35个循环包括：94℃变性30sec，57℃退火40sec，72℃延伸1.5min。最后72℃后延伸10min。
PCR反应结束后，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现这6个转化子中都出现了约1.4kb的电泳条带，说明抗潮霉素基因稳定整合到葡萄座腔菌的基因组中(图2)。
Claims (1)
1.一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法，包括以下步骤：
(1)制备葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的原生质体，并对原生质体进行恢复培养；
(2)将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；
(3)将步骤(2)得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤(1)中恢复培养后的原生质体混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；
(4)确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子；
所述恢复培养的条件为：在25～28℃下恢复培养2～6h；
所述农杆菌为AGL-1；
步骤(2)中，利用冻融法将质粒载体转化到农杆菌中；
步骤(3)中，农杆菌与原生质体的混合比例为：OD600为0.5～0.6的农杆菌100μL与浓度为2×106～4×106cfu/mL的原生质体200μL混合；
所述诱导平板中含有0.2mM的乙酰丁香酮；
所述共培养的条件为：22℃下共培养45～48h；
诱导平板的表面覆盖有一层硝酸纤维素膜，农杆菌与原生质体的混合物是涂布到该硝酸纤维素膜表面上的；共培养完成后，将硝酸纤维素膜切成0.5cm宽的条带，并将各条带转移至筛选平板上，涂布有混合物的一面朝下，条带之间间隔0.5cm，置于28℃下培养7天；
步骤(4)中，先将潜在转化子接种至无筛选压的培养基上培养，传代若干次后再转接至含筛选压的培养基上培养，能够正常生长的潜在转化子即为遗传稳定的转化子；通过PCR扩增检测潜在转化子的基因组DNA中是否含有外源目的基因。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410172134.1A CN103952431B (zh) | 2014-04-25 | 2014-04-25 | 一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410172134.1A CN103952431B (zh) | 2014-04-25 | 2014-04-25 | 一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103952431A CN103952431A (zh) | 2014-07-30 |
| CN103952431B true CN103952431B (zh) | 2017-05-10 |
Family
ID=51329782
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410172134.1A Expired - Fee Related CN103952431B (zh) | 2014-04-25 | 2014-04-25 | 一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103952431B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107129996B (zh) * | 2016-02-26 | 2020-05-12 | 浙江大学 | 一种质粒载体及其构建方法和应用 |
| CN108823234B (zh) * | 2017-10-31 | 2022-02-08 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101864449B (zh) * | 2010-05-10 | 2011-11-16 | 华中农业大学 | 一种根癌农杆菌介导的核盘菌的遗传转化方法 |
-
2014
- 2014-04-25 CN CN201410172134.1A patent/CN103952431B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103952431A (zh) | 2014-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111187726B (zh) | 一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制备的稻瘟病杀菌剂 | |
| CN109825457B (zh) | 一种耐盐芽孢杆菌E40207a2及其应用 | |
| CN113215002B (zh) | 一种内生真菌m-b927及其应用 | |
| CN105039183B (zh) | 一种埃德菌fs110原生质体及其制备方法和转化方法 | |
| CN107815478A (zh) | 利用小金色链霉菌bjx007发酵生产春雷霉素的方法 | |
| CN105331552B (zh) | 一株高效脱氮不动杆菌新种及其应用 | |
| CN112175887A (zh) | 一种大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌及其应用 | |
| CN114456949B (zh) | 一株白僵菌jsha-md912及其应用 | |
| CN103952431B (zh) | 一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法 | |
| CN104651319A (zh) | 一种禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16及其应用 | |
| CN103266130B (zh) | 大豆水通道蛋白基因GmPIP1;2的应用 | |
| CN110468054B (zh) | 一种虫生真菌玫烟色棒束孢SP535在p-氯苯胺生物降解中的应用 | |
| CN111621424A (zh) | 一株耐盐碱的新木霉及其应用 | |
| CN106282222B (zh) | 一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化方法 | |
| CN107815426B (zh) | 发酵生产春雷霉素的专用菌株及其应用 | |
| CN102120997A (zh) | 葡萄病程相关蛋白pr10-1水解rna与抑菌活性的方法 | |
| CN106367360A (zh) | 一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌的基因转化方法 | |
| CN105420167B (zh) | 一种蜡状芽孢杆菌及其应用 | |
| CN112501053B (zh) | 解淀粉芽孢杆菌hbns-1、其应用及所得农用肥料 | |
| CN107502562A (zh) | 重组蝗绿僵菌及其制备方法和应用 | |
| CN109666655B (zh) | 一种禾谷镰刀菌单链环状DNA病毒FgGMTV1/HB58及其应用 | |
| CN114426987A (zh) | 一种辣椒白绢病菌的遗传转化方法 | |
| CN114107327A (zh) | 绿色木霉高温胁迫响应关键酶基因TvHSP70、重组表达载体、工程菌及其应用 | |
| CN109182154B (zh) | 一株高产蛋白酶的巴布维红酵母 | |
| CN107129996A (zh) | 一种质粒载体及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170510 Termination date: 20200425 |