CN101864449B - 一种根癌农杆菌介导的核盘菌的遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种根癌农杆菌介导的核盘菌的遗传转化方法，将含有双元载体的根癌农杆菌与核盘菌的原生质体混合后共培养，用抗生素筛选，获得转化子，该方法转化效率可达1/5.9×10⁴个原生质体。本发明以核盘菌的原生质体为受体，以根癌农杆菌为介体，克服了核盘菌菌丝细胞为多核，且子囊孢子难以大量获得等原因导致的核盘菌遗传转化困难的问题，提供了一种简单方便、转化效率稳定的核盘菌的遗传转化方法。同时本发明也提供了一种简单高效的核盘菌原生质体制备方法。

Description

一种根癌农杆菌介导的核盘菌的遗传转化方法

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种根癌农杆菌介导的核盘菌的遗传转化方法。

背景技术

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种世界性分布的重要植物病原真菌，寄主范围广泛，可以寄生75科400多种植物(Boland and Hall，1994)。主要寄生双子叶植物如豆类、十字花科植物如油菜等，也可以寄生部分单子叶植物。在我国引起油菜、豆类等重要油料作物和蔬菜作物的菌核病。核盘菌引起的油菜菌核病在我国长江流域发病率达一般年份发病率为30％左右，严重时达80％以上，减产20％-70％。由于缺乏抗病品种，作物菌核病的防治十分困难。

用分子生物学手段研究核盘菌的致病及发育机理，可以为作物菌核病高效、安全控制提供新的研究思路。Broad研究所(Broad Institute)2005年公布了核盘菌菌株1980的全基因组序列，为核盘菌分子生物学研究提供了非常大的帮助。然而近些年有关核盘菌的分子方向研究却远少于其它已知全基因组序列的丝状真菌。原因之一在于核盘菌的遗传转化是开展核盘菌分子生物学研究的一项重要技术，如核盘菌基因敲除、基因互补或基因沉默等都必需使用核盘菌遗传转化方法；特别是建立核盘菌突变体库能快速、大批量的发现核盘菌中各种类型的功能基因，并明确基因控制的生物学性状，而突变体库的建立更需要一种非常稳定且高效的转化方法。但是核盘菌不产生分生孢子，丝细胞为多核且子囊孢子为双核(Wong&Willetts，1979)，即核盘菌没有单核的转化受体，核盘菌遗传转化时只能采用多核的菌丝、原生质体或子囊孢子为转化受体。因此缺乏合适的转化受体使核盘菌的遗传转化非常困难，进而导致核盘菌分子生物学研究进展相对缓慢。

从1973年Mishra和Tatum首次报道真菌Neurospora crassa的遗传转化以来(Mishra&Tatum，1973)，建立了许多真菌的高效遗传转化体系。但核盘菌的遗传转化研究相对其它丝状真菌起步较晚，自Rollins利用PEG介导转化核盘菌原生质体获得基因敲除转化子后(Rollins，2003)，对核盘菌遗传转化体系建立及优化的探索逐渐开展。国内外报道的核盘菌的遗传转化方法主要有以下五种：(1)聚乙二醇(PolyethyleneGlycol，PEG)介导的核盘菌的原生质体转化(Rollins，2003；Wamatu et al.，2005；de Silva et al.，2005，2009；杨雷，2006)。(2)根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的核盘菌的子囊孢子转化(Weld et al.，2006；Liberti D et al.，2006，2007，008；史洋等，2009)。(3)根癌农杆菌介导的核盘菌的菌丝转化(江明等，2006；双桑等，2008；安乐等，2007，2010；郭艳梅等，2008)。(4)利用植物接种仪器BIM-LAB产生的压缩空气将带有抗性标记的环状质粒DNA转入核盘菌的菌丝和菌核中(Levy et al.，2008)，但目前没有其它实验室使用该方法的报道，是否能够推广还有待验证。(5)羊国根等利用电穿孔转化核盘菌的原生质体获得9个转化子(羊国根等，2009)，但该方法转化效率低。

对目前报道的核盘菌转化方法进行总结表明：农杆菌介导的转化和PEG介导的转化是核盘菌中最常用的转化方法。虽然Rollins(Rollins，2003)报道的PEG介导的核盘菌原生质体转化方法，是目前被他人引用次数最多的核盘菌转化方法，该方法目前仅用于获得核盘菌某个基因被敲除的转化子。已有大量文献证明丝状真菌转化时，农杆菌转化方法与PEG转化方法相比，农杆菌转化方法具有转化效率高、转化子T-DNA为单拷贝、随机插入频率高等优点。此外PEG转化时的受体只能为原生质体，而高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。因此农杆菌介导的核盘菌转化理论上效率比PEG介导的转化更高。农杆菌介导的核盘菌转化目前仅报道了用于转化核盘菌的菌丝和子囊孢子。虽然菌丝是最容易获取的转化受体，但是菌丝细胞为多核，外源基因整合到多核细胞的染色体上会出现三种不同现象：(1)所有的细胞核中的外源基因都整合到染色体的相同位点而形成同核体，但这种概率极低；(2)外源基因整合到其中一个细胞的染色体中；(3)外源基因整合到几个细胞核的染色体不同位点。第(2)和第(3)种情况获得的转化子为异核体，而如果是用于遗传研究必须用同核体的转化子(Bashi Zafer Dallal et al.，2010)。核盘菌子囊孢子的细胞核数目比菌丝少，只有两个细胞核，因此比菌丝转化获得单拷贝转化子的可能性大。Weld等(2006)报道的农杆菌介导的子囊孢子转化效率为每5×10⁸个子囊孢子获得一个转化子，该转化效率远比其它真菌孢子转化效率低；且转化子平均T-DNA拷贝数仍比较多，平均为2.5个拷贝。此外获得成熟的子囊孢子需要长达两个月以上时间，某些核盘菌菌株在实验室环境甚至难以产生子囊孢子。原生质体也为多核，但是原生质作为转化受体具有群体数目多、且没有细胞壁限制的影响，因此比菌丝被转化的几率大。有大量报道称原生质体制备繁琐，或不同批次的酶活性不一致，导致原生质体制备试验不能很好的重复(Weld et al.，2006；Levyet al.，2008；Bashi Zafer Dallal et al.，2010)，是使用原生质体作为转化受体的主要问题。因此原生质体作为转化受体，仍有问题需要解决。

总之，目前已经报道的核盘菌转化方法都存在一定的缺点，更没有建立核盘菌突变体库的报道。缺乏高效、稳定的遗传转化体系成为核盘菌分子生物学研究的瓶颈。因此，对现有的核盘菌遗传转化方法进行改进或创建新的高效的核盘菌遗传转化体系对推动核盘菌分子生物学研究意义重大。

发明内容

本发明目的在于解决现有的核盘菌遗传转化难题，提供一种简单、稳定、高效的核盘菌的遗传转化方法。本发明的方法是，将含有双元载体的根癌农杆菌与核盘菌的原生质体混合后共培养，用抗生素筛选，获得转化子，该方法转化效率可达1/5.9×10⁴个原生质体。本发明以核盘菌的原生质体为受体，以根癌农杆菌为介体，克服了核盘菌菌丝细胞为多核，且子囊孢子难以大量获得等原因导致的核盘菌遗传转化困难的问题，提供了一种简单方便、转化效率稳定的核盘菌的遗传转化方法。同时本发明也提供了一种简单高效的核盘菌原生质体制备方法。

本发明的具体方案如下：

1、核盘菌原生质体的制备及保存

(1)将核盘菌Sunf-M接种于PDA培养基上，于20℃培养活化。

PDA制作同常规方法，其步骤如下：200g去皮马铃薯，加适量蒸馏水煮制后加葡萄糖20g，琼脂13g，补充蒸馏水至1000ml。

(2)将活化后的核盘菌Sunf-M接种至铺有玻璃纸的PDA平板上，20℃培养48h后收集核盘菌菌丝。

(3)取核盘菌菌丝用灭菌的研钵将菌丝磨碎后接种到100ml的PDB(PDB的配制方法同PDA，但培养基中不加琼脂)培养基中，于150r/min 20℃振荡培养24h后6000r/min，离心10min，弃上清。收集沉淀的菌丝，用灭菌的0.8M MgSO₄洗涤一次。

(4)用灭菌的0.8M MgSO₄配制酶液，酶液含0.15％(w/v)的蜗牛酶(Snailase)及1.5％(w/v)的裂解酶(购自Sigma公司)。酶液10000r/min 4℃离心10min，取上清用细菌过滤器过滤两次除菌。

(5)取步骤1(3)中洗涤后的菌丝与步骤1(4)中的酶液混匀，比例为菌丝鲜重∶酶液＝0.25-0.35g∶1ml(w/v)。30℃100r/min振荡培养2h，镜检原生质体释放情况，若菌丝酶解不完全则适当延长酶解时间至3h或4h。

(6)菌丝释放原生质体2-4h后，于6000r/min 4℃离心15min，弃上清，用100μl STC液溶解沉淀物，并用STC液稀释到约10⁶个/ml。获得的原生质体加入8％(v/v)的二甲基亚砜(DMSO)，混匀后转入灭菌的Eppendorf管中，于-80℃保存备用。

STC液配方为：1.2M山梨醇，10mM Tris-pH 7.5，50mM CaCl₂。

(7)制备的原生质体中会含有核盘菌菌丝碎片，但该菌丝碎片也可以用于转化。

2、农杆菌的培养

(1)采用电击转化方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本实施例所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)将质粒pTFCM(参见：Li et al.，2005)转入根癌农杆菌中。

(2)挑取农杆菌单菌落于LB液体培养基中，于220r/min，28℃下振荡培养24h。

固体LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂13g，补ddH₂O至1000ml，pH7.0。

液体LB配方同固体LB，但不添加琼脂。

固体及液体LB培养基在使用前添加50μg/ml链霉素、50μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素。

链霉素及卡那霉素的配方为：取10mg链霉素或卡那霉素用ddH₂O溶解后定容到1ml，配成浓度为10mg/ml的链霉素或卡那霉素，细菌过滤器过滤两次除菌后，于-20℃贮存备用。

利福平配方为：取10mg利福平用甲醇溶解后定容到1ml，配成浓度为10mg/ml的利福平，细菌过滤器过滤两次除菌后，于-20℃贮存备用。

(3)取100μl的农杆菌菌液移至20ml MM培养基中，于220r/min，28℃振荡培养12h。MM培养基使用前加入50μg/ml卡那霉素。

MM培养基参考Hooykaas et al.，1979，并稍作修改；配方如下：

K缓冲液(K₂HPO₄200g，KH₂PO₄145g，补ddH₂O至1000ml)10ml，M-N缓冲液(MgSO₄·7H₂O 30g，NaCl 15g，补ddH₂O至1000ml)20ml，葡糖糖2g，0.01％FeSO₄10ml，20％(NH₄)₂SO₄2.5ml，1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1ml，补ddH₂O至1000ml，以H₃PO₄或NaOH调培养基的pH至7.0。

(4)将MM培养基中的农杆菌菌液于4000r/min，25℃离心10min后弃上清，沉淀用IM培养基重悬浮并稀释至OD₆₀₀＝0.15，加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度为400μM，于150r/min，28℃，黑暗条件下诱导培养6h。

IM培养基参考Hooykaas et al.，1979，并稍作如下修改；配方如下：

K缓冲液(组分同步骤2(3))10ml，M-N缓冲液(组分同步骤2(3))20ml，葡糖糖1g，0.01％FeSO₄10ml，20％(NH₄)₂SO₄2.5ml，1％CaCl₂·2H₂O 1ml，50％甘油(w/v)10ml，2-(N-吗啉)乙磺酸钠7.808g，补ddH₂O至1000ml，用H₃PO₄或NaOH调培养基的pH至6.0。

乙酰丁香酮(AS)配制：取AS0.1962g用二甲基亚砜溶解后定容到10ml，配成终浓度为0.1M的AS，于-20℃贮存备用。

3、农杆菌与核盘菌原生质体共培养

(1)取步骤1(5)中保存的核盘菌原生质体与液体RM培养基按1∶3(v/v)的比例混匀，20℃，100r/min振荡培养19h。将上述准备好的农杆菌及原生质体按1∶1(v/v)的比例混合均匀，在20℃，100r/min黑暗条件下振荡培养40min。

液体RM培养基配方为：蔗糖0.7mol，酵母提取物1g，补ddH₂O至1000ml。

(2)将原生质体与农杆菌混合液按200μl/皿的量均匀涂布到铺有玻璃纸的CO-IM培养基上，CO-IM培养基在使用前加入AS至终浓度为200μM。将培养皿在超净工作台中吹至半干，20℃黑暗条件下培养2天。2天后观察玻璃纸上是否有核盘菌菌丝生长，如果有则进行下面步骤4的操作，如果无，则共培养3天后进行下面步骤4的操作。

CO-IM培养基配方同步骤2(4)中IM培养基，每1000ml培养基添加13g琼脂。

4、转化子的筛选及保藏

将步骤C(2)中的玻璃纸移至另一灭过菌的空培养皿中，使有菌丝的一面朝上，玻璃纸上覆盖附加30μg/ml潮霉素和50μg/ml头孢霉素的PDA培养基，于20℃下培养，将长出的核盘菌菌丝接种至附加30μg/ml潮霉素和50μg/ml头孢霉素的PDA培养基上，得到核盘菌的候选转化子；将该候选转化子接种至附加30μg/ml潮霉素的PDA培养基上，连续培养三代得到稳定的核盘菌转化子。

转化子的保藏：将核盘菌转化子接种于附加30μg/ml潮霉素的PDA培养基的Eppendorf管斜面上，于4℃下保存，同时收集核盘菌转化子的菌核，于37℃烘干后置4℃下保藏。

头孢霉素的配制方法为：取100mg头孢霉素用ddH₂O溶解后定容到1ml，配成浓度为100mg/ml的头孢霉素，细菌过滤器过滤两次除菌后，于-20℃贮存备用。

在上述制备步骤中，除非特别说明，所有培养基及无菌试验用品均按照常规的高压蒸汽灭菌方法灭菌(121℃高压蒸汽灭菌30min)，室温保存备用。

本发明建立了一种农杆菌介导的核盘菌遗传转化体系，提供了核盘菌原生质体的制备保存方法，特别是提供了一种核盘菌转化子纯化方法，是对现有技术的一个革新。与现有技术相比本发明具有以下优点：

1.原生质体制备方法与已经报道的核盘菌原生质体制备方法相比更为简单，同时已经证实此方法也适宜于稻瘟菌(Magnaporthe grisea)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、盾壳霉(Coniothyrium minitans)等多种丝状真菌。

2.原生质体可以一次性大量制备并长期保存，根据试验需要随时取用。

3.以原生质体作为转化受体，便于外源基因的导入。与采用子囊孢子为转化受体相比，原生质体材料制备技术简单，且可以长期保存，随用随取，操作方便；与采用菌丝为转化体相比，原生质体没有细胞壁的限制，更利于外源基因的进入。

4.以根癌农杆菌作为转化介体，具有转化效率高、转化子为单拷贝的频率高等优点。而转化介体PEG则对细胞存在毒害性。

5.本发明的方法转化效率高，约每5.9×10⁴个原生质体即可以获得1个转化子，而已报道的子囊孢子为受体进行的转化效率为每5×10⁸个子囊孢子获得一个转化子，效率提高了约10000倍。

6.建立的以原生质体为受体的转化方法应用广泛，几乎适用于所有的丝状真菌。尤其是对于菌丝细胞为多核，且不易获得孢子或孢子也为多核的丝状真菌，可以参考该方法进行遗传转化。此外某些可以产生单核的孢子的真菌，如果其遗传转化后的突变体不能产生孢子，需要对突变体进行基因功能互补研究时，也可以参考此说明方法。

利用本方法成功以含有不同质粒的根癌农杆菌，转化了多种核盘菌菌株，构建了核盘菌菌株T-DNA随机插入突变体库，并用该方法对多种不同营养亲和型的核盘菌部分基因进行了沉默或敲除，而且经多次重复实验具有相同转化效率。

这是国内外首次报道利用农杆菌介导转化核盘菌的原生质体，获得大量核盘菌的转化子。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是潮霉素磷酸转移酶基因(Hph)片段的核苷酸序列。

图1、本发明提供的农杆菌介导的核盘菌原生质体转化操作示意简图。

图2、是实施例1中核盘菌Sunf-M的原生质体。图中：

A为核盘菌原生质体释放情况；B为获得的核盘菌原生质体。

图3、是实施例1中所用质粒pTFCM的图谱。

图4、实施例1中核盘菌Sunf-M的原生质体在液体RM培养基中培养动态。

图5、实施例1中出发菌株Sunf-M及部分转化子菌落形态(PDA，20℃20d)。图中：

A为核盘菌菌株Sunf-M；B～T为核盘菌菌株Sunf-M的转化子

图6、实施例1中随机挑选的转化子潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的PCR扩增的电泳图谱。图中：

泳道1～12：核盘菌Sunf-M菌株的转化子；泳道13：质粒pTFCM；

泳道14：Sunf-M；泳道15：水(对照)；泳道M：DNA marker

图7、实施例1中随机挑选的转化子以潮霉素磷酸转移酶基因(hph)片段为探针进行的Southern杂交的图谱。图中：泳道1：DNA Marker；泳道2：Kpn I酶切的质粒pTFCM；泳道3：Kpn I酶切的核盘菌Sunf-M；泳道4：空白对照；泳道5～7：Kpn I酶切的SunF-M转化子；泳道8～11：Xho I酶切的Sunf-M转化子；泳道12～13：Sac I酶切Sunf-M转化子。

图8、实施例2中盾壳霉ZS-1菌株原生质体用血球计数板计数。

图9、实施例2中水稻纹枯病菌WH-1菌丝酶解2h后原生质体释放情况。

图10、实施例2中-80℃保存1个月后核盘菌Sunf-M的原生质体在RM培养基上再生情况(20℃，4d)。

图11、核盘菌Sunf-M的原生质体与农杆菌混合液共在铺有玻璃纸的CO-IM培养基上培养2天的生长情况。

具体实施方式

为了更详细方便地陈述该发明方法，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明(为例节约篇幅，具体步骤及其培养基成分参见本说明书的《发明内容》部分)。

实施例1：核盘菌菌株Sunf-M的T-DNA随机插入突变体库的构建

1.转化受体核盘菌菌株Sunf-M原生质体的制备

将核盘菌菌株Sunf-M(Xie Jun et al.，Journal of General Virology.2006，87，241-249)接种至PDA培养基上，于20℃培养，连续挑取生长旺盛的核盘菌Sunf-M菌落边缘菌丝块转接2代活化菌株。

取活化后的核盘菌菌株Sunf-M菌落边缘菌丝块3块，接种在1皿铺有玻璃纸的PDA平板上。48h后收集菌丝，用灭菌的研钵将菌丝磨碎后加入3ml PDB，并用装有灭菌枪头的移液器吸吐混匀。吸取菌丝碎片接种到100ml的PDB培养基中，150r/min 20℃振荡培养24h后6000r/min，离心10min，弃上清。向沉淀的菌丝用0.8M MgSO₄洗涤一次。取20ml 0.8M MgSO₄配制酶液，加入0.3g的蜗牛酶(Snailase)及0.03g的裂解酶(购自Sigma公司)，用移液器吸吐混匀。酶液于10000r/min 4℃离心10min中以沉淀难以溶解的酶，取上清用细菌过滤器过滤两次除菌。

用移液枪轻轻吸取少许洗涤后的菌丝，加入到酶液中，100r/min，30℃振荡培养酶解2h后，于6000r/min 4℃离心15min，弃上清，用100μl的STC液溶解沉淀物。取10μl STC溶解液稀释10倍后在显微镜观察下原生质体(见图2)，用血球计数板计数原生质体数目，然后用STC稀释至5×10⁶个/ml。将获得的核盘菌原生质体转入1.5ml灭菌的Eppendorf管中，加入二甲基亚砜至终浓度为10％，混匀后于-80℃保存备用。

原生质体保存浓度不需要太高，否则由于原生质体浓度过高，每皿得到的转化子数目太多，且核盘菌生长速度较快，最终无法挑取单个的转化子。

2.转化质粒的准备

利用质粒pTFCM为转化载体(参考Li et al.，2005，图谱见图3)。用碱裂解法提取质粒DNA，并制备农杆菌菌株EHA105的感受态细胞(参考Sambrook et al.，1989)，通过电击转化的方法将及质粒pTFCM转化到EHA105中。

3.转化介体农杆菌的培养

将含有质粒pTFCM的农杆菌菌株EHA105，在含有50μg/ml链霉素、50μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的固体LB平板上划线培养2天，挑取农杆菌单菌落接种到含50μg/ml链霉素、50μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，于220r/min 28℃振荡培养24h。然后取100μl的农杆菌菌液接种到含50μg/ml卡那霉素的20ml MM培养基中，220r/min 28℃振荡培养。12h后，将MM培养基中的菌液于4000r/min，25℃离心10min后弃上清，沉淀用IM培养基重悬浮，并稀释至OD₆₀₀＝0.15，加入AS至终浓度为400μM，150r/min 28℃黑暗条件下诱导培养6h。

4.核盘菌原生质体培养

将农杆菌菌液接种到MM培养基培养的同时，从-80℃冰箱中取出保存的核盘菌Sunf-M的原生质体，冰上融化。取融化后的原生质体1ml与3ml液体RM培养基混匀，100r/min 20℃振荡培养，每隔1小时观察一次原生质体生长情况，根据原生质体培养后生长动态，选取萌发19小时的原生质体(见图4)与农杆菌进行共培养。将IM培养基中诱导培养后的农杆菌菌液及培养19h后的原生质体按1∶1(v/v)的比例混匀，100r/min，20℃黑暗条件下振荡培养40min。

5.核盘菌原生质体与农杆菌共培养

取农杆菌与原生质体混合液按200μl/皿的量均匀涂布到铺有玻璃纸的CO-IM培养基上，CO-IM培养基在使用前加入AS至终浓度为200μM。将培养皿在超净工作台中吹至半干，20℃黑暗条件下培养，根据玻璃纸上核盘菌菌丝生长情况共培养2天或3天。

6.选择性培养

将CO-IM培养基中的玻璃纸转移至另一灭菌的空培养皿中，菌丝的一面朝上，玻璃纸上覆盖含30μg/ml潮霉素和50μg/ml头孢霉素的PDA培养基。一旦有菌丝长出，立即挑出接种到含30μg/ml潮霉素和50μg/ml头孢霉素的PDA培养基上，并继续在含30μg/ml潮霉素的PDA培养基上连续培养三代至生长稳定，菌丝从6cm培养皿的一端生长到另一端为生长了一代。最终获得的表型稳定的转化子在含30μg/ml潮霉素的PDA培养基的斜面上保存，同时收集转化子的菌核，37℃烘干后置于4℃保存。

通过该方法获得了大量核盘菌Sunf-M的转化子，构建了核盘菌Sunf-M的T-DNA插入突变体库。筛选获得菌核形成缺陷型、致病力缺陷型、生长速度缺陷型等各种类型的菌株Sunf-M突变体(部分转化子菌落形态见图5)。

7.核盘菌Sunf-M的转化子PCR鉴定

随机选取12个转化子，经过10代的连续培养后，转化子菌落形态不发生变化。利用PCR扩增转化子T-DNA上的潮霉素磷酸转移酶基因片段，对转化子进行验证。

(1)提取转化子的基因组DNA：用铺有玻璃纸的含有30μg/ml潮霉素的PDA平板培养转化子，3天后收集菌丝，提取转化子基因组DNA(Sambrook，et al.，1989)。

具体方法为：称取2g核盘菌菌丝置于研钵中，在液氮中充分研磨成粉末状，转入10ml的离心管中。加入3ml经65℃预热的提取缓冲液，充分混匀后，置于65℃水浴锅中水浴20min，期间每隔3min轻轻颠倒混匀一次；12000r/min离心10min，取上清，加入3ml氯仿，振荡均匀；12000r/min离心15min；取上清液于另一新离心管中，加入两倍体积的沉淀缓冲液混合均匀，室温沉淀30min；然后12000r/min离心15min，收集沉淀(尽量取出多余的液体)；将沉淀重新悬浮于2ml 1M NaCl中，并加入等体积的氯仿/苯酚(v/v＝1/1)混匀，12000r/min离心15min；取上清，再加入等体积的氯仿12000r/min离心15min；取上清，加入两倍体积-20℃预冷的无水乙醇混匀；-20℃沉淀30min后，12000r/min 4℃离心15min，弃上清，沉淀用70％酒精洗涤三次，获得DNA沉淀37℃干燥后，加适量的TE溶解，于-20℃或-80℃保存备用。所有的DNA样品用分光光度计检测，并经1％的琼脂糖凝胶电泳，分析DNA的含量及质量。

其中，提取缓冲液配方为：2％CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，w/v)，2％PVP(聚乙烯吡咯烷酮，w/v)，1.4M NaCl，0.1M的三羟甲基氨甲烷-盐酸(Tris-HCl)，0.02M乙二胺四乙酸(EDTA)。

沉淀缓冲液配方为：0.05M Tris-HCl，pH 8.0；1％CTAB(w/v)；0.01M EDTA。

TE配方为：10mM Tris-HCl(pH 8.0)1mM EDTA(pH 8.0)，50μg/ml RNAase A。

(2)以质粒pTFCM为阳性对照，以核盘菌野生型菌株Sunf-M及无菌水为阴性对照，用潮霉素磷酸转移酶基因特异引物hphFP(5’CAG CGT CTC CGA CCT GAT 3’)和hphRP(5’TCT GCG GGC GAT TTG T3’)对转化子基因组DNA进行PCR鉴定。

PCR扩增体系：DNA 50-100ng，10×PCR buffer(含Mg²⁺)2.5μl，10mM dNTPs 0.5μl，rTaq酶(5U/μl，购自宝生物工程(大连)有限公司，中国辽宁省大连市)0.2μl，引物hphFP和hphRP(10μM)各1μl，补ddH₂O至25μl。

PCR反应程序：95℃预变性5min；进入PCR循环，每个循环为94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；然后72℃延伸10min。PCR产物按照常规方法用1％琼脂糖凝胶进行电泳，经凝胶成像系统成像观察并记录电泳结果。

所有供试转化子及质粒pTFCM均能扩增出预期的877bp大小的片段，而未经转化的野生型菌株及无菌水对照则扩增不到相应大小的片段，说明转化子含有插入的T-DNA片段(见图6)。

为了进一步证实PCR扩增结果的可靠性，取PCR扩增产物用回收试剂盒(购自AXYGEN公司，中国浙江省杭州市，按照试剂盒的说明书操作)纯化后进行测序。Blast分析表明PCR扩增产物均为潮霉素磷酸转移酶基因(Hph)片段(其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：1所示)。证明T-DNA已经成功转入核盘菌Sunf-M的染色体，且可以稳定遗传。

8.核盘菌Sunf-M的转化子Southern杂交检测

(1)DNA样品制备

随机选取部分转化子，参照实施例1中步骤6中的核盘菌菌丝收集及DNA提取方法，提取转化子基因组DNA。

用限制性核酸内切酶Kpn I、Xho I或Sac I(购自宝生物工程(大连)有限公司，中国辽宁省大连市)分别完全酶切转化子及阴性对照菌株Sunf-M的基因组DNA。酶切体系：转化子基因组DNA 15μg，限制性核酸内切酶15U，加入30μl对应的Buffer，补ddH₂O至300μl，37℃酶切过夜(12h-18h)。

取10μl酶切产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。基因组DNA酶切充分后，加入5μl核酸共沉剂(购自宝生物工程(大连)有限公司，中国辽宁省大连市)及600μl无水乙醇混匀，于-20℃沉淀过夜后，12000r/min 4℃离心20min，70％的乙醇洗涤，干燥后溶解于20μl TE中。

同时，用限制性核酸内切酶Kpn I酶切质粒pTFCM的DNA，作为阳性对照，酶切体系：pTFCM 20μl，Kpn I 2μl，10×L Buffer 5μl，ddH₂O 23μl。37℃酶切2h。用上述相同方法纯化酶切产物并溶于TE中。

将获得的酶切产物56℃处理3min，然后冰上骤冷。用0.7％的琼脂糖凝胶电泳，以小于1V/cm的电压电泳18h。然后，用毛细管转移法将琼脂糖凝胶里的酶切产物转移至尼龙膜(Hybond N⁺，Amersham公司)上(参考Sambrook et al.，1989)。

(2)探针标记

用引物hphFP和hphRP从pTFCM中扩增Hph片段(引物序列及PCR反应程序同实施例1中步骤6)，并用回收试剂盒回收扩增的片段。以随机引物法用Random Primer DNA Labeling Kit(购自宝生物工程(大连)有限公司，中国辽宁省大连市)对回收片段进行α-³²P(购自北京福瑞公司)标记作为探针，按照试剂盒的说明书操作。

(3)Southern杂交

将标记后的探针与转移至尼龙膜上的酶切产物进行杂交(参考Sambrook et al.，1989)。杂交后的尼龙膜置于磷屏盒中压膜后，扫描磷屏，对杂交结果进行分析。

结果如图7所示，转化子均能检测到杂交信号，并且杂交信号表现了丰富的带型，表明T-DNA在转化子中为随机插入。

实施例2：可行性分析实施例

虽然核盘菌原生质体比菌丝容易转化，且比子囊孢子容易获取，但已经报道的核盘菌转化用的原生质体制备需要配制多种不同的溶液，且需要用多次用不同的溶液洗涤菌丝或原生质体(Rollins，2003；杨雷等，2006)，因此核盘菌原生质体制备复杂成为利用原生质体作为转化受体的最大缺点。本发明针对原生质体制备及原生质体保存等条件进行了优化。发明中提供的核盘菌原生质体制备方法只需配制MgSO₄及STC溶液，并只需要用MgSO₄液洗涤一次菌丝，获得的原生质体不需要洗涤等处理，且原生质体可以DMSO保存，而不需要配制成分复杂的保存液。此外发明中提供的转化方法原生质体所需浓度(10⁶个/ml)比PEG介导的转化所需浓度低(10⁸个/ml)。结合具体实施列对利用原生质体制备进行转化可行性进行分析，如下：

1.盾壳霉及水稻纹枯病菌原生质体制备

利用本发明所提供的方法，制备了盾壳霉(Coniothyrium minitans)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、稻瘟菌(Magnaporthe grisea)等多种丝状真菌的原生质体，证明本发明提供的方法稳定性及使用范围。下面分别以能产生分生孢子但生长速度较慢的菌株盾壳霉和不能产生分生孢子但生长速度较快的菌株水稻纹枯病菌为例，对本发明提供的原生质体制备方法再做详细说明。

(1)盾壳霉(Coniothyrium minitans)原生质体制备

取产生分生孢子后的盾壳霉菌株ZS-1(Li et al.，2005)按照实施例1中步骤1接种玻璃纸3天后收集菌丝1皿，用灭菌的研钵磨碎后接种PDB培养基，吸取菌丝碎片接种到100ml的PDB培养基中，150r/min20℃振荡培养24h后6000r/min，离心10min，弃上清。然后按照实施例1中步骤1中所述方法进行后续操作。能够产生分生孢子的菌株用该方法制备原生质体技术要点在于取含有孢子的菌丝块接种玻璃纸，这样接种到PDB的菌丝碎片中也会含有大量孢子，萌发的孢子生长出的鲜嫩的菌丝更容易释放原生质体。如图8所示，盾壳霉原生质体稀释100倍后用血球计数板计算浓度。

(2)水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)原生质体制备

取水稻纹枯病菌WH-1(Xie et al.，2008)按照实施例1中步骤1接种玻璃纸2天后收集菌丝1皿，用灭菌的研钵磨碎后接种PDB培养基，吸取菌丝碎片接种到100ml的PDB培养基中，150r/min 20℃振荡培养12h后6000r/min，离心10min，弃上清。然后按照实施例1中步骤1中所述方法进行后续操作。生长较快的菌株用该方法制备原生质体技术要点在于PDB中振荡培养菌丝碎片的时间不能过长。水稻纹枯病菌菌丝酶解2h后菌丝尖端原生质体释放情况见图9。

从上面两个具体实施例可以看出，本发明提供的核盘菌原生质体制备方法是可行的，同时该方法对其它多种丝状真菌也适用。

2.原生质体的纯化

利用本发明提供的核盘菌原生质体方法获得的原生质体中会有核盘菌的菌丝碎片，但核盘菌的菌丝碎片也可以用于转化。然而有些试验中需要使用纯化的原生质体，对本发明提供的原生质体制备方法稍加改变即可。具体方法为将《发明内容》中的步骤1(6)改为：在原生质体达到足够的量时，用铺有两层灭菌的擦镜纸的漏斗过滤酶液。收集滤液，于6000r/min 4℃离心15min，弃上清，用STC液溶解沉淀物。

3.核盘菌原生质体的保存

(1)用DMSO可以保存动物细胞，保存所需DMSO的浓度一般为5％-10％(v/v)。为确定核盘菌原生质体能否用DMSO直接保存，及保存所需的DMSO最佳使用浓度，按照实施例2中“原生质体纯化”方法制备核盘菌原生质体。取新鲜的核盘菌Sunf-M的原生质体，用1ml STC液溶解后，各取100μl分装到10个Eppendorf管中，分别加入1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的DMSO(v/v)，于-80℃保存。1个月取用不同浓度DMSO保存的原生质体，稀释相同倍数后均匀涂布在固体RM培养基(配方同液体RM培养基，此外每1000ml培养基加13g琼脂)平板上。3天后计数RM平板上的再生菌株菌落数目，浓度为1％-10％的DMSO保存的原生质体在RM培养基都能再生，7％-10％的DMSO保存的原生质体再生菌株菌落数目明显高于其它浓度，其中DMSO浓度为8％时菌落数目最多。图10所示为保存1个月后的原生质体在RM培养基上再生情况。

(2)由于核盘菌原生质体与农杆菌混合后是在铺有玻璃纸的CO-IM培养基上共培养，为确定核盘菌原生质体在该条件下是否能够再生，观察了该条件下原生质体的再生情况。取按上述方法用8％的DMSO保存的核盘菌原生质体，按《说明书内容》步骤3(1)和步骤3(2)所述的方法，将原生质体在RM培养基中培养19h后与IM诱导后的农杆菌按1∶1(v/v)的比例混匀后，100r/min 20℃黑暗条件下振荡培养40min。然后取农杆菌与原生质体混合液按200μl/皿的量均匀涂布到铺有玻璃纸的CO-IM培养基上，CO-IM培养基在使用前加入AS至终浓度为200μM。将培养皿在超净工作台中吹至半干，20℃黑暗培养2天。如图11所示，可见核盘菌菌丝生长。

因此可以使用DMSO在低温条件下较长时间保存核盘菌原生质体，并用于核盘菌的遗传转化。这种保存方法比Rollins(2003)采用的保存方法保存液成分简单。Rollins提供的原生质体保存方法为：用1ml STC液溶解原生质体，并加入250μl PEG(40％PEG 3350，50mM Tris-HCl，pH 7.5，50mM CaCl₂)，1％(v/v)DMSO和0.3mg肝素。

原生质体的简单长期保存使本发明提供的转化方法更加简单。虽然原生质体制备比菌丝准备过程复杂，但原生质体只需一次制备，就可以长期保存、多次使用，而使用菌丝或子囊孢子为受体进行转化，每次转化都需要花长时间准备新鲜的转化受体材料。因此，用DMSO保存核盘菌原生质体用于转化试验与其它方法相比具有明显的优势。

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序列表

110 华中农业大学

120 一种根癌农杆菌介导的核盘菌的遗传转化方法

130

141 2010-04-16

160 1

170 PatentIn version 3.1

210 1

211 877

212 DNA

213 潮霉素磷酸转移酶基因(Hph)

220

221 gene

222 (1)..(877)

223

400 1

tctgcgggcg atttgtgtac gcccgacagt cccggctccg gatcggacga ttgcgtcgca     60

tcgaccctgc gcccaagctg catcatcgaa attgccgtca accaagctct gatagagttg    120

gtcaagacca atgcggagca tatacgcccg gagccgcggc gatcctgcaa gctccggatg    180

cctccgctcg aagtagcgcg tctgctgctc catacaagcc aaccacggcc tccagaagaa    240

gatgttggcg acctcgtatt gggaatcccc gaacatcgcc tcgctccagt caatgaccgc    300

tgttatgcgg ccattgtccg tcaggacatt gttggagccg aaatccgcgt gcacgaggtg    360

ccggacttcg gggcagtcct cggcccaaag catcagctca tcgagagcct gcgcgacgga    420

cgcactgacg gtgtcgtcca tcacagtttg ccagtgatac acatggggat cagcaatcgc    480

gcatatgaaa tcacgccatg tagtgtattg accgattcct tgcggtccga atgggccgaa    540

cccgctcgtc tggctaagat cggccgcagc gatcgcatcc atggcctccg cgaccggctg    600

cagaacagcg ggcagttcgg tttcaggcag gtcttgcaac gtgacaccct gtgcacggcg    660

ggagatgcaa taggtcaggc tctcgctgaa ttccccaatg tcaagcactt ccggaatcgg    720

gagcgcggcc gatgcaaagt gccgataaac ataacgatct ttgtagaaac catcggcgca    780

gctatttacc cgcaggacat atccacgccc tcctacatcg aagctgaaag cacgagattc    840

ttcgccctcc gagagctgca tcaggtcgga gacgctg                             877

Claims (1)

1.一种根癌农杆菌介导的核盘菌的遗传转化方法，其特征在于下列步骤：

A.核盘菌原生质体的制备及保存

(1)将核盘菌Sunf-M接种于PDA培养基上，于20℃培养活化；

(2)将活化后的核盘菌Sunf-M接种于铺有玻璃纸的PDA培养基上20℃培养，48h后收集菌丝；

PDA培养基配方如下：200g去皮马铃薯，加适量蒸馏水煮制后加葡萄糖20g，琼脂13g，补充蒸馏水至1000ml，pH7.0；

(3)取步骤A(2)的菌丝，用灭过菌的研钵将菌丝磨碎后接种至PDB培养基内，于150r/min，20℃振荡培养24h后，在6000r/min下离心10min，弃上清，收集沉淀的核盘菌菌丝，用灭过菌的0.8M MgSO₄溶液洗涤核盘菌菌丝一次；

PDB培养基配方同所述的PDA培养基，但不加琼脂；

(4)用灭过菌的0.8M MgSO₄配制酶液，该酶液的配方如下：按w/v计，0.15％蜗牛酶，1.5％裂解酶，将配制好的酶液于10000r/min，4℃下离心10min，取上清，用细菌过滤器过滤进行两次除菌；

(5)取步骤A(3)中洗涤后的核盘菌菌丝与步骤A(4)的酶液混匀，按照以下比例：核盘菌菌丝0.25-0.35g，酶液1ml，于30℃，100r/min振荡培养2-4h使核盘菌的原生质体释放，得到核盘菌原生质体；

(6)将步骤A(5)的核盘菌原生质体于6000r/min，4℃，离心15min，弃上清，用100μl的STC液溶解沉淀物，用STC液稀释核盘菌原生质体至10⁶个/ml，并将核盘菌原生质体与按v/v计，8％的二甲基亚砜混匀后分装于Eppendorf管中，于-80℃保存备用；

所述的STC液的配方如下：

1.2M山梨醇，10mM Tris-pH 7.5，50mM CaCl₂；

B.农杆菌的培养

(1)采用电击转化方法将质粒pTFCM转入根癌农杆菌中；

(2)挑取步骤B(1)的农杆菌单菌落接种于附加50μg/ml链霉素、50μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，于220r/min，28℃振荡培养24h；

其中：LB培养基配方如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，补ddH₂O至1000ml，pH7.0；

(3)取步骤B(2)的农杆菌菌液100μl至附加50μg/ml卡那霉素的MM培养基中，于220r/min，28℃振荡培养12h；

其中：MM培养基配方如下：

K缓冲液配制：K₂HPO₄ 200g，KH₂PO₄ 145g，补ddH₂O至1000ml，使用量为10ml；

M-N缓冲液：MgSO₄·7H₂O 30g，NaCl 15g，补ddH₂O至1000ml，使用量为20ml；

其他成分：葡糖糖2g，0.01％FeSO₄ 10ml，20％(NH₄)₂SO₄ 2.5ml，1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1ml，补ddH₂O至1000ml，pH7.0； 

(4)将MM培养基中的农杆菌菌液于4000r/min，25℃离心10min后弃上清，沉淀用IM培养基重悬浮，将农杆菌液稀释至OD₆₀₀＝0.15，加入乙酰丁香酮至终浓度为400μM，于150r/min，28℃黑暗条件下诱导培养6h；

其中：IM培养基配方如下：

K缓冲液配制：K₂HPO₄ 200g，KH₂PO₄ 145g，补ddH₂O至1000ml，使用量为10ml；

M-N缓冲液：MgSO₄·7H₂O 30g，NaCl 15g，补ddH₂O至1000ml，使用量为20ml；

其他成分：葡糖糖1g，0.01％FeSO₄ 10ml，20％(NH₄)₂SO₄ 2.5ml，1％CaCl₂·2H₂O 1ml，50％甘油(w/v)10ml，2-(N-吗啉)乙磺酸钠7.808g，补ddH₂O至1000ml，pH6.0；

C.农杆菌与核盘菌原生质体共培养

(1)取步骤A(6)中保存的核盘菌原生质体，与液体RM培养基按v/v计，以1∶3的比例混匀，于20℃，100r/min振荡培养19h，使其活化；再将活化后农杆菌和核盘菌原生质体按v/v计，以1∶1的比例混合均匀，得到农杆菌-核盘菌原生质体混合液，于20℃，100r/min黑暗下振荡培养40min；

其中：RM培养基配方如下：0.7mol蔗糖，酵母提取物1g，补ddH₂O至1000ml；

(2)将步骤C(1)的农杆菌-核盘菌原生质体混合液按200μl/皿的量均匀涂布于铺有玻璃纸的终浓度为200μM的乙酰丁香酮的CO-IM培养基上，将培养皿在超净工作台中吹至半干，于20℃黑暗培养2天；观察玻璃纸上核盘菌菌丝的生长情况；

其中：CO-IM培养基配方如下：

K缓冲液配制：K₂HPO₄ 200g，KH₂PO₄ 145g，补ddH₂O至1000ml，使用量为10ml；

M-N缓冲液：MgSO₄·7H₂O 30g，NaCl 15g，补ddH₂O至1000ml，使用量为20ml；

葡糖糖1g，0.01％FeSO₄ 10ml，20％(NH₄)₂SO₄ 2.5ml，1％CaCl₂·2H₂O 1ml，50％甘油(w/v)10ml，2-(N-吗啉)乙磺酸钠7.808g，13g琼脂，补ddH₂O至1000ml，pH6.0；

D.转化子的筛选及保存

将步骤C(2)中的玻璃纸移至另一灭过菌的空培养皿中，使有菌丝的一面朝上，玻璃纸上覆盖附加30μg/ml潮霉素和50μg/ml头孢霉素的PDA培养基，于20℃下培养，将长出的核盘菌菌丝接种至附加30μg/ml潮霉素和50μg/ml头孢霉素的PDA培养基上，得到核盘菌的候选转化子；将该候选转化子接种至附加30μg/ml潮霉素的PDA培养基上，连续培养三代得到稳定的核盘菌转化子。 

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