CN106367360A - 一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌的基因转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌的基因转化方法。一种农杆菌介导的蝉拟青霉基因转化方法，包括以下步骤：（1）制备蝉拟青霉（Paecilomyces cicadae）的分生孢子；（2）将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；（3）将步骤（2）得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤（1）中恢复培养后的分生孢子混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；（4）确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子。

Description

一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌的基因转化方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌的基因转化方法。
背景技术
蝉拟青霉菌(Paecilomyces cicadae)是一种虫生真菌，又称为蝉棒束孢霉(Isaria cicadae)，属半知菌类炭角菌科。蝉拟青霉菌可以感染竹蝉的若虫，形成似花朵状的子座称为蝉花，是我国的一种传统中药。其有性阶段被认为是大蝉草(Cordycepscicadae)。在自然界广为分布的是蝉拟青霉(蝉花)，大蝉草难以见到。
研究表明，蝉拟青霉菌丝体含有多糖、腺苷、虫草酸、麦角甾醇、多种必需氨基酸及生物碱等多种生物活性物质；其生物活性作用主要包括增强机体免疫调节功能、滋补强壮，提升机体的营养状况，解热镇痛、抗肿瘤和抗病，还有治疗疟疾，心悸（镇心）、血瘀症、抗癌症、增强免疫，激发巨噬细胞活性，促进脾脏细胞增殖、树突细胞的成熟等。但其分子遗传学研究还很初步，急需开发适用于蝉拟青霉的分子生物学技术，促进蝉拟青霉的进一步开发利用
随着现代生物技术的发展，分子生物学技术已经与传统生物学技术结合在一起，大大促进了生物学研究和生物产业的发展，无论是对生物细胞进行分子改造，还是克隆有用的基因，都需要建立外源基因转化进入细胞的转化体系，这是对细胞进行分子改造和研究的前提。针对蝉拟青霉这种具有重要经济价值的真菌，截止目前，我们还没有见到如何针对该菌进行基因转化的报道。
发明内容
本发明目的是针对上述不足之处提供了一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌基因转化方法，首次建立了针对蝉拟青霉菌的基因转化体系。
一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌基因转化方法是采取以下技术方案实现：
一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌基因转化方法，包括以下步骤：
（1）在PDA培养基上23℃-28℃培养蝉拟青霉菌5-7天，使其大量产孢。
（2）将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；
用冻融法将质粒转化到农杆菌中：
① 将农杆菌菌株AGL1在LB平板上划线活化，28℃培养2天；然后将1个单菌落转到5mLLB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
② 将2mL上述培养液转移到装有50mL的 LB液体培养基的三角瓶中，28℃振荡培养6小时，测定其吸光度，当OD600 =0.5～1.0时停止培养。
③ 将培养好的菌液放置在冰上，然后转移到50mL离心管中，在 4℃条件下，3000g离心5min。
④ 弃去上清液，沉淀用1mL预冷的20 mM CaCl2溶液悬浮，分装到预冷的1.5 mL离心管中，每管0.1mL。
⑤ 取4µL 的pTEGG质粒（0.25µg/µL）加入到含有0.1mL农杆菌的1.5 mL离心管中，盖好盖子，轻轻混匀，然后迅速放到液氮中冷冻。
⑥ 取出1.5 mL离心管，置于37℃水浴中保温5min，解冻。
⑦ 在1.5 mL离心管中加入1mL的LB培养液， 28℃下，100rpm轻摇培养2～4h。
⑧ 将离心管放入离心机中，12000rpm离心2min，弃去1mL培养液，然后将沉淀悬浮，涂布于含有50µg/mL卡那霉素的LB平板上，正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，28℃培养2～4天。
（3）将步骤（2）得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤（1）中培养得到的分生孢子混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；
① 从新鲜培养的LB平板（含50µg/mL卡那霉素）上挑选农杆菌单菌落接种于5mL LB液体培养基（含50µg/mL卡那霉素）中，200 r/min，28℃过夜培养；
② 第二天，取400µL培养液转移到5mL含50g/mL卡那霉素的诱导液体培养基（AIM）中，OD600值约0.15，28℃培养5～6个小时，使菌液的OD600达到0.5～0.6；
③同时将蝉拟青霉菌株PC-1的分生孢子浓度调整好（107个/mL）
④ 将100mL的IM固体培养基融化后，在室温冷却到50℃，然后加入乙酰丁香酮储备液200µL，卡那霉素储备液100µL，轻轻摇动混匀后，倒入6cm一次性塑料培养皿中，制成诱导平板；待培养皿中的培养基凝固后，将一张直径5cm的灭菌纤维素膜覆盖在培养基表面；
⑤ 取100µL培养好的农杆菌AGL-1（含载体）菌液和100µL转化材料混合，混合液均匀涂于诱导平板上的硝酸纤维素膜表面，22℃共培养48h；
⑥ 将100mL的PDA固体培养基融化后，在室温冷却到50℃，然后加入乙酰丁香酮储备液200µL，头孢霉素储备液100µL，链霉素储备液100µL，卡那霉素储备液100µL，G418储备液350µL，轻轻摇动混匀后，倒入6cm一次性塑料培养皿中，制成筛选平板；将诱导平板上的硝酸纤维素膜切成约0.5cm的条带，转移到筛选平板上，条带之间相隔约0.5cm ，置于在28℃培养7天，可以见到有菌丝长到硝酸纤维素膜条带之间的培养基上；
⑦ 挑取长出的菌丝，转移到含有360µg/mL的G418的PDA平板上，28℃培养5天，确认是否转化成功，如果能够生长，可确认转化成功；
（4）确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子；
1）从获得的转化子中随机挑选了6个转化子，在PDA培养基平板上28℃转接培养5次，然后再转接在含有360µg/mL的G418的PDA平板上，28℃培养5天，结果这6个转化子都可以生长，说明转化子的遗传稳定性好，转入的抗性基因稳定存在；
2）绿色荧光检测
将以上随机选择的6个转化子接种在PDA平板上，28℃培养5天。用挑针挑取少量菌丝，置于载玻片上，制成观察玻片，放到显微镜的载物台上。打开紫外光（450～490nm），观察绿色荧光。结果发现这6个转化子的菌丝都能发出绿色荧光，说明外源基因转化后可以进行稳定表达；
3）PCR检测
① 将随机挑选的6个转化子菌株在PDA平板上25oC生长7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300µL提取缓冲液的1.5mL离心管中；
提取缓冲液：1MKCl, 100mM Tris-HCl, 10mM EDTA，pH=8.0。
② 用电磨机将挑取的菌丝磨碎，然后再加入300μL提取缓冲液，剧烈震荡2 min；
③ 10000 rpm离心10min；
④ 吸取上清至另一离心管中，弃沉淀；
⑤ 加入等体积的异丙醇(分析纯)，沉淀核酸，轻轻颠倒混匀数次后，12000 rpm离心10min；
⑥ 轻轻倒去上清液，在吸水纸上排干水分；
⑦ 加入300µL 70%乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000 rpm离心2min；
⑧ 轻轻倒去上清液，在吸水纸上吸干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；
⑨ 用50µL ddH2O重悬沉淀，得到各转化子的基因组DNA，浓度达到30ng/µL。
⑩以各转化子的基因组DNA为模板，分别利用引物Pgpd-u/ G418d进行PCR扩增。
PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行，其中，PCR反应体系（50µL）：上下游引物各2µM，dNTPs 200µM，Mg2+ 1.5mM，10 ×PCR buffer 5µL，模版DNA 2μL，Taq酶2U。
PCR反应条件：94℃预变性2min，然后35个循环包括：94℃变性30sec，60℃退火40sec，72℃延伸1.5 min。最后72℃后延伸10min。
PCR反应结束后，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现这6个转化子中都出现了约1.4kb的电泳条带，说明抗G418基因稳定整合到蝉拟青霉的基因组中。
本发明以蝉拟青霉的分生孢子作为转化材料，利用农杆菌介导技术将外源目的基因转入蝉拟青霉的细胞内，并整合到蝉拟青霉的基因组中。如未作特殊说明，本发明所述潜在转化子是指，能在筛选平板上生长但未确定目的基因是否稳定存在于其基因组的转化子。
具体地，一种农杆菌介导的蝉拟青霉基因转化方法，包括以下步骤：
（1）培养收集蝉拟青霉的分生孢子；
（2）将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；
本发明中，将外源目的基因连接到含有G418抗性基因的质粒中，获得所述的质粒载体，再利用冻融法将质粒载体转化到农杆菌中。pTEGG质粒作为一种大肠杆菌-农杆菌穿梭表达载体，其带有GFP基因，GFP基因可作为荧光标记基因，鉴定外源目的基因是否整合到蝉拟青霉中。
冻融法操作简便，不需要其他仪器就可以完成农杆菌的转化。
本发明中，所述农杆菌为AGL-1。与其他农杆菌菌株相比，AGL-1更适用于子囊菌的基因转化。
（3）将步骤（2）得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤（1）中恢复培养后的分生孢子混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；
农杆菌与分生孢子的混合比例优选为：OD600为0.5~0.6的农杆菌100 μL与浓度为106cfu/mL（更优选为107cfu/mL）的分生孢子200μL混合。该混合比例下，每管转化材料在一个平板上最多长出20-30个转化子。
诱导平板一般是采用含有乙酰丁香酮（AS）的农杆菌生长培养基制成的，筛选平板一般是采用含有筛选物质（具体筛选物质视不同的外源目的基因而定）的蝉拟青霉生长培养基制成的。
乙酰丁香酮能够诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进T-DNA的加工与转移，使农杆菌中携带外源目的基因的T-DNA更易进入蝉拟青霉基因组并与其整合。
作为优选，所述诱导平板中含有0.1~0.3 mM的乙酰丁香酮。作为进一步优选，所述诱导平板中含有0.2 mM的乙酰丁香酮。AS浓度过高会对分生孢子产生毒害作用，影响转化效率。
以目的基因为G418抗性基因和绿色荧光霉素基因为例，相应的诱导平板是在100mL 冷却至50℃左右的IM固体培养基中加入乙酰丁香酮储备液（100mM）200µL，卡那霉素储备液（50 mg/mL）100µL，混匀后倒入培养皿制成的。在诱导平板中加入卡那霉素是因为农杆菌的质粒上含有卡那霉素抗性基因，加入卡那霉素是为了抑制除农杆菌以外的其它杂菌生长，防止杂菌污染。
相应的筛选平板则是在100mL 冷却至50℃左右的PDA固体培养基中加入乙酰丁香酮储备液（100mM）200µL，头孢霉素储备液（400 mg/mL）100µL，链霉素储备液（10 mg/mL）100µL，卡那霉素储备液（50 mg/mL）100µL，G418储备液（100mg/mL）350µL，混匀后倒入培养皿制成的。在筛选平板中加入头孢霉素、链霉素、卡那霉素这3种抗生素是为了抑制细菌的生长。
农杆菌与分生孢子在诱导平板上共培养的条件是影响转化效率的重要因素，本发明中，共培养的条件优选为22℃下共培养45~50 h；更优选为22℃下共培养48h。
诱导平板的表面覆盖有一层硝酸纤维素膜，农杆菌与分生孢子的混合物是涂布到该硝酸纤维素膜表面上的。如此共培养完成后，将硝酸纤维素膜切成约0.5cm宽的条带，并将各条带（涂布有混合物的一面朝下）转移至筛选平板上，条带之间间隔约0.5cm，置于28℃下培养7天，可见条带之间的培养基上有菌丝长出，长出的菌丝即为本发明所述潜在转化子。
（4）确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子。
对于如何确认外源目的基因是否转化成功，一般是先将潜在转化子接种至无筛选压的培养基上培养，传代若干次后再转接至含筛选压的培养基上培养，能够正常生长的潜在转化子即为遗传稳定的转化子。
筛选压是与目的基因相对应的，以目的基因是G418抗性基因为例，筛选压即为G418。
除此之外，还能通过PCR扩增检测潜在转化子的基因组DNA中是否含有外源目的基因。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明以分生孢子作为转化材料，利用农杆菌介导技术将外源目的基因转入蝉拟青霉的细胞内，并整合到蝉拟青霉的基因组中。试验发现，筛选需要G418的浓度较高，达到350µg/mL，106分生孢子可获得20~30个潜在转化子。
附图说明
以下将结合附图对本发明作进一步说明：
图1A为转化子的分生孢子中绿色荧光检测结果图(图中标尺=10µm)；
A1是在紫外光下，分生孢子有明显的绿色荧光；A2是白光下分生孢子的形态。
图1B为转化子的菌丝中绿色荧光检测结果图(图中标尺=10µm)；
B1是在紫外光下，菌丝有明显的绿色荧光；B2是白光下的形态。
图1C为野生型菌株PC-1的绿色荧光检测结果图(图中标尺=10µm)；
C1 是野生型菌丝PC-1在紫外光下的形态，无荧光发出；C2是在白光下的形态。
图2为转化子的PCR扩增结果图；其中，M表示DNA分子量标准，P表示质粒模板，1~6表示随机挑取的6个转化子模板，W表示野生型菌株PC-1模板。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的方法作进一步详细说明。
1、蝉拟青霉分生孢子制备
（1）试剂和培养基的制备
①马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar, PDA）：将马铃薯200g切成小块，加水煮沸15min，然后2层纱布过滤后，弃去马铃薯块，在过滤液中加入葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000 mL；然后进行常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。
②吐温-20：将100mL吐温-20转移到三角瓶中，用橡皮塞密封瓶口，常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）后备用。
③灭菌水：将00mL水转移到三角瓶中，用橡皮塞密封瓶口，常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）后备用。
（2）分生孢子制备
① 将蝉拟青霉菌株（PC-1）接种到直径9cm的PDA平板上，25℃培养5天。然后在其中加入10mL的灭菌水，20µL的灭菌后的吐温-20。用三角棒刮下分生孢子，然后用血球计数板计数，用灭菌水调整到107分生孢子/mL，用于转化。
2 转化载体的构建：
（1）培养基的制备
①马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar, PDA）：将马铃薯200g切成小块，加水煮沸15min，然后2层纱布过滤后，弃去马铃薯块，在过滤液中加入葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000 mL；然后进行常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。
②马铃薯葡萄糖液体培养基（potato dextrose broth, PDB）：将马铃薯200g切成小块，加水煮沸15min，然后2层纱布过滤后，弃去马铃薯块，在过滤液中加入葡萄糖20g，加蒸馏水定容至1000 mL；然后进行常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。
（2）曲霉菌TrpC启动子和GPD启动子的获得
①将本公司保存的黑曲霉（ Aspergillus niger）菌株A1在接种到PDA培养基上，25℃培养5天。用挑针挑取5-8块约3×3mm2的菌丝块，接种到100 mL的PDB液体培养基中，25℃培养4天。
② 在超净工作台中，用四层纱布过滤菌丝，然后用0.7M NaCl冲洗菌丝3次，用灭菌的滤纸和吸水纸滤干水分，称取020mg置于1.5mL无菌离心管中，加入500μL 提取缓冲液(1M KCl，100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH=8.0)，放入少许石英砂（或2粒磁珠），研磨仪研磨1min（至菌丝粉碎）；
③ 12000rpm离心10min，吸取上清至另一离心管中，弃沉淀。然后加入等体积异丙醇；轻轻颠倒混匀后室温静置10min；
④ 12000rpm离心10min，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上干燥；
⑤ 干燥后加入70%酒精800μL，12000rpm离心2min，轻轻倒去上清液；
⑥ 在吸水纸上排干水分，37℃干燥15min，使乙醇充分挥发；
⑦ 用50μL ddH2O或1×TE buffer重悬沉淀，DNA样品可置于4℃冰箱过夜。
⑧ 用下面的引物分别扩增相应的DNA片段：（相关片段的序列信息已经发布在GenBank中，Accession number：AB512772）：
PCR反应体系（50μL）：
10×PCR buffer（with Mg2+） 5μL
dNTP (25 mM) 0.5μL
相应的引物1(10μM) 2μL
相应的引物2(10μM) 2μL
DNA模板 2μL
Taq polymerase 0.5μL
ddH2O 38μL；
PCR反应程序：
⑨PCR产物的回收纯化：
PCR反应结束后，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用爱思进生物技术公司的DNA凝胶纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行，包括：
1）将50μLPCR产物全部加到1%的琼脂糖凝胶的点样孔中，按5 V/CM的电泳条件电泳30min.
2）电泳结束后，在紫外灯下用刀片切取含目的DNA片段的凝胶，置于2mL离心管中，称重；
3）按照1mg凝胶加入3mL的DE-A缓冲液的标准，加入DE-A缓冲液到收集凝胶的2mL离心管中，75℃保温10min，期间振荡数次，至完全融化。
4）加入0.5倍DE-A体积的DE-B缓冲液，混合均匀。
5）将DNA制备管放入2mL离心管中，将混合液转移到DNA制备管中，12000 rpm 离心1min，弃上清。
6）将DNA制备管放回2mL离心管中，加500 μL缓冲液W1，12000 rpm离心30s。
7）将DNA制备管放回2mL离心管中，加700 μL缓冲液W2，12000 rpm离心30s。
8）重复步骤⑦一次。
9）将DNA制备管放回2mL离心管中，12000 rpm 离心 2min。以排干膜上洗涤液；
10）将DNA制备管放回2mL离心管中，加50μL的ddH2O，10000rpm离心1min，洗脱DNA置-20℃下保存。
所得到的TrpC启动子约360bp，GPD启动子约580bp。
（3）GFP基因编码区和抗G418基因编码区的PCR扩增
①PCR引物信息如下表
②通过PCR扩增获得GFP基因(GFP)：
PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行，其中，PCR反应体系(50µL)：引物EGFPu 和EGFPdxz各2µM，dNTPs 200µM，Mg2+ 1.5mM，5 ×PS PCR buffer 10µL，模板(质粒pEGFP，购买自CLONTECH公司)DNA 1 ng，PrimeStar DNA聚合酶2U。
PCR反应条件：94℃ 预变性2min，然后35个循环包括：94℃ 变性30sec，55℃ 退火40sec，72℃ 延伸1 min。最后72℃ 后延伸10min。
③通过PCR扩增获得抗G418基因：
PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行，其中，PCR反应体系(50µL)：引物Hyg2 和HPH3各2µM， dNTPs 200µM，Mg2+ 1.5mM，5 ×PS PCR buffer 10µL，模板(质粒SuperCos 1购买自stratagene公司)DNA 1 ng，PrimeStar DNA聚合酶2U。
PCR反应条件：94℃ 预变性2min，然后35个循环包括：94℃ 变性30sec，57℃ 退火40sec，72℃ 延伸1 min。最后72℃ 后延伸10min。
（4）质粒载体的构建：
用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ酶切质粒pCAMBIA1300，胶回收6.8kb的大片段。然后将上述获得的PCR片段用PCR片段纯化试剂盒纯化后，通过一步克隆方法(Vazyme公司的CloneExpress Multis试剂盒)，通过重组反应构建新的载体，重组体系为：5×CE MultisBuffer 4µL，pCAMBIA1300酶切产物50 ng，GPD启动子、G418片段、TrpC启动子、GFP片段各25ng，Exnase multis酶2µL，用ddH2O补足20µL，混匀后37℃保温30 min。
重组好的载体用常规方法转化大肠杆菌DH5α：取20μL 冷却的反应液，加入到200µL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45~90秒，冰水浴孵育2min。加入900µL 的LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45 min。然后离心沉淀菌体，取100 µLLB培养液重新悬菌液后，全部均匀涂布在含有50µg/mL的卡那霉素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
通过是菌落PCR进行克隆的鉴定。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20µL的LB培养基中混匀，直接取1µL作为PCR模板。分别用(3)、(4)方法PCR扩增GFP和hygromycin B基因。将PCR阳性菌落的剩余菌液接种至含有50µg/mL的卡那霉素的LB培养基中培养过夜，取100LB送生工生物技术有限公司进行测序验证，然后在2mL菌液中加入甘油，使甘油浓度为25%，置于-80℃超低温冰箱中保存备用。
构建的质粒载体定名为pTEGG，是以pCAMBIA1300为骨架，GFP前融合了曲霉的TrpC启动子，用于验证真菌转化后外源基因（GFP）是否表达；在抗G418基因前融合了曲霉的GPD启动子，用于真菌转化子的筛选。
（质粒pCAMBIA1300信息：Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P (1994) Thesmall, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for planttransformation. Plant Mol Biol 25:989-994）
2、农杆菌介导的蝉拟青霉基因转化
（1）培养基和溶液配制
① 农杆菌培养基（IM）：0.8 mL 1.25 K-Phosphate-buffer pH 4.8（用KH2PO4和K2HPO4配制）；20 mL MN-buffer（30 g/l MgSO4·7H2O，15g/L NaCl）；1 mL 1% CaCl2·2H2O（w/v）；10 mL 0.01 % FeSO4（w/v）；5 mL spore elements（100 mg/L ZnSO4·7H2O，100 mg/LCuSO4·H2O，100 mg/L H3BO3，100 mg/L Na2MoO4·2H2O）（过滤灭菌）；2.5 mL 20% NH4NO3（w/v）；10 mL 50% glycerol（v/v）；40 mL 1 M MES pH 5.5（用NaOH调pH值）；20% glucose（w/v），液体培养基中加10 mL，固体培养基加5 mL；加水至1L，固体培养基加1.5%琼脂粉。
② 100mM乙酰丁香酮储备液（Acetosyringone，AS）：1.962g乙酰丁香酮用二甲基亚砜（DMSO）溶解，定容到100 mL，用孔径为0.22µm的微孔滤膜过滤除菌。
③ 农杆菌诱导培养基（AIM）：在100 mL 的IM培养基中加入乙酰丁香酮储备液200µL，使乙酰丁香酮的终浓度为200µM。
④ 恢复培养基（Yeast extract Peptone Sucrose，YPS）：蛋白胨（Peptone）5 g,酵母提取物（Yeast extract）3.5g，葡萄糖（Glucose（10g，蔗糖（Sucrose）342.3g，水1000mL，pH= 7.0。常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。
⑤ 卡纳霉素储备液（50 mg/mL）：将1g氯霉素溶解在20mL的无水乙醇中，备用。
⑥ 链霉素储备液（10 mg/mL）：将100mg链霉素溶解在10mL的灭菌水中，备用。
⑦ 头孢霉素储备液（400 mg/mL）：将2g头孢霉素溶解在5mL的灭菌水中，备用。
⑧ G418储备液：80mg/mL，由生工生物技术有限公司购买。
⑨ LB固体培养基：胰蛋白胨(Trypone) 10g，酵母提取物 (Yeast extract) 5g，氯化钠 (NaCl) 10g，琼脂15g, 水1000mL，pH= 7.0。常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。
⑩ LB液体培养基：LB固体培养基中不加琼脂，其他相同。
（2）蝉拟青霉菌株PC-1对G418的敏感性检测
① 将蝉拟青霉菌株PC-1接种到PDA平板上，25℃培养5天。
② 取5个装有20 mL的PDA培养基的50 mL三角瓶，融化培养基后室温冷却到50℃，标记为1-8号。用移液器吸取100mg/ mL的G418，按表1中所示的量加入各个瓶中，配成相应的浓度，然后倒入直径6cm的一次性塑料培养皿中，每个瓶中的培养基倒一个培养皿。
表1 20 mL的PDA培养基含有G418的浓度
瓶号 1 2 3 4 5 6 7 8
加入G418的量（µL） 25 50 75 100 125 150 175 180
G418的浓度（µg/mL） 50 100 150 200 250 300 350 360
③ 从培养好的蝉拟青霉菌株PC-1的菌落边缘挑取3×3mm2的菌丝块，放到步骤（2）中制备的含有G418的PDA平板上，25℃培养5天。
④ 观察菌株PC-1的生长情况，结果发现，在1号瓶倒的平板和2号瓶倒的平板上，菌株PC-1可以生长，其他的平板上没有菌丝生长。说明蝉拟青霉菌株PC-1对G418比较敏感，在高于350µg/mL的G418的PDA培养基上不能生长。
（4）用冻融法将pTEGG转化到农杆菌中
① 将农杆菌菌株AGL1在LB平板上划线活化，28℃培养2天；然后将1个单菌落转到5mLLB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
② 将2mL上述培养液转移到装有50mL的 LB液体培养基的三角瓶中，28℃振荡培养6小时，测定其吸光度，当OD600 =0.5～1.0时停止培养。
③ 将培养好的菌液放置在冰上，然后转移到50mL离心管中，在 4℃条件下，3000g离心5min。
④ 弃去上清液，沉淀用1mL预冷的20 mM CaCl2溶液悬浮，分装到预冷的1.5 mL离心管中，每管0.1mL。
⑤ 取4µL 的pTEGG质粒（0.25µg/µL）加入到含有0.1mL农杆菌的1.5 mL离心管中，盖好盖子，轻轻混匀，然后迅速放到液氮中冷冻。
⑥ 取出1.5 mL离心管，置于37℃水浴中保温5min，解冻。
⑦ 在1.5 mL离心管中加入1mL的 LB培养液， 28℃下，100rpm轻摇培养2～4h。
⑧ 将离心管放入离心机中，12000rpm离心2min，弃去1mL培养液，然后将沉淀悬浮，涂布于含有50µg/mL卡那霉素的LB平板上，正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，28℃培养2～4天。
（5）农杆菌介导转化蝉拟青霉菌株PC-1
① 从新鲜培养的LB平板（含50µg/mL卡那霉素）上挑选农杆菌单菌落接种于5mL LB液体培养基（含50µg/mL卡那霉素）中，200 r/min，28℃过夜培养。
② 第二天，取400µL培养液转移到5mL含50g/mL卡那霉素的诱导液体培养基（AIM）中，OD600值约0.15，28℃培养5～6个小时，使菌液的OD600达到0.5～0.6。
③同时将蝉拟青霉菌株PC-1的分生孢子浓度调整好（107个/mL）
④ 将100mL的IM固体培养基融化后，在室温冷却到50℃，然后加入乙酰丁香酮储备液200µL，卡那霉素储备液100µL，轻轻摇动混匀后，倒入6cm一次性塑料培养皿中，制成诱导平板；待培养皿中的培养基凝固后，将一张直径5cm的灭菌纤维素膜覆盖在培养基表面。
⑤ 取100µL培养好的农杆菌AGL-1（含载体）菌液和100µL转化材料混合，混合液均匀涂于诱导平板上的硝酸纤维素膜表面，22℃共培养48h。
⑥ 将100mL的PDA固体培养基融化后，在室温冷却到50℃，然后加入乙酰丁香酮储备液200µL，头孢霉素储备液100µL，链霉素储备液100µL，卡那霉素储备液100µL，G418储备液350µL，轻轻摇动混匀后，倒入6cm一次性塑料培养皿中，制成筛选平板；将诱导平板上的硝酸纤维素膜切成约0.5cm的条带，转移到筛选平板上，条带之间相隔约0.5cm ，置于在28℃培养7天，可以见到有菌丝长到硝酸纤维素膜条带之间的培养基上。
⑦ 挑取长出的菌丝，转移到含有360µg/mL的G418的PDA平板上，28℃培养5天，确认是否转化成功。如果能够生长，可确认转化成功。
每个共培养的培养皿可转化得到30个蝉拟青霉的转化子。
（5）转化子的检测
1）遗传稳定性检测
从获得的转化子中随机挑选了6个转化子，在PDA培养基平板上28℃转接培养5次，然后再转接在含有360 µg/mL G418的PDA平板上，28℃培养5天，结果这6个转化子都可以生长，说明转化子的遗传稳定性好，转入的抗性基因稳定存在。
2）绿色荧光检测
将以上随机选择的6个转化子接种在PDA平板上，28℃培养5天。用挑针挑取少量菌丝，置于载玻片上，制成观察玻片，放到显微镜的载物台上。打开紫外光（450～490nm），观察绿色荧光。结果发现这6个转化子的菌丝都能发出绿色荧光，说明外源基因转化后可以进行稳定表达（图1）。
3）PCR检测
① 将随机挑选的6个转化子菌株在PDA平板上25oC生长7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300µL提取缓冲液的1.5mL离心管中；
提取缓冲液：1M KCl, 100mM Tris-HCl, 10mM EDTA，pH=8.0。
② 用电磨机将挑取的菌丝磨碎，然后再加入300μL提取缓冲液，剧烈震荡2 min；
③ 10000 rpm离心10min；
④ 吸取上清至另一离心管中，弃沉淀；
⑤ 加入等体积的异丙醇(分析纯)，沉淀核酸，轻轻颠倒混匀数次后，12000 rpm离心10min；
⑥ 轻轻倒去上清液，在吸水纸上排干水分；
⑦ 加入300µL 70%乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000 rpm离心2min；
⑧ 轻轻倒去上清液，在吸水纸上吸干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；
⑨ 用50µL ddH2O重悬沉淀，得到各转化子的基因组DNA，浓度达到30ng/µL。
⑩以各转化子的基因组DNA为模板，分别利用引物Pgpd-u/ G418d进行PCR扩增。
PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行，其中PCR反应体系（50µL）：上下游引物各2µM，dNTPs 200µM，Mg2+ 1.5mM，10×PCR buffer 5µL，模版DNA 2μL，Taq酶2U。
PCR反应条件：94℃预变性2min，然后35个循环包括：94℃变性30sec，60℃退火40sec，72℃延伸1.5 min。最后72℃后延伸10min。
PCR反应结束后，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现这6个转化子中都出现了约1.4kb的电泳条带，说明抗G418基因稳定整合到蝉拟青霉的基因组中（图2）。

Claims (5)

1.一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌基因转化方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）在PDA培养基上23℃-28℃培养蝉拟青霉菌5-7天，使其大量产孢；
（2）将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；
用冻融法将质粒转化到农杆菌中：
① 将农杆菌菌株AGL1在LB平板上划线活化，28℃培养2天；然后将1个单菌落转到5mLLB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；
② 将2mL上述培养液转移到装有50mL的 LB液体培养基的三角瓶中，28℃振荡培养6小时，测定其吸光度，当OD600 =0.5～1.0时停止培养；
③ 将培养好的菌液放置在冰上，然后转移到50mL离心管中，在 4℃条件下，3 000g离心5min；
④ 弃去上清液，沉淀用1mL预冷的20 mM CaCl2溶液悬浮，分装到预冷的1.5 mL离心管中，每管0.1mL；
⑤ 取4µL 的pTEGG质粒（0.25µg/µL）加入到含有0.1mL农杆菌的1.5 mL离心管中，盖好盖子，轻轻混匀，然后迅速放到液氮中冷冻；
⑥ 取出1.5 mL离心管，置于37℃水浴中保温5min，解冻；
⑦ 在1.5 mL离心管中加入1mL的 LB培养液， 28℃下，100rpm轻摇培养2～4h；
⑧ 将离心管放入离心机中，12000rpm离心2min，弃去1mL培养液，然后将沉淀悬浮，涂布于含有50µg/mL卡那霉素的LB平板上，正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，28℃培养2～4天；
（3）将步骤（2）得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤（1）中培养得到的分生孢子混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；
① 从新鲜培养的LB平板（含50µg/mL卡那霉素）上挑选农杆菌单菌落接种于5mL LB液体培养基（含50µg/mL卡那霉素）中，200 r/min，28℃过夜培养；
② 第二天，取400µL培养液转移到5mL含50g/mL卡那霉素的诱导液体培养基（AIM）中，OD600值约0.15，28℃培养5～6个小时，使菌液的OD600达到0.5～0.6；
③同时将蝉拟青霉菌株PC-1的分生孢子浓度调整好（107个/mL）；
④ 将100mL的IM固体培养基融化后，在室温冷却到50℃，然后加入乙酰丁香酮储备液200µL，卡那霉素储备液100µL，轻轻摇动混匀后，倒入6cm一次性塑料培养皿中，制成诱导平板；待培养皿中的培养基凝固后，将一张直径5cm的灭菌纤维素膜覆盖在培养基表面；
⑤ 取100µL培养好的农杆菌AGL-1（含载体）菌液和100µL转化材料混合，混合液均匀涂于诱导平板上的硝酸纤维素膜表面，22℃共培养48h；
⑥ 将100mL的PDA固体培养基融化后，在室温冷却到50℃，然后加入乙酰丁香酮储备液200µL，头孢霉素储备液100µL，链霉素储备液100µL，卡那霉素储备液100µL，G418储备液350µL，轻轻摇动混匀后，倒入6cm一次性塑料培养皿中，制成筛选平板；将诱导平板上的硝酸纤维素膜切成约0.5cm的条带，转移到筛选平板上，条带之间相隔约0.5cm ，置于在28℃培养7天，可以见到有菌丝长到硝酸纤维素膜条带之间的培养基上；
⑦ 挑取长出的菌丝，转移到含有360µg/mL的G418的PDA平板上，28℃培养5天，确认是否转化成功，如果能够生长，可确认转化成功；
（4）确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子；
1）从获得的转化子中随机挑选了6个转化子，在PDA培养基平板上28℃转接培养5次，然后再转接在含有360µg/mL的G418的PDA平板上，28℃培养5天，结果这6个转化子都可以生长，说明转化子的遗传稳定性好，转入的抗性基因稳定存在；
2）绿色荧光检测
将以上随机选择的6个转化子接种在PDA平板上，28℃培养5天；用挑针挑取少量菌丝，置于载玻片上，制成观察玻片，放到显微镜的载物台上；打开紫外光（450～490nm），观察绿色荧光；结果发现这6个转化子的菌丝都能发出绿色荧光，说明外源基因转化后可以进行稳定表达；
3）PCR检测
① 将随机挑选的6个转化子菌株在PDA平板上25oC生长7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300µL提取缓冲液的1.5mL离心管中；
提取缓冲液：1M KCl, 100mM Tris-HCl, 10mM EDTA，pH=8.0；
② 用电磨机将挑取的菌丝磨碎，然后再加入300μL提取缓冲液，剧烈震荡2 min；
③ 10000 rpm离心10min；
④ 吸取上清至另一离心管中，弃沉淀；
⑤ 加入等体积的异丙醇(分析纯)，沉淀核酸，轻轻颠倒混匀数次后，12000 rpm离心10min；
⑥ 轻轻倒去上清液，在吸水纸上排干水分；
⑦ 加入300µL 70% 乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000 rpm离心2min；
⑧ 轻轻倒去上清液，在吸水纸上吸干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；
⑨ 用50µL ddH2O重悬沉淀，得到各转化子的基因组DNA，浓度达到30ng/µL；
⑩以各转化子的基因组DNA为模板，分别利用引物Pgpd-u/ G418d进行PCR扩增；
PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行，其中，PCR反应体系（50µL）：上下游引物各2µM， dNTPs 200µM，Mg2+ 1.5mM，10 ×PCR buffer 5µL，模版DNA 2μL，Taq 酶2U；
PCR反应条件：94℃ 预变性2min，然后35个循环包括：94℃ 变性30sec，60℃ 退火40sec，72℃ 延伸1.5 min；
最后72℃ 后延伸10min；
PCR反应结束后，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现这6个转化子中都出现了约1.4kb的电泳条带，说明抗G418基因稳定整合到蝉拟青霉的基因组中。
2.根据权利要求1所述的蝉拟青霉基因转化方法，其特征在于，步骤（3）中，农杆菌与分生孢子的混合比例为：OD600为0.5~0.6的农杆菌100 μL与浓度为2×106~108cfu/mL的分生孢子100μL混合。
3.根据权利要求1所述的蝉拟青霉基因转化方法，其特征在于，所述诱导平板中含有0.1~0.2 mM的乙酰丁香酮。
4.根据权利要求1所述的蝉拟青霉基因转化方法，其特征在于，所述诱导平板中含有350μg/mL的G418培养基上筛选。
5.根据权利要求1所述的蝉拟青霉基因转化方法，其特征在于，步骤（3）中，共培养的条件为：22℃下共培养45~50 h。
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