CN107502562A - 重组蝗绿僵菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组蝗绿僵菌，其能够表达磷酸甘油酸激酶。在该重组蝗绿僵菌中导入的基因为磷酸甘油酸激酶基因，其能够显著提高专性菌蝗绿僵菌中果糖‑6‑磷酸的浓度，显著提高杀虫效率，使蝗绿僵菌的半致死时间LT50从7.045±0.211天缩短到5.617±0.187天；且对环境无害，生物安全性好，对人类无毒性。

Description

重组蝗绿僵菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及转基因菌株及其制备方法和用途，尤其涉及能够提高专性菌蝗绿僵菌杀虫效率的重组蝗绿僵菌及其制备方法和应用。

背景技术

昆虫病原真菌，相较于化学杀虫剂，具有环境友好、抗逆性强、能大量扩散、选择性高等优点，是广泛应用的一类生物农药。然而，目前昆虫病原真菌作为杀虫剂仍然存在着致死时间较长的缺点。通过研究真菌致病机理，利用基因工程手段改造真菌，提高真菌杀虫剂的效果是当前研究的一个重要方向。例如：

1、高表达真菌分泌的水解酶类基因。过表达体壁降解蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶(subtilisins)Pr1A可以提高真菌穿透体壁的速度，显著提高了金龟子绿僵菌的毒力，加快致死速度并且在血腔中激活多酚氧化酶原系统，导致虫体迅速黑化，对烟草天蛾的致死时间减少了25％，害虫的取食率也降低了40％。Fang等将几丁质水解酶Bbchitl基因转入白僵菌基因组中，获得超表达工程菌株。工程菌株对蚜虫的毒力明显增强。与野生菌株相比，工程菌株对蚜虫的致死剂量降低50％，致死时间缩短50％。

2、对真菌代谢基因的改造。Xia等通过构建真菌酸性海藻糖降解酶(ATM)超表达载体，转化广谱绿僵菌，增强真菌对寄主血淋巴中海藻糖的代谢能力，促进广谱绿僵菌在昆虫体内生长。

3、引入外源基因。北非蝎毒素(Androctonus australis neurotoxin)AaIT是鳞翅目、双翅目昆虫的特异性神经毒素。Wang 等人将该基因导入绿僵菌后，能在寄主血腔中特异性表达神经毒素，改造后的真菌对烟草天蛾的毒性提高了22倍。

4、表达与免疫相关的基因。Yang等人在白僵菌中表达昆虫先天免疫识别通路Toll信号通路的丝氨酸抑制酶Spn43Ac，对桃蚜的半致死时间减少了24％，致死率提高了2倍。Fan等将葡萄糖- 果糖氧化还原酶(Glucose-frustose oxidoreductase GFOR)基因基因导入白僵菌中，构建的转基因工程菌通过合成葡萄糖酸内酯 (GDL)可以抑制寄主革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria binding proteins GNBPs)的活性，抑制宿主的免疫反应，使真菌的致死时间减少了48h，杀虫效果得到提高。

但目前通过基因工程手段改造真菌仍然存在一些缺陷。例如，中国发明专利授权公告号为CN101755050公开的将优化的编码北非蝎(Androctonus australis)神经毒素AaIT的多核苷酸序列导入金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)中并表达，其可提高杀虫效率，有效用于昆虫的控制。但导入真菌中的蝎毒基因对人类有毒，会对人类造成一定危险。

另外，通过基因工程手段改造的真菌，大多数对昆虫不特异。如白僵菌和金龟子绿僵菌(广谱绿僵菌)，在防治害虫的同时，有益的昆虫也能被杀死，造成生态灾害。

在真菌侵染寄主的过程中，细胞壁糖蛋白和真菌多糖代谢与真菌生长分化、致病性、对寄主免疫响应的适应密切相关。寄主先天免疫的第一步是对外来病原体的识别。真菌细胞壁上的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，如β-1,3-葡聚糖、甘露糖等，会被模式识别受体PRRs，包括C型凝集素、肽聚糖识别蛋白、革兰氏阴性菌结合蛋白(GNBP)等的免疫识别，引起免疫响应。

绿僵菌属真菌被广泛用于蝗虫防治，代表种类有金龟子绿僵菌、罗伯茨绿僵菌和蝗绿僵菌等，不同种类的杀虫范围不同。如金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、罗伯茨绿僵菌 (Metarhizium robertsii)为广谱性杀虫真菌，而蝗绿僵菌 (Metarhiziumacridum)只能感染蝗虫等直翅目昆虫，是寄主专一化的专性菌。绿僵菌细胞壁成分包括甘露聚糖、β-葡聚糖、几丁质。β-葡聚糖和几丁质靠近细胞膜，构成细胞壁骨架，外层的葡聚糖被结构松散的甘露聚糖覆盖。虽然专性菌蝗绿僵菌比广谱菌罗伯茨绿僵菌的杀虫效果较好，但其致死时间仍然较长，杀虫能力仍需进一步提高。

发明内容

本发明的发明人经过长期不懈的努力发现，专性菌蝗绿僵菌的基因组中缺乏磷酸甘油酸激酶基因。将磷酸甘油酸激酶基因导入到专性菌蝗绿僵菌中，通过提高3-磷酸甘油酸的表达，进而影响真菌细胞壁多糖的合成，降低宿主免疫系统的识别，加速蝗绿僵菌在宿主体内的繁殖，提高专性菌的杀虫能力。本发明的发明人注意到，3-磷酸甘油酸不仅参与真菌的糖酵解/糖异生途径，还参与真菌细胞壁表面多糖的合成代谢。3-磷酸甘油酸可以生成果糖 -6-磷酸，果糖-6-磷酸是真菌糖类代谢途径中的重要中间产物。一方面果糖-6-磷酸的积累会引起葡萄糖的积累，而葡萄糖是细胞壁葡聚糖合成的前体；另一方面，果糖-6-磷酸可以在甘露糖磷酸异构酶(Phosphomannose isomerase，PMI)的可逆催化下从果糖-6-磷酸转化为甘露糖-6-磷酸，甘露糖-6-磷酸能生成GDP-甘露糖， GDP-甘露糖是细胞壁甘露聚糖合成的前体物质。因此，3-磷酸甘油酸是连接甘油酸代谢和真菌糖代谢的重要物质。其通过影响糖代谢和真菌多糖合成，进而影响宿主免疫系统的识别，加速真菌在宿主体内的繁殖，从而提高真菌的杀虫效果。

因此，本发明提供了一种重组蝗绿僵菌，其能够表达磷酸甘油酸激酶。

示例性地，本发明中重组蝗绿僵菌的保藏编号为CGMCC NO.14153，分类命名为Metarhizium acridum，于2017年8月29 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。

示例性地，本发明中能够表达磷酸甘油酸激酶的重组蝗绿僵菌包含外源的编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列。

本发明的重组蝗绿僵菌通过磷酸甘油酸激酶的表达，促进3- 磷酸甘油酸的生产，进而直接或间接的提高真菌中的果糖-6-磷酸和/或葡萄糖-6-磷酸的浓度以提高杀虫效率。

在本发明中外源的编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列可为任何能够在蝗绿僵菌中表达的磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列。例如，编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列的变体，同系物，衍生物或片段等。但优选的，所述外源的编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列来自于广谱菌罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)或广谱菌金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)。

优选地，本发明中外源的编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列包含或者由如下序列组成：

a)SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列；

b)在严谨条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补序

列进行杂交、且编码磷酸甘油酸激酶的多核苷酸或其片段的

多核苷酸；

c)上述a)或b)的互补序列；或

d)由于遗传密码简并性而从SEQ ID NO：1的核苷酸衍生的多核苷酸。

本文所述的“严谨条件”，可以为低严谨条件、中严谨条件、高严谨条件中的任一种，优选为高严谨条件。示例性地，“低严谨条件”可为30℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“中严谨条件”可为40℃、5×SSC、5×Denhardt液、 0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“高严谨条件”可为50℃、5×SSC、 5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严谨度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的严谨度。

除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST 等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码本发明的磷酸甘油酸激酶的多核苷酸具有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1 或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、 99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。

核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法规则BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268,1990；Proc.Natl. Acad.Sci.USA 90:5873,1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发(Altschul SF,et al:JMol Biol 215: 403,1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统可设定默认参数值。

示例性地，本发明中外源的编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列包含或者由SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：1的简并序列组成，例如通过将SEQ ID NO：1中的密码子替换成蝗绿僵菌的偏爱密码子而形成的核苷酸序列。

本发明还提供了杀虫剂，其包括本发明的重组蝗绿僵菌，以及任选地，农药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可为云母粉、轻质碳酸钙、陶土、滑石粉、高岭土、硅藻土、凹凸棒土、膨润土、海泡石、尿素、氯化钾、硫酸钠、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵中的一种或多种。

本发明另一方面提供了本发明的重组蝗绿僵菌在制备杀虫剂中的用途。

优选地，本发明的杀虫剂用于杀灭蝗虫。

任选地，本发明的杀虫剂还可以包含其他能够杀灭蝗虫的活性成分。示例性的，如绿僵菌素、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、类烟碱类、神经钠通道阻断剂、杀虫的巨环内酯、γ-氨基丁酸 (GABA)拮抗剂、杀虫脲类和保幼激素模拟物中的一种或多种。

本发明还提供了重组蝗绿僵菌的制备方法，包括如下步骤：将本发明的编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列可操作性地导入专性菌蝗绿僵菌。

本发明还提供了一种杀灭蝗虫的方法，其包括施用本发明的重组蝗绿僵菌的步骤。优选地，所述施用包括将用本发明的重组蝗绿僵菌喷洒至农作物，例如玉米和小麦。

示例性地或优选地，本发明具有以下优势之一：

本发明的重组蝗绿僵菌能够显著提高专性菌蝗绿僵菌中果糖 -6-磷酸的浓度，显著提高杀虫效率。例如本发明的重组蝗绿僵菌可使蝗绿僵菌的半致死时间LT50从7.045±0.211天缩短到5.617 ±0.187天；且对环境无害，生物安全性好，对人类无毒性。

附图说明

图1为本发明实施例中重组质粒的结构示意图；

图2为本发明实施例中转化子的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例MAC与MAC+119转化子中的果糖-6- 磷酸含量的实验结果图；

图4为本发明实施例MAC与MAC+199转化子菌丝表面多糖纤维密度的实验结果图；

图5为本发明实施例中导入磷酸甘油酸激酶基因对飞蝗半致死时间的实验结果图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。

实施例1磷酸甘油酸激酶表达质粒构建方法

本实施例中以广谱罗伯茨绿僵菌(记为MAA)磷酸甘油酸激酶基因为例进行说明，其gene bank登录号为XM_007823117 (MAA_05119)D-glycerate 3-kinase[EC:2.7.1.31]，具体序列如 SEQ ID NO：1所示。本实施例中并不限定磷酸甘油酸激酶基因的序列，可为编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列的变体，同系物，衍生物或片段等，只要其最终能够表达磷酸甘油酸激酶即可。

1.广谱罗伯茨绿僵菌磷酸甘油酸激酶序列的扩增

设计引物MAA_05119F与MAA_05119R，扩增表达磷酸甘油酸激酶的基因区域，模板为广谱罗伯茨绿僵菌MAA菌丝提取的 cDNA。

设计引物，在产物两端加XhoI的酶切位点，引物序列如下：

MAA_05119F:GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGATGTCCAC ATTCGCAGATGACA(如SEQ ID NO：2所示)；

MAA_05119R:CCGCTCGAGTATCCGCACAACTTCCTTGAC CTT(如SEQ ID NO：3所示)。

PCR反应的混合物为：5μL的10×Ex Taq Buffer聚合酶缓冲液，8μL的2.5mM dNTP，10μM的上下游引物各1μL，1μL的模板，0.25μL的Takara Ex Taq DNA聚合酶，加超纯水至总体积为 50μL；

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃30sec，58℃30sec，72℃延伸1.5min(35个循环)；最后72℃延伸10min。

PCR反应产物用质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收产物。

2.工程菌株的构建

对pDHt-RFP-Bar质粒经XhoI内切酶酶切后切胶回收，将其和步骤1所得产物用重组酶进行重组，形成新质粒 pDHt-GLYK-RFP-Bar(如图1所示)。经转化、PCR鉴定，获得阳性的大肠杆菌转化菌株。用甘油酸激酶特异引物MAA_05119F/R 测序确认，得到所需载体。

根癌农杆菌介导法(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT)构建真菌遗传转化体系：将所得载体转化至农杆菌AGL-1，PCR鉴定后选取阳性农杆菌AGL-1转化菌株， YEB培养基(含50mg/ml Carb和50mg/ml Kan)扩大培养。收集菌体，用适量的IM液体培养基重悬OD₆₆₀为0.15，28℃避光培养至菌液浓度OD₆₆₀为0.5-0.8。

同时制备野生型专性菌蝗绿僵菌(记为MAC)分生孢子孢悬液。将MAC接种于PDA平板上培养。培养14天时，从PDA平板上刮取适量的野生型专性菌蝗绿僵菌MAC分生孢子到1mL的含0.05％Tween-20无菌水中，涡旋震荡后用玻璃丝棉过滤除去菌丝，收集滤液。12000rpm离心3min后用Tween-20无菌水洗2次，重悬后用血球计数板计数，并将野生型专性菌蝗绿僵菌MAC孢子悬液调到每mL悬液中含有约10⁶分生孢子，备用。

将上述培养在IM培养基中的AGL-1菌液及野生型专性菌蝗绿僵菌MAC的分生孢子悬液各100μL混和均匀涂布在IM培养基平板上。共培养48h后，用无菌水洗涤共培养物，用含噻孢霉素和草胺膦的M-100培养基避光培养7-10天至抗性菌落出现，分单孢后，保存具有抗性的真菌组织备用。抽提真菌基因组并用特异引物PCR验证转化子。

3.真菌基因组验证

使用全式金Plant Tissue PCR Kit(AD301)试剂盒验证转化子的基因组。

挑取上述具有抗性的真菌组织，加入40ul PD1 Buffer后涡旋混匀或用移液器吹打。在95℃金属浴孵育10min(提前预热好设备)，之后加入40μL PD2Buffer，混匀后可直接作为模板进行PCR 验证。所用特异引物为MAA_05119F和RFP-R(RFP-R序列的NCBI GenBank登陆号为：AB166761.1，具体序列为 TTAGGCGCCGGTGGAGTG(如SEQ ID NO：4所示)。

PRC体系如下：

所得PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，Marker为D2000。琼脂糖凝胶电泳实验结果如图2。图2中，泳道1-8为具有抗性真菌，泳道9-11为对照(野生型专性蝗绿僵菌MAC)。从图2中可以看出，泳道1-8在1000bp和2000bp之间有条带(理论条带为1559bp)，而泳道9-11中对照的MAC样品未发现条带，说明带有RFP的 MAA05119基因已经转入野生型专性蝗绿僵菌MAC基因组，上述具有抗性的真菌即为重组专性菌蝗绿僵菌(记为MAC+119)。将该重组专性菌蝗绿僵菌送于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏名称为MAC119，保藏编号为CGMCC NO.14153，保藏日期为2017年8月29日。

实施例2重组专性菌蝗绿僵菌菌丝的果糖-6-磷酸含量测定

使用PicoProbe Fructose-6-Phosphate Fluorometric Assay Kit (BioVision)测定菌丝的果糖-6-磷酸(F6P)的含量。

1、制作标准曲线：

稀释F6P标准液到1nmol/μL，分别加入0、2、4、6、8、10μL 到96孔白色酶标版中，以增强发光强度。用Assay Buffer补齐至每孔体积为50μL。加入50μL的反应混合液(Reactionmix)。同时，以F6P Assay Buffer代替反应混合液中的F6P Converter作对照。反应混合液及对照的配制方法如下表1。

表1反应混合液及对照的配制

2、样品制备：

将实施例1中所得的重组专性菌蝗绿僵菌培养在IM培养基平板上。培养14天后，取重组专性菌蝗绿僵菌的菌丝体，利用0.1 ×PBS洗涤3次，用0.22μm滤网过滤收集菌丝体。用冷冻干燥仪 -45℃冻干样品。取样品约1mg，称重记为m，加入7％高氯酸裂解细胞壁(去除蛋白的影响)，并用研磨棒研碎样品。使用K₂CO₃中和溶液，使pH在6.5-8.0。离心后将上清转移到新的离心管中，记录总体积V，备用。

为排除样品中NADH，NADPH产生背景干扰，设空白对照组。

3、果糖-6-磷酸含量的测定

将上述重组专性菌蝗绿僵菌的菌丝体样品加入到酶标板的孔中，每孔加样量为50μL，加入50μL的反应混合液(Reaction mix)，以野生专性菌蝗绿僵菌的菌丝体样品作为对照。避光在37℃孵育 5min后，测量荧光Ex/Em＝535/587nm。以F6P为0时得到的数值为0，将所得数据去除本底干扰。绘制标准曲线，得到趋势线及公式。将样品所得数据带入，得到相应的浓度。具体结果见图3。

如图3所示，MAC、MAC+119的果糖-6-磷酸含量分别为 1522.2nmol/g和3439.5nmol/g。转入磷酸甘油酸激酶基因后所得的重组专性菌蝗绿僵菌的果糖-6-磷酸含量上升，说明该基因的导入增强了真菌中果糖-6-磷酸的累积。

实施例3重组专性菌蝗绿僵菌菌丝体细胞壁多糖厚度测定

1、高压冷冻-冷冻替代制备样品

将实施例1中的重组专性菌蝗绿僵菌培养在IM培养基平板上。培养14天后，收集重组专性菌蝗绿僵菌菌丝，用灭菌的 0.1mol/L PBS缓冲液(pH7.4)洗2次，离心去除水分。挑取菌丝放入高压冷冻仪(Leica EM PACT2high-pressure freezer)中上样用的金属皿中，加入适量冷冻保护液，样品迅速在液氮和高压环境中被固定。

取出冷冻仪中的样品，在液氮中转移至冷冻替代仪(Leica EM AFS2automaticfreeze substitution system)的样品管中。转移前，在样品管中加入1％的锇酸-丙酮溶液。设置冷冻替代程序如下：

-90℃保持10小时；升温至-30℃(每小时2℃)；-30℃保持 8小时；升温至20℃(每小时2℃)。升温至20℃后用纯丙酮溶液每小时替换一次，共3次。

2、制样和透射电镜观察

树脂渗透过程中，每12小时替换一次渗透液，替换的渗透液中Epson812树脂和纯丙酮的比例依次为1:3，1:1，3:1，1:0。纯树脂时渗透3天，每12小时替换新的树脂。渗透结束后，用Epson812 树脂在45℃聚合炉中聚合48h，制备好包埋块。修块后，使用超薄切片机进行切片，用100目铜网捞片。超薄切片厚度为60nm，切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，随后使用JEM-1400透射电子显微镜，在80KV电压下观察重组专性菌蝗绿僵菌(MAC+119) 的菌丝切片形态并拍照，以野生型专性菌蝗绿僵菌(MAC)为对照。实验结果如图4所示。从图4中可以看出，MAC菌的细胞壁上多糖纤维稀疏，而MAC+119菌细胞壁上的多糖纤维致密。致密的多糖纤维能够加强抵抗蝗虫的免疫系统。

实施例4重组专性菌蝗绿僵菌杀虫效率测定

将重组专性菌蝗绿僵菌(MAC+119)接种于PDA培养基上培养，刮取重组专性菌蝗绿僵菌的孢子，加入适量的花生油悬浮孢子涡旋震荡，用玻璃丝绵过滤后收集孢子，用花生油重悬。在显微镜下使用细胞计数板计数，通过多次重悬和计数，使终浓度为 1×10⁶孢子/ml。吸取2μL的孢悬液点滴在羽化后4天的群居东亚飞蝗雄虫的背甲板下，以花生油处理和野生型专性菌蝗绿僵菌 (MAC)孢子作为对照。每12小时记录死亡虫数。最后用SPSS 20.0软件统计得出半致死时间(LT50)，比较野生型和转化菌株的杀虫毒力。其实验结果具体见图5。

如图5所示，野生型专性菌蝗绿僵菌(MAC)半致死时间为 7.045±0.211d，导入甘油酸激酶基因后重组专性菌蝗绿僵菌(MAC+119)对飞蝗的半致死时间为5.617±0.187d。说明导入甘油酸激酶基因提高了专性菌蝗绿僵菌的毒力。

3-磷酸甘油酸的浓度的提高，能够提高果糖-6-磷酸的含量，最后直接或间接地引起葡萄糖和甘露糖-6-磷酸的积累，影响真菌的糖代谢和细胞壁的形成，加速真菌在宿主体内的繁殖，影响宿主免疫系统的识别，从而提高真菌的杀虫效果。

本实施例中重组专性菌蝗绿僵菌的半致死时间LT50从 7.045±0.211天缩短到5.617±0.187天，显著提高了专性菌蝗绿僵菌的杀虫效率。且明显地，导入基因对环境无害，生物安全性好。

本发明通过导入甘油酸激酶基因直接或间接地提高葡萄糖和/ 或甘露糖-6-磷酸的积累进而增强真菌农药杀虫效率。依据该原理，也可通过其他途径提高葡萄糖和/或甘露糖-6-磷酸的积累浓度来提高杀虫效率。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 重组蝗绿僵菌及其制备方法和应用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 885

<212> DNA

<213> Metarhizium robertsii

<400> 1

atgtccacat tcgcagatga caaagcacca atatgcatcc ccttcatcac gcagctgctc 60

caaacccacc ggaccaaatc cccggaccgc ccgctcatca tcggcctcaa cggcatgcag 120

ggcgtcggca agacgactct cgtcgcgccg ctggctgccg ccctcaacgc ccgcggcatc 180

cacacgctcg tcttcagcat cgacgacttt tatctccccc acgacgagca ggtcaggcta 240

gccgcgtcgc atcccgagaa cgcactcgtg cagcatcgcg gggagccagg cacgcacgac 300

gtccccctgg caaaggccgt ctttgcttcg cttctcaaca acttgcccac ctctatcccg 360

cagtacgaca aggccctctt ctccggacag ggcgaccgcc tgccgccctc ccagtggcgg 420

ccggccaacc acccgggcca accacccgtc caggtcgtca tctttgaagg ctggtgcgtc 480

ggcttccgtt ccgtcccggc tgctcaggtg gaggcgaagt ggaaaggccc cagtaggacc 540

ttgcataaac ataaactgga gcacttgcaa tttgtaaatg aggaactgag caactacgac 600

gccctgacgg attcttttga cgcgtttata catattgact ctgaggatgc agagtacgtg 660

tatgcctggc gacaggagca ggaagattcg ttgcgggcca ccaggggtga tccgacggcg 720

gggatgactc ccgagcaggt ggtcaggttt gtggatgggt attatcctgc ctatgagctc 780

tatacagatg gtatgaggag aggcatattc aaggacaggc ccgagtgtca gttgcgcatg 840

attgttggta gggatagaaa ggtcaaggaa gttgtgcgga tatga 885

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtaccgggc cccccctcga gatgtccaca ttcgcagatg aca 43

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgctcgagt atccgcacaa cttccttgac ctt 33

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaggcgccg gtggagtg 18

Claims (11)

1.重组蝗绿僵菌，其能够表达磷酸甘油酸激酶。

2.如权利要求1所述的重组蝗绿僵菌，其保藏编号为CGMCC NO.14153。

3.如权利要求1或2所述的重组蝗绿僵菌，其包含外源的编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的重组蝗绿僵菌，所述外源的编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列来自于广谱菌罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)或广谱菌金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，优选地，所述外源的编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列能够相对野生型蝗绿僵菌而言提高所述重组蝗绿僵菌中果糖6-磷酸的浓度。

5.如权利要求3所述的重组蝗绿僵菌，其中所述外源的编码磷酸甘油酸的核苷酸序列包含或者由如下序列组成：

a)SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

b)能够与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补序列进行杂交、且编码磷酸甘油酸激酶的多核苷酸或其片段；

c)上述a)或b)的互补序列；或

d)由于遗传密码简并性而从SEQ ID NO：1的核苷酸衍生的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的重组蝗绿僵菌，所述外源的编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的简并序列或者由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的简并序列组成。

7.一种杀虫剂，其包括权利要求1-6中任一项所述的重组蝗绿僵菌，以及任选地，农药学上可接受的载体。

8.权利要求1-6中任一项所述的重组蝗绿僵菌在制备杀虫剂(优选用于杀灭蝗虫的杀虫剂)中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，所述杀虫剂还包含杀灭蝗虫的其他活性成分，优选地，所述其他活性成分选自绿僵菌素、拟除虫菊酯、胺基甲酸酯、新烟碱酸、神经元钠通道阻断剂、杀昆虫巨环内酯、γ-胺基丁酸(GABA)拮抗剂、除虫脲和灭幼脲所组成的组。

10.权利要求1-6中任一项所述的重组蝗绿僵菌的制备方法，包括如下步骤：

将编码磷酸甘油酸激酶的核苷酸序列(优选为权利要求5或6中所定义的核苷酸序列)可操作性地导入专性菌蝗绿僵菌中，优选地，所述导入是通过根癌农杆菌介导法进行的。

11.一种杀灭蝗虫的方法，包括使用权利要求1-6中任一项所述重组蝗绿僵菌的步骤。