CN101307313A

CN101307313A - 蝎毒素基因转化的杀虫真菌工程菌株及应用

Info

Publication number: CN101307313A
Application number: CNA2007100408129A
Authority: CN
Inventors: 王成树; 吕丁丁
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2007-05-18
Filing date: 2007-05-18
Publication date: 2008-11-19
Also published as: WO2008141578A1; CN101755050A; CN101755050B

Abstract

本发明公开了一种优化的编码北非蝎神经毒素多肽AaIT的多核苷酸序列，其适于在真菌中转录表达。本发明还公开了一种可表达北非蝎神经毒素多肽AaIT的真菌菌株。本发明还公开了一种可用于防治昆虫的制剂，所述制剂对环境以及昆虫以外的其它动植物没有危害，属于一种环境友好的制剂。本发明还公开了一种可用于指导目的基因在昆虫血腔中特异表达的启动子。本发明首次将真菌细胞可感染昆虫并寄生在昆虫体内的特性和昆虫毒素多肽的毒性良好地结合在一起，大大提高了真菌的杀昆虫效率。

Description

蝎毒素基因转化的杀虫真菌工程菌株及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，更特别地，本发明涉及一种优化的编码北非蝎神经毒素多肽AaIT的多核苷酸，可表达北非蝎神经毒素多肽AaIT的真菌工程菌株，以及利用所述菌株杀灭昆虫的方法。

背景技术

随着社会经济的发展以及人们对生活水平要求的提高，环境友好的微生物杀虫剂的研究和应用受到越来越高的重视。微生物杀虫剂种类很多，已发现的有2000多种，按照微生物种类可分为细菌、真菌、病毒、原生动物和线虫等。目前被开发应用并形成商品化产品的主要有细菌类杀虫剂、真菌类杀虫剂、病毒类杀虫剂。

真菌类杀虫剂已经有多年应用历史，目前应用的真菌种类主要是一些寄生谱较广的昆虫病原真菌，种类主要有：白僵菌、绿僵菌、拟青霉、座壳孢菌和轮枝菌。真菌杀虫的主要机制是通过昆虫体壁主动入侵，属于触杀性微生物杀虫剂，因而比病毒或细菌昆虫病原微生物通过消化道感染具有独特的优势，如对刺吸式害虫的控制、害虫不易产生抗性及容易取得持续控制效果等。但与细菌或病毒杀虫剂相似的是，真菌杀虫剂同样具有杀虫效果缓慢的弱点，适宜条件下，一般需要3-7天的时间，这在很大程度上阻碍了包括真菌杀虫剂在内的微生物农药的大面积应用，尤其在爆发性害虫的控制上，微生物杀虫剂具有很大的局限性。

因此，本领域还需要找到可更为有效快速地杀灭昆虫且安全性高的杀昆虫制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种优化的编码北非蝎神经毒素多肽AaIT的多核苷酸。

本发明的另一目的在于提供一种可表达北非蝎神经毒素多肽AaIT的真菌工程菌株。

本发明的另一目的在于提供一种有效的、可显著提高真菌杀虫剂杀虫效率的方法。

在本发明的第一方面，提供一种编码北非蝎神经毒素多肽AaIT的多核苷酸，所述的多核苷酸的序列选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：1中第163-375位所示的核苷酸序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中第106-375位所示的核苷酸序列；

(c)具有SEQ ID NO：1中第1-375位所示的核苷酸序列；或

(d)与SEQ ID NO：1中第163-375位有至少95％相同性，且编码SEQ ID NO：2中20-89位所示氨基酸序列的核苷酸序列，并且所述的多核苷酸序列可在真菌中表达。

在本发明的第二方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制备防治昆虫的制剂。

在本发明的第三方面，提供一种昆虫血腔特异表达启动子，所述的启动子选自下组：

(1)具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的多核苷酸；

(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在昆虫血腔中特异性表达功能的多核苷酸；或

(3)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且具有指导目的基因在昆虫血腔中特异性表达功能的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供所述的启动子的用途，所述的启动子用于指导目的基因在昆虫血腔中特异性表达。

在本发明的第五方面，提供一种构建物，所述的构建物从5’至3’依次含有以下元件：

本发明所述的启动子；和

目的基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。

在另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。

在另一优选例中，所述的目的基因可编码具有对昆虫有毒性的蛋白。

在另一优选例中，所述的目的基因位于所述昆虫血腔特异性表达启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。

在另一优选例中，所述的构建物中，在启动子和目的基因之间，还包含：核糖体翻译识别元件，和/或信号肽编码元件。

在另一优选例中，所述的构建物中，

所述的目的基因是昆虫毒素多肽的编码元件；

所述的核糖体翻译识别元件具有SEQ ID NO：1中第9-105位的核苷酸序列；

所述的信号肽具有SEQ ID NO：2中1-19位所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的昆虫毒素多肽的编码元件为北非蝎神经毒素多肽AaIT的编码元件。

在另一优选例中，所述的北非蝎神经毒素多肽AaIT具有SEQ ID NO：2中20-89位所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的信号肽的编码序列具有SEQ ID NO：1中106-162位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的北非蝎神经毒素多肽AaIT的编码元件选自下组：

(i)具有SEQ ID NO：1中第163-375位所示的核苷酸序列；

(ii)与SEQ ID NO：1中第163-375位有至少95％相同性，且编码SEQ ID NO：2中20-89位所示氨基酸序列的核苷酸序列，并且所述的多核苷酸序列可在真菌(优选的为绿僵菌或白僵菌)中表达。

在本发明的第六方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的多核苷酸或所述的构建物。

在本发明的第七方面，提供一种细胞，所述的细胞：

含有所述的载体；或

其基因组中整合有外源的所述的多核苷酸或所述的构建物。

在另一优选例中，所述的细胞是重组真菌细胞。

在另一优选例中，所述的真菌选自：绿僵菌或白僵菌。

在另一优选例中，所述的真菌细胞为孢子形式。

在本发明的第八方面，提供一种孢子，所述的孢子由所述的真菌细胞产生。

在本发明的第九方面，提供一种防治昆虫的制剂，所述的制剂含有(a)所述的细胞和/或所述的孢子；以及(b)农药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的制剂含有1×10²-1×10¹²个/ml(优选的为1×10³-1×10¹⁰个/ml；更优选的为1×10⁴-1×10⁸个/ml)所述的孢子(可以是浓缩形式或稀释形式)。

在本发明的第十方面，提供一种防治昆虫的方法，所述方法包括：给予需要防治昆虫的对象或场所施用所述的孢子。

在另一优选例中，所述的昆虫选自(但不限于)：鳞翅目昆虫、双翅目昆虫、鞘翅目昆虫。

在本发明的第十一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的昆虫血腔特异表达启动子，作为启动子元件。

在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的昆虫血腔特异表达启动子可操作性连接的目的基因。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了北非蝎神经毒素多肽AaIT基因序列及其它功能性序列的融合序列，其含有MCL1 mRNA 5′-非翻译区、MCL1信号肽编码序列、AaIT编码序列，且两端携带Bam HI酶切位点。

图2显示了北非蝎神经毒素多肽AaIT的表达载体的结构示意图。

图3显示了真菌转化及表达验证的结果。

A，使用绿僵菌GFP-549转化子诱导表达实验，表明绿色荧光蛋白GFP的信号只有当真菌侵染至昆虫血腔时才表达；

B，A的光学显微镜图片；

C，RT-PCR检测，使用引物ToxU和ToxL扩增表明：当转化子AaIT-549在腐生培养基萨氏葡萄糖营养液中生长时毒素基因不表达，只有在昆虫血淋巴中(包括离体)生长时才表达；

D，时间序列RT-PCR分析，表明当真菌在昆虫血淋巴中生长时可以被快速表达；

E，Western杂交验证，表明转化子AaIT-549在昆虫血液离体培养(泳道3)或感染刚死亡的烟草天蛾幼虫体内表达AaIT多肽(泳道4-8)，当转化子在基本培养基或萨氏葡萄糖培养液中生长时(泳道1，2)，毒素多肽不会被表达；

F、G，转化子AaIT-549在昆虫血淋巴中离体生长72小时后用于注射丽蝇(F，上)和烟草天蛾(G，左)幼虫，引起典型的虫体收缩现象，F下或G右为注射在昆虫血淋巴中生长的野生型菌株549后的情况。

图4显示了ARSEF 549野生型(WT)和毒素转化菌株(AaIT-549)在相同使用浓度下对烟草天蛾(a)和埃及伊蚊(b)生物测定时的存活曲线。

A，测定孢子浓度C1-C3分别为5×10⁵，1×10⁶和2×10⁷分生孢子/毫升。对照(control)为仅以0.05％吐温-20处理的阴性对照的相应情况。内图上为野生型ARSEF 549感染后刚死亡的烟草天蛾幼虫，下为AaIT-549感染后死亡的身体收缩的幼虫；

B，测定孢子浓度C1-C3分别为1×10⁴，1×10⁵和5×10⁵分生孢子/毫升。对照(control)为仅以0.05％吐温-20处理的阴性对照的相应情况。内图上为野生型ARSEF 549感染后刚死亡的埃及伊蚊成虫，下为AaIT-549感染后死亡的翅膀展开的成虫。

图5显示了ARSEF 549野生型(WT)和毒素转化菌株(AaIT-549)感染烟草天蛾后的虫粪干重比较。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次根据真菌的基因偏好，通过基因优化手段在真菌细胞中表达了北非蝎神经毒素多肽AaIT。本发明将真菌细胞感染昆虫并寄生在昆虫体内的能力和北非蝎神经毒素多肽AaIT的神经毒性良好地结合在一起，大大提高了真菌的杀昆虫效率。

为了提高真菌的杀虫效率，本发明人考虑在真菌细胞内转化外源的毒素基因，通过表达毒素来提高杀虫效率。蝎、蜘蛛和蚂蚁的毒液或唾液腺中含有不同种昆虫特异性神经毒素，一般在微量的水平可以麻痹或杀死被捕食昆虫。因此，本发明人选择了北非蝎(Androctonus australis)神经毒素多肽AaIT，按照杀虫真菌的基因编码偏好，将AaIT反编码成杀虫真菌的基因序列，并在5’-端添加分泌信号肽序列进行基因合成，在可控启动子的调节下进行杀虫真菌的转化。经过对技术手段的不断探索和改进，最终在杀虫真菌中成功表达了AaIT并经验证其可提高真菌的杀虫效率。

真菌

本发明中，所述的真菌是指一类具有感染昆虫能力并能够寄生在昆虫体内的杀虫真菌。优选的，所述的真菌选自：绿僵菌或白僵菌。

绿僵菌(Metarhizium anisopliae)属子囊菌类，它是一种广谱的昆虫病原菌，能寄生昆虫8个目，30科共约200余种，也能寄生螨类，它可以诱发昆虫产生绿僵病。绿僵菌的菌落呈绒毛状或棉絮状，最初白色，产生孢子时呈绿色，故称绿僵菌。

绿僵菌以孢子发芽侵入昆虫体内，并在体内繁殖和形成毒素，导致昆虫死亡，但对植物没有毒害。死虫在体表形成的病菌孢子散出后，可再次侵染其它健虫，在昆虫种群内形成重复侵染，在一定时间内可引起昆虫死亡。其寄主范围已超过200余种昆虫，较常见的有金龟甲、象甲、金针虫、鳞翅目昆虫幼虫、椿象等。但天然的绿僵菌具有杀虫效果缓慢的弱点。

白僵菌(Beauveria bassiana)属于子囊菌亚门、白僵菌属(Beauveria)。菌丝有横隔有分枝的真菌。白僵菌可以侵入6个目15科200多种昆虫、螨类的虫体内大量繁殖，同时产生白僵素(大环脂类毒素)和草酸钙结晶，这些物质可引起昆虫中毒，使体液发现机能发生变化，打乱新陈代谢以致昆虫死亡，然而有杀虫速度较慢。

北非蝎神经毒素多肽AaIT

北非蝎神经毒素多肽AaIT是一种分离自北非蝎的昆虫特异性神经毒素多肽，其含有70个氨基酸(SEQ ID NO：2)，作用于昆虫神经细胞的离子通道上，在低浓度(如纳克水平)即可以麻痹或直接杀死昆虫，引起的典型症状是导致昆虫虫体收缩，但对哺乳动物无害。以往，本领域人员曾在昆虫杆状病毒中表达AaIT，利用可表达AaIT的杆状病毒来杀灭昆虫，证明是一种可一定程度提高昆虫病毒杀虫效率的可行方法。然而，利用昆虫病毒进行杀虫具有很大的局限性，主要缺点在于：病毒需要活体培养繁殖，生产成本高；另一方面昆虫病毒通过消化道感染，杀灭昆虫的速度慢。目前本领域至今还没有在杀虫真菌中成功表达AaIT的先例。

在本发明中，本发明人将AaIT多肽的编码基因转化入杀虫真菌的基因组中，所述真菌分生的孢子与昆虫接触后，通过昆虫体壁主动入侵到昆虫体内，在昆虫体内表达AaIT多肽，从而大大地提高了真菌的杀虫效率。更特别的，本发明人通过在AaIT多肽的编码基因序列的5’端设计特定的启动子序列和信号肽编码序列，从而使得AaIT多肽可在昆虫血腔内被特异性高表达且被分泌到真菌细胞外。

因此，本发明提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸可编码北非蝎神经毒素多肽AaIT，其含有SEQ ID NO：1中163-375位所示的核苷酸序列。所述的多核苷酸是根据真菌的基因编码偏好，通过基因优化改造后获得的，从而使得其可在真菌中良好地被表达。所述的多核苷酸与AaIT的天然多核苷酸(GenBank登录号M27706，无法在真菌中表达)的相同性为71.6％。

本发明所述的多核苷酸中，除了编码AaIT多肽的多核苷酸以外，还可包括附加的编码信号肽序列和/或核糖体翻译识别序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其也能够编码北非蝎神经毒素多肽AaIT，且其在转化入真菌(优选绿僵菌或白僵菌)后能够表达AaIT多肽，但所述的变异体的序列与天然的AaIT基因序列不相同。所述的核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代，但不会从实质上改变其编码的多肽的序列和功能。优选的，所述的多核苷酸的变异体与SEQ ID NO：1中第163-375位具有80％的相同性；更优选的，所述的多核苷酸的变异体与SEQ IDNO：1中第163-375位具有90％的相同性；最优选的，所述的多核苷酸的变异体与SEQ ID NO：1中第163-375位具有95％或更高的相同性，例如两者的相同性为96％、97％、98％或99％。

本发明的多核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了本发明的多核苷酸序列，就可以用重组法来大批量地获得该序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到该序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成本发明的多核苷酸序列，所述的人工合成可以是单次合成(适用于片段长度较短的情况)或多次合成(即先合成多个小片段，然后再进行连接)。目前，已经可以完全通过人工合成来得到编码北非蝎神经毒素多肽AaIT的DNA序列。然后可将该DNA序列引入适当的DNA分子(如载体)和细胞中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki等，Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化所扩增的DNA/RNA片段。

昆虫血腔特异表达启动子及其指导的基因表达

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于编码序列的上游(5’)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

如本文所用，“组织特异性启动子”又称“器官特异性启动子”，在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达。

如本文所用，所述的“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少10倍，优选至少高100倍，更优选至少高1000倍水平被表达，则该启动子被认为是组织或器官特异性的。

本发明提供一种启动子，所述的启动子选自下组：

(1)具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的多核苷酸；

多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在昆虫血腔中特异性表达的功能。

本发明的启动子是组织或器官特异性的，更特别的，其是昆虫血腔特异性的。在本发明的实例中，本发明人发现，在本发明的启动子的指导下，可以使AaIT基因或GFP基因特异地在昆虫血腔中表达，而在其它组织、器官或其它培养条件不表达。

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(优选结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些对于昆虫有毒性的蛋白。

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加表达量，提高毒性，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。

任何一种前述的启动子和目的基因序列可被包含在重组载体中。

所述的重组载体一般包括(从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如真菌细胞、细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如CaCl₂法，MgCl₂法。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

构建物和载体

本发明还提供一种构建物，所述的构建物从5’至3’依次含有以下元件：本发明的昆虫血腔特异性表达启动子，目的基因。通常，所述的目的基因位于所述昆虫血腔特异性表达启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。

作为本发明的优选方式，在启动子和目的基因之间，还包含：核糖体翻译识别元件，和/或信号肽编码元件。信号肽编码元件的加入与否取决于所需表达的目的基因的种类以及是否需要将目的基因分泌到细胞外。

作为本发明的优选方式，提供了一种可用于表达昆虫毒素多肽的构建物，所述的构建物从5’至3’依次具有以下元件：

本发明的启动子；

核糖体翻译识别元件；

信号肽编码元件；和

昆虫毒素多肽的编码元件。

作为本发明的优选方式，所述的昆虫毒素多肽为北非蝎神经毒素多肽AaIT，所述的北非蝎神经毒素多肽AaIT具有SEQ ID NO：2中20-89位所示的氨基酸序列。更优选的，所述的北非蝎神经毒素多肽AaIT的编码元件具有SEQ ID NO：1中163-375位所示的核苷酸序列，该核苷酸序列经过了密码子优化，从而适合于在真菌细胞中表达。

本发明的启动子可使得AaIT的编码元件特异性地表达于昆虫血腔中，而在其它条件下不表达或表达极低，从而避免了AaIT多肽被表达于昆虫以外而造成的对环境或其它动植物的危害，提高了安全性和环境友好性。

作为本发明的优选方式，所述的核糖体翻译识别元件具有SEQ ID NO：1中第9-105位的核苷酸序列。

作为本发明的优选方式，所述的信号肽具有SEQ ID NO：2中1-19位所示的氨基酸序列。更特别的，所述的MCL1蛋白信号肽的编码序列具有SEQ ID NO：1中106-162位所示的核苷酸序列。所述的MCL1蛋白信号肽可使得AaIT被分泌到真菌细胞(或孢子)外，从而使AaIT与昆虫的体腔接触，发挥毒性。

真菌载体和真菌细胞

本发明也涉及包含本发明的AaIT多核苷酸的载体。本发明中，编码AaIT的多核苷酸序列或含有该多核苷酸序列的构建物可插入到重组表达载体中。在本发明中适用的“重组表达载体”包括但不限于：在真菌中表达的载体。只要能在真菌内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含AaIT编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，coldSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。

作为本发明的优选方式，本发明人将本发明的启动子克隆入表达载体内，然后将含核糖体翻译识别元件、信号肽编码元件和北非蝎神经毒素多肽AaIT的编码元件的序列连接于启动子的3’端，构成重组的表达载体。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

为了制备可表达AaIT多肽的重组真菌细胞，将所述的构建物或载体转化真菌细胞。本发明对转化的方法没有特别的限制。真菌原生质体的方法在本发明中是较合适的，所述方法可参见Wang，C.S.和St Leger，R.J.2006.Acollagenous protective coat enables Metarhizium anisopliae to evadeinsect immune responses.Proc Natl Acad Sci USA.103：6647-6652中所描述的。筛选转化子的方法是本领域技术人员所熟知的。

在获得遗传稳定的真菌细胞重组子(重组真菌菌株)后，可将所述重组真菌菌株接种到适当的培养基上，从而使真菌菌株繁殖和/或产生孢子。重组真菌孢子可被制成防治昆虫的制剂，从而用于杀灭昆虫。可杀灭的昆虫包括(但不限于)：鳞翅目昆虫、双翅目昆虫、鞘翅目昆虫。

防治昆虫的制剂

本发明还提供了一种防治昆虫的制剂(如农药)，所述的制剂含有：有效量的所述的重组真菌或其分生孢子。更优选的，所述的制剂还含有农药学上可接受的载体。

本发明的防治昆虫的制剂可被制成任何适合的剂型。例如，所述的制剂的形式包括(但不限于)：粉剂、颗粒剂、油剂、乳剂、可湿粉、微胶囊剂、无纺布菌剂。

在制备制剂时，合适的固体稀释剂包括(但不限于)：硅藻土，玉米壳，磷酸三钙，软木粉，高岭土、膨润土或硅镁土等粘土、或水溶性聚合物。

固体制剂还可以含有一种或多种相容性润湿剂，分散剂，乳化剂或色素，这些成分在固态时也可起稀释剂的作用。

液体制剂的形式可以是溶液、悬浮液或乳液，也可以将其包在天然或合成聚合物中，并可以包含润湿剂、分散剂或乳化剂。这样的乳液、悬浮液或溶液可用水性、有机或水-有机稀释剂来制备水溶性聚合物(以及上述稀释剂的混合物)。此外，所述稀释剂中可含有例如以上所述离子型或非离子型的润湿剂、分散剂或乳化剂或它们的混合物。

所述的制剂可以是浓缩形式的或稀释形式的。作为本发明的优选方式，所述的制剂含有1×10²-1×10¹²个/ml(液体)或1×10²-1×10¹²个/g(固体)所述重组真菌菌株的孢子；更优选的，所述的制剂含有1×10³-1×10¹⁰个/ml(液体)或1×10³-1×10¹⁰个/g(固体)所述重组真菌菌株的孢子；进一步优选的，所述的制剂含有1×10⁴-1×10⁸个/ml(液体)或1×10⁴-1×10⁸个/g(固体)所述重组真菌菌株的孢子。制剂中孢子含量可根据剂型实际情况适当增加或减少。

适合采用本发明的制剂保护的对象或场所没有特别的限制，可以是(但不限于)：谷类作物(例如玉米，小麦，水稻，高粱)；田间、林间、种植院、暖房、果园和葡萄园中的观赏作物、种植院作物和林木，例如：棉花，烟草，蔬菜(例如豆类，油菜，葫芦，莴苣，洋葱，西红柿，胡椒)，田间作物(如马铃薯，甜菜，落花生，大豆，油菜)，甘蔗，草地和林木(如玉米，高粱，紫花苜蓿)，种植院作物(茶叶，咖啡，可可，香蕉，油棕，椰子，橡胶，香料)，果园和小树林(如核果，柑橘，猕猴桃，鳄梨，芒果，橄榄，胡桃)，葡萄园，暖房、花园或公园中的观赏作物，花卉和灌木，树林、种植院和花圃中的林木(包括落叶林木，常青林木)。

防治昆虫的方法

本发明还提供一种防治昆虫的方法，所述方法包括：给予需要防治昆虫的对象有效量的所述的孢子。

将采用所述的孢子制剂施用于生长中的植物的合适方法包括：固体播撒，叶面喷洒，液体灌溉等。优选的施用方式是对叶施用。

本领域技术人员可以看出，所述制剂的施用必需随例如温度、湿度、待处理区域和待处理植物等外界条件而改变。因此，施用比应可在一较宽的范围内变化。本发明制剂的使用频率可由农民、病害防治专业人士或其他本领域技术人员根据预期效果来选择。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明首次将真菌细胞感染昆虫并寄生在昆虫体内的能力和北非蝎神经毒素多肽AaIT的神经毒性良好地结合在一起，从而大大提高了真菌的杀昆虫效率。

(2)本发明中对AaIT的编码基因进行了密码子改造，从而可利用绿僵菌高效表达AaIT多肽，克服了现有技术中天然分离的AaIT基因难以在绿僵菌中表达的技术难题。

(3)通过在AaIT的编码基因的5’端添加MCL1信号肽的编码序列，并以昆虫血腔特异表达启动子来调控基因的表达，从而使得转化有AaIT的重组真菌菌株可特异性在昆虫血腔内高表达。

(4)利用所述的重组真菌孢子可制备成防治昆虫的制剂(农药)，所述制剂施用方便，对有害昆虫的杀伤效率高，并且对环境以及昆虫以外的其它动植物没有危害，属于一种环境友好的制剂。

(5)本发明首次揭示一种可用于指导外源蛋白在昆虫血腔中特异性高效表达的启动子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1基因合成及载体构建

1.基因的构建

基因的设计如下，将北非蝎针对昆虫的特异性神经毒素多肽AaIT的氨基酸序列反编码成杀虫真菌偏好的基因，并在该基因的5′-端添加金龟子绿僵菌基因MCL1(参见GenBank登录号：DQ238488或DQ238489；或Wang，C.S.和St Leger，R.J.2006.A collagenous protective coat enables Metarhiziumanisopliae to evade insect immune responses.Proc Natl Acad Sci USA.103：6647-6652)的信号肽(MCL1 SP，氨基酸序列为MRELSSVLAL SGLLALASA)编码序列和MCL1 mRNA 5′-非翻译区。并且，在序列两端分别设计BamHI酶切位点以便于切割和连接。

通过常规的方法人工合成该基因，合成的序列如图1所示，并通过BamHI酶切位点将之克隆入质粒pUC57(Genescript公司)。

2.载体的构建

为了达到使所述基因在昆虫血腔中特异表达的目的，本发明人使用绿僵菌昆虫血腔特异高表达基因MCL1的启动子(MCL1 pro)作为指导该基因表达的启动子，将该启动子克隆入表达载体，具体方法如下：

采用以下引物：

PcU(SEQ ID NO：4)：

CGGGATCCAATCATGCAGCGCTATGAGA，(下划线为BamHI酶切位点)；和

PcL(SEQ ID NO：5)：

CTTGGATCCCGGGATGGTCTAGGGAACGGAAA，(下划线分别为BamHI和SmaI酶切位点)。

以绿僵菌基因组DNA(常规方法制备)为模板，通过PCR扩增获得MCL1基因ATG翻译起始位点上游2769bp序列。

PCR扩增产物经BamHI酶切、纯化后克隆入质粒pGPS3Bar(参见Wang，C.S.和St Leger，R.J.2006.A collagenous protective coat enablesMetarhizium anisopliae to evade insect immune responses.Proc Natl AcadSci USA.103：6647-6652)的相应位点中，得到质粒pBarPc。

为了验证MCL1启动子的调控特异性，本发明人利用以下引物：

TCCCTAGACCATCCCGTACCGGTCGCCACCATG(SEQ ID NO：6)；和

CTGTCGACGGATCCCTTACTTGTACAGCTCGTCCA(SEQ ID NO：7)。

以质粒pEGFP(Clontech)为模板，通过PCR扩增获得GFP基因序列。然后，使用In-Fusion Dry-down PCR试剂盒(Clontech)将GFP基因序列克隆到pBarPc的SmaI酶切位点得到质粒pPcGFP。

利用以下引物：

ToxF(SEQ ID NO：8)：

CACCAGACCAGCCCCTCATGGAACATCACACTCG；和

ToxR(SEQ ID NO：9)：

GTCGACGGATCCCCCTTAGTTGATGATGGTGGTAT。

以前述构建的携带AaIT编码序列、MCL1信号肽编码序列和MCL1 mRNA 5′-非翻译区的pUC57质粒为模板，PCR扩增获得扩增产物，使用In-FusionDry-down PCR试剂盒将扩增产物克隆入pBarPc的SmaI酶切位点得到质粒pMcl 1prAaIT，该质粒的结构见图2。

实施例2真菌转化及表达验证

前述构建的表达载体pPcGFP和pMcl1prAaIT经SwaI酶切、线性化后使用真菌原生质体的方法(参见Wang，C.S.和St Leger，R.J.2006.Acollagenous protective coat enables Metarhizium anisopliae to evadeinsect immune responses.Proc Natl Acad Sci USA.103：6647-6652)进行金龟子绿僵菌菌株ARSEF 549(购自美国农业部虫生真菌菌种保藏中心http://arsef.fpsnl.cornell.edu/mycology/ARSEF_Culture_Collection.html#Catalog)的转化，筛选获得遗传稳定的转化子GFP-549和AaIT-549。

1.使用绿僵菌GFP-549转化子诱导表达实验

在马铃薯琼脂(PDA，Difco公司)培养基上，接种GFP-549孢子，25℃下培养20天后，收集分生孢子，分别接种于萨氏葡萄糖营养液(SDB，Difco公司)、基本培养基(葡萄糖10克/升，NaNO₃6克/升，KCl 0.52克/升，MgSO₄.7H₂O 0.52克/升，KH₂PO₄0.25克/升)以及离体的昆虫血液(分离自烟草天蛾5龄幼虫，65℃加热处理5分钟，13000rpm下离心5分钟，取上清液即获得)培养72小时。

结果发现，绿色荧光蛋白GFP的信号只有当GFP-549转化子在昆虫血淋巴中培养时才表达。

本发明人还以GFP-549孢子悬浮液感染烟草天蛾5龄幼虫，3天后分离收集菌体，于荧光显微镜下检测绿色荧光信号。

以GFP-549孢子悬浮液感染烟草天蛾5龄幼虫后的结果见图3A，绿色荧光蛋白GFP的信号只有当真菌侵染至昆虫血腔时才表达。图3B为图3A的光学显微镜图片。

2.绿僵菌AaIT-549转化子的生长和表达

a.RT-PCR

将转化子AaIT-549分别接种于腐生培养基萨氏葡萄糖营养液(SDB，购自Difco公司)和昆虫血淋巴(Hemolymph，分离自烟草天蛾5龄幼虫，65℃加热处理5分钟，13000rpm下离心5分钟，取上清液即获得)中，在25℃温度，180rpm转速下进行培养。其中WT为同步处理的野生型金龟子绿僵菌菌株ARSEF 549对照。

培养24小时后，采用布氏漏斗、Whatman NO 1滤纸过滤法分别收集菌丝，取0.1克，用RNeasy mini kit(Qiagen公司)试剂盒抽提总RNA，然后取1微克总RNA，使用oligo-dT primer试剂盒(购自ABgene公司)制备单链cDNA。

以ToxU(GCGTGAACTTTCTTCGGTTC(SEQ ID NO：10))和ToxL(TAGCCCTTATCGGCGTAGTG(SEQ ID NO：11))为引物，以上述方法获得的cDNA为模板进行常规的RT-PCR。分离扩增产物，进行电泳检测。

结果见图3C，表明当转化子AaIT-549在腐生培养基萨氏葡萄糖营养液中生长时毒素基因不表达，只有在昆虫血淋巴中(包括离体)生长时才表达。

b.时间序列RT-PCR

将金龟子绿僵菌菌株野生型菌株ARSEF 549与毒素基因转化子AaIT-549孢子接种于萨氏葡萄糖营养液(SDB，Difco公司)，25℃温度，180rpm转速下培养36小时，如上述方法过滤收集菌丝，再转入到昆虫血淋巴中(制备方法同a中所述)培养不同时间(如图所示)，以同样方法收集菌丝、提取总RNA及进行单链cDNA制备并用作PCR模板。

结果见图3D，时间序列RT-PCR分析表明当真菌在昆虫血淋巴中生长时可以被快速表达。

c.Western杂交试验

将转化子AaIT-549分别接种于腐生培养基萨氏葡萄糖营养液、基本培养基(葡萄糖10克/升，NaNO₃6克/升，KCl 0.52克/升，MgSO₄.7H₂O 0.52克/升，KH₂PO₄0.25克/升)以及离体的昆虫血液(制备同a中所述)中，采用如a所述同样的方法进行培养72小时，5000rpm离心5分钟，收集上清液。

用转化子AaIT-549感染烟草天蛾幼虫(Manduca sexta)，收集刚死亡的幼虫血淋巴，13000rpm下离心5分钟，取上清液。

用SDS上样缓冲液将上述不同上清液样本制成匀浆，经16.5％Tris-TricineSDS-PAGE胶(Bio-Rad公司)分离后，用抗北非蝎毒液抗体(购自MicroPharm公司，英国)进行杂交、染色后由ECL曝光成像。以18S核糖体rRNA基因作为阳性对照。

结果如图3E所示，表明：转化子AaIT-549在昆虫血液离体培养可表达AaIT多肽(泳道3)；AaIT-549转化子感染刚死亡的烟草天蛾幼虫后可在体内表达AaIT多肽(泳道4-8)；当AaIT-549转化子在基本培养基或萨氏葡萄糖培养液中生长时，毒素多肽不会被表达(泳道1，2)。

3.昆虫注射试验

将转化子AaIT-549置于昆虫血淋巴中离体生长，在72小时后，5000rpm离心5分钟，收集上清液用于注射丽蝇(Sarcophaga bullata)和烟草天蛾幼虫，注射量分别为20和100微升，观察两种昆虫的变化。以野生型金龟子绿僵菌菌株ARSEF 549在昆虫血淋巴中的离体培养物作为对照。

结果见图3F和图3G，可见转化子AaIT-549的培养上清液可引起典型的虫体收缩现象，其中图3F上和图3G左分别是丽蝇和烟草天蛾幼虫注射后的情况；图3F下或图3G右分别是将野生型菌株549培养上清液注射丽蝇和烟草天蛾幼虫后的情况。

实施例3农药制剂的制备

在马铃薯琼脂(PDA，购自Difco公司)培养基上，接种AaIT-549孢子，在25℃下培养20天后，收集分生孢子，用0.05％吐温-20(Sigma公司)配制各菌株孢子悬浮液。

所述的农药制剂配方如表1：

表1AaIT-549孢子悬浮液制备

	制剂1	制剂2	制剂3	制剂4	制剂5	制剂6
	制剂1	制剂2	制剂3	制剂4	制剂5	制剂6	AaIT-549的孢子(个)	2×10⁷	1×10⁷	5×10⁶	1×10⁶	5×10⁵	1×10⁵
0.05％吐温-20(ml)	1	1	1	1	1	1	AaIT-549的孢子(个)	2×10⁷	1×10⁷	5×10⁶	1×10⁶	5×10⁵	1×10⁵

实施例4昆虫生物测定

为了比较野生型菌株ARSEF 549与AaIT毒素基因转化子AaIT-549在杀虫毒力上的差异，用0.05％吐温-20配制各菌株孢子悬浮液，梯度孢子浓度分别从2×10⁷-1×10⁵分生孢子/毫升。供试昆虫分别选择刚蜕皮5龄烟草天蛾幼虫和埃及伊蚊(Aedes aegypti)雌性成虫(羽化后3天)，进行生物测定，方法参见Wang，C.S.和St Leger，R.J.2006.A collagenous protective coatenables Metarhizium anisopiiae to evade insect immune responses.ProcNatl Acad Sci USA.103：6647-6652。

结果表明，对于烟草天蛾和埃及伊蚊而言，AaIT-549比野生型ARSEF 549造成50％死亡率所需的菌株孢子浓度分别降低22倍和9倍；对于烟草天蛾和埃及伊蚊而言，施加AaIT-549比野生型ARSEF 549的50％存活时间分别缩短约30％和40％(表2；图4)。通过测定虫粪干重，毒素转化菌株AaIT-549比野生型感染时的烟草天蛾取食量下降约50％(图5)。

表2ARSEF 549(WT)及AaIT-549对烟草天蛾及埃及伊蚊的毒力比较

*使用检测的孢子浓度为2×10⁷分生孢子/毫升；

料使用检测的孢子浓度为1×10⁵分生孢子/毫升；

括号内数值为95％置信区间；

LD₅₀，致死中量；

ST₅₀，50％存活率。

实施例5启动子变体

采用常规的基因合成方法合成SEQ ID NO：3所示序列的启动子的变异形式I，该变异形式将SEQ ID NO：3序列的第63位的G→C；

采用常规的基因合成方法合成SEQ ID NO：3所示序列的启动子的变异形式II，该变异形式将SEQ ID NO：3序列的5’端加上2个核苷酸GT。

采用与实施例2类似的方法，检测由变异形式的启动子指导的GFP在昆虫血腔中的表达，结果发现，GFP的信号只有当转化子在昆虫血淋巴中培养时才表达。因此说明，上述的变异形式的启动子也能够指导基因特异性地在昆虫血腔中进行表达。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>蝎毒素基因转化的杀虫真菌工程菌株及应用

<130>071836

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>383

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>融合基因

<400>1

cgggatcctg ttcatggaac atcacactcg ctgactctgg acaccaactg tattcactcg 60

ctaattcgtt cctggctcaa attcttttcc gttccctaga ccatcatgcg tgaactttct 120

tcggttctcg ccetttcggg cttgctggcc ctggcgtcgg caaagaagaa cggctacgcc 180

gtcgatagca gcggcaaggc ccccgagtgc ctgctgagca actactgcaa caaccagtgc 240

accaaggtcc actacgccga taagggctac tgctgcctgc tgagctgcta ctgcttcggc 300

ctgaacgatg ataagaaggt cctggagatc agcgataccc gtaagagcta ctgcgatacc 360

accatcatca actaaggatc ccg 383

<210>2

<211>70

<212>PRT

<213>北非蝎(Androctonus australis)

<400>2

Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp Ser Ser Gly Lys Ala Pro Glu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Ser Asn Tyr Cys Asn Asn Gln Cys Thr Lys Val His Tyr Ala

20 25 30

Asp Lys Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Cys Tyr Cys Phe Gly Leu Asn

35 40 45

Asp Asp Lys Lys Val Leu Glu Ile Ser Asp Thr Arg Lys Ser Tyr Cys

50 55 60

Asp Thr Thr Iie Ile Asn

65 70

<210>3

<211>2769

<212>DNA

<213>绿僵菌(Metarhizium anisopliae)

<220>

<221>misc_feature

<223>启动子

<400>3

aatcatgcag cgctatgaga gcaatcaaag tcccaagtga atgactcgct atcatatgtg 60

atgtgtgacg tagcattgat gtccgcgcag tcctttccac gaagatacgt gcatagtagc 120

ataaaatatg acaatatgat tcaatctagc tgcatgtata gagtaattta gacacggtgt 180

gctaagattg gcccctcatg gcgagagaag taataccagc gattcgcttt ccgggtgccg 240

ctctccaatg ccttgctgtc aggcactttg ggcggtatgc atggactccc cttgtaacgc 300

aaatattaaa tatagtgctt atagcgttta atgattcgta aacggctgac agaagcccga 360

gcaaaaaatg tgtggcgatc tattggatga tgcaacagcg actgcgacat aatttcttct 420

ctcgctattt taataacatg gagcagaagg atttgatagg acacgcacga ccccgtcagc 480

ctggtatgta tgtttgagtt gcatgcggac ttgacagcca agccgggtga tgtttattgc 540

tcgcaacccg ctctagaagg aagtgtctgg tcgcgcaaac atgacaggaa caaggagcaa 600

ccccaaatga ttatcatttt ctctgtggag gaaatgattc gcaggataac agagctctac 660

cagtgggaga aagtgggaga aagtgggacc attgatgatt tcccaaagca ggcgcgcagg 720

ggctgcgcac attcttccgc acgcgcaacg catgatcaat actaattaaa caaatgactc 780

gatgattcca ttcgaggaga tgaccgacgc ttgtgcctgg aagcaatagc attcgcatat 840

taattcatcc gactcgagtc gggctatttg cacggcgcta agctgttttt gtgttggcgg 900

ccttggtcac acccatgctc gcgcccgctt ttttaaaaac ttgacattgt tttcaagcca 960

ttcttgaaca acttgagagc agtcaagacc aagcacagct taagtcgcat aaatcgccat 1020

ttccgcttcc tttaggggat atttatacca ttcaaagcct tttcattact ctgccactac 1080

tgtcggcgct gctcgaaccc taaaagggtt atccatccga gaagcgacgg ctcttccggc 1140

tgcggttcag ggatacgtag tcgtttcccc gatttctgga gaccctactc cgcactgctc 1200

ctcctcctac ttgctctgtg gcatgtccac cggttagtca tgttggtggt tgaggttgtg 1260

cgtaatttgc agagttatcc gactgctacg gcaagagtat cgcgagggtt gcgccgcgac 1320

atctggaacc ttcaactagc tccgcttgtg ttgttggatt gactcatacg tgataaccaa 1380

agagtctaac tgaagacgct accctgagcc acgtcctatt ctcccccaaa agcacaatgt 1440

ggcgggagtc tcccttcatc cgcgtcatgt gggcttccgt attaggacgc cgggcagggt 1500

taccctagct ggcgatgatg gcatctaccg aaattccgcc accttctggc cacatttggc 1560

cagatgggat gagtgagtgt ggggttgaat gacagagtga gcagaatctt ggccgatggg 1620

cgtcttggga gggagtagca aagtacgtac aaacataaaa accgtgcgcc ttgctagcca 1680

tcccttgcgc catgcttata aagtaatccc atggtgccga gctggacagg gggaccatga 1740

gtatgagcag aataaagttg gaccagacac gttttcccca ttggctcaca ttgctcggaa 1800

caaggcgatg agtactacgc tccacaaccg cgtttgcagc gctaacgtct ttagcatggc 1860

taatatagaa atagtgtgtt ggtaggatgg caagatgtaa gtcactaggt agttctgaat 1920

aggttctcaa ccgccgtagt agaaacagaa gatgccgtgc gtgcttaaac aagggcggac 1980

ggggtttcca aaatgtcggt caatctatgt accgtcgagc ctgcggttta ttcccatcac 2040

cataagagga tctggattgc ccagaggaga ctcgttgtgg gctgtcaatt tatcccacag 2100

cttccatggc caccttcaaa ttacattgct gacgcgtgac gatccatctc agcatacaca 2160

aacagatcca ttcaatgtaa aaatgtcaaa gagtattcag cccgaatctc ttgcattgtc 2220

acgtatacta gtacatacga aaatagtaga acacaaccag gcacctattc taaaaggtgg 2280

atcaagaaaa aaacatcatc tcacagcaag gcggatgcca aagatgaacc gcgcgttgcc 2340

tcactccaca ccaactcaaa ccctgcaagg cgcggcctgt gtcctagaat acatatgtgc 2400

agtatacatg atagagtcta ttactgaaaa ggggaaaatg gagcccagaa tgtcaatagc 2460

atcaggccat ggcttggcgg ttgaccaggg gctgccaagt cccgctgact cttgaccaag 2520

atttcgattc atgcaggccc caatagcgca aatgattgtg gggatgacgc cagtgcaagc 2580

aggaatgcag gtacaagttt gtataattct tctgaaatat atatatcagt agtgactccg 2640

gcaatccgta ccatcttgcg ccaccagacc agctgttcat ggaacatcac actcgctgac 2700

tctggacacc aactgtattc actcgctaat tcgttcctgg ctcaaattct tttccgttcc 2760

ctagaccat 2769

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

cgggatccaa tcatgcagcg ctatgaga 28

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

cttggatccc gggatggtct agggaacgga aa 32

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

tccctagacc atcccgtacc ggtcgccacc atg 33

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

ctgtcgacgg atcccttact tgtacagctc gtcca 35

<210>8

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

caccagacca gcccctcatg gaacatcaca ctcg 34

<210>9

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

gtcgacggat cccccttagt tgatgatggt ggtat 35

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

gcgtgaactt tcttcggttc 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>11

tagcccttat cggcgtagtg 20

Claims

1.一种编码北非蝎神经毒素多肽AaIT的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：1中第163-375位所示的核苷酸序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中第106-375位所示的核苷酸序列；

(c)具有SEQ ID NO：1中第1-375位所示的核苷酸序列；或

2.权利要求1所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备防治昆虫的制剂。

3.一种昆虫血腔特异表达启动子，其特征在于，所述的启动子选自下组：

(1)具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的多核苷酸；

4.权利要求3所述的启动子的用途，其特征在于，所述的启动子用于指导目的基因在昆虫血腔中特异性表达。

5.一种构建物，其特征在于，所述的构建物从5’至3’依次含有以下元件：

权利要求3所述的启动子；和

目的基因。

6.如权利要求5所述的构建物，其特征在于，在启动子和目的基因之间，还包含：核糖体翻译识别元件，和/或信号肽编码元件。

7.如权利要求5或6所述的构建物，其特征在于，

所述的目的基因是昆虫毒素多肽的编码元件；

所述的信号肽具有SEQ ID NO：2中1-19位所示的氨基酸序列。

8.如权利要求7所述的构建物，其特征在于，所述的昆虫毒素多肽的编码元件为北非蝎神经毒素多肽AaIT的编码元件。

9.如权利要求8所述的构建物，其特征在于，所述的北非蝎神经毒素多肽AaIT的编码元件选自下组：

(i)具有SEQ ID NO：1中第163-375位所示的核苷酸序列；

(ii)与SEQ ID NO：1中第163-375位有至少95％相同性，且编码SEQ ID NO：2中20-89位所示氨基酸序列的核苷酸序列，并且所述的多核苷酸序列可在真菌中表达。

10.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的多核苷酸或权利要求5所述的构建物。

11.一种细胞，其特征在于，所述的细胞：

含有权利要求10所述的载体；或

其基因组中整合有外源的权利要求1所述的多核苷酸或权利要求5所述的构建物。

12.如权利要求11所述的细胞，其特征在于，所述的细胞是重组真菌细胞。

13.一种孢子，其特征在于，所述的孢子由权利要求12所述的真菌细胞产生。

14.一种防治昆虫的制剂，其特征在于，所述的制剂含有(a)权利要求12所述的细胞和/或权利要求13所述的孢子；以及(b)农药学上可接受的载体。

15.一种防治昆虫的方法，其特征在于，所述方法包括：给予需要防治昆虫的对象或场所施用权利要求13所述的孢子。

16.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求3所述的昆虫血腔特异表达启动子，作为启动子元件。