CN113528518A

CN113528518A - 抑制核盘菌的miRNA及其应用

Info

Publication number: CN113528518A
Application number: CN202110717623.0A
Authority: CN
Inventors: 梅家琴; 钱伟; 高杨; 汤青林
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113528518B

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个抑制核盘菌的Os‑miR169y及其应用。Os‑miR169y成熟miRNA序列如SEQ ID No.1所示，其人工合成的前体核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的Os‑miR169y可靶向核盘菌SsRPL19基因，Os‑miR169y在核盘菌中的超量表达显著抑制了菌丝生长，降低了菌丝致病力，并导致菌核形成时间延后，Os‑miR169y在拟南芥中的超量表达，有效减小了发病面积，提高了拟南芥的菌核病抗性，在提高寄主植物菌核病抗性方面具有良好的应用前景。

Description

抑制核盘菌的miRNA及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个抑制核盘菌的miRNA及其应用。

背景技术

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种典型的死体营养型、寄主范围广泛的丝状植物病原真菌，分布范围覆盖95个国家及地区，可侵染600多种植物，其中包括一些重要农作物，如大豆，油菜，向日葵，芸薹属蔬菜等。在适宜条件下，核盘菌可迅速侵染寄主植物产生菌核病。植物对核盘菌的抗性体现为基础抗性，目前为止仍未找到核盘菌的致病基因及植物中对应的抗病基因，因此寄主植物的抗菌核病育种进展缓慢。目前生产上主要通过一些农业措施和化学药剂来防治菌核病，但效果不稳定，并且存在环境污染及抗药性等问题。开展可抑制核盘菌的生物小分子物质研究，进而指导寄主植物的生产实践，对实现植物的安全稳产有重要意义。

植物非寄主抗性是自然界广泛存在的抗病系统，具有持久性和广谱性，对作物抗病育种有重要的应用价值。对于核盘菌而言，水稻是其非寄主植物之一。根据对水稻与油菜接种核盘菌前和接种后的小RNA测序(sRNA-Seq)及转录组测序(RNA-Seq)联合分析，鉴定到1个水稻特异的、响应核盘菌诱导的miRNA，该miRNA可靶向核盘菌基因。根据其成熟miRNA序列特征，将其归属于miR169家族，是该家族一个新成员，本发明将其编号为Os-miR169y。miR169基因家族是植物界所发现的较大的miRNA基因家族，多数成员具有调控植物生长发育及对逆境产生响应的功能。然而Os-miR169y是一个新成员，其功能及靶基因并未有任何报道。本发明对该Os-miR169y进行抑菌功能研究，并开发其用于寄主植物的抗性提高的途径，可为寄主植物的菌核病抗性改良提供基础。

发明内容

本发明的目的是提供Os-miR169y成熟miRNA及其应用。

首先，本发明提供Os-miR169y，其为成熟miRNA，序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供编码所述的Os-miR169y的前体，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供含有所述Os-miR169y的过表达载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述Os-miR169y靶向核盘菌基因并抑制核盘菌的用途。

本发明还提供所述Os-miR169y在调控寄主植物菌核病抗性中的用途。

本发明从水稻中鉴定到了1个与核盘菌抗性相关的Os-miR169y，经双荧光素酶报告系统检测，Os-miR169y可靶向核盘菌SsRPL19基因，利用基因工程手段构建了Os-miR169y的核盘菌过表达载体，将其转入野生型核盘菌中超量表达，能抑制核盘菌的菌丝生长，降低致病力，延缓菌核形成时间。利用基因工程手段构建了Os-miR169y的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能有效提高拟南芥菌核病抗性。

本发明为核盘菌寄主植物的抗性改良提供了很好的应用前景。

附图说明

图1是Os-miR169y与靶基因SsRPL19碱基结合情况预测结果。

图2是双荧光素酶活检测Os-miR169y与SsPRL19互作的结果。四组数据依次为：miR169y空载菌液+pGrDL_SPb菌液，miR169y空载菌液+pGrDL_SPb_169菌液，35S-miR169y菌液+pGrDL_SPb_169菌液，35S-miR169y菌液+pGrDL-SPb菌液。**表示P<0.01。

图3是Os-miR169y同源基因在物种间的系统发育分析。Os-miR169y成熟序列与其近缘物种及其他植物的序列相比，序列差异明显，表明了该序列的特异性。实心圆表示预测到miRNA与SsPRL19存在靶向关系。物种拉丁名缩写：Aly-Arabidopsis lyrata；Ath-Arabidopsis thaliana；Aof-Asparagus officinalis；Bdi-Brachypodium distachyon；Bju-Brassica juncea；Bra-Brassica rapa；Can-Capsicum annuum；Ccl-Citrusclementina；Cmo-Cucurbita moschata；Csi-Citrus sinensis；Esa-Eutremasalsugineum；Fan-Fragaria ananassa；Fex-Fraxinus excelsior；Fsy-Fagus sylvatica；Ghi-Gossypium hirsutum；Hbr-Hevea brasiliensis；Hsy-Hibiscus syriacus；Mac-Musaacuminata；Nbe-Nicotiana benthamiana；Ogl-Oryza glaberrima；Oni-Oryza nivara；Oru-Oryza rufipogon；Osa-Oryza sativa；Pda-Phoenix dactylifera；Peu-Populuseuphratica；Ptr-Populus trichocarpa；Qro-Quercus robur；Sit-Setaria italica；Sla-Silene latifolia；Sly-Solanum lycopersicum；Spe-Solanum pennellii；Spi-Solanumpimpinellifolium；Stu-Solanum tuberosum；Tae-Triticum aestivum；Zma-Zea mays。

图4是Os-miR169y在核盘菌中超量表达的载体pEf1-Os-miR169y菌检结果。不同泳道代表不同的单克隆，扩增片段为402bp的单克隆即为Os-miR169y的过表达载体pEf1-Os-miR169y。

图5是核盘菌Os-miR169y过表达转化子的PCR和荧光定量PCR鉴定结果。PCR鉴定共筛选出7个402bp条带的阳性转化子(A图)，所有转化子的Os-miR169y表达量均高于野生型菌株(B图)。

图6是Os-miR169y过表达的转基因核盘菌表型。Os-miR169y过表达的2个转基因菌株EF1-miR169y-1和EF1-miR169y-1，其菌丝生长速度显著低于wt(A图)，培养10天后仍无菌核形成(B图)，培养25天可产生菌核(C图)，接种油菜叶片菌斑面积小于wt(D图)，接种油菜茎秆的菌斑长度显著小于wt(E图)，表明Os-miR169y过表达的转基因核盘菌，其菌丝生长速度和致病力显著下降、菌核形成延缓。

图7是Os-miR169y在拟南芥中超量表达的载体pBinGlyRed3-Os-miR169y菌检结果。不同泳道代表不同的单克隆，扩增片段为222bp的单克隆即为Os-miR169y的过表达载体pBinGlyRed3-Os-miR169y。

图8拟南芥Os-miR169y超量表达株系的PCR和荧光定量PCR鉴定结果。PCR鉴定共筛选出4个222bp条带的阳性转化子(A图)，其中2个纯合株系的Os-miR169y表达量均高于野生型拟南芥Col-0和转入空载(EV)的拟南芥(B图)。

图9是超量表达Os-miR169y拟南芥的菌核病抗性鉴定结果。接种24h后转基因拟南芥叶片上菌斑表现比野生型wt小(A图)，测定后超量表达Os-miR169y的拟南芥平均菌斑面积显著小于野生型wt(B图)，**表示P<0.01。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 Os-miR169y与核盘菌SsRPL19基因的靶向关系验证

靶基因预测

使用patmatch_v1.2软件来进行小RNA和靶基因的互补配对，再通过程序筛选预测得到最终结果，其筛选的条件需同时满足：小RNA与靶基因的靶向互补关系中，最多可允许出现4个错配(G-U配对算0.5个错配)；不允许发生连续的错配；小RNA的5'端(2～12的位置中)不允许碱基错配；小RNA/target的10～11的位置，不允许碱基错配；小RNA/target的miRNA 5'端1～12位最多允许2.5个错配；小RNA/target的MFE(最小自由能)必须大于或等于miRNA与靶基因完美结合MFE的60％(图1)。

双荧光报告系统载体构建

以pGrDL_SPb质粒为模板，以T-F/169-L19R、169-L19F/T-R为引物(引物序列T-F:5'-CGCCGGTGAACTTCCCGCCG-3'，T-R:5'-CTGGATTTTGGTTTTAGGAAT-3'，169-L19F:5'-GTCGACCCAAGCCAAGAAGGCTGCCCTGCAGTCGCCATGCGG-3'，169-L19R:5’-GGCAGCCTTCTTGGCTTGGGTCGACAAGGAATTCTTACACGG-3’)，分别扩增位于LUC基因下游的两个片段，将克隆所得的片段分别命名为片段1、片段2，替换的靶位点序列包含在169-L19F/169-L19R中。扩增出的片段1、片段2胶回收后，按照摩尔比1：1进行混合，以混合物为模板，T-F/T-R为引物进行融合PCR，反应体系为：2μl片段1，2μl片段2，25μl 2×Taq Mix，2μl T-F(10μM)，2μl T-R(10μM)，17μldd H₂O，反应程序为94℃，5min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；30个循环，72℃，5min；16℃，10min。将融合PCR所得产物胶回收，连接T载体。连接产物转化大肠杆菌后，挑取单克隆用T-F/T-R为引物进行菌检并测序，测序比对结果正确的菌液提取质粒后，Sal I/Spe I双酶切获得含有靶位点的目的片段，同时Sal I/Spe I双酶切pGrDL_SPb质粒获得线性化的载体骨架，将上述载体和目的片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取适当数量的单克隆进行菌检，用于菌检的引物为：T-F/T-R。

转化农杆菌感受态

挑选一个菌检正确的菌液提取质粒，将该质粒命名为pGrDL_SPb_169，所提质粒转化农杆菌感受态细胞。步骤如下：取-80℃保存的GV3101(pSoup)农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化；无菌条件下，向感受态细胞中加入100ng～1μg质粒DNA轻轻混匀，冰水浴中静置5min；将离心管置于液氮中速冻5min；然后快速将离心管置于37℃水浴中保持5min，此过程勿晃动水面；将离心管放回冰水浴中，冰浴5min；无菌条件下加入800μl无抗生素LB液体培养基，于28℃摇床振荡培养2～3小时；5000rpm离心5min收菌体，留100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，取适量菌液，涂布于相应抗生素的LB平板上，于28℃培养箱中倒置培养过夜。

烟草瞬时共表达

将带有重组质粒的农杆菌在LB液体培养基中(含Kan/Rif)28℃，200rpm过夜培养；将培养好的农杆菌液转入50ml无菌离心管中，低温高速离心机4℃，4000rpm离心10min，弃上清；向离心管中加入适量烟草侵染悬浮液并吹打沉淀，使菌体悬浮起来，分光光度计测量OD 600＝0.6～1.2，0.8最佳，室温放置2h，彻底悬浮菌液；取1000X(X＝0.8/所测OD值)微升菌液至2ml离心管中，4000rpm离心10min后弃上清，加入1ml的悬浮液重新悬浮菌体；按照以下四组设计方案：荧光素酶质粒pGrDL_SPb菌液+35S空载质粒菌液、质粒pGrDL_SPb菌液+35S-miR169y菌液、质粒pGrDL_SPb_169菌液+35S空载质粒，质粒pGrDL_SPb_169+35S-miR169y质粒，按照前者：后者体积比＝1:10混合菌液，终体积1ml；选取生长一个月左右的本氏烟(4～5叶期)进行注射，注射前要充分吸水使其气孔张开，用1ml注射器，以叶脉为界限一片叶子注射两个伤口，1ml打3片叶子并用马克笔圈出侵染部位，每组菌液注射三片叶子；将处理过的烟草做好标记，暗培养12h后放回培养箱正常管理。

双荧光素酶活性检测

注射菌液2～3天后进行测量，在马克笔圈出的范围内剪取叶片(≤25mg)放入1.5ml离心管中，加入干净的钢珠，放入液氮中冷冻，并用打样机打碎；在震碎的烟草组织中加入100μl 1×Cell Lysis Buffer(细胞裂解液)混匀，室温放置5-10min(如果荧光素酶表达水平过低，可适当减少裂解液用量以提高蛋白浓度)；12000rpm离心2分钟，吸取20μl上清于2ml离心管中，加入100μl平衡至室温的Luciferase Substrate迅速混匀，用发光检测仪检测Firely Luciferase报告基因活性；在以上反应液中加入100μl新鲜配置的Renilla底物工作液，迅速混匀后用发光检测仪检测Renilla Luciferase报告基因活性，Renillaluciferase作为校正转染效率的内参，消除孔间细胞数量和转染效率的差异。

经patmatch_v1.2软件对Os-miR169y与核盘菌SsRPL19基因进行靶向关系预测，两者存在互作关系，Os-miR169y和靶基因的互补配对情况见图1。通过双荧光素酶活检测，确认了Os-miR169y与核盘菌SsRPL19基因的互作，其结果见图2。进一步，将Os-miR169y的成熟序列与已知的miRNA序列对比和系统进化树分析，该序列与其他同源miRNA差异明显，表明了Os-miR169y的特异性(图3)。

实施例2 Os-miR169y的核盘菌转基因载体pEf1-Os-miR169y构建

人工合成Os-miR169y的前体序列(序列如SEQ ID No.2)，将生物公司返回的含有该序列的质粒进行EcoR V单酶切，另外用EcoR V单酶切pEf1载体质粒，两者酶切体系均为：2μl EcoR V，5μl质粒DNA(1000ng/μl)，5μl 10x FastDigest buffer，38μl ddH₂O，均在PCR仪中37℃孵育1h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段大小(Os-miR169y前体序列为118bp，pEf1载体约为9000bp)的胶块于1.5ml离心管中，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。对线性化pEf1载体进行去磷酸化处理，反应体系为：1μl Quick CIP，5μl

Buffer，2μl DNA(1000ng/μl)，12μl ddH₂O。反应条件为37℃，30min；80℃，2min。将上述胶回收获得的前体序列和去磷酸化后的线性化pEf1载体通过T4 DNA连接酶进行连接，连接体系为：3μl胶回收产物，3μl pEf1载体，1μl T4 DNA Ligase，3μl ddH₂O。PCR仪中22℃连接1h。将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取适当数量的单克隆于含有对应抗性的LB液体培养基(添加Amp，100mg/ml)中，37℃摇床200rpm培养6～8个小时后进行菌液PCR检测，引物为GY2F/GY2R(GY2F:5’-CTGGACTTCACTTTTGCCTCT-3’，GY2R:5’-CTCTTGGACATATCCCTCTGG-3’)，PCR体系为：2μl菌液，12.5μl 2×Taq Mix，2μl GY2 F(10μM)，2μl GY2R(10μM)，6.5μl ddH₂O，反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；30个循环，72℃，5min；16℃，end。将扩增片段为402bp的克隆菌液进行扩大培养，所得菌液提取质粒，即为Os-miR169y的过表达载体pEf1-Os-miR169y(图4)。

实施例3转基因载体pEf1-Os-miR169y转入核盘菌

核盘菌原生质体的制备

将核盘菌菌株‘1980’接种到铺有玻璃纸的土豆葡萄糖(PDA)培养基上培养36h，在超净工作台刮取1～2皿菌丝于100ml PDB培养基中，22℃150rpm摇床震荡培养36h；培养好的菌丝用300目大小的网筛过滤得到菌丝体，用0.8MMgSO₄洗涤菌丝体两次；将菌丝体挑入酶解液中，30℃150rpm摇床中酶解2～3h，期间抽取1ml酶解液在计数板上观察酶解情况；用灭菌漏斗过滤酶解后的溶液，4000rpm，4℃离心10min，沉淀即为核盘菌原生质体；将上述沉淀用2～5ml 0.8M MgSO₄溶液清洗两次，4 000rpm，4℃离心10min，弃上清液；原生质体悬浮液吹打悬浮沉淀，分装于1.5ml离心管中，每管100μl；将制备好的核盘菌原生质体保存于-80℃低温冰箱中，备用。

PEG介导的原生质体转化

将载体pEf1-Os-miR169y质粒单酶切线性化后利用PEG介导的原生质体转化的方式转化核盘菌菌株1980，具体步骤如下：质粒单酶切后进行胶回收，向胶回收产物中分别加入2μl亚精胺和2μl肝素钠；将上述混合物加入制备好的100μl原生质体中，冰浴40min；向离心管中加入1ml PTC轻柔混匀，切勿吹打震荡，25℃处理30min；将上述混合液加入配置好的RM底部培养基中(培养基温度不可过高，以手背触摸培养基瓶身不烫手为宜)，轻轻晃动培养基，混匀后迅速倒在培养皿中，每皿约20ml左右，于22℃培养箱中倒置培养；培养16h后，重新打开培养皿倒入5ml左右含潮霉素200μg/L的RM顶部培养基，顶部培养基要均匀的覆盖在底部上；22℃培养箱中正置培养约4～5d，即可在在顶部培养基表面长出肉眼可见的菌落。用接种针挑取从顶部培养基表面生长出来的单菌落于含潮霉素(100μg/ml)的PDA培养基上，22℃培养箱中倒置暗培养1天。选取在潮霉素(100μg/ml)抗性的PDA培养基上生长正常的菌丝转移至新的潮霉素(200μg/ml)抗性的PDA培养基中进行筛选，将培养基中潮霉素浓度提高为300μg/ml进行最终的筛选。将经过3次筛选的单菌落进行编号，即获得具有稳定潮霉素抗性的转化子。

实施例4 Os-miR169y的转基因核盘菌筛选

将经过潮霉素抗性筛选的转化子接种到铺有玻璃纸的PDA培养基上，22℃培养36h，刮取菌丝于装有钢珠的2ml离心管，立即置于液氮中，采用CTAB法提取核盘菌DNA，以核盘菌1980为对照，用引物GY2F/GY2R(GY2F:5’-CTGGACTTCACTTTTGCCTCT-3’,GY2R:5’-CTCTTGGACATATCCCTCTGG-3’)进行PCR扩增，筛选产物为402bp的个体作为阳性转化子。另外，收集菌丝用TRNzol法提取其总RNA，用北京全式金生物技术有限公司生产的

miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix进行miRNA反转录试剂(加尾法)，体系如下：5μl Total miRNA，1μl

miRNA RT Enzyme Mix，10μl 2×TSmiRNA Reaction Mix，4μl RNase-Free Water，反应程序为：37℃，1h。反转录cDNA后进行荧光定量PCR检测，以SsU6为内参(引物为AT-U6F:5′-CGATAAAATTGGAACGATACAG-3′；Universal miRNA-R:5′-GATCGCCCTTCTACGTCGTAT-3′)，检测转化子中Os-miR169y的表达量(引物RT-miR169 F:5′-GGCAGTCTCCTTGGCTAGA-3′；Universal miRNA-R:5′-GATCGCCCTTCTACGTCGTAT-3′)。PCR反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，56℃20s，72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。经PCR检测，共筛选出7个402bp大小条带的阳性转化子(图5A)，荧光定量PCR显示7个转化子的Os-miR169y表达量均高于野生型菌株(图5B)。

实施例5 Os-miR169y的转基因核盘菌表型鉴定

根据实施例4中荧光定量PCR结果，选取阳性转化子EF1-miR169y-1与EF1-miR169y-2进行后续的表型鉴定。将野生型核盘菌菌株1980(wt)及阳性转化子在普通PDA培养基上活化，用直径为6mm的打孔器沿菌丝边缘打孔，将新鲜的菌丝块转移至新的PDA培养基中央(20ml/皿)，置于22℃霉菌培养箱中培养，每隔12h采用十字交叉法测量其生长直径，取平均值计算生长面积S(按圆形计算，单位cm²)和生长面积变化度D_S，D_S(％)＝100*(S_转化子-S_wt)/S_wt。实验重复5次，每个处理5皿/重复。将上述完成生长速度测定的核盘菌在22℃霉菌培养箱中继续培养，培养10天时观察菌核形成情况。

在PDA上培养36h的菌丝边缘用6mm打孔器打取菌丝块，在油菜6-9叶期之间，采用离体叶片接种法接种于油菜中双11号的倒三叶，每个菌株每次接种5片叶片，每个叶片接种2个菌丝块，接种后置于22±1℃、湿度>85％条件下。接种48h后采用十字交叉法测量菌斑长径a和短径b，采用公式s＝π*a*b/4计算叶片发病面积，病斑面积变化度d_s(％)＝100*(s_转化子-s_wt)/s_wt。实验重复5次。

在PDA上培养36h的菌丝边缘用6mm打孔器打取菌丝块，在油菜成熟前2周，采用离体茎秆接种法接种于油菜中双11号茎秆节间平整部位，每个菌株每次接种5个茎秆，每个茎秆上接种3个菌丝块，中间间隔15cm，接种后置于22±1℃、湿度>85％条件下，96h后统计菌斑长度l，计算病斑长度变化度d_l(％)＝100*(l_转化子-l_wt)/l_wt。实验重复5次。

经表型鉴定，培养36h的Os-miR169y过表达转化子菌丝生长面积相对于wt减小了48.8％(S_{EF1-miR169y-1}＝15.05±1.34cm²，S_{EF1-miR169y-2}＝16.09±2.13cm²,S_wt＝30.42±0.71cm²)(P<0.01)(图6A)；培养10天后，Os-miR169y过表达转化子则尚未形成菌丝团结构(图6B)，培养25天后，Os-miR169y过表达转化子的菌核体积较小，单粒干重显著小于wt(W_EF1-miR169y＝0.13g，W_wt＝0.17g)(P<0.05)(图6C)；致病力检测发现，接种miR169y过表达转化子的病斑面积较wt减小了33.1％(s_OE-miR169y-1＝2.88±0.44cm²，s_OE-miR169y-2＝2.95±0.44cm²,s_wt＝4.36±0.72cm²)(P<0.01)(图6D),接种miR169y过表达转化子的病斑长度较wt减小了47.0％(l_OE-miR169y-1＝2.96±0.30cm，l_OE-miR169y-2＝2.60±0.36cm,l_wt＝5.25±0.31cm)(P<0.01)(图6E)。综合上述结果，Os-miR169y过表达的转基因核盘菌，其菌丝生长速度和致病力显著下降、菌核形成延缓。

实施例6 Os-miR169y的植物转基因载体pBinGlyRed3-Os-miR169y构建

将生物公司返回的含有miR169y前体序列的质粒及pBinGlyRed3质粒用Xba I/XhoI双酶切，琼脂糖电泳后胶回收，胶回收产物用T4 DNA连接酶连接并转化大肠杆菌，挑取适当数量的单克隆进行菌检，引物组合为QW586F/QW586R(QW586F:5’-CGCACAATCCCACTATCCTT-3’；QW586R:5’-AAAAGACAAAAGTGGGGTAG-3’)，菌检条带为222bp的菌液提取质粒，将该质粒转入农杆菌用于拟南芥遗传转化。其中涉及的双酶切、胶回收、连接、菌检等操作同实施例2。根据上述步骤，本发明将PCR扩增片段为222bp的克隆菌液进行扩大培养，所得菌液提取质粒，即为Os-miR169y的过表达载体pBinGlyRed3-Os-miR169y(图7)。

实施例7转基因载体pBinGlyRed3-Os-miR169y转入拟南芥

将农杆菌菌液在含有Kan(50mg/L)Rif(25mg/L)、Str(25mg/L)的LB液体培养基中培养，28℃，200rpm过夜培养；将培养好的农杆菌液转入50ml无菌离心管中，低温高速离心机4℃，4000rpm离心10min，弃上清；向离心管中加入适量侵染悬浮液吹打沉淀，使菌体悬浮起来，分光光度计将侵染液OD600调节至0.8～1.0；在人工气候培养箱中种植的野生型拟南芥Col-0，待盛花期，去掉已经完成受精的荚果后，将拟南芥花序浸泡于侵染液中轻轻晃动30s，取出后将拟南芥用保鲜膜覆盖保湿，暗培养24h后转移至培养箱正常培养，待拟南芥成熟后收获种子。

实施例8 Os-miR169y的转基因拟南芥筛选

将侵染后收获的拟南芥种子用红色激发光照射，挑选呈现红色荧光的种子为T0代，T0代种子种植后单株收获得到T1种子，将每个单株的种子再次进行照射筛选，选出发红色荧光:不发光的种子数量＝3:1株系的种植下一代，每个株系种植20株左右，T2代收获的种子中全部发红色荧光的植株即为该株系的纯合植株。

取转化的拟南芥和野生型拟南芥(阴性对照)苗期叶片用CTAB法粗提DNA，并其进行PCR鉴定，所使用引物组合为QW586F/QW586R(QW586F:5’-CGCACAATCCCACTATCCTT-3’；QW586R:5’-AAAAGACAAAAGTGGGGTAG-3’)，具有222bp扩增片段的为转基因阳性植株。

取阳性转基因纯合植株幼嫩叶片1-2片装入有钢珠的2ml无RNase的离心管，立即放入液氮，用TRNzol法提取总RNA，利用加尾法进行miRNA反转录，转录步骤同实施例4。反转录合成cDNA后进行荧光定量PCR检测，以AT-U6为内参(引物为AT-U6F:5′-CGATAAAATTGGAACGATACAG-3′；Universal miRNA-R:5′-GATCGCCCTTCTACGTCGTAT-3′)，检测转基因拟南芥中Os-miR169y的表达量(引物为RT-miR169F:5′-GGCAGTCTCCTTGGCTAGA-3′；Universal miRNA-R:5′-GATCGCCCTTCTACGTCGTAT-3′)，PCR反应程序为同实施例4。

经PCR鉴定，共获得4个阳性植株(图8A)，目前分离出2个纯和株系(35S-miR169y-1、35S-miR169y-2)，荧光定量PCR检测出2个转基因株系的Os-miR169y表达量均高于野生型拟南芥col-0(wt)，其中35S-miR169y-1中miR169y的表达量为wt的30.88倍、35S-miR169y-2中miR169y表达量为wt的20.65倍(图8B)。

实施例9 Os-miR169y的转基因拟南芥表型鉴定

苗期选取拟南芥生长状态一致的叶片作为接种材料，用直径为2mm的打孔器在核盘菌野生型菌株培养36h的菌丝边缘打取菌丝块，采用活体接种方式，将长有菌丝的一面贴合于拟南芥叶片表面，22℃保湿培养，接种24h后，以接种点为圆心采用十字交叉的方法测量病斑直径大小，计算病斑面积，计算方法同实施例5。实验重复3次，每个株系每次至少接种5苗。

对拟南芥的表型鉴定结果发现，接种24h后转基因株系35S-miR169y-1和35S-miR169y-2的发病面积分别为0.52±0.15cm²，0.73±0.21cm²，显著小于野生型Col-0(1.03±0.23cm²)(P<0.01)，Os-miR169y超量表达的转基因株系菌斑面积分别减小了52.5％和32.1％(图9)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 抑制核盘菌的miRNA及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> miRNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

ggcagucucc uuggcuaga 19

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

tgctctagac agcagcagag ggcagtctcc ttggctagac aggagattca gtttgaagct 60

ggacttcact tttgcctctc tcttatagcc aaggagactg cctgcctgct gctcgagcgg 120

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgccggtgaa cttcccgccg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctggattttg gttttaggaa t 21

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcgacccaa gccaagaagg ctgccctgca gtcgccatgc gg 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggcagccttc ttggcttggg tcgacaagga attcttacac gg 42

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctggacttca cttttgcctc t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctcttggaca tatccctctg g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgataaaatt ggaacgatac ag 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gatcgccctt ctacgtcgta t 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggcagtctcc ttggctaga 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgcacaatcc cactatcctt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaaagacaaa agtggggtag 20

Claims

1.Os-miR169y的成熟miRNA，其序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述的Os-miR169y成熟miRNA的基因。

3.如权利要求1所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.权利要求2或3所述基因在调控核盘菌寄主植物菌核病抗性中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因转入寄主植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，提高植物菌核病抗性。

9.一种转基因植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因植株与野生型相比，其菌核病抗性显著提高。