CN114277051B - 一种绿色荧光青霉菌的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种绿色荧光青霉菌的制备方法涉及一种小麦黑胚病致病菌构建成荧光菌的的方法。包括以下步骤：一、制备带有绿色荧光GFP基因的农杆菌，采用冻融法将GFP基因转入GV3101农杆菌中；二、扩繁在有抗生素条件可存活的带有绿色荧光GFP基因的农杆菌至标准浓度；三、制备四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液；四、将带有绿色荧光GFP基因的农杆菌转入四川小麦黑野生青霉菌孢子之中得到转化子；五、用抗生素提纯转化子菌液获得纯化的绿色荧光青霉菌。优点：绿色荧光青霉侵染小麦后在接菌部位能够清晰观察到绿色荧光标记，因此可用于探索单一青霉菌如何导致小麦黑胚病的产生和其致病力评估，可作为研究小麦黑胚病产生原因和定位小麦抗黑胚病基因提供有力工具。

Description

一种绿色荧光青霉菌的制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学及植物病理中的致病菌技术领域，具体地说，涉及一种小麦黑胚病致病菌构建成荧光菌的的方法。

背景技术

小麦（Triticumaestivum L.），隶属禾本科（Gramineae），小麦族、小麦属（TriticumL.），起源于亚洲西部，是最早的栽培农作物之一，也是一种广泛种植的粮食作物。小麦黑胚病（Black point of wheat）是一种小麦籽粒病害，它的典型症状是小麦胚部变成黑色或者褐色，严重病变籽粒褐色病变部分蔓延至小麦腹股沟处，也被称为黑斑病、黑点病。世界上许多国家和地区的小麦主产区都受到了此病的影响，加拿大、澳大利亚、秘鲁、中国等受影响较为严重。小麦黑胚病是一种常见的小麦籽粒劣化病害，起初并没有得到人们的重视。自1980年以来，我国北方冬麦主产区小麦黑胚病愈发严重。近年来，随着全球气候变化、耕作模式的转变、品种的更替、黑胚病发病越来越严重，种子发病率在20%-70%之间，严重影响了小麦的正常生产利用。

黑胚病对小麦品质的影响表现为：黑胚病变籽粒首先影响了籽粒的外观，给收购者产生不好的视觉感受，影响收购价格。同时，黑胚病变籽粒也降低了面粉的色泽、粉质和出粉率，最严重者直接导致食物出现褐色斑点。与正常籽粒相比，黑胚病变籽粒所磨出的面粉品质也会大大降低。黑胚病对人和牲畜影响表现为：作为小麦黑胚病致病菌之一的链格孢菌会产生毒素，人体摄入后严重者会出现哮喘症状，或者引起皮肤过敏，长期高浓度接触者可能会导致食道癌的发生，牲畜也会出现类似反应。小麦黑胚籽粒对出苗率影响表现为：小麦黑胚籽粒对小麦的出苗率，鲜重、根重等一些生理指标有很大的影响。与健康籽粒相比，黑胚籽粒出苗比正常籽粒慢，黑胚严重的甚至不出苗，出苗后成活率也会大大降低。黑胚籽粒对小麦千粒重的影响表现为：严重的小麦黑胚病变籽粒，种皮皱缩，千粒重大大降低，最大者可降低至18.7%。

研究结果表明，多种病原菌可以引发小麦黑胚病，但是在不同年份和不同地区之间菌种存在着差异。目前，超过100种真菌从小麦黑胚籽粒中被分离出来，许多分离出来的真菌都与小麦黑胚病有关，例如链格孢属（Alternaria）、平脐蠕孢属（Bipolaris）、弯孢属（Curvularia）、内脐蠕孢属（Drechslera）、附球霉属（Epicoccum）、镰刀菌属（Fusarium）、黑孢霉属（Nigrospora）、青霉属（Penicillium）、小菌核属（Sclerotium）。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,简称GFP）是一种存在于水母、珊瑚等腔肠动物体内的发光蛋白。它们通过发光来寻找食物、趋利避害和寻找配偶。研究人员从多管水母（Aequoria）中分离得到GFP,它是由238个氨基酸残基组成的单一多肽链。它可以在真核和原核生物中表达，其中也包括了真菌菌丝体。20世纪90年代，GFP在大肠杆菌中成功表达，之后GFP在多个生物领域被研究利用，并且取得了非常显著的成果。在活体植物器官、组织和细胞中，GFP常常被应用于植物和真菌以及真菌和真菌之间的互作研究。

研究人员对粗糙脉孢菌进行遗传转化，从此开创了真菌遗传转化的先河。随着科学技术水平以及基因工程迅猛发展，真菌的遗传转化技术得到了进一步的完善，取得了巨大的进步。目前国内外真菌遗传转化的方法主要分为DNA遗传转化法和以质粒载体为媒介的转化方法。以质粒为载体的真菌转化方法包括了农杆菌介导转化法和病毒介导转化法。针对不同的研究对象，人们通常采用不同的转化方法，尽可能的提高真菌转化效率。1998年，Groot等人用农杆菌转化了Aspergillusniger等六种真菌，此后根癌农杆菌介导的遗传转化得到广泛应用。

小麦黑胚病是一种世界范围内严重影响种子质量及食品安全的种子病害，给种植户造成了巨大的经济损失，严重危及生产及食品安全。随着全球气候变暖所引发的一系列次生灾害的发生，小麦黑胚病的发生地、发生面积、危害程度逐步扩大和加重。研究表明，小麦黑胚病是一种真菌性病害，受病原菌和环境影响比较明显；小麦黑胚病也是一个受多基因控制的数量性状，遗传机制复杂，对其深入的研究比较困难。小麦黑胚籽粒严重影响生产及食品安全，选育小麦黑胚病抗性品种显得极为重要。目前，对小麦黑胚病的研究尚处于起步的阶段，可利用的小麦黑胚病抗性材料较少，对小麦黑胚病的致病病原菌尚不明确。

发明内容

本发明的目的是提供能够用绿色荧光定位四川地区小麦黑胚病的青霉菌位置，作为研究四川地区小麦黑胚病提供方便观察青霉菌位置分布的有力工具。

对四川地区小麦黑胚病病原菌进行两年两个环境下的分离，利用ITS-rDNA测序结合形态学鉴定的方法，明确了四川地区小麦黑胚病病原种类青霉菌(penicillium)本文也称野生青霉菌；其中青霉菌在多年、多环境及多材料中均分离得到，出现频率较高。针对四川野生青霉菌致病性进行进一步研究，并利用农杆菌介导真菌的遗传转化方法将荧光GFP基因转入到野生青霉菌株中，得到荧光青霉菌、或称绿色荧光青霉菌、或称荧光菌；荧光菌株用于四川地区小麦黑胚病主要致病菌的鉴定及侵染部位追踪具有十分重要的意义。

本发明的构思是：用绿色荧光载体pGWB5质粒的绿色荧光GFP基因的DNA片段转入工程菌GV3101农杆菌，用带有绿色荧光GFP基因DNA片段的GV3101农杆菌把绿色荧光GFP基因DNA片段转入四川地区小麦黑胚病的青霉菌中，获得能在荧光共聚焦显微镜下观察到绿色荧光的绿色荧光青霉菌。其应用是将该绿色荧光青霉菌去浸染四川地区小麦，用共聚焦显微镜观察被浸染四川地区小麦中，青霉菌的发生和分布规律，为四川地区小麦防治青霉菌提供对青霉菌的发生和分布规律研究工具。

本发明的发明内容是：

下述的步骤一至步骤五是制备绿色荧光青霉菌，步骤六至步骤七是把绿色荧光青霉菌应用在感染四川小麦，对感染的四川小麦用荧光共聚焦显微镜进行观察，用观察到绿色荧光的发生和分布来表示四川小麦青霉菌对四川小麦感染试验的发生和分布情况，即用绿色荧光青霉菌作为工具，能方便地对四川小麦黑胚病青霉菌进行研究。

一种绿色荧光青霉菌的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、制备带有绿色荧光GFP基因的农杆菌，采用冻融法将绿色荧光GFP基因转入GV3101农杆菌中，获得带有绿色荧光GFP基因的农杆菌，包括以下七步；

1.1、取-80℃保存的GV3101农杆菌在离心管中融化至室温；

1.2、在无菌条件下，向刚刚化冻的GV3101农杆菌悬浮液中加入1ug带有GFP基因的绿色荧光载体pGWB5质粒，轻轻混匀，在冰水浴中静置10min；

1.3、将离心管置于液氮中速冻5min；

1.4、快速将离心管置于37℃水浴中保持5min, 不要晃动水面；

1.5、将离心管放在冰水浴中，再保持5min；

1.6、无菌条件下加入800ul无抗LB液体培养基，在28℃，200rpm，振荡培养2h；

1.7、将上一步骤的液值涂布在含有100ug/ml潮霉素的固体LB培养基上，28℃倒扣静置培养36-48h，获得带有绿色荧光GFP基因的农杆菌；

LB液体培养基的配方是蛋白胨 10g/L, 酵母粉 5g/L, 氯化钠 10g/L，蒸馏水1L；

固体LB培养基的配方是蛋白胨 10g/L, 酵母粉 5g/L, 氯化钠 10g/L 蒸馏水1L, 琼脂粉 15g/L。

步骤二、扩繁在有抗生素条件可存活的带有绿色荧光GFP基因的农杆菌至标准浓度，便下后与标准浓度的四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液混合，进行有配合比的获得转化子，即有配合比的获得带有绿色荧光GFP基因的农杆菌液；

将带有上述步骤获得的绿色荧光GFP基因的农杆菌接种环一环于5ml 抗生素MM培养基中,在220 rpm震荡培养箱28℃培养48h；然后吸取2mL培养好的菌液于离心管中，12000rpm离心1min，弃上清液注入1.5mL IM液体培养基重新混匀；再取重新混匀的菌液200ul,用IM液体培养基稀释10倍，测定OD₆₀₀值，计算10mL IM液体培养基中加入的菌液量，使带有绿色荧光GFP基因的农杆菌菌液的OD₆₀₀值为0.10-0.15的标准浓度为止；

所述的抗生素MM培养基的配方是葡萄糖 2.000g/L, 硝酸铵 1.000g/L, 磷酸二氢钾 0.500g/L, 磷酸氢二钠 1.500g/L, 氯化钠 1.000g/L, 七水硫酸镁 0.200g/L, Z-Salts 10ml ；其中Z-Salts的配方是七水硫酸锌 0.001g，五水硫酸铜 0.001g 硼酸0.001g, 硫酸铵 0.500g, 一水合硫酸锰 0.001g，一水钼酸钠 0.001g；调PH值到7.2；再加入抗生素含量为Rif利福平50 ug/mL，Kan卡拉霉素50 ug/mL；

所述的IM液体培养基的配方是MM培养基中加入MES吗啉乙磺酸8.7g/L, 葡萄糖 2g/L，甘油 5 g/L，乙酰丁香酮AS 200μg /L。

步骤三、制备标准浓度的四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液

用普通PDA培养基接种四川小麦黑野生青霉菌，25℃培养两周左右产孢子，用无菌水将孢子洗下，梯度稀释，获得四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液，于血球计数板上观察，使四川小麦黑野生青霉菌孢子浓度为1×10⁶ cfu/mL标准浓度为止；

所述普通PDA固体培养基：马铃薯浸粉 3.0g/L, 葡萄糖20g/L, 琼脂 14g/L, 蒸馏水 1L；

所述四川小麦黑野生青霉菌是由四川农业大学现代农业研发基地提供的小麦黑胚籽粒上分离得到的野生青霉菌。

步骤四、将带有绿色荧光GFP基因的农杆菌转入四川小麦黑野生青霉菌孢子之中得到转化子，即得到目标菌——带有绿色荧光青霉菌；

制备IM固体平板，将备用的玻璃纸剪成与培养皿大小相同的圆形，灭菌后平铺到IM固体平板上，整理到两者之间基本无明显气泡，在超菌工作台内吹干，吸取步骤二的带有绿色荧光GFP基因的农杆菌液200uL，和吸取步骤三的四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液各200uL，将这两种液体混合均匀涂抹于IM固体平板的玻璃纸上，超菌工作台吹干，于25℃培养箱中黑暗培养48h，得到带有绿色荧光青霉菌转化子菌液和未转化成功的菌的多菌混合液；

所述IM固体平板的配方是MM培养基加以下试剂：MES吗啉乙磺酸 8.7 g, 葡萄糖2.0 g，甘油 5 .0g，AS乙酰丁香酮200μM，调pH值到5.4,500mL液体培养基中加9.0g琼脂制得IM固体平板；

其中

MM培养基的配方是葡萄糖 2.000g/L, 硝酸铵 1.000g/L, 磷酸二氢钾 0.500g/L, 磷酸氢二钠 1.500g/L, 氯化钠 1.000g/L, 七水硫酸镁 0.200g/L, Z-Salts 10ml ；其中Z-Salts的配方是七水硫酸锌 0.001g，五水硫酸铜 0.001g 硼酸 0.001g, 硫酸铵0.500g, 一水合硫酸锰 0.001g，一水钼酸钠 0.001g；调PH值到7.2。

步骤五、用抗生素提纯转化子菌液获得纯化的绿色荧光青霉菌，纯化的绿色荧光青霉菌是可以作为研究四川小麦黑胚病的黑野生青霉菌发生和分布规律的，便于观察的研究工具；

将步骤四获得的多菌混合液接种到含抗生素的PDA培养基上进行纯化培养，培养时间为到整个平板长满菌为止，一般1周时间，待长满整个平板时，将带有绿色荧光青霉菌转化子菌的菌株进行单孢分离，获得纯化的绿色荧光青霉菌株；

抗生素的PDA培养基配方是：普通PDA培养基中还加入Kan卡拉霉素50 ug/mL、Hyg潮霉素100 ug/mL；

其中，普通PDA培养基：马铃薯浸粉 3.0g/L, 葡萄糖20g/L, 琼脂 14g/L, 蒸馏水1L。

步骤六、用两种菌的ITS序列比对进行分别鉴定后，结果是绿色荧光青霉菌是原青霉菌携带了绿色荧功能的菌；说明绿色荧光青霉菌具有原青霉菌相同的对四川小麦产生黑胚病的功能，则绿色荧光青霉菌可以替代四川野生青霉菌对四川小麦产生黑胚病进行研究；

6.1、将野生青霉菌接种在普通PDA培养基上，28℃培养1周；而另将纯化的绿色荧光青霉菌接种在含有100ug/ml潮霉素的PDA培养基上，28℃培养1周；

6.2、分别取野生青霉菌和纯化的绿色荧光青霉菌菌丝在荧光显微镜下进行观察，可以看到纯化的绿色荧光青霉菌发出显著的绿色荧光，但野生青霉菌的没有绿色荧光；

6.3、在超净工作台里，将野生青霉菌和纯化的绿色荧光青霉菌分别使用刮刀将平板上的菌挂入分别的2ml的灭菌EP管中，使用Magen公司的DNA提取试剂盒（HiPure FungalDNA Kit）分别进行DNA提取，送测序公司分别对野生青霉菌和纯化的绿色荧光青霉菌DNA样品ITS序列进行测序；

6.4、使用软件DNAman对野生青霉菌和纯化的绿色荧光青霉菌测序的结果进行比对；本专利发明人将这两种DNA样品比对结果：野生青霉菌和荧光青霉菌的ITS序列完全一致，综合荧光观察和测序鉴定，野生青霉菌和荧光青霉菌是完全相同的菌，并且说明荧光蛋白成功转入野生青霉菌可进行后续的接菌实验。ITS序列是对野生青霉菌中，具有代表野生青霉菌的部分DNA片段的序列，ITS序列不包括绿色荧光载体pGWB5质粒的GFP基因DNA片段。

步骤七、用纯化的绿色荧光青霉菌侵染小麦材料应用，接种了菌的小麦穗取下在荧光共聚焦显微镜下观察，观察到有荧光的位置就是有野生青霉菌，该位置也是四川小麦黑胚病的病灶位置；

用纯化的绿色荧光青霉菌侵染小麦材料，还用野生型菌株侵染作对照，采用单花滴注法进行接菌，具体操作如下：

7.1、分别将绿色荧光青霉菌转化子菌在含湖霉素100ug/mL的PDA培养基上培养2周，另将野生青霉菌在普通PDA培养基上培养2周；

7.2、菌落长满培养基后，两个培养基分别使用灭菌刀片将菌刮入分别的无菌水中，使用血球计数板在显微镜下对菌孢子浓度进行计算，调节菌液浓度直至孢子数为5×10⁵/mL;

7.3、将两种菌液分别滴注到不同扬花初期麦穗中部的2朵小花，重复5穗；

7.4、使用塑料袋套袋保湿3天，每天使用无菌水对接菌穗进行喷施3-4次，以达到保湿效果，3天后去除塑料袋；

7.5、分别接种两种菌后每天对两种接菌穗进行观察；

7.6、待小麦成熟后将整个接种了菌的小麦穗取下在荧光共聚焦显微镜下观察；

7.7、在荧光共聚焦显微镜下观察用纯化的绿色荧光青霉菌侵染小麦的应用效果，观察到有荧光的位置就是有野生青霉菌，该位置也是四川小麦黑胚病的病灶位置。

观察操作是取材侵染材料的内颖壳、外颖壳以及胚制成的临时切片在荧光共聚焦显微镜下进行观察。接种无菌水、接种野生青霉菌的颖壳及胚检测不到荧光信号；而接种绿色荧光青霉菌的颖壳以及黑胚种子的胚均能检测到荧光信号；并且有荧光信号的地方有四川小麦黑胚病的病灶。

本专利利用“步骤二”获得野生青霉菌对潮霉素的耐性，有助于接下来对具有潮霉素耐性的荧光青霉菌进行筛选；在“步骤四”中本专利将绿色荧光蛋白的DNA片段成功导入野生青霉菌，使得青霉菌带有可直接观察的荧光标签，便入对接种荧光青霉菌的小麦材料感染效果进行观察，通过荧光可直观反应荧光青霉菌对小麦种子的侵染程度，因此可用于探索单一青霉菌如何导致小麦黑胚病和评估青霉菌对小麦黑胚病的致病力。试验中，接种了荧光青霉菌的小麦籽粒胚部显现出明亮的绿色荧光，说明青霉菌能够高效侵染小麦籽粒。本专利首次利用荧光标记蛋白(GFP)标记小麦黑胚病主要致病菌青霉菌(penicillium)，即用绿色荧光青霉菌为研究小麦黑胚病产生原因和定位小麦抗黑胚病提供有力工具。

本发明的优点：本实验利用农杆菌介导法将绿色荧光蛋白GFP基因片段导入野生青霉菌中，得到的转化子绿色荧光青霉菌，而绿色荧光青霉菌保持了和野生型相同的菌落形态，导入的荧光蛋白GFP基因片段能够稳定遗传，菌丝和分子孢子的荧光表达良好。绿色荧光青霉侵染小麦后在接菌部位能够清晰观察到绿色荧光标记，因此可用于探索单一青霉菌如何导致小麦黑胚病的产生和其致病力评估。本研究首次利用荧光标记蛋白标记小麦黑胚病主要致病菌为研究小麦黑胚病产生原因和定位小麦抗黑胚病基因提供有力工具。

具体实施方式

实施例1、一种绿色荧光青霉菌的制备方法

一种绿色荧光青霉菌的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、制备带有绿色荧光GFP基因的农杆菌，采用冻融法将绿色荧光GFP基因转入GV3101农杆菌中，获得带有绿色荧光GFP基因的农杆菌，包括以下七步；

1.1、取-80℃保存的GV3101农杆菌在离心管中融化至室温；

1.2、在无菌条件下，向刚刚化冻的GV3101农杆菌悬浮液中加入1ug带有GFP基因的绿色荧光载体pGWB5质粒，轻轻混匀，在冰水浴中静置10min；

1.3、将离心管置于液氮中速冻5min；

1.4、快速将离心管置于37℃水浴中保持5min, 不要晃动水面；

1.5、将离心管放在冰水浴中，再保持5min；

1.6、无菌条件下加入800ul无抗LB液体培养基，在28℃，200rpm，振荡培养2h；

1.7、将上一步骤的液值涂布在含有100ug/ml潮霉素的固体LB培养基上，28℃倒扣静置培养36-48h，获得带有绿色荧光GFP基因的农杆菌；

LB液体培养基的配方是蛋白胨 10g/L, 酵母粉 5g/L, 氯化钠 10g/L，蒸馏水1L；

固体LB培养基的配方是蛋白胨 10g/L, 酵母粉 5g/L, 氯化钠 10g/L 蒸馏水1L, 琼脂粉 15g/L；

步骤二、扩繁在有抗生素条件可存活的带有绿色荧光GFP基因的农杆菌至标准浓度，便下后与标准浓度的四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液混合，进行有配合比的获得转化子，即有配合比的获得带有绿色荧光GFP基因的农杆菌液；

将带有上述步骤获得的绿色荧光GFP基因的农杆菌接种环一环于5ml 抗生素MM培养基中,在220 rpm震荡培养箱28℃培养48h；然后吸取2mL培养好的菌液于离心管中，12000rpm离心1min，弃上清液注入1.5mL IM液体培养基重新混匀；再取重新混匀的菌液200ul,用IM液体培养基稀释10倍，测定OD₆₀₀值，计算10mL IM液体培养基中加入的菌液量，使带有绿色荧光GFP基因的农杆菌菌液的OD₆₀₀值为0.10-0.15的标准浓度为止；

所述的抗生素MM培养基的配方是葡萄糖 2.000g/L, 硝酸铵 1.000g/L, 磷酸二氢钾 0.500g/L, 磷酸氢二钠 1.500g/L, 氯化钠 1.000g/L, 七水硫酸镁 0.200g/L, Z-Salts 10ml ；其中Z-Salts的配方是七水硫酸锌 0.001g，五水硫酸铜 0.001g 硼酸0.001g, 硫酸铵 0.500g, 一水合硫酸锰 0.001g，一水钼酸钠 0.001g；调PH值到7.2；再加入抗生素含量为Rif利福平50 ug/mL，Kan卡拉霉素50 ug/mL；

所述的IM液体培养基的配方是MM培养基中加入MES吗啉乙磺酸8.7g/L, 葡萄糖 2g/L，甘油 5 g/L，乙酰丁香酮AS 200μg /L；

步骤三、制备标准浓度的四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液

用普通PDA培养基接种四川小麦黑野生青霉菌，25℃培养两周左右产孢子，用无菌水将孢子洗下，梯度稀释，获得四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液，于血球计数板上观察，使四川小麦黑野生青霉菌孢子浓度为1×10⁶ cfu/mL标准浓度为止；

所述普通PDA固体培养基：马铃薯浸粉 3.0g/L, 葡萄糖20g/L, 琼脂 14g/L, 蒸馏水 1L；

所述四川小麦黑野生青霉菌是由四川农业大学现代农业研发基地提供的川育24小麦黑胚籽粒上分离得到的野生青霉菌；

步骤四、将带有绿色荧光GFP基因的农杆菌转入四川小麦黑野生青霉菌孢子之中得到转化子，即得到目标菌——带有绿色荧光青霉菌；

制备IM固体平板，将备用的玻璃纸剪成与培养皿大小相同的圆形，灭菌后平铺到IM固体平板上，整理到两者之间基本无明显气泡，在超菌工作台内吹干，吸取步骤二的带有绿色荧光GFP基因的农杆菌液200uL，和吸取步骤三的四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液各200uL，将这两种液体混合均匀涂抹于IM固体平板的玻璃纸上，超菌工作台吹干，于25℃培养箱中黑暗培养48h，得到带有绿色荧光青霉菌转化子菌液和未转化成功的菌的多菌混合液；

所述IM固体平板的配方是MM培养基加以下试剂：MES吗啉乙磺酸 8.7 g, 葡萄糖2.0 g，甘油 5 .0g，AS乙酰丁香酮200μM，调pH值到5.4,500mL液体培养基中加9.0g琼脂制得IM固体平板；

其中

MM培养基的配方是葡萄糖 2.000g/L, 硝酸铵 1.000g/L, 磷酸二氢钾 0.500g/L, 磷酸氢二钠 1.500g/L, 氯化钠 1.000g/L, 七水硫酸镁 0.200g/L, Z-Salts 10ml ；其中Z-Salts的配方是七水硫酸锌 0.001g，五水硫酸铜 0.001g 硼酸 0.001g, 硫酸铵0.500g, 一水合硫酸锰 0.001g，一水钼酸钠 0.001g；调PH值到7.2；

步骤五、用抗生素提纯转化子菌液获得纯化的绿色荧光青霉菌，纯化的绿色荧光青霉菌是可以作为研究四川小麦黑胚病的黑野生青霉菌发生和分布规律的，便于观察的研究工具；

将步骤四获得的多菌混合液接种到含抗生素的PDA培养基上进行纯化培养，培养时间为到整个平板长满菌为止，一般1周时间，待长满整个平板时，将带有绿色荧光青霉菌转化子菌的菌株进行单孢分离，获得纯化的绿色荧光青霉菌株；

抗生素的PDA培养基配方是：普通PDA培养基中还加入Kan卡拉霉素50 ug/mL、Hyg潮霉素100 ug/mL；

其中，普通PDA培养基：马铃薯浸粉 3.0g/L, 葡萄糖20g/L, 琼脂 14g/L, 蒸馏水1L；

步骤六、用两种菌的ITS序列比对进行分别鉴定后，结果是绿色荧光青霉菌是原青霉菌携带了绿色荧功能的菌；说明绿色荧光青霉菌具有原青霉菌相同的对四川小麦产生黑胚病的功能，则绿色荧光青霉菌可以替代四川野生青霉菌对四川小麦产生黑胚病进行研究；

6.1、将川育24野生青霉菌接种在普通PDA培养基上，28℃培养1周；而另将用川育24制备的纯化的绿色荧光青霉菌接种在含有100ug/ml潮霉素的PDA培养基上，28℃培养1周；

6.2、分别取川育24野生青霉菌和纯化的川育24绿色荧光青霉菌菌丝在荧光显微镜下进行观察，可以看到纯化的川育24绿色荧光青霉菌发出显著的绿色荧光，但川育24野生青霉菌的没有绿色荧光；

6.3、在超净工作台里，将川育24野生青霉菌和纯化的川育24绿色荧光青霉菌分别使用刮刀将平板上的菌挂入分别的2ml的灭菌EP管中，使用Magen公司的DNA提取试剂盒（HiPure Fungal DNA Kit）分别进行DNA提取，送测序公司分别对川育24野生青霉菌和纯化的川育24绿色荧光青霉菌DNA样品ITS序列进行测序；

6.4、使用软件DNAman对川育24野生青霉菌和纯化的川育24绿色荧光青霉菌测序的结果进行比对；本专利发明人将这两种DNA样品比对结果：野生青霉菌和荧光青霉菌的ITS序列完全一致，综合荧光观察和测序鉴定，野生青霉菌和荧光青霉菌是完全相同的菌，并且说明荧光蛋白成功转入野生青霉菌可进行后续的接菌实验。ITS序列是对野生青霉菌中，具有代表川育24野生青霉菌的部分DNA片段的序列，ITS序列不包括绿色荧光载体pGWB5质粒的GFP基因DNA片段。

步骤七、用纯化的川育24绿色荧光青霉菌侵染小麦材料应用，接种了该菌的小麦穗取下在荧光共聚焦显微镜下观察，观察到有荧光的位置就是有川育24野生青霉菌，该位置也是四川小麦黑胚病的病灶位置；

用纯化的川育24绿色荧光青霉菌侵染小麦材料，还用野生型菌株侵染作对照，采用单花滴注法进行接菌，具体操作如下：

7.1、分别将川育24绿色荧光青霉菌转化子菌在含湖霉素100ug/mL的PDA培养基上培养2周，另将野生青霉菌在普通PDA培养基上培养2周；

7.2、菌落长满培养基后，两个培养基分别使用灭菌刀片将菌刮入分别的无菌水中，使用血球计数板在显微镜下对菌孢子浓度进行计算，调节菌液浓度直至孢子数为5×10⁵/mL;

7.3、将两种菌液分别滴注到不同扬花初期麦穗中部的2朵小花，重复5穗；

7.4、使用塑料袋套袋保湿3天，每天使用无菌水对接菌穗进行喷施3-4次，以达到保湿效果，3天后去除塑料袋；

7.5、分别接种两种菌后每天对两种接菌穗进行观察；

7.6、待小麦成熟后将整个接种了菌的小麦穗取下在荧光共聚焦显微镜下观察；

7.7、在荧光共聚焦显微镜下观察用纯化的川育24绿色荧光青霉菌侵染小麦的应用效果，观察到有荧光的位置就是有野生青霉菌，该位置也是四川小麦黑胚病的病灶位置。

观察操作是取材侵染材料的内颖壳、外颖壳以及胚制成的临时切片在荧光共聚焦显微镜下进行观察。接种无菌水、接种野生青霉菌的颖壳及胚检测不到荧光信号；而接种川育24绿色荧光青霉菌的颖壳以及黑胚种子的胚均能检测到荧光信号；并且有荧光信号的地方有四川小麦黑胚病的病灶。

本实施例选用的四川小麦品种有临汾5064、川育24、太学7号、蜀麦969、中信麦98。于2019年夏天在在四川省成都市温江区的四川农业大学温室种植以上材料，每个材料种植25盆，采用单花滴注法于开花后十天分别接种川育24野生青霉菌种和川育24绿色荧光青霉菌于每个小穗，两种菌液浓度分别都为5×104 cfu/mL，接种灭菌水的为对照。

在小麦晚熟晒干脱粒后，从每个品种中随机挑选至少三个样品，通过黑胚病定义的统一标准对黑胚籽粒进行判别，计算每个样品的黑胚率，求得的平均值即为该品种的黑胚率。

本实施例试验结果表明，川育24绿色荧光青霉菌株以及川育24野生青霉菌株侵染材料黑胚病率都显著高于对照组，川育24绿色荧光青霉菌株以及川育24野生青霉菌株的黑胚病率分别比对照组增加值为：临汾5064分别增加了53.09%、50.37%、川育24分别增加了62.46%、58.20%、太学7号分别增加了47.74%、61.85%、蜀麦969分别增加了50.79%、59.27%、中信麦98分别增加了49.97%、65.66%。

川育24绿色荧光青霉菌株以及川育24野生青霉菌株侵染材料的荧光显微观察：取材侵染材料的内颖壳、外颖壳以及胚制成的临时切片在荧光共聚焦显微镜下进行观察。接种无菌水、川育24野生青霉菌的颖壳及胚检测不到荧光信号；接种川育24绿色荧光青霉菌的颖壳以及黑胚种子的胚均能检测到荧光信号。

Claims (1)

1.一种绿色荧光青霉菌的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、制备带有绿色荧光GFP基因的农杆菌，采用冻融法将GFP基因转入GV3101农杆菌中，包括以下七步；

1.1、取-80℃保存的GV3101农杆菌在离心管中融化至室温；

1.2、在无菌条件下，向刚刚化冻的GV3101农杆菌悬浮液中加入1ug带有GFP基因的绿色荧光载体pGWB5质粒，轻轻混匀，在冰水浴中静置10min；

1.3、将离心管置于液氮中速冻5min；

1.4、快速将离心管置于37℃水浴中保持5min, 不要晃动水面；

1.5、将离心管放在冰水浴中，再保持5min；

1.6、无菌条件下加入800ul无抗LB液体培养基，在28℃，200rpm，振荡培养2h；

1.7、将上一步骤的液值涂布在含有100ug/ml潮霉素的固体LB培养基上，28℃倒扣静置培养36-48h，获得带有绿色荧光GFP基因的农杆菌；

LB液体培养基的配方是蛋白胨 10g/L, 酵母粉 5g/L, 氯化钠 10g/L，蒸馏水 1L；

固体LB培养基的配方是蛋白胨 10g/L, 酵母粉 5g/L, 氯化钠 10g/L 蒸馏水 1L, 琼脂粉 15g/L；

步骤二、扩繁在有抗生素条件可存活的带有绿色荧光GFP基因的农杆菌至标准浓度；

将带有上述步骤获得的绿色荧光GFP基因的农杆菌接种环一环于5ml 抗生素MM培养基中,在220 rpm震荡培养箱28℃培养48h；然后吸取2mL培养好的菌液于离心管中，12000rpm离心1min，弃上清液注入1.5mL IM液体培养基重新混匀；再取重新混匀的菌液200ul,用IM液体培养基稀释10倍，测定OD₆₀₀值，计算10mL IM液体培养基中加入的菌液量，使带有绿色荧光GFP基因的农杆菌菌液的OD₆₀₀值为0.10-0.15的标准浓度为止；

所述的抗生素MM培养基的配方是葡萄糖 2.000g/L, 硝酸铵 1.000g/L, 磷酸二氢钾0.500g/L, 磷酸氢二钠 1.500g/L, 氯化钠 1.000g/L, 七水硫酸镁 0.200g/L, Z-Salts10ml ；其中Z-Salts的配方是七水硫酸锌 0.001g，五水硫酸铜 0.001g 硼酸 0.001g, 硫酸铵 0.500g, 一水合硫酸锰 0.001g，一水钼酸钠 0.001g；调PH值到7.2；再加入抗生素含量为Rif利福平50 ug/mL，Kan卡拉霉素50 ug/mL；

所述的IM液体培养基的配方是MM培养基中加入MES吗啉乙磺酸8.7g/L, 葡萄糖 2 g/L，甘油 5 g/L，乙酰丁香酮AS 200μg /L；

步骤三、制备四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液；

用普通PDA培养基接种四川小麦黑野生青霉菌，25℃培养两周左右产孢子，用无菌水将孢子洗下，梯度稀释，获得四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液，于血球计数板上观察，使四川小麦黑野生青霉菌孢子浓度为1×10⁶ cfu/mL标准浓度为止；

所述普通PDA固体培养基：马铃薯浸粉 3.0g/L, 葡萄糖20g/L, 琼脂 14g/L, 蒸馏水1L；

步骤四、将带有绿色荧光GFP基因的农杆菌转入四川小麦黑野生青霉菌孢子之中得到转化子

制备IM固体平板，将备用的玻璃纸剪成与培养皿大小相同的圆形，灭菌后平铺到IM固体平板上，整理到两者之间基本无明显气泡，在超菌工作台内吹干，吸取步骤二的带有绿色荧光GFP基因的农杆菌液200uL，和吸取步骤三的四川小麦黑野生青霉菌孢子悬浮液各200uL，将这两种液体混合均匀涂抹于IM固体平板的玻璃纸上，超菌工作台吹干，于25℃培养箱中黑暗培养48h，得到带有绿色荧光青霉菌转化子菌液和未转化成功的菌的多菌混合液；

所述IM固体平板的配方是MM培养基加以下试剂：MES吗啉乙磺酸 8.7 g, 葡萄糖 2.0g，甘油 5 .0g，AS乙酰丁香酮200μM，调pH值到5.4,500mL液体培养基中加9.0g琼脂制得IM固体平板；

其中

MM培养基的配方是葡萄糖 2.000g/L, 硝酸铵 1.000g/L, 磷酸二氢钾 0.500g/L, 磷酸氢二钠 1.500g/L, 氯化钠 1.000g/L, 七水硫酸镁 0.200g/L, Z-Salts 10ml ；其中Z-Salts的配方是七水硫酸锌 0.001g，五水硫酸铜 0.001g 硼酸 0.001g, 硫酸铵 0.500g,一水合硫酸锰 0.001g，一水钼酸钠 0.001g；调PH值到7.2；

步骤五、用抗生素提纯转化子菌液获得纯化的绿色荧光青霉菌

将步骤四获得的多菌混合液接种到含抗生素的PDA培养基上进行纯化培养，培养时间为到整个平板长满菌为止，一般1周时间，待长满整个平板时，将带有绿色荧光青霉菌转化子菌的菌株进行单孢分离，获得纯化的绿色荧光青霉菌株；

抗生素的PDA培养基配方是：普通PDA培养基中还加入Kan卡拉霉素50 ug/mL、Hyg潮霉素100 ug/mL；

其中，普通PDA培养基：马铃薯浸粉 3.0g/L, 葡萄糖20g/L, 琼脂 14g/L, 蒸馏水 1L。