CN104531750A

CN104531750A - 一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法

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Publication number: CN104531750A
Application number: CN201410817214.8A
Authority: CN
Inventors: 姚协丰; 羊杏平; 李苹芳; 张曼; 徐锦华; 刘广
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-12-24
Filing date: 2014-12-24
Publication date: 2015-04-22

Abstract

一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法，包括如下步骤：(1)蔓枯病菌菌株分生孢子液的制备；(2)制备含有GFP基因的农杆菌菌液；(3)蔓枯病菌株的GFP基因转化标记；(4)对标记有绿色荧光蛋白GFP的蔓枯病菌株进行鉴定；(5)获得带有绿色荧光蛋白标记GFP的蔓枯病菌株。本发明以蔓枯病菌株GSB20为转化体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将绿色荧光蛋白基因标记蔓枯病菌株GSB20基因组，获得标记绿色荧光蛋白的蔓枯病菌菌株GSB20-GFP。

Description

一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法

技术领域

本发明涉及植物病理学领域，特别涉及一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法。

背景技术

甜瓜蔓枯病是由瓜类壳二孢菌(Ascochyta citrullina Smith,其无性世代为泄根亚隔孢壳Didymella bryoniae)引起的真菌病害，在甜瓜的幼苗期至采收期均可发生。该病害大多发生在植株茎基部和节间部，发病后致使整个植株失水枯萎而死亡。蔓枯病菌寄主范围广泛，可危害葫芦科的甜瓜、黄瓜、西瓜、南瓜等多种经济作物。冬春日光温室及早春、秋后大棚栽培均有发生，在生产上往往植株死亡率可达30％～40％，造成严重减产，目前其危害程度远高于瓜类枯萎病和疫病，已成为制约甜瓜生产的主要障碍。要获得抗病品种，首先要了解蔓枯病的分子遗传基础和致病机制，目前国内外对于甜瓜蔓枯病的病原菌的鉴定，类群分析研究已取得了一些进展，但缺乏对蔓枯病致病机理认识。

稳定表达绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌株对于研究蔓枯病菌致病相关基因、侵染过程和致病机理，对于研究蔓枯病菌侵染致病过程的组织学研究和蔓枯病病原菌致病相关基因、病原菌与寄主互作以及病原菌的功能基因组学研究奠定基础，同时，为蔓枯病害控制和甜瓜抗蔓枯病抗病育种材料获得提供理论基础。然而，目前，国内外已有利用不同遗传转化方法转化绿色荧光蛋白标记(GFP)真菌的报道，但已报道的GFP标记真菌菌株方法或未涉及具体标记相关细节，或标记转化步骤繁琐，效率低下，荧光强度不稳定。目前更没有可参考的蔓枯病菌GFP标记菌株及方法报道，这已经成为蔓枯病菌侵染致病过程与机理研究的瓶颈。目前更没有可参考的GFP标记蔓枯病菌菌株及方法报道。因此，急需获得稳定表达绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌株及方法。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌株的方法，以蔓枯病菌株(GSB20)为转化体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将绿色荧光蛋白基因标记蔓枯病菌株(GSB20)基因组，获得标记绿色荧光蛋白的蔓枯病菌菌株(GSB20-GFP)。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法，包括如下步骤：

(1)蔓枯病菌菌株分生孢子液的制备；

(2)制备含有GFP基因的农杆菌菌液；

(3)蔓枯病菌株的GFP基因转化标记；

(4)对标记有绿色荧光蛋白GFP的蔓枯病菌株进行鉴定；

(5)获得带有绿色荧光蛋白标记GFP的蔓枯病菌株。

进一步的，所述蔓枯病菌菌株为蔓枯病菌菌株GSB20。

进一步的，所述步骤(1)的具体操作步骤为：使用打孔器切取蔓枯病菌GSB20菌块，在马铃薯固体培养基上培养4d后，在紫外光和普通光12小时交替培养10天，用培养液A冲洗培养基表面，收集并稀释孢子液，调节孢子液浓度至1x10⁶个/mL，得到蔓枯病菌株GSB20孢子悬浮液，备用。

进一步的，所述步骤(2)的具体操作步骤为：将携带表达绿色荧光蛋白载体pGFP的农杆菌AGL-1在新鲜的平板B上划线，28℃培养48h后，挑取单克隆，接种到5mL培养液B中，于25℃，220rpm振荡培养48h后用紫外分光光度计测OD₆₀₀值，用培养液A稀释，使菌液OD₆₀₀＝0.10，然后将菌液稀释液在28℃振荡培养4h，得到AGL-1农杆菌菌液，备用。

进一步的，所述步骤(3)蔓枯病菌株的GFP基因转化标记方法如下：

1)将步骤(2)中制备的AGL-1农杆菌菌液和步骤(1)中制备的蔓枯病菌株GSB20孢子悬浮液等体积混合，取200μL混合液均匀涂布于不含抗生素的IM共培养平板上的硝酸纤维素滤膜表面，24℃避光共培养24h；

2)共培养24h后，将滤膜揭下，正铺到培养基C上，24℃培养168h，生长出转化子；

3)用无菌接种环挑取单个转化子接种到PDA筛选平板上进行二次筛选，25℃培养，保存转化子GSB20-GFP，用于阳性鉴定。

进一步的，所述的步骤(1)、(2)中的培养液A为加入了400μmol·L^-1乙酰丁香酮的IM液体诱导培养基，IM液体诱导培养基；平板B是加入了50mg·L^-1卡那霉素和50mg·L^-1利福平的YEB平板；培养液B是加入了50mg·L^-1卡那霉素和50mg·L^-1利福平的MM液体基础培养基。

进一步的，所述的步骤(3)中的培养基C是加入了300mg·L^-1特美汀和100mg·L-1潮霉素的马铃薯固体培养基。

进一步的，所述步骤(4)的具体操作步骤为：

1)采用PCR方法，用真菌ITS通用引物、蔓枯病菌株特异性引物、绿色荧光蛋白基因的特异性引物检测阳性转化子为被标记绿色荧光蛋白基因的蔓枯病菌株；

2)采用OLYMPUS DP72荧光显微镜观察转化子是否携带绿色荧光蛋白基因。

进一步的，所述的步骤(4)中的真菌ITS引物为：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’、

鉴定蔓枯病菌株特异性引物为：

DB17F：5’-GCAGTCAATCCTTATCC-3’，

DB17R：5’-CGAAAGATTGTGTGACC-3’，

绿色荧光蛋白基因的特异性引物为：

GFP-F：5’-ACGGCAAGCTGACCCTGAAG-3’，

GFP-R：5’-CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3’。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明以蔓枯病菌株(GSB20)为转化体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将绿色荧光蛋白基因标记蔓枯病菌株(GSB20)基因组，获得标记绿色荧光蛋白的蔓枯病菌菌株(GSB20-GFP)，该方法具有如下优点：

(1)快速方便，步骤简化，只进行一次转膜，并能直接在膜上挑取绿色荧光蛋白标记的蔓枯病菌株(GSB20-GFP)，共培养时间短，24h即可转移膜，减少污染。

(2)荧光稳定性强：在无潮霉素选择压培养基多代培养(>5代)均可获得绿色荧光强度稳定的标记蔓枯病菌株。

(3)转化标记菌株效率高：约为480个标记菌株/10⁶个分生孢子。(4)可用于蔓枯病菌株突变体库的构建，筛选、寄主抗性定量鉴定、寄主对蔓枯病菌株侵染的响应机制及蔓枯病菌株侵染和致病机理研究。

附图说明

图1为绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌株(GSB20-GFP)的荧光检测结果，其中图1a：菌丝体荧光，图1b：菌丝体白光，图1c：分生孢子荧光，图1d：分生孢子白光。

图2：绿色荧光蛋白基因标记的蔓枯病菌株(GSB20-GFP)的PCR检测结果，

其中M：Marker II DNAMarker；I1-I4：标记菌株ITS序列PCR扩增结果；DB1-DB4：标记菌株蔓枯病菌特异性引物PCR扩增结果；G1-G4：标记菌株绿色荧光蛋白基因的特异性引物PCR扩增结果；CKG：未标记绿色荧光蛋白菌株PCR扩增结果；CKD：未加DNA阴性对照PCR扩增结果。

图3：硝酸纤维素滤膜上筛选长出的绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌(GSB20-GFP)。

图4：经5代筛选后PDA平板上生长的绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌(GSB20-GFP)，CK：GSB20。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

本实施方式中的蔓枯病菌株GSB20由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供；携带表达载体pGFP的农杆菌AGL-1由江苏省农业生物学重点实验室提供；硝酸纤维素滤膜购于国药集团化学试剂有限公司。

本实施方式中的CTAB提取缓冲液由0.7mol/L NaCl、100mmol/LTris-HCl pH 8.0、20mmol/L EDTA、10g/L PVP、20g/L CTAB和0.1％β-巯基乙醇组成；TE缓冲液由10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA组成，其pH为8.0。

实施例1

绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌株的方法，其步骤如下：

1、蔓枯病菌菌株(GSB20)分生孢子液制备

打孔器切取蔓枯病菌(GSB20)菌块，在马铃薯固体培养基上培养4d后，在紫外光和普通光12小时交替培养10天，用培养液A冲洗培养基表面，将孢子液收集到灭菌的三角瓶中，用灭菌的双层纱布过滤，然后用培养液A稀释孢子液，用血球计数板计算分生孢子浓度，调节孢子液浓度至1x10⁶个/mL，得到蔓枯病菌株(GSB20)孢子悬浮液，备用；

2、含有GFP基因的农杆菌菌液制备

将携带表达载体pGFP的农杆菌AGL-1在新鲜的平板A上划线，28℃培养48h后，挑取单克隆，接种到5mL培养液B中，于25℃，220rpm振荡培养48h后用紫外分光光度计测OD₆₀₀值，用培养液A稀释，使菌液OD₆₀₀＝0.10，然后将菌液稀释液在28℃振荡培养4h，得到AGL-1农杆菌菌液，备用。

3、蔓枯病菌株的GFP基因转化标记

(1)1中制备的AGL-1农杆菌菌液和步骤2中制备的蔓枯病菌株(GSB20)孢子悬浮液等体积混合，取200μL混合液均匀涂布于不含抗生素的IM共培养平板上的硝酸纤维素滤膜表面，24℃避光共培养24h；

(2)共培养24h后，将滤膜揭下，正铺到培养基C上，24℃培养168h，生长出转化子(如图3)；

(3)用无菌接种环挑取单个转化子接种到PDA筛选平板上进行二次筛选，25℃培养，保存转化子GSB20-GFP，用于阳性鉴定(如图4)。4、标记绿色荧光蛋白(GFP)的蔓枯病菌株PCR鉴定

(1)标记菌株基因组DNA的提取

采用CTAB法提取转化子基因组DNA，步骤如下：

A.取50mg新鲜菌丝，加600μL 2x CTAB提取缓冲液和少许灭菌石英砂，在研钵中将菌丝充分研磨；

B.将研磨后的溶液转入1.5mL无菌Eppendorf管中，于65℃水浴保温30min，加等体积的氯仿和异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，充分摇匀，4℃下8000x g离心5min；

C.移取上清液至另一新的Eppendorf管中，加入3mol/L的NaAc溶液和冰冻乙醇，NaAc溶液的体积是上清液体积的10％，其pH为6.0，冰冻乙醇的体积是上清液体积的2.5倍，在-20℃沉淀30min；

D.4℃10000x g离心5min，弃上清液，用70％的无水乙醇清洗沉淀2-3次，通风干燥沉淀20min，加TE缓冲液充分溶解，即为转化子基因组DNA溶液，-20℃保存备用。

(2)PCR扩增检测

为了确定绿色荧光蛋白基因被标记在蔓枯病菌株基因组中的情况，采用PCR扩增方法进行了真菌ITS序列通用引物、蔓枯病菌株特异性引物、绿色荧光蛋白基因的特异性引物对被标记绿色荧光蛋白的蔓枯病菌株分子鉴定。

根据真菌ITS序列通用引物、蔓枯病菌株特异性引物、表达载体中绿色荧光蛋白基因序列设计特异性引物用于PCR扩增，引物序列分别为：

真菌ITS引物：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

扩增产物长度为545bp。

鉴定蔓枯病菌株特异性引物：

DB17F：5’-GCAGTCAATCCTTATCC-3’

DB17R：5’-CGAAAGATTGTGTGACC-3’

扩增产物长度为559bp。

绿色荧光蛋白基因的特异性引物：

GFP-F：5’-ACGGCAAGCTGACCCTGAAG-3’，

GFP-R：5’-CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3’。

扩增产物长度为590bp。

按表1依次在无菌的PCR反应管中加入PCR反应试剂，短暂涡旋混匀后将PCR反应管置于PCR仪中进行扩增。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸5min；12℃保温。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图2)。

表1 PCR反应体系

试剂	反应体积/μl
		2xPCR Reaction Mix	10
GEP-F上游引物(10μM)	0.5
		GFP-R下游引物(10μM)	0.5
Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)	0.5
		DNA模板(10ng/μl)	1
无菌去离子水	补足至总体积20μl

5、绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌株(GSB20-GFP)的荧光检测用无菌接种环挑取生长于PDA筛选培养基上的标记菌株的菌丝制成玻片，采用OLYMPUS DP72荧光显微镜观察转化菌株的荧光。

检测的菌丝体和分生孢子有绿色荧光发生，则确定该菌株为绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌(GSB20-GFP)(如图1)。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)蔓枯病菌菌株分生孢子液的制备；

(2)制备含有GFP基因的农杆菌菌液；

(3)蔓枯病菌株的GFP基因转化标记；

(4)对标记有绿色荧光蛋白GFP的蔓枯病菌株进行鉴定；

(5)获得带有绿色荧光蛋白标记GFP的蔓枯病菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔓枯病菌菌株为蔓枯病菌菌株GSB20。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作步骤为：使用打孔器切取蔓枯病菌GSB20菌块，在马铃薯固体培养基上培养4d后，在紫外光和普通光12小时交替培养10天，用培养液A冲洗培养基表面，收集并稀释孢子液，调节孢子液浓度至1x10⁶个/mL，得到蔓枯病菌株GSB20孢子悬浮液，备用。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作步骤为：将携带表达绿色荧光蛋白载体pGFP的农杆菌AGL-1在新鲜的平板B上划线，28℃培养48h后，挑取单克隆，接种到5mL培养液B中，于25℃，220rpm振荡培养48h后用紫外分光光度计测OD₆₀₀值，用培养液A稀释，使菌液OD₆₀₀＝0.10，然后将菌液稀释液在28℃振荡培养4h，得到AGL-1农杆菌菌液，备用。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)蔓枯病菌株的GFP基因转化标记方法如下：

6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)、(2)中的培养液A为加入了400μmol·L^-1乙酰丁香酮的IM液体诱导培养基，IM液体诱导培养基；平板B是加入了50mg·L^-1卡那霉素和50mg·L^-1利福平的YEB平板；培养液B是加入了50mg·L^-1卡那霉素和50mg·L^-1利福平的MM液体基础培养基。

7.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的培养基C是加入了300mg·L^-1特美汀和100mg·L^-1潮霉素的马铃薯固体培养基。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体操作步骤为：

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体操作步骤为：

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的真菌ITS引物为：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’、

鉴定蔓枯病菌株特异性引物为：

DB17F：5’-GCAGTCAATCCTTATCC-3’，

DB17R：5’-CGAAAGATTGTGTGACC-3’，

绿色荧光蛋白基因的特异性引物为：

GFP-F：5’-ACGGCAAGCTGACCCTGAAG-3’，

GFP-R：5’-CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3’。