CN105567728B - 一种携带gfp基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体 - Google Patents

一种携带gfp基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及到香石竹斑驳病毒属(Carmovir μs)的甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus,MNSV），在该病毒侵染性克隆获得的基础上构建了携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒克隆载体，并进行了致病性分析，证实该携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒的克隆载体为侵染性克隆载体。携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体是把GFP的全长基因通过融合PCR的方法与甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pCB301‑MNSV连接，获得的具有侵染性克隆的重组表达载体。该载体通过冻融法转入农杆菌菌株GV3101中，获得对甜瓜植物具有高效侵染能力且携带有GFP的病毒载体pMNSV‑GFP。

Description

一种携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体及其构建方法。
背景技术
病毒的侵染性cDNA克隆是指RNA病毒具有侵染性的cDNA或cDNA具有侵染性的体外转录物，接种寄主植物后表现与野生毒源一致的症状。cDNA侵染性克隆的建立克服了RNA病毒难以遗传操作的瓶颈，使在DNA水平上应用基因重组等相关技术开展分子生物学研究得以实现。如：对病毒侵染性克隆利用定点突变技术研究病毒基因组及其基因功能；对其改造为基因沉默载体开展植物功能基因组学的研究；将报告基因插入病毒侵染性克隆中直观地观察和研究病毒在植物体内运动和积累情况；此外，还可研究病毒致病性方面的问题，如症状发生、种子和昆虫传播等机理。
在病原菌侵染寄主植物途径的研究中，常利用荧光素酶基因( lux )和β-葡萄糖苷酸酶基因( gus) 等标记病原菌，进行跟踪检测，但荧光素酶检测时需向试验材料内渗入荧光素；而β-葡萄糖苷酸酶进行组织化学分析时，需要昂贵的反应底物，并且基因标记能够破坏病原菌，在进行组织处理时也会阻断植物病原菌的继续侵染。因此，在病原菌侵染寄主植株途径的研究中一直未取得可靠的实时实态过程。绿色荧光蛋白（Green fluorescentprotein，GFP）是1962 年从发光水母中发现，由于其本身是一种发光蛋白，具有稳定、直观、操作方便的荧光性质。利用GFP标记靶标微生物是目前研究微生物和宿主互作的重要手段，与抗生素抗性标记和放射性同位素标记等方法相比，GFP 标记因为对菌株影响小，易操作，并可以直接观察和评估定殖效果而受到国内外研究者的重视。作为报告基因，GFP 具有如下优点：(1）绿色荧光蛋白基因的表达不需要借助辅助因子以及其他外源底物，在荧光显微镜下就能直接观察到绿色荧光，具有方便、快速、灵敏度高等特点，且还可以通过荧光强度，衡量其在单细胞水平的表达量。（2）绿色荧光蛋白无毒性，对活细胞无毒害，不影响目的基因的功能,转化后细胞仍可连续传代，其分子结构及荧光特性相当稳定，对光漂白、碱性、适当高温、除垢剂、有机溶剂和大多数普通酶等有较强的耐受性。（3）易于载体构建：绿色荧光蛋白的编码序列较小仅717bp 左右，可与目的基因整合到同一个质粒中，避免载体过大而引起带来转化效率过低的问题。（4）能够对活细胞进行实时定位观察。通过 GFP 标记病原菌研究其侵染寄主的过程，最大程度的接近自然真实状态。
MNSV属于香石竹斑驳病毒属(Carmovirμs)，主要通过种子、土壤真菌和黄瓜黑头叶甲、机械摩擦接种进行传播，该病害随种子调运远距离传播将会严重影响我国甜瓜生产。MNSV基因组很小，只有4.3kb，是非常好的基因工程材料，侵染性克隆的成功使对该病毒的研究易于在DNA水平上进行操作，通过基因工程改造该基因，加快MNSV功能基因组学的研究，为揭示其基因功能奠定基础。GFP 稳定性好，表达载体容易构建，适合作为标记基因跟踪病原菌研究其发生发展规律。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术的不足而提供一种携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体及其构建方法。
本发明的目的是以下述技术方案实现的：
一种携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体，它是由GFP全长基因融合到甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pCB301-MNSV的cp基因后面获得的。
如上甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤：
（1）分别利用RT-PCR的方法获得GFP基因和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因；
（2）将步骤（1）获得的GFP片段和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因通过Infusion-HD酶连接，转化大肠杆菌DH5ɑ，筛选并提取获得含有GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pMNSV-GFP。
步骤（1）中用来扩增甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因的引物为：MNSV-GFP-F：5＇-CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TTT AAT TTA TTG CAC TCC AAA TC-3＇；MNSV-GFP-R：5＇-AAA AGT TCT TCT CCT TTA CT CAT GGC GAG GTAG GCT GTT TCC GGA G-3＇；该引物用来扩增MNSV的全基因组序列，并去掉cp基因终止密码子，划线部分为融合的GFP序列。
步骤（1）用来扩增GFP全长基因序列的引物为：GFP-F：5＇-CTC CGG AAA CAG CCT ACC TCGCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TT-3＇；GFP-R：5＇-GAT TTG GAG TGC AAT AAA TT AAA TTT GTA TAG TTC ATC CATGC CAT G-3＇；划线部分为融合的MNSV的部分序列。
步骤（1）PCR扩增所用的模板为pCB301-MNSV质粒模板。
步骤（1）PCR扩增所用的模板为含有GFP基因的质粒pBI221-GFP。
一种如上所述携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的验证方法为，通过农杆菌冻融法把携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒克隆载体转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌注射接种寄主植物甜瓜子叶，观察甜瓜幼苗的发病情况，证实携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒载体为具有侵染性的载体pMNSV-GFP。
本发明采用同源重组的方式将GFP全长基因融合到甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的cp基因后面，然后通过转入农杆菌宿主细胞GV3101，摩擦接种到甜瓜上证实其具有侵染性，并通过激光共聚焦观察到GFP基因的成功表达，可及时跟踪MNSV病毒的发展情况。MNSV基因组很小，只有4.3kb，是非常好的基因工程材料，侵染性克隆的成功使对该病毒的研究易于在DNA水平上进行操作，通过基因工程改造该基因，加快MNSV功能基因组学的研究，为揭示其基因功能奠定基础。GFP基因稳定性好，表达载体容易构建，适合作为标记基因跟踪病原菌研究其发生发展规律，将 GFP基因与MNSV融合，实现对该病毒的荧光标记，借助荧光显微镜，真实反映该病毒在植株中的分布，明确病毒在植物体内的运动和定植，直观地呈现了 MNSV 侵染的动态过程， 不仅为病原菌与寄主互作和致病机理的研究提供了依据，也为病害的科学防治提供了参考。
附图说明
图1是MNSV侵染性克隆载体pCB301-MNSV图谱；
图2是携带有GFP基因pBI221-GFP载体图谱；
图3是携带了GFP 基因的MNSV侵染性克隆载体pMNSV-GFP 图谱；
图4是通过激光共聚焦观察携带有GFP基因的MNSV接种后甜瓜叶部和根部图（仪器型号：Leica TCS SP5；在激发光488nm的波长条件下观察）。
具体实施方式
一种携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体，它是由GFP全长基因融合到甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pCB301-MNSV（专利CN2015105541484）的cp基因后面获得的，如图3所示；所述GFP基因和MNSV融合基因如序列SEQ ID NO:05所示。MNSV基因组只有4.3kb，是非常好的基因工程材料，该病毒侵染性克隆的成功使对该病毒的研究转到DNA水平上。在把GFP基因融合到MNSV的试验方案上，申请人层尝试把GFP基因融合到病毒组分的其他部位，结果发现把GFP基因融合到MNSV cp基因后，其对寄主植物的致病力强，且表达稳定。因此，申请人采用把GFP基因融合到MNSV cp基因后，实现了对该病毒的荧光标记，借助激光共聚焦显微镜，真实反映该病毒在植株中的分布，明确病毒在植物体内的运动和定植，直观地呈现了 MNSV 侵染的动态过程,为病原菌与寄主互作和致病机理的研究提供了依据。
此外，该发明利用了融合PCR和重组酶的特点构建了MNSV携带有GFP基因的方法与传统的酶切连接方式相比，最突出的优点是不受限制性内切酶位点的影响，不引入外源的酶切位点，对侵染性克隆的影响最小，利用该方法对该侵染性克隆载体进行随意的缺失、突变及替换等多种基因工程手段进行改造，该方法既节省了工序，又提高了重组的阳性率，避免了实验的繁琐及内切酶的限制。
上述携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤：
（1）分别利用RT-PCR的方法获得GFP和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因；在设计扩增MNSV及GFP全长基因的引物时，利用了重组融合的方法，MNSV基因5＇和3＇端分别重组了24bp和20bp的GFP序列；在扩增GFP基因时5＇和3＇端两端序列分别融合了MNSV的23bp和20bp的序列；
①获得甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因：设计引物为MNSV-GFP-F：5＇-CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TTT AAT TTA TTG CAC TCC AAA TC-3＇；MNSV-GFP-R：5＇-AAA AGT TCT TCT CCT TTA CT CAT GGC GAG GTAG GCT GTT TCC GGA G-3＇；该引物用来扩增MNSV的全基因组序列，并去掉cp基因终止密码子，划线部分为融合的GFP序列；20μLRT-PCR扩增标准反应体系：4.0μL 5×PCR buffer，2 μL 正向和反向引物混合物（各10μM），0.2μLTaq DNA 聚合酶（5 Μ/μL），1 μL pCB301-MNSV质粒模板（如图1所示，MNSV的全长基因置于35s启动子和35s-t终止子中间，该载体具有在植物中表达的能力，能够侵染MNSV的寄主植物甜瓜），补充ddH2O至20μL。PCR 反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性40 s，60℃退火40s，72℃延伸50s，循环30 次；最后72℃ 10 min；以上用到的各种试剂均购自大连TaKaRa公司。
②获得GFP全长基因：设计引物为GFP-F：5＇-CTC CGG AAA CAG CCT ACC TCGCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TT-3＇；GFP-R：5＇-GAT TTG GAG TGC AAT AAA TT AAA TTTGTA TAG TTC ATC CATGC CAT G-3＇；划线部分为融合的MNSV序列；该引物用来扩增717bp的全长GFP序列；20μLRT-PCR扩增标准反应体系：4.0μL 5×PCR buffer，2 μL 正向和反向引物混合物（各10μM），0.2 μLTaq DNA 聚合酶（5 Μ/μL），1 μL pBI221-GFP模板（如图2所示，购自上海生工生物公司），补充ddH2O至20μL。PCR 反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性40 s，60℃退火40s，72℃延伸50s，循环30 次；最后72℃ 10 min。
（2）将步骤（1）获得的GFP和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因用1%的琼脂糖胶检测，按照回收试剂盒（大连TaKaRa公司）说明书进行回收。用Infusion-HD重组酶（购自Clontech公司）把回收的GFP和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因连接到。重组酶连接体系为：GFP基因片段：2μL；甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因：3μL，Infusion-HD酶：5μL，共计10μL，置于50℃，30min，随后把产物转化大肠杆菌DH5ɑ，涂布在含有kan抗生素的平板上，37℃培养，筛选含有甜瓜坏死斑点病毒的全基因组及GFP的全长基因的克隆载体，即为携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒克隆载体pMNSV-GFP，用碱裂解法抽提质粒载体。
将上述携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒克隆载体pMNSV-GFP转入农杆菌，并通过摩擦接种证实该载体的侵染性，具体包括以下步骤：
（1）转入农杆菌：采用冻融法，将上述pMNSV-GFP转入农杆菌GV3101感受态细胞，具体为：加入1μg的重组载体，置于冰上30min，液氮中速冻5min，37℃ 5min，加入500μl的不含有任何抗生素的LB培养基中，28℃慢速培养4-6h，涂布于含有50μg/ml的Km、10μg/ml四环素和50μg/ml的Rif 的3种抗生素的LB固体培养基平板上28℃培养约48h；利用菌落PCR的方法筛选阳性转化子。
（2）农杆菌注射接种及致病性鉴定：把筛选到的阳性转化子接种到含有50μg/ml的Km、10μg/ml四环素和50μg/ml的Rif 的3种抗生素的LB的液体培养基中，28℃ 200rpm培养至OD600为1.0左右，6000rpm 10min离心收集沉淀，重悬与含有10mM Mgcl2，10mM MES，150μm的乙酰丁香酮的浸润缓冲液中，调整OD600至1.0，静置4h后注射接种两叶一心的甜瓜子叶的背部，接种后把甜瓜苗保持在黑暗中10h后，22℃培养。观察甜瓜幼苗的发病情况，检测甜瓜坏死斑点病毒克隆载体的侵染性。接种后每天观察发病情况。接种4天后，接种的子叶开始出现局部的坏死斑点症状，至第8天时，子叶的枯斑开始连片出现，真叶也陆续出现坏死斑点症状，经RT-PCR检测显示，接种后大部分植株表现阳性，发病率达90%（发病27/30）。通过激光共聚焦显微镜观察发病的植株的根部和叶片，可以明显发现GFP基因在根部和叶片中表达，如图4所示，a-c为接种叶片，a为在激光下暗场，b为明场，c为两个叠加；d-f为根部，d为在激光下暗场，e为明场，f为两个叠加，绿色荧光部分（图中灰色所示）为GFP基因的表达。同时，随后将发病的植株经摩擦接种回接到健康的甜瓜植株上，接种7天后植株均表现明显的枯斑症状，说明构建的侵染性克隆能够摩擦接种传播。由此证实携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pMNSV-GFP构建成功。
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 一种携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体
<130> 1
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 引物
<400> 1
catggcatgg atgaactata caaatttaat ttattgcact ccaaatc 47
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物
<400> 2
aaaagttctt ctcctttact catggcgagg taggctgttt ccggag 46
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物
<400> 3
ctccggaaac agcctacctc gccatgagta aaggagaaga actttt 46
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 引物
<400> 4
gatttggagt gcaataaatt aaatttgtat agttcatcca tgccatg 47
<210> 5
<211> 4978
<212> DNA
<213> MNSV+GFP融合基因
<400> 5
上述MNSV+GFP序列中划线部分为GFP全长基因。

Claims (7)

1.一种携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pMNSV-GFP，其特征在于：它是由GFP全长基因融合到甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pCB301-MNSV的cp基因后面获得的，所述GFP基因与甜瓜坏死斑点病毒的融合基因序列如序列SEQ ID NO: 5所示。
2.如权利要求1所述的携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pMNSV-GFP的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）分别利用RT-PCR的方法获得GFP和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因；
（2）将步骤（1）获得的GFP片段和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因通过Infusion-HD酶连接，转化大肠杆菌DH5ɑ，筛选并提取获得含有GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pMNSV-GFP。
3.如权利要求2所述的携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pMNSV-GFP的构建方法，其特征在于步骤（1）中用来扩增甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因的引物为：MNSV-GFP-F：5＇-CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TTT AAT TTA TTG CAC TCC AAATC-3＇；MNSV-GFP-R：5＇-AAA AGT TCT TCT CCT TTA CT CAT GGC GAG GTAG GCT GTT TCCGGA G-3＇；该引物用来扩增MNSV的全基因组序列，并去掉cp基因终止密码子，划线部分为融合的GFP基因序列。
4.如权利要求2所述的携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pMNSV-GFP的构建方法，其特征在于步骤（1）用来扩增GFP全长基因序列的引物为：GFP-F：5＇-CTC CGG AAA CAG CCT ACC TCGCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TT-3＇；GFP-R：5＇-GAT TTG GAG TGC AAT AAA TT AAA TTT GTA TAG TTC ATC CATGC CAT G-3＇；划线部分为融合的MNSV的部分序列。
5.如权利要求3所述的携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pMNSV-GFP的构建方法，其特征在于步骤（1）PCR扩增所用的模板为pCB301-MNSV质粒模板。
6.如权利要求4所述的携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pMNSV-GFP的构建方法，其特征在于步骤（1）PCR扩增所用的模板为含有GFP基因的质粒pBI221-GFP。
7.一种如权利要求1-6任一项所述携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pMNSV-GFP的验证方法，其特征在于：通过农杆菌冻融法把如权利要求1-6任一项所述的携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒克隆载体pMNSV-GFP转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌注射接种寄主植物甜瓜子叶，观察甜瓜幼苗的发病情况，证实携带GFP基因的甜瓜坏死斑点病毒载体为具有侵染性的载体pMNSV-GFP。
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