KR20210101227A - 식물 벡터, 조성물 및 그것들과 관련된 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시물은 치료제, 예컨대 펩타이드, 단백질 또는 작은 RNA를 숙주 식물에 도입하기에 적합한 단일 가닥 RNA 벡터에 관한 것이다. 벡터는 임의의 이동 단백질 또는 코팅 단백질을 암호화하지 않지만, 숙주 식물 내에서 전신 및 체관부-제한된 이동 및 복제가 가능하다.

Description

식물 벡터, 조성물 및 그것들과 관련된 용도

관련 출원에 대한 교차 참조 :

본 출원은 2018년 11월 13일에 출원된, "Vectors Useful for Treating Plant Diseases and Method of Using the Same"이라는 명칭의 미국 가특허 출원 일련 번호 62/760,098에 기초하며, 이 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함되고 우선권이 주장된다.

서열 목록에 대한 참조 :

본 출원은 37 C.F.R. 1.821, 등에 따른 하나 이상의 서열 목록을 포함하고, 그것은 컴퓨터로 판독 가능한 매체 (파일명: 2105_0071PCT_ST25, 2019년 11월 12일에 생성되고, 37,755 바이트의 크기를 가짐)로 개시되어 있으며, 이 파일은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술:

본 발명은 미국 농무부 (United States Department of Agriculture: USDA)에 의해 수여된 승인 번호 AP17PPQS 및 T00C118 및 국립 과학 재단 (National Science Foundation: NSF)에 의해 수여된 승인 번호 1411836 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 갖는다.

본 발명의 분야:

본 개시물은 펩타이드, 단백질 또는 작은 RNA와 같은 치료제를 숙주 식물에 도입하는데 적합한 단일 가닥 RNA 벡터에 관한 것이며, 그 이동은 실질적으로 체관부(phloem)로 제한되고 식물 질병 또는 병태를 제어하거나 관리하기 위해 표적화된다.

일반 및 고도로 표적화된 항균제 둘 다가 순환계가 동물 전체에 걸친 광범위한 적용을 위한 전달 시스템을 제공하는 동물 (예를 들어, 인간)을 위해 개발되었다. 그에 반해, 단순화된 순환계의 부족이 숙주 식물 전체에 걸친 전달을 복잡하게 만들기 때문에 비-유전적으로 변형된 식물에 대한 일반 또는 표적화된 치료제를 개발하려는 훨씬 더 적은 연구가 실행되었다. 이것은 항균제의 주사가 빠르게 희석될 수 있는 크고, 수명이 긴 나무 (예를 들어, 감귤류)에서 특히 문제가 많다. 결과로서, 살충제의 외부 적용, 예를 들어, 성장 시기 동안 표적 삽입물 또는 다른 벡터를 제어하기 위해, 병원체 또는 벡터를 표적화하는 작용물의 일반적인, 또는 비싼 단기간 주사시 식물의 건강을 강화시키기 위한 엽면 적용을 넘어서 전체 식물 감염 또는 병태를 치료하기 위한 해결책이 거의 존재하지 않는다.

감귤류 산업에 영향을 미치는 질병 및 병태가 특히 관련이 있다. 감귤류 녹화(Greening)로도 알려져 있는 감귤그린병 (Huanglongbing: HLB)은 세계적으로 가장 심각한 감귤류 질병 중 하나이다. HLB는 박테리아 칸디다투스 리베리박터 종(칸디다투스 리베리박터 spp.)의 3가지 종 (아시아티쿠스(asiaticus), 아프리카누스(africanus), 및 아메리카누스(americanus))과 관련이 있으며 2가지 감귤이(psyllid) 종, 아시아 감귤나무 이 (Asian citrus psyllid: ACP) (디아포리나 시트리(Diaphorina citri), 쿠와야마(Kuwayama) 및 아프리카 감귤나무 이(African citrus psyllid) (트리오자 에리트레애(Trioza erytreae), 델 구에르초(Del Guercio))에 의해 전염된다. HLB는 접목-전염 가능하고 박테리아-함유 감귤이가 감귤류 나무를 먹고 살고 박테리아가 번식하는 체관부에 병원성 박테리아를 침착시킬 때 자연적으로 확산된다. 나무가 감염되면, 치료법이 없다. 병든 과일이 인간의 건강에 아무런 위협이 되지 않지만, HLB는 전세계에 걸쳐 수백만 에이커(acre)의 감귤류 작물을 황폐화시켰다. 미국에서만, ACP 및 CL 아시아티쿠스 (CLas)는 플로리다 감귤류 산업을 훼손하여, 매우 짧은 시간 내에 수십억 달러의 작물 손실을 초래하였다. 더욱이, HLB는 미국 내 모든 감귤류 생산 지역으로 확산되었다. 대부분의 감염된 나무들은 감염으로 수년 내에 죽고, 과일은 모양이 변형되고 맛이 떨어져서 소비하기에 부적합하다. 미국 농무부 (USDA)에 따르면, 전체 감귤류 산업이 상당한 위험에 처해 있다.

식물 생리학의 고찰은 식물 질병 및 병태를 관리하기 위한 전략의 개발 및 구현을 돕는다. 식물의 관다발계는 당 및 아미노산, 뿐만 아니라 다수의 개발 공정 및 생물 및 비생물 스트레스에 대한 반응에 필요한 신호전달 분자, 예컨대 작은 리보핵산 (RNA), 단백질, 펩타이드 및 호르몬에 대한 핵심 도관이다 (도 1) (Lee, J.Y. and Frank, M. (2018), Plasmodesmata in phloem: different gateways for different cargoes, Curr Opin Plant Biol 43:119-124; Tugeon, R. and Wolf, S. (2009), Phloem Transport: Cellular Pathways and Molecular Trafficking, Ann Rev Plant Biol 60:207-221). 전령 RNA (mRNA)는 이들 신호전달 분자의 일부를 포함하고, 수천 개의 반세포(companion cell) mRNA가 이웃의 제핵(enucleated) 체 요소로부터 단리될 수 있으며, 그것들은 삼투적으로 생성된 정수압에 의해 공급원 (당 생성) 조직으로부터 싱크(sink) (당 활용) 조직, 예컨대 뿌리 및 순의 끝으로 양방향으로 수송된다 (Folimonova, S.Y. and Tilsner, J. (2018), Hitchhikers, highway tools and roadworks: the interactions of plant viruses with the phloem, Curr Opin Plant Biol 43:82-88; Ham, B.K. and Lucas, W.J. (2017), Phloem-Mobile RNAs as Systemic Signaling Agents, Annual Rev Plant Biol 68:173-195). 50% 정도의 반세포 전사체가 이동에 관여하는 것으로 생각되며 (Kim, G. et al. (2014), Genomic-scale exchange of mRNA between a parasitic plant and its hosts, Science 345:808-811; Thieme, C.J. et al. (2015), Endogenous Arabidopsis messenger RNAs transported to distant tissues, Nature Plants 1(4):15025; Yang, Y. et al. (2015), Messenger RNA exchange between scions and rootstocks in grafted grapevines, BMC Plant Biol 15, 251), 이것은 mRNA의 이러한 실질적인 부분집합이 장거리를 이동하는 방법 및 이유에 관한 다양한 질문을 제기한다. 예를 들어, RNA 이동의 과정은 얼마나 선택적인가? 선택이 있다면, 그것은 어떻게 촉진되는가? 전이 RNA가 변형 (예를 들어, 메틸화)되는가? 전이 RNA가 SE로 빠져나가기 전에 임의의 특정 세포 이하 위치에서 발견되는가? RNA를 수송하기 위한 "우편 번호(zip code)"가 존재하는가? 전이 RNA가 특정 단백질에 의해 결합되고 특이적으로 상호작용하는 서열이 존재하는가? 싱크 세포는 아마도 동일한 mRNA를 전사시킬 수 있기 때문에 얼마나 많은 mRNA의 흐름이 생물학적으로 유의미하고 얼마나 비-선택적인가?

mRNA 이동의 문헌에서도 혼란이 만연하다. 일부 연구에서는 RNA 이동성의 주요 결정요인이 반세포의 풍부함인 것으로 나타났다 (Kim, G. et al. (2014), Genomic-scale exchange of mRNA between a parasitic plant and its hosts, Science 345:808-811; Thieme, C.J. et al. (2015), Endogenous Arabidopsis messenger RNAs transported to distant tissues, Nature Plants 1(4):15025; Yang, Y. et al. (2015), Messenger RNA exchange between scions and rootstocks in grafted grapevines, BMC Plant Biol 15, 251). 주로 풍부함을 기반으로 하며, 반감기 및 전사물 길이가 또한 역할을 하는 mRNA 이동에 대한 비-선택적인 브라운 확산 모델(Brownian diffusion model)을 제안하기 위해 수학적 모델이 사용되었다 (Calderwood, A. et al. (2016), Transcript Abundance Explains mRNA Mobility Data in Arabidopsis thaliana, Plant Cell 28:610-615). 하지만, 다른 연구에서는 반대의 결론에 도달했으며, 반세포 내 mRNA 풍부함은 이동과 연관성이 없다는 것을 발견하였다 (Xia, C. et al. (2018), Elucidation of the Mechanisms of Long-Distance mRNA Movement in a Nicotiana benthamiana /Tomato Heterograft System, Plant Physiol 177:745-758). 이에 더하여, 일반적으로 체관부가 전이 RNA를 표적화하는 RNase를 함유하지 않는 것으로 추정되지만 (Morris, R.J. (2018), On the selectivity, specificity and signaling potential of the long-distance movement of messenger RNA, Curr Opin Plant Biol 43:1-7), Xia 등은 또한 대부분의 이동성 mRNA가 분해되고 뿌리 또는 상부엽에 도달하지 못 한다는 것을 발견하였다. 다른 연구에서는 예상되는 tRNA-유사 구조의 존재가 이동성 mRNA의 11% 초과와 연관성이 있다는 것이 발견되었으며 (Zhang, W.N. et al. (2016), tRNA -Related Sequences Trigger Systemic mRNA Transport in Plants, Plant Cell 28:1237-1249), 이동성 mRNA가 특이적 "우편 번호"를 포함할 수 있다는 것을 시사한다. 하지만, 유사한 tRNA-유사 모티프(motif)를 함유하는 다른 풍부한 mRNA는 이동성이 아니었다 (Xia, C. et al. (2018), Elucidation of the Mechanisms of Long-Distance mRNA Movement in a Nicotiana benthamiana /Tomato Heterograft System, Plant Physiol 177:745-758). 따라서, 이전의 연구에서는 상이한 세포 조건 하에 살아있는 조직에서 이동성이 추적 가능한, 고도로 풍부한 이동성 RNA로 이루어진 모델 시스템을 확인하고 개발하는데 실패했다.

다수가 리보핵산단백질 복합체 (vRNP)로서 식물을 통해 이동하는 식물 바이러스는 내인성 RNA 이동에 의해 사용되는 것과 동일한 경로를 사용하도록 진화되었다. 식물 바이러스는 상당한 양으로 축적될 수 있고, 대부분 표피 또는 엽육 세포에서 감염이 시작된 다음, 이웃의 세포의 세포질 사이에서 연속성(continuity)을 허용하는, 원형질 연락사(plasmodesmata)라고 불리는 고도로 선택적인 세포내 연결기를 통해 세포에서 세포로(cell-to-cell) 이동한다 (도 1; 또한 Lee, J.Y. and Frank, M. (2018), Plasmodesmata in phloem: different gateways for different cargoes, Curr Opin Plant Biol 43:119-124; Schoelz, J.E. et al. (2011), Intracellular transport of plant viruses: finding the door out of the cell, Mol Plant 4:813-831 참조). 장거리 전신 이동 (잎에서 잎으로)은, 복제가 일어나는 경우, 바이러스가 반세포로 들어간 후 이어서, 자손이 반세포와 체 요소를 연결하는 특수한 분지형 원형질 연락사를 통한 전이에 의해 체 요소로 빠져나가는 것을 요구한다. 관형 체 요소에 도달하면, 바이러스는 체관부 광동화 스트림과 함께 수동적으로 이동하고 빠져나가면 전신 감염을 확립한다 (Folimonova, S.Y. and Tilsner, J. (2018), Hitchhikers, highway tolls and roadworks: the interactions of plant viruses with the phloem, Curr Opin Plant Biol 43:82-88).

vRNP로서 체관부를 통해 수송되는 바이러스에 대해, 이동은 숙주 mRNA와 유사하다. 모든 식물 바이러스는 이동에 필요한 적어도 하나의 이동 단백질을 암호화하며, 이것은 바이러스 RNA에 결합하고 원형질 연락사를 확장시킨다. 따라서, 숙주 mRNA 이동은 또한 유사한 숙주-암호화된 이동 단백질을 필요로 할 가능성이 크다. 이동 단백질은 비-특이적 RNA 결합 단백질이다. 하지만, 반세포 유전자 발현의 재프로그래밍(reprograming)이 필요할 수 있지만, vRNP가 어떻게 체관부로 로딩되고 원위 조직에서 언로딩(unload)되는지에 관한 문제가 남아있다 (Collum, T.D. et al. (2016), Tobacco mosaic virus-directed reprogramming of auxin / indole acetic acid protein transcriptional responses enhances virus phloem loading, Proc Natl Acad Sci USA 113:E2740-E2749). mRNA 운송 작용(trafficking)이 광범위하고 비-특이적이면, RNA 바이러스가 자체의 암호화된 이동 단백질을 필요로 하는 이유는 불분명하다. 일부 연구원들은 RNA 바이러스가 반세포 원형질 연락사의 크기-배제 한계 (~70 kDa)를 넘는 큰 RNA-의존적 RNA 폴리머라제를 포함하는 사전 형성된 복제 복합체로서 이동하는 경우 이동 단백질을 필요로 한다는 것을 제안한다 (Heinlein, M. (2015), Plant virus replication and movement, Virology 479:657-671). 또한 일부 바이러스가 왜 그리고 어떻게 체관부-제한되는지가 불분명하게 남아있다. 예를 들어, 체관부-제한된 클로스터바이러스(Closterovirus)는 적어도 5개의 이동 단백질을 갖고, 체관부-제한은 침묵 억제자를 과발현시키고 숙주 방어를 하향조절함으로써 완화될 수 있으며 (Folimonova, S.Y. and Tilsner, J. (2018), Hitchhikers, highway tolls and roadworks: the interactions of plant viruses with the phloem, Curr Opin Plant Biol 43:82-88), 체관부-제한이 일부 바이러스에 대한 복잡한 공정임을 시사한다. 체관부-제한은 또한 능동적인 공정일 수 있다 (세포에서 세포로의 이동 단백질의 부족과는 대조적으로). 예를 들어, 감자잎 말림 바이러스(Potato leaf role virus) 이동 단백질의 도메인을 변화시키는 것은 체관부를 빠져나가는 능력을 부여하였다 (Bendix, C., and Lewis, J.D. (2018), The enemy within: phloem-limited pathogens, Mo Plant Path 19:238-254).

식물 바이러스 이동 단백질의 기원이 해결될 때 mRNA의 숙주 이동과 vRNP 이동 사이의 직접적인 관련성이 확립되었다. 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus) 이동 단백질과 관련된 호박 단백질 (RPB50)은 자체의 mRNA, 뿐만 아니라 다른 mRNA를 체관부로 수송할 수 있다는 것이 발견되었다 (Xoconostle-Cazares, B. et al. (1999), Plant paralog to viral movement protein that potentiates transport of mRNA into the phloem, Science (New York, NY) 283:94-98; Ham, B.K. et al. (2009), A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex, Plant Cell 21:197-215).

비-세포-자율적 단백질 (NCAP)로 알려져 있는 이들 내인성 이동 단백질의 복합적인 집단은 mRNA의 장거리 체관부 운송 작용의 원인인 것으로 제안되었다 (Gaupels, F. et al. (2008), Nitric oxide generation in Vicia faba phloem cells reveals them to be sensitive detectors as well as possible systemic transducers of stress signals, New Phytol 178:634-646; Gomez, G. et al. (2005), Identification of translocatable RNA-binding phloem proteins from melon, potential components of the long-distance RNA transport system, Plant J 41:107-116; Kim, M. et al. (2001), Developmental changes due to long-distance movement of a homeobox fusion transcript in tomato, Science (New York, NY) 293:287-289; Pallas, V. and Gomez, G. (2013), Phloem RNA-binding proteins as potential components of the long-distance RNA transport system, Front Plant Sci 4:130; Yoo, B.C. et al. (2004), A systemic small RNA signaling system in plants, Plant Cell 16:1979-2000).

그들의 발견 이후로 (Deom, C.M. et al. (1987), The 30- kilodalton gene product of tobacco mosaic virus potentiates virus movement, Science (New York, NY) 237:389-394), 원형질 연락사로의 vRNP의 세포내 운송 작용, 뿐만 아니라 세포에서 세포로의 장거리 이동의 원인이 되는 많은 바이러스 이동 단백질이 확인되었다 (Tilsner, J. (2014), Techniques for RNA in vivo imaging in plants, J Microscopy 258(1):1-5). 일부 바이러스 (예를 들어, 움브라바이러스(umbravirus))에 대하여, 세포에서 세포로의 장거리 이동은 다수의 이동 단백질과 관련이 있다 (Ryabov, E.V. et al. (2001), Umbravirus-encoded proteins both stabilize heterologous viral RNA and mediate its systemic movement in some plant species, Virology 288:391-400). 예를 들어, 클로스터바이러스, 예컨대 시트러스 트리스테자(citrus tristeza) 바이러스는 3개의 이동 단백질을 함유한다. 하지만, 대부분의 바이러스에 대하여, 모든 이동 활성은 단일 이동 단백질과 관련이 있는 것으로 생각된다.

바이러스 벡터를 사용하여 질병, 곤충 또는 다른 불리한 조건 (예를 들어, HLB 및/또는 운반 곤충)과 싸우기 위해 조작된 치료제를 식물에 전달하는 것은 연구 목적을 위해 병원체에 대한 저항성과 같은 특성 또는 다른 원하는 성질을 식물에 도입하는 확립된 수단이다. 식물에 벡터를 제공하는 다양한 방법들이 해당 분야에 공지되어 있다. 이것은 종종 세포의 게놈의 변형을 일으킬 수 있는, 아그로박테리아 종괴 형성(tumefaction)-매개된 "아그로침윤(agroinfiltration)"에 의한 식물 세포의 핵으로의 바이러스 벡터의 전달에 의해, 또는 게놈 변형에 대한 요건 없이 감염을 유발하는, 세포의 세포질로의 바이러스 벡터의 전달에 의해 달성된다. 아그로침윤의 경우에, 바이러스 게놈의 cDNA는 T-DNA로 도입되며, 그 다음에 이것은 식물에 제공된다. 이러한 T-DNA는 게놈의 전사를 허용하는 추가의 조절 DNA 구성요소를 포함한다. DNA 삽입물은 표적화된 식물을 감염시킬 수 있는 바이러스 cDNA 벡터에 부착된다. 바이러스가 RNA 바이러스인 경우, 바이러스와 삽입물은 식물 세포 내에서 RNA로 전사되고, 그 이후 바이러스는 정상적인 RNA 바이러스로서 (증폭 및 이동) 행동한다. 따라서, 효과적인 벡터로서 작용하기 위해서는, 바이러스는 기능성을 비활성화시키지 않으면서 삽입물을 받아들이고 조작된 바이러스가 삽입물(들)을 전달하고 어떤 경우에는 그것을 발현하기에 충분한 수준으로 숙주 내에 전신에 축적될 수 있다는 것을 보장하도록 조작되어야 한다. 이들 삽입물은, 단백질로 번역되는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame: ORF)이든 유익한 기능을 위해 사용되는 RNA든, 효과적이고 숙주 또는 숙주나 환경의 임의의 다운스트림 소모에 대해 충분히 비-독성인 방식으로 표적화된 조직에 전달되어야 한다. 하지만, 상기 기준을 충족하고 특정 식물에 대해서만 이용 가능한 제한된 수의 바이러스 벡터 (예를 들어, 담배에 대한 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus))만이 존재한다. 불행하게도, 대부분의 식물에 대해, 특히 수명이 긴 나무 및 덩굴 식물에 대해 적합한 바이러스 벡터, 또는 차선의 바이러스 벡터는 알려져 있지 않다.

따라서, RNA 또는 DNA 요법을 광범위하게 시행하는 능력은 실질적으로 기존의 기술로 제한된다. 다수의 바이러스에 의해 감염된 많은 식물들로 1,000가지가 넘는 식물 바이러스가 확인되었다. 예를 들어, 감귤류 나무는, 다른 것들 중에서도, 감귤류 잎 브로치 바이러스(citrus leaf brotch virus), 감귤류 잎 융단 바이러스(citrus leaf rugose virus), 감귤류 나증 바이러스 C(citrus leprosis virus C), 감귤류 골다공증 바이러스(citrus psorosis virus), 감귤류 급사-관련 바이러스(citrus sudden death-associated virus), 시트러스 트리스테자 바이러스 (CTV), 감귤류변색 바이러스(citrus variegation virus), 감귤류잎맥 돌기 바이러스(citrus vein enation virus) 및 감귤류황색 모자이크 바이러스(citrus yellow mosaic virus)로 감염된다. 하지만, CTV, 급성 쇠약 및 고접병(stem pitting)과 같은 심각한 감귤류 질병의 병원(causal agent)은 현재 감귤류 체관부로 작용물을 전달하기 위한 벡터로 개발된 유일한 바이러스이다.

CTV는 클로스터바이러스 속의 구성원이다. 그것은 길이가 2000 nm이고 직경이 12 nm의 크기를 가진 2개의 캡시드(capsid) 단백질로 구성된 굴곡성 막대 형상의 비리온을 갖는다. 19 kb가 넘는 게놈으로, CTV (및 다른 클로스터바이러스)는 식물을 감염시키는 공지된 가장 큰 RNA 바이러스이다. 그것은 전 세계적으로 수백만 그루의 감귤류나무를 죽이거나 쓸모없게 만드는 악성 병원체이지만, 조작된 벡터 형태는 적어도 플로리다(Florida) 감귤류나무에 대해 덜 악성인 (캘리포니아(California) 나무에서는 고도로 악성임) 균주로부터 유래된다. 선행 연구에서는 알려진 대로 CTV-기반 벡터가 식물 세포에서 조작된 삽입물을 발현하는 것으로 입증되었다 (US 8389804; US 20100017911 A1). 하지만, 그것은 식물에서 축적되고 표적화된 유익한 결과를 달성하는 능력의 일관성이 없었기 때문에 상업화되지는 않았다. 충분히 높은 수준으로 복제할 수 없는 CTV의 능력과 열 민감도는 치료를 위한 충분한 양의 RNA를 생성하는 능력을 제한하는 것으로 생각된다.

따라서, CTV-기반 벡터는 필요한 경우 효과적인 유익한 페이로드(payload)를 전달하기 위한 매우 제한된 능력을 갖는다. 더욱이, CTV는 큰 크기로 인해 함께 작동하기 힘들다. CTV는 또한 중복 감염 배제(superinfection exclusion)되며, CTV-기반 벡터는 CTV로 이미 감염된 나무를 감염시킬 수 없다. CTV는 또한 여러 진딧물 종을 통해 식물에서 식물로 고도로 전염 가능하며, 원치않는 방법으로 다른 숙주를 돌연변이시키거나 그것과 상호작용할 수 있는 환경으로의 제어되지 않는 탈출과 관련된 조절자가 반감을 갖는 성질이다. 이에 더하여, 한 영역 (예를 들어, 플로리다)에 대해 적합한 균주는 또 다른 영역 (예를 들어, 캘리포니아)의 나무의 품종에 부적합하다. 이러한 문제에도, CTV는 감귤류나무에 이용 가능한 유일한 바이러스 벡터 플랫폼이다.

따라서, 상기 언급된 문제 중 일부 또는 전부를 해결하고, 식물, 특히 수명이 긴 식물, 예컨대 나무 또는 덩굴 식물에 바람직한 성질을 도입하고 및/또는 치료제(들)를 전달할 수 있는 감염원이 필요하다.

본 개시물은 식물에 외인성 삽입물(들)을 전달할 수 있는 신규한 감염원(들), 개시된 작용물(들)에 의해 감염된 식물을 포함하는 조성물, 및 그것들과 관련된 방법 및 용도에 관한 것이다. 개시된 작용물은 때때로 본원에서 "독립적으로 이동성인 RNA" 또는 "iRNA"라고 불린다. 감염성 단일 가닥 RNA임에도, iRNA는, 모든 공지된 식물 바이러스의 주요 특징인, 그것들이 임의의 이동 단백질(들) 또는 RNA 침묵 억제자를 암호화하지 않는 것을 고려할 때 바이러스가 아니다. 이에 더하여, 사실상 모든 식물 RNA 바이러스와 달리, 움브라바이러스를 제외하면, iRNA는 또한, 식물에서 식물로의 바이러스의 벡터식 이동에 대한 요건인, RNA를 비리온으로 캡시드화하기 위한 코팅 단백질을 암호화하지 않는다. 이동 단백질 발현의 부족에도, iRNA는 숙주 식물의 체관부 내에서 전신으로 이동 가능하다. 바이러스와 비교하여, iRNA는 대부분의 공지된 식물 바이러스를 초과하는 수준으로 축적될 수 있는 능력; 예를 들어, 가장 작은 식물 RNA 바이러스의 단지 약 3분의 2의 크기인 비교적 작은 크기, 따라서 이러한 통상적인 식물 RNA 바이러스와 비교하여 함께 작업하기 훨씬 쉬움; 및 그 자체로 다른 식물로 확산될 수 없다는 것 (임의의 코팅 단백질을 암호화할 수 없는 능력을 고려하여)과 같은 추가적인 유리한 성질을 갖는다.

개시된 구체예에 따르면, 감염원은 조작된 삽입물을 함유하는 iRNA-기반 벡터를 포함하며, 이것은 표적화된 펩타이드, 단백질(들)의 식물 발현을 촉발시키고 및/또는 유익한 적용을 위해 벡터로부터 분열되는 표적화된 작은 RNA를 생산한다. 본 개시물의 양태는 다음을 포함한다: 표적화된 항-병원체의 전달을 위한 iRNA-기반 벡터; 식물을 감염시키는 박테리아 또는 곤충 벡터에 의해 요구되는 박테리아에서 표적화된 항균 효소 항생제(enzybiotic); TEV IRES로부터 생성된 효소 항생제; iRNA 게놈으로의 siRNA의 통합; 삽입물을 지지하는 스캐폴드(scaffold)의 베이스(base)를 안정화시키기 위해 잠금 및 도크(lock and dock) 구조로의 삽입물의 통합; 삽입물의 탈안정화 효과에 정확하게 대항하기 위해 국소 영역의 안정성을 향상시키도록 변형된 iRNA 게놈으로부터의 siRNA의 통합; 표적화된 곤충 벡터를 분열시키거나 사멸시키는 siRNA의 통합; 나무의 캘러스(callose) 생산에 부정적인 영향을 완화시키는 siRNA의 통합; 병원체의 식물 인식을 완화시키는 siRNA의 통합; 및 특정 식물 특성 (예를 들어, 난쟁이증(dwarfism))을 촉발시키는 삽입물의 통합. 따라서, 본원에서 개시된 감염원 및 조성물은 통상적인 기술과 비교하여 우수하고 유리한 성질을 소유한다.

본 개시물의 iRNA-기반 벡터는 다양한 단백질의 발현 및/또는 감귤류 및 다른 숙주 식물의 체관부로의 작은 RNA의 전달을 위한 일반적인 플랫폼으로서의 사용에 적합하다. 일부 실행에서, 반세포 및 체관부 유세포(parenchyma cell)에서 엄청난 수준으로 축적되는 CYVaV-기반 벡터가 제공된다. 본 개시물의 벡터는 나무의 체관부에서 특정 침묵 유전자 발현의 효과를 검사하는데 이용될 수 있다. 이에 더하여, CYVaV는 체 요소를 통한 mRNA의 장거리 이동을 검사하기 위한 모델 시스템으로 개발될 수 있다. CYVaV는 사실상 감률류의 모든 품종을 감염시킬 수 있기 때문에, 감염된 식물에서 생성된 임의의 증상이 거의 없으면, 목본 식물 내에서 RNA의 이동이 쉽게 검사될 수 있다.

개시된 구체예에 따르면, 본 개시물은 복제 요소(들) 및 이종성 분절(들)을 포함하는 플러스-센스(plus-sense) 단일 가닥 리보핵산 (RNA) 벡터에 관한 것이며, RNA 벡터는 기능적 코팅 단백질(들) 오픈 리딩 프레임 (ORF) 및 기능적 이동 단백질(들) ORF가 부족하다. 일부 실행에서, RNA 벡터는 서열 번호: 4 및/또는 서열 번호: 5의 핵산 서열(들)을 포함하는 3' 캡 독립적 번역 인핸서 (3' Cap Independent Translation Enhancer: 3' CITE)를 포함한다. 일부 구체예에서, 3' CITE는 서열 번호: 3의 핵산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, RNA 벡터의 복제 요소(들)는 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 및/또는 서열 번호: 14의 핵산 서열을 가진 하나 이상의 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다. 일부 실행에서, 복제 요소(들)는 추가적으로 또는 대안으로 서열 번호: 15 및/또는 서열 번호: 16의 핵산 서열을 가진 하나 이상의 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다.

일부 구체예에서, RNA 벡터는 감귤류황색 잎맥 바이러스 (서열 번호:1) 또는 그것의 iRNA 친척으로부터 유래된다. 본 개시물의 RNA 벡터는 숙주 식물 내에서 전신 및 체관부-제한된 이동 및 복제가 가능하다. 본 개시물의 RNA 벡터는 감염 후 적어도 1개월 동안 숙주 식물 내에서 복제, 이동 및/또는 번역에 대해 기능적으로 안정하다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 RNA 벡터의 이종성 분절(들)은 리포터 분자, 펩타이드, 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실행에서, 폴리펩타이드는 살충제, 항균제, 항바이러스제, 또는 항진균제이다. 일부 실행에서, 항균제는 효소 항생제이다. 일부 실행에서, 항균제는 박테리아 칸디다투스 리베리박터(Candidatus Liberibacter) 종, 예를 들어, 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 (CLas)을 표적으로 한다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 RNA 벡터의 이종성 분절(들)은 작은 비-암호화 RNA 분자 및/또는 RNA 간섭 분자를 포함한다. 일부 실행에서, 작은 비-암호화 RNA 분자 및/또는 RNA 간섭 분자는 곤충 벡터, 바이러스, 또는 균류를 표적으로 한다. 일부 실행에서, 작은 비-암호화 RNA 분자 및/또는 RNA 간섭 분자는 곤충 벡터, 바이러스, 또는 상기 균류의 핵산을 표적으로 한다. 일부 실행에서, 표적화된 바이러스는 감귤류잎맥 돌기 바이러스 (CVEV) 및 시트러스 트리스테자 바이러스 (CTV)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

RNA 벡터는 다수의 이종성 분절을 포함할 수 있으며, 각각 동일하거나 상이한 기능성을 제공한다는 것을 이해해야 한다. 일부 구체예에서, 이종성 분절(들)은 제1 이종성 분절이고, RNA 벡터는 제2 이종성 분절(들)을 더 포함하며, 복제 요소(들)는 제1 및 제2 이종성 분절의 중간이다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 RNA 벡터의 이종성 분절(들)은 표현형 특성을 변화시키는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실행에서, 표현형 특성은 살충제 내성, 제초제 내성, 곤충 저항성, 감소된 캘러스 생산, 증가된 성장 속도, 및 난쟁이증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 개시물은 또한 본 개시물의 RNA 벡터를 포함하는 숙주 식물에 관한 것이다. 숙주 식물은 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 또는 식물 세포일 수 있다. 일부 실행에서, 숙주 식물은 시트러스(citrus), 비티스(vitis), 피쿠스(ficus) 및 올레아(olea)로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 있다. 일부 실행에서, 숙주 식물은 감귤류 나무 또는 감귤류 나무 접목이다.

본 개시물은 또한 본 개시물의 RNA 벡터로 감염된 식물, 식물 기관, 식물 조직, 또는 식물 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실행에서, 식물은 시트러스, 비티스, 피쿠스 및 올레아로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 있다. 일부 실행에서, 식물은 감귤류 나무 또는 감귤류 나무 접목이다.

본 개시물은 또한 본 개시물의 RNA 벡터를 숙주 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 이종성 분절(들)을 숙주 식물에 도입하기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이종성 분절(들)을 숙주 식물에 도입하는 단계는 본 개시물의 RNA 벡터를 포함하는 식물의 식물 기관 또는 식물 조직을 도입 전에는 RNA 벡터를 포함하지 않는 또 다른 식물의 식물 기관 또는 식물 조직으로 접목시키는 단계를 포함한다. 본 개시물의 RNA 벡터는 숙주 식물을 전신으로 감염시킬 수 있다.

본 개시물은 또한 식물, 식물 기관, 식물 조직, 또는 식물 세포에서 이종성 분절(들)을 생산하는 공정에 관한 것이며, 본 개시물의 RNA 벡터를 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 식물은 시트러스, 비티스, 피쿠스 및 올레아로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 있다.

본 개시물은 또한 본 개시물의 RNA 벡터를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 개시물은 또한 이종성 분절(들)을 식물, 식물 기관, 식물 조직, 또는 식물 세포에 도입하기 위한 본 개시물의 RNA 벡터(들)의 사용에 관한 것이다. 본 개시물은 또한 RNA 벡터(들)를 상기 도입 전에는 RNA 벡터를 포함하지 않는 식물 기관 또는 식물 조직에 도입하기 위한, 본 개시물의 숙주 식물(들)의 사용, 또는 본 개시물의 조성물(들)의 사용에 관한 것이다. 일부 실행에서, RNA 벡터를 도입하는 단계는 RNA 벡터를 포함하는 식물의 식물 기관 또는 식물 조직을 RNA 벡터를 포함하지 않는 또 다른 식물의 식물 기관 또는 식물 조직에 접목시키는 단계를 포함한다.

본 개시물은 또한 하나 이상의 이종성 분절(들)을 RNA로 삽입하는 단계를 포함하는, 식물과 함께 사용하기 위한 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이며, RNA는 CYVaV; CYVaV의 친척; CYVaV와 적어도 70% RdRp 동일성을 갖는 다른 RNA 벡터; 및 또 다른 iRNA로 이루어진 군으로부터 선택딘다. 본 개시물은 또한 개시된 방법(들)에 의해 생산된 벡터에 관한 것이다. 본 개시물은 또한 벡터로서 RNA 분자의 사용에 관한 것이며, RNA는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CYVaV; CYVaV의 친척; CYVaV와 적어도 70% RdRp 동일성을 갖는 다른 RNA 벡터; 및 또 다른 iRNA. 일부 실행에서, RNA는 식물의 치료, 예를 들어, 식물의 바이러스 또는 박테리아 감염의 치료, 예를 들어, 감귤류 식물에서 CTV 감염 또는 감귤류 녹화의 치료에 사용된다. RNA는 하나 이상의 삽입된 이종성 분절(들), 예를 들어, 효소 항생제로 변형된다.

본 개시물은 또한 식물의 질병 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조 중에 있는 것을 특징으로 하는 RNA 분자의 사용에 관한 것이며, RNA는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CYVaV; CYVaV의 친척; CYVaV와 적어도 70% RdRp 동일성을 가진 다른 RNA 벡터; 및 또 다른 iRNA. 일부 실행에서, 질병 또는 병태는 식물의 바이러스 또는 박테리아 감염, 예를 들어, 감귤류 식물의 CTV 또는 감귤류 녹화이다.

본 개시물은 또한 의약으로서 또는 식물의 질병 또는 병태의 치료시 사용하기 위한 RNA 분자에 관한 것이며, RNA는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CYVaV; CYVaV의 친척; CYVaV와 적어도 70% RdRp 동일성을 갖는 다른 RNA 벡터; 및 또 다른 iRNA.

도 1은 식물의 관다발계를 통한 개략적인 이동 경로를 나타낸다 (Lee, J.Y. and Frank, M. (2018), Plasmodesmata in phloem: different gateways for different cargoes, Curr Opin Plant Biol 43:119-124).
도 2는 톰버스비리대(Tombusviridae) 과의 일부 바이러스와 CYVaV의 관련성을 나타내는 계통수(phylogenic tree)이다.
도 3은 CYVaV 및 유사한 RNA 분자의 게놈 조직을 개략적으로 나타낸다 (패널 A). 복제에 수반되는 단백질을 암호화하는 ORF는 짙은 회색으로 확인된다 (PEMV2에 대해 p33 및 p94; CYVaV에 대해 p21 및 p81; PMeV2-ES에 대해 p35 및 p86; PUV에 대해 p31 및 p85; TBTVa에 대해 p29 및 p89). 움브라바이러스 PEMV2는 또한 이동에 수반되는 단백질 p26 및 p27을 암호화하는 ORF를 소유한다 (옅은 회색 상자에서 확인됨). 프레임 이동 리보솜 재암호화 부위 (FS) 및 판독 리보솜 재암호화 부위 (RT)가 또한 확인된다. 침윤된 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 잎 (패널 B, 상부) 및 전체 잎 (패널 B, 하부)의 CYVaV 플러스 (+) 가닥의 수준이 나타나 있다. 전장 CYVaV 및 PEMV2의 밀 배아 추출액(wheat germ extract)에서 시험관 내(in vitro) 프레임 이동에 의해 합성된 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRp)의 수준이 나타나있다 (패널 C). CYVaV에 의해 생산된 p81 폴리머라제와 비교하여 PEMV2로부터의 p94의 수준의 차이는 상당하다. CYVaV의 프레임 이동 부위는 바이러스학에서 공지되어 있는 가장 강력한 것들 중 하나이고 예외적으로 높은 축적의 원인이라고 생각된다.
도 4는 추가적인 iRNA의 게놈 조직 및 부채선인장(Opuntia), 무화과 나무(Fig tree), 및 에티오피아 옥수수(Ethiopian corn)에서 확인된 CYVaV의 가까운 친척을 개략적으로 나타낸다. iRNA 친척은 모두 3'UTR에서 삽입물을 갖고 미지의 기능의 단백질 (p21.2)을 암호화하는 ORF를 생성하는 다른 뉴클레오타이드 변화를 나타낸다.
도 5는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 아그로-침윤된 잎의 RNA 수준을 나타낸다. 니코티아나 벤타미아나의 잎에서 CVEV (레인 1-2), CVEV+CYVaV (레인 3-5) 및 CYVaV (레인 5-8). CYVaV의 축적은 추정 헬퍼(helper) 바이러스 CVEV의 존재 하에 실질적으로 증가하였다. 플러스-가닥은 위에 나타나있다. rRNA 로딩 대조군은 아래에 나타나있다. p14 침묵 억제자는 모든 잎에서 동시-침윤되었다.
도 6은 니코티아나 벤타미아나의 아그로침윤된 잎을 이용한 또 다른 실험의 RNA 수준을 나타낸다. CYVaV 또는 CVEV 또는 CYVaV + CVEV가 니코티아나 벤타미아나의 잎으로 아그로침윤된다. CYVaV는 CVEV의 비리온에 캡시드화되었고, 비리온은 1주일 후 단리되고 캡시드화된 RNA는 PCR 분석되었다.
도 7은 CYVaV (패널 A) 및 CYVaV + CVEV (패널 B)의 황화 증상을 나타내며, 이것은 시트론(citron) (사진), 레몬, 및 라임으로 제한된다.
도 8은 니코티아나 벤타미아나에서 CYVaV의 전신 및 체관부-제한된 이동을 나타내며, CYVaV는 식물의 수송 조직에 국한된다. CYVaV의 플러스 가닥을 검출하는 형광 발광 제자리 혼성체화 (Fluorescence in situ hybridization: FISH) 이미지화는 분홍색으로 염색되었으며 (영역은 본원에서 일반적으로 흰색 파선 및 원으로 나타남) 패널 A-G에 나타나있고, 잎 꼭지(petiole) (패널 A-D) 및 뿌리 조직 (패널 E-G)의 종단면 및 횡단면을 포함한다. 조직은 DAPI로 염색되었다. 반세포 (CC), 체관부 유세포 (PPC) 및 체 요소 (SE), 및 목질부 (XL)가 확인되었다. iRNA는 SE, CC 및 PPC로 완전히 제한된다. 파란색 (본원에서는 짙은 회색 또는 검은색 영역으로 나타남)이 내인성 DNA의 DAPI 염색된 곳이다. CYVaV는 사실상 테스트된 감귤류의 모든 품종에서 증상이 없다.
도 9는 부채선인장, 무화과 및 옥수수에서 SHAPE 구조 탐침 및 CYVaV 친척과의 계통 발생 비교에 의해 결정된 바와 같이 CYVaV의 전장 2차 구조를 개략적으로 나타낸다. 재암호화 프레임 이동 부위 (도 10 참조)는 상자 형태의 단일 실선 영역으로 확인되고, ISS-유사 (I-형상 구조) 3' CITE (도 11 참조)는 상자 형태의 파선 영역으로 확인된다. 예를 들어, 삽입된 헤어핀(hairpin)(들)을 수용하기 위한 영역은 상자 형태의 이중선 영역으로 나타나있다.
도 10은 CYVaV 및 PEMV2에서 재암호화 프레임 이동 부위의 구조를 개략적으로 나타낸다 (패널 A). CYVaV는 이 영역 내 구조의 다중 입체구조를 나타내며 (도 9 참조) 하나만 표시된다. 슬리퍼리 부위(Slippery site)는 상자 형태의 파선으로 확인되고, 종결 코돈 염기는 검은색 원 안에 있다. 상자 형태의 실선에 의해 확인된 염기는 3' 단부와의 장거리 상호작용에 관여한다.
도 11은 CYVaV의 ISS-유사 3' 캡 독립적 번역 인핸서 (3' CITE)를 개략적으로 나타낸다. CYVaV의 3' 단부의 구조가 나타나있다. 3' CITE는 표시된 가장 왼쪽 부분에 나타나있고 염기는 원형이다. 상자 형태의 실선으로 확인된 서열은 재암호화 부위와의 장거리 RNA:RNA 상호작용에 관여한다.
도 12는 트랜스(trans)-억제 검정의 결과를 나타낸다. 전장 CYVaV는 절단된 버전의 ISS (ISS_S) 또는 실제 크기의 ISS (ISS_L)의 10배 몰 초과량의 존재 하에 시험관 내에서 번역되었다.
도 13은 CYVaV가 침묵 억제자를 암호화하지 않는다는 것을 입증한다. 패널 A 및 B에 관하여, 니코티아나 벤타미아나 16C 식물은 GFP을 발현하는 작제물 (이들 식물에서 침묵함) 및 CYVaV p21 또는 p81을 발현하는 작제물, 또는 공지된 침묵 억제자 p19 (TBSV로부터 유래됨) 또는 p38 (TCV로부터 유래됨)을 발현하는 작제물로 아그로침윤되었다. p19 및 p38만이 GFP의 침묵을 억제하여, 녹색 형광 발광이 발현될 수 있게 한다 (패널 B에서 원형 파선으로 확인되는 침윤된 영역). 패널 C에 관하여, GFP 올리고뉴클레오타이드로 탐침된 노던 블롯(northern blot)은 GFP RNA가 p21 또는 p81의 존재 하에서 여전히 침묵한다는 것을 나타냈다.
도 14는 애기장대(Arabidopsis) 원형질체에서 CYVaV의 복제를 입증한다. CYVaV의 감염성 클론이 생성되었다. 야생형 RNA 전사물 (CYVaV) 또는 RdRp (CYVaV-fsm)의 합성을 제거하여, 복제하지 않는. 재암호화 슬리퍼리 부위의 돌연변이를 함유하는 전사물이 애기장대 원형질체로 접종되었다. RNA가 추출되고 30시간 후에 노던 블롯이 수행되었다. CYVaV-fsm의 접종된 전사물은 30시간에 여전히 원형질체에 존재하였다 (반면에 전통적인 바이러스에서는 그것들은 4시간 이후 검출 불가능할 것이다). 플러스 가닥이 패널 A에 나타나고, 마이너스 가닥 복제 중간물이 패널 B에 나타난다.
도 15는 니코티아나 벤타미아나에서 CYVaV의 복제를 입증한다. 패널 A에 관하여, 노던 블롯에 의해 결정된 니코티아나 벤타미아나의 침윤된 잎에서 축적되는 CYVaV의 수준이 나타나있다. 패널 B에 관하여, CYVaV로 침윤된 식물은 전신 증상을 산발적으로 나타냈다 (도 16 참조). 이들 식물에서 높은 수준의 CYVaV가 축적되었다. 패널 C에 관하여, 전신 감염된 식물의 개개의 잎에서 CYVaV의 수준이 나타나있다. 잎 4 및 5는 CYVaV로 아그로침윤되었다. 가장 어린 잎에서 CYVaV의 상당한 축적을 주목해야 한다.
도 16은 CYVaV로 전신 감염된 니코티아나 벤타미아나의 증상을 나타낸다. 잎 4 및 5는 CYVaV로 아그로침윤되었다. 전신 감염된 식물의 첫 번째 징후는 "컵 모양의(cupped)" 잎이며 (패널 A), 이것은 거의 항상 잎 9였다. 다음 몇 주에서, 잎 혹(leaf gall)이 식물의 정단 분열 조직(apical meristem) 및 각각의 절에서 나타났다 (패널 B). 동일한 연령의 감염되지 않은 식물 (패널 C, 왼쪽) 및 감염된 식물 (패널 C, 오른쪽)이 나타나있다. 전신 감염된 식물은 또한 뿌리 혹(root gall)을 가지며 (패널 D), 노던 식물 블롯에 의해 증명된 바와 같이 CYVaV의 상당한 양을 함유한다 (패널 E).
도 17은 동일한 연령의 식물 (오른쪽)과 함께 감염 후 53일에 토마토 식물의 이미지이고 (왼쪽) CYVaV의 예외적인 숙주 범위를 입증한다. 전신 감염된 니코티아나 벤타미아나 식물의 Sap는 토마토 식물의 잎 꼭지로 주사되었다. 4개의 식물 중 하나는 매우 강력한 증상을 나타냈으며 PCR 분석에 의해 CYVaV에 대해 양성이었다.
도 18은 CYVaV가 오이의 체관부로부터 추출된 고도로 풍부한 단백질에 결합한다는 것을 입증한다. 패널 A에 관하여, 라벨링된 전장 CYVaV는 이 노스웨스턴 블롯(northwestern blot)에서 중요한 단백질에 결합하였다. 단백질은 SDS 겔 전기영동 후 재생되었다. 이 단백질은 오이의 체관부의 RNA를 체 요소로 보호하는 것으로 알려져 있는 RRM 모티프(motif)를 함유하는 공지된 고도로 보존된 RNA 결합 단백질일 것으로 생각된다. 패널 B에 관하여, 단백질이 전기영동 이후 변성된 채로 유지될 때 결합을 볼 수 없었다.
도 19는 CYVaV가 TEV IRES를 사용하여 3'UTR로부터 추가의 단백질을 발현할 수 있다는 것을 입증한다. 담배 식각 바이러스 (Tobacco etch virus: TEV) 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosome entry site: IRES)의 다운스트림에서 나노루시퍼라제의 3개의 별개의 삽입물의 위치 (3개의 별개의 작제물 내)가 나타나있다 (패널 A). 3개의 작제물에 대한 시험관 내 번역이 밀 배아 추출액에서 측정되었다 (패널 B). 나노루시퍼라제 단백질 (Nluc)의 위치는 겔의 하부 근처에 있다. 나노루시퍼라제의 발현은 생체 내에서 원형질체에서 측정되었다 (패널 C). 작제물의 전장 RNA 전사물 (패널 A)은 원형질체로 형질전환되었고; 18시간 후, 전체 단백질이 추출되고 나노루시퍼라제 활성은 광도계로 측정되었다.
도 20은 위치 2250에서의 안정한 헤어핀 삽이물을 나타낸다. CY2250sfPDS60의 개략도가 패널 A에 나타나있다. CYVaV의 2차 구조에서 삽입물의 위치는 패널 B에 나타나있으며, 이 위치는 도 9의 이중선 상자에 의해 나타난 바와 같이 삽입된 헤어핀을 수용하기 위한 영역에 상응한다. 위치 2250에서 상이한 양의 서열을 함유하는 CYVaV-wt, 및 CYVaV VIGS 벡터의 T7 전사물의 밀 배아 추출액 시험관 내 번역 검정의 데이터는 패널 C에 나타나있다. 예를 들어, 작제물 sfPDS60은 식물에서 훌륭한 전신 이동을 입증하였다. CYVaV wt 및 CYVaV VIGS 벡터에 의해 감염된 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana) 원형질체로부터 단리된 전체 RNA의 노던 블롯 분석. CYVaV-GDD 음성 대조군은 패널 D에 나타나있다. (+)는 플러스 가닥을 나타내고 (-)는 마이너스 가닥 복제 중간물이다. CY2250sfPDS60에 의해 감염된 니코티아나 벤타미아나의 이미지는 패널 E에 나타나있다. 국소 잎 및 전체 잎으로부터의 RT-PCR 생성물은 패널 F에 나타나있다. 프라이머 세트는 CYVaV의 3' 영역에서 위치 1963-2654를 증폭시킨다. 전체 잎으로부터 수거된 벡터의 삽입 영역 (밑줄)의 서열은 패널 G에 나타나있으며, 헤어핀의 줄기를 형성하는 삽입물의 측면에서 파선 상자 형태의 서열을 갖는다.
도 21은 위치 2301에서 안정한 헤어핀 삽입물을 나타낸다. CY2301sfPDS60의 개략도는 패널 A에 나타나있다. CYVaV의 2차 구조에서 삽입물의 위치는 패널 B에 나타나있고, 도 9의 이중선 상자에 의해 나타난 바와 같이, 삽입된 헤어핀을 수용하기 위한 영역에 상응한다. 위치 2301 및 2319에서 상이한 양의 서열을 함유하는 CYVaV-wt, 및 CYVaV VIGS 벡터로부터의 T7 전사물의 밀 배아 추출액 시험관 내 번역 검정의 데이터는 패널 C에 나타나있다. 예를 들어, 작제물 PDS60은 식물에서 훌륭한 전신 이동을 입증하였다. CYVaV wt 및 CYVaV VIGS 벡터에 의해 감염된 아라비돕시스 탈리아나 원형질체로부터 단리된 전체 RNA의 노던 블롯 분석. CYVaV-GDD 및 음성 대조군은 패널 D에 나타나있다. (+)는 플러스 가닥을 나타내고 (-)는 마이너스 가닥 복제 중간물이다. CY2301sfPDS60에 의해 감염된 니코티아나 벤타미아나의 이미지는 패널 E에 나타나있다. 국소 잎 및 전체 잎으로부터의 RT-PCR 생성물은 패널 F에 나타나있다. 프라이머 세트는 CYVaV의 3' 영역에서 위치 1963-2654를 증폭시킨다. 전체 잎으로부터 수거된 바이러스 벡터의 삽입 영역의 서열은 패널 G에 나타나있으며, 헤어핀의 줄기를 형성하는 파선 상자 형태의 서열을 갖는다.
도 22는 위치 2319에서 안정한 헤어핀 삽입물을 나타낸다. CY2319sfPDS60의 개략도는 패널 A에 나타나있다. CYVaV의 2차 구조에서 삽입물의 위치는 패널 B에 나타나있고, 도 9에서 이중선 상자로 표시된 삽입된 헤어핀을 수용하기 위한 영역에 상응한다. 위치 2301 및 2319에서 상이한 양의 서열을 함유하는 CYVaV-wt, 및 CYVaV VIGS 벡터로부터의 T7 전사물의 밀 배아 추출액 시험관 내 번역 검정의 데이터는 도 21, 패널 C에 나타나있다. CYVaV wt 및 CYVaV VIGS 벡터에 의해 감염된 아라비돕시스 탈리아나 원형질체로부터 단리된 전체 꿈의 노던 블롯 분석. CYVaV-GDD 및 음성 대조군은 또한 도 21, 패널 D에 나타나있다. CY2319sfPDS60에 의해 감염된 니코티아나 벤타미아나의 이미지는 패널 C에 나타나있다. 국소 잎 및 전체 잎으로부터의 RT-PCR 생성물은 패널 D에 나타나있다. 프라이머 세트는 CYVaV의 3' 영역에서 위치 1963-2654를 증폭시킨다.
도 23은 CYVaV의 RdRp의 ORF로의 60 nt 삽입물 (비-헤어핀)의 위치를 나타낸다 (패널 A). 삽입물의 위치는 검은색 화살표로 표시된다. 검은색 육각형으로 표시된 종결 코돈은 RdRp를 절단하기 위해 삽입물의 바로 업스트림에서 조작되었다. 애기장대 원형질체에서 플러스 가닥 RNA 수준의 노던 블롯은 패널 B에 나타나있다. CYVaV-GDD는 비-복제 대조군이다.
도 24는 삽입물의 염기를 안정화시키기 위한 잠금 및 도크 서열을 나타낸다. 패널 A에 관하여, 도킹 서열(docking sequence)과 도킹하는 테트라루프(tetraloop) GNRA (GAAA)는 매우 안정한 구조를 생성하고, 기본적인 잠금 및 도크 서열을 나타낸다. 패널 B에 관하여, 결정학 스캐폴드로서 도킹된 테트라루프로 이루어진 스캐폴드의 사용이 나타나있다. 패널 C에 관하여, 독특한 잠금 및 도크 구조가 나타나있다. 삽입물 (헤어핀 또는 비-헤어핀 서열)은 제한 부위 (파선 상자에 의해 확인됨)에 추가될 수 있다. 서열 내 원형 염기는 GAAA 테트라루프에 대한 도킹 서열이다.
도 25는 국소적인 3'UTR 구조를 안정화시키는 것이 고도로 유해하지만, 근처에 탈안정화 삽입물의 삽입은 생존력을 회복시킨다는 것을 나타낸다. 패널 A에 관하여, CYVaV-wt의 개략도. CYVaV-wt 3'stb는 G:U 쌍을 G:C 쌍으로 전환시키는 6 nt 변화를 함유하는 모체 안정화된 작제물이다. 60개의 뉴클레오타이드의 2개의 삽입물은 위치 2319 및 2330에서 안정화된 모체 작제물에 추가되어 CY2319PDS60_3'stb 및 CY2330PDS60_3'stb를 형성한다. 구조를 안정화시키고 CYVaV-wt 3'stb를 생성하도록 이루어진 뉴클레오타이드 변화는 패널 B에서 원형이다. 삽입 부위는 각각의 작제물에 대해 화살표로 표시된다: 작제물 CY2319PDS60_3'stb에 대한 삽입 부위를 나타내는 패널 A의 왼쪽 화살표; 작제물 CY2330PDS60_3'stb에 대한 삽입 부위를 나타내는 패널 A의 오른쪽 화살표. 패널 C에 관하여, 패널 A에서 나타난 작제물로부터의 T7 전사물의 밀 배아 추출액 시험관 내 번역 검정으로부터의 데이터가 나타나있다. p81 수준 (프레임 이동 생성물)은 이 영역을 안정화시킴으로써 강력하게 영향을 받는다. 패널 D에 관하여, CYVaV-wt, CYVaV-wt 3'stb, CY2319PDS60_3'stb, CY2330PDS60_3'stb, 및 CYVaV-GDD (비-복제 대조군)에 의해 영향을 받은 아라비돕시스 탈리아나 원형질체로부터 단리된 전체 RNA의 전체 RNA의 노던 블롯 분석이 나타나있다. (+)는 플러스 가닥을 나타내고 (-)는 마이너스 가닥 복제 중간물이다.

본 개시물은 식물에 대한 벡터로서 사용하기 위한 신규한 감염원, 개시된 작용물(들)에 의해 감염된 식물을 포함하는 조성물, 및 그것들과 관련된 용도 및 방법에 관한 것이다. 본 개시물의 감염원은 본원에서 때때로 "독립적으로 이동성인 RNA" 또는 "iRNA"라고 불리고 통상적인 바이러스 벡터와 비교하여 우수한 특징을 나타낸다. 개시된 구체예에 따르면, iRNA는 자체의 복제를 지속하기 위해 식물을 감염시키고 RNA 폴리머라제를 암호화하지만, 임의의 이동 단백질 또는 코팅 단백질을 암호화할 수 없는 RNA 분자이다. 이에 더하여, iRNA는 임의의 RNA 침묵 억제자를 암호화하지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, "숙주"는 핵산에 의해 감염될 수 있고 핵산을 복제할 수 있는 세포, 조직 또는 유기체를 나타낸다. 숙주는 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 원형질체, 및 식물 세포를 포함할 수 있다. 식물 기관은 식물의 뚜렷하고 눈에 띄게 분화된 부분, 예컨대 뿌리, 줄기, 잎, 시드(seed), 접목 또는 자손(scion)을 나타낸다. 식물 조직은 전체적으로 또는 부분적으로 식물의 임의의 조직을 나타낸다. 원형질체는 세포 벽 없이 단리된 세포를 나타내며, 세포 배양물, 조직 또는 전체 식물로의 재생을 위한 능력을 갖는다. 식물 세포는 원형질체와 세포벽으로 이루어진, 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 나타낸다.

본원에서 사용된 바와 같이, "핵산 서열," "폴리뉴클레오타이드," "뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 서로 교체 가능하게 사용되고 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 임의의 기능을 수행할 수 있다. "유전자"는 특정 폴리펩타이드 서열을 암호화할 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 나타낸다.

특정 분자"로부터 유래된" 벡터는 벡터가 이러한 분자의 유전적 요소 또는 서열 부분을 함유한다는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 벡터는 이러한 분자 (예를 들어, iRNA)의 레플리카제 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함한다. 하나 이상의 이종성 분절(들)은 추가적인 서열로서 본 개시물의 벡터에 추가될 수 있다. 일부 실행에서, 상기 이종성 분절(들)이 추가되어 높은 수준의 발현 (예를 들어, 특정 단백질 또는 작은 RNA의)이 달성된다. 결과로 생성된 벡터는 주형으로서 RNA 벡터를 사용한 RNA-의존적 RNA 폴리머화에 의해 추가의 RNA 벡터 분자를 형성함으로써 식물 세포에서 복제 가능하다. iRNA 벡터는 그것이 유래되는 RNA 분자 (예를 들어, CYVaV)로부터 구성될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "감염" 또는 "감염시킬 수 있는"은 벡터가 핵산을 숙주로 수송하거나 도입시켜, 핵산 또는 그 일부(들)가 복제되고 및/또는 단백질 또는 다른 작용물들이 합성되거나 전달되는 능력을 포함한다. 감염은 또한 선택된 핵산 서열이 표적 숙주의 게놈으로 통합되는 능력을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "표현형 특성"은 유전자 또는 유전자들의 발현 또는 억제로부터 기인하는 관찰 가능한, 측정 가능한 또는 검출 가능한 특징 또는 성질을 나타낸다. 표현형은 관찰 가능한 특성, 뿐만 아니라 생화학적 과정을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "내인성"은 숙주에 의해 발현되는 폴리펩타이드, 핵산 또는 유전자를 나타낸다. "이종성"은 숙주에 의해 자연적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드, 핵산 또는 유전자를 나타낸다. "기능적 이종성 ORF"는 각각의 변형되지 않은 또는 고유한 분자에 존재하지 않고 펩타이드, 단백질 또는 작은 RNA와 같은 특정 작용물을 수득하도록 발현될 수 있는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 나타낸다. 식물, 식물 조직 또는 식물 세포에서 벡터로부터 발현 가능한 것에 대하여, 기능적 이종성 ORF를 포함하는 벡터는 하나 이상의 하위 게놈 프로모터 또는 발현에 필요한 다른 서열(들)을 포함한다.

특정 생성물의 발현을 결정하기 위한 다양한 검정이 해당 분야에 공지되어 있으며, 혼성체화 검정 (예를 들어, 노던 블롯 분석), 증폭 절차 (예를 들어, RT-PCR), 및 배열-기반 기술을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 발현은 또한 단백질 생성물을 검사하기 위해 해당 분야에 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있으며, 방사성 면역 검정, ELISA (효소 결합 면역 방사 검정), 샌드위치(sandwich) 면역 검정, 면역 방사 검정, 제자리(in situ) 면역 검정, 웨스턴 블롯 분석, 면역 침강 검정, 면역 발광 검정, GC-Mass Spec, 및 SDS-PAGE를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

"외인성 RNA 분절"은 고유한 분자로 삽입된 RNA의 분절을 나타내며, 외인성 RNA 분절의 공급원은 고유한 분자와 상이하다. 공급원은 또 다른 바이러스, 살아있는 유기체, 예컨대 식물, 동물, 박테리아, 바이러스 또는 균류, 화학적으로 합성된 물질, 또는 이것들의 조합일 수 있다. 외인성 RNA 분절은 특정 용도에 적절한 임의의 기능을 제공할 수 있으며, 비-암호화 기능 RNA, RNA가, 숙주 세포에 의해 번역되어, 유용한 또는 원하는 성질을 가진 펩타이드 (예를 들어, 약 2 내지 50개의 아미노산을 포함하는 분자) 또는 단백질 (예를 들어, 50개 이상의 아미노산을 포함하는 분자)의 합성을 초래하는 서열을 암호화하는 전령 RNA의 역할을 하는 암호화 기능을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이동 단백질"은 세포에서 세포로 및/또는 장거리 이동에 필요한 단백질(들)을 나타낸다. "코팅 단백질"은 바이러스 코팅을 포함하거나 그것을 구성하는 단백질(들)을 나타낸다.

움브라바이러스와 유사하게, iRNA는 기능적 코팅 단백질(들) ORF를 소유하지 않고 및/또는 그렇지 않으면 임의의 코팅 단백질을 암호화한다. 이에 더하여, iRNA의 RNA 폴리머라제는 움브라바이러스의 것과 유사하다. 하지만, 움브라바이러스와는 달리, iRNA는 기능적 이동 단백질(들) ORF를 소유하지 않고 및/또는 그렇지 않으면 넌센스(nonsense) 매개된 감쇠에 대항하기 위한 안정화 단백질의 역할을 하는, 임의의 세포에서 세포로의 이동 단백질(들) 또는 임의의 장거리 이동 단백질(들)을 암호화한다.

코팅 단백질이 없는 통상적인 바이러스는 일반적으로 그것들의 게놈이 숙주 RNA 침묵 방어 시스템에 취약하다는 것을 고려하면 식물 세포 내에서 덜 안정하다. 하지만, iRNA는 놀랍게도 세포내 환경에서 안정하며, 이것은 효과적인 벡터에 대한 중요한 특징이다. iRNA는 또한 특정 헬퍼 바이러스의 부재 하에서 접종된 숙주 식물로 제한되는데, 그것들은 관련된 비리온 없이 곤충 벡터에 의해 전염 가능하지 않기 때문이다. iRNA는 특정 헬퍼 바이러스, 예를 들어, 감귤류 잎맥 돌기 바이러스 (CVEV)를 포함하는, 미국에서 드물게 볼 수 있는 바이러스인 에나모바이러스(enamovirus)의 존재 하에서만 비리온으로 캡시드화된다고 생각된다.

개시된 구체예에서, 복제 요소(들) 및 이종성 분절(들)을 포함하는 재조합 플러스-센스 단일 가닥 RNA 벡터가 제공된다. 본 개시물의 RNA 벡터는 체관부에서 높은 수준으로 축적될 수 있고, 단백질, 펩타이드, 항균제 및/또는 살충제 (예를 들어, siRNA)와 같은 치료제(들)을 식물 조직에 직접적으로 전달할 수 있다. 특정 실행에서, RNA 벡터는 iRNA 분자로부터 유래되며, 이것은 임의의 코팅 단백질(들) 또는 이동 단백질(들)을 암호화하는 능력이 없다. 예를 들어, 벡터는 감귤류의 황색 잎맥 질병과 관련된 분류되지 않은 분자인, 감귤류 황색 정맥 관련 바이러스 (CYVaV)로 알려져 있는 iRNA 분자로부터 유래되고 및/또는 그것의 구조적 요소를 포함한다.

따라서, 개시된 구체예는 iRNA 분자, 예를 들어, CYVaV의 유전적 구성요소를 사용하여 플러스-센스 단일 가닥 RNA 분자를 기반으로 하거나 그것으로부터 유래된 iRNA-기반 벡터를 제공한다. 이에 더하여, 본 개시물은 iRNA-기반 (예를 들어, CYVaV-기반) 벡터(들)를 포함하는 키트 및/또는 혼합물에 관한 것이다. 이러한 혼합물은 고체 형태, 예컨대 건조되거나 동결건조된 고체로 되어있거나, 또는 액체, 예를 들어, 수용액, 현탁액 또는 분산액, 또는 겔로 되어있을 수 있다. 이러한 혼합물은 식물, 식물 조직 또는 식물 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 이러한 키트 및 혼합물은 본 개시물의 iRNA-기반 벡터로 식물(들) 또는 식물 세포(들)를 성공적으로 감염시키고 및/또는 이종성 단백질을 발현시키거나 또는 이러한 식물 또는 식물 세포(들)에 다른 치료제를 전달하는데 사용될 수 있다.

본 개시물은 또한 본원에서 개시된 상기 iRNA-기반 벡터를 포함하는 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포, 및/또는 상기 벡터에 의해 암호화되거나 전달되는 치료제 또는 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에 관한 것이다. 본 개시물은 또한 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포로부터 이러한 이종성 폴리펩타이드를 단리시키는 방법을 제공한다. 식물, 식물 조직 또는 식물 세포로부터 단백질을 단리시키기 위한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

CYVaV는 임의의 헬퍼 바이러스에 독립적으로 1950년대에 4그루의 라임콰트(limequat) 나무에서 발견되었다 (Weathers, L. (1957), A vein-yellowing disease of citrus caused by a 접목-전염 가능한 virus, Plant Disease Reporter 41:741-742; Weathers, L.G. (1960), Yellow-vein disease of citrus and studies of interactions between yellow-vein and other viruses of citrus, Virology 11:753-764; Weathers, L.G. (1963), Use of synergy in identification of strain of Citrus yellow vein virus, Nature 200:812-813). CYVaV의 추가의 분석 및 시퀀싱이 수년 후에 게오르기오스 비달라키스(Georgios Vidalakis) (University of California, Davis, CA; GenBank: JX101610)에 의해 실행되었다. 비달라키스 박사의 연구실에서 앞서 확립된 나무 공급원으로부터 수거된 샘플에 대한 분석이 실행되었고 (Weathers, L.G. (1963), Use of synergy in identification of strain of Citrus yellow vein virus, Nature 200:812-813) 감귤류 클론 보호 프로그램 (Citrus Clonal Protection Program: CCPP)의 질병 은행에서 유지되었다. CYVaV를 특성화하기 위한 비달라키스 연구실의 연구는 결정적이지 못 했다. 하지만, CYVaV를 함유하는 감염된 샘플 중 다수가 또한 에나모바이러스 감귤류 잎맥 돌기 바이러스 (CVEV)를 함유하였고; 증상 향상을 위해 CCPP 직원이 식물을 황색 잎맥 및 잎맥 돌기로 혼합 감염시키는 것은 1950년대에서 1980년에는 비교적 일반적이었다.

CYVaV는 RNA의 단일 양성 센스 가닥으로 구성된 작은 (~2.7 kb) iRNA 분자이다. 그것은 매우 높은 수준으로 복제되고, 매우 안정하고, 체관부에 제한되고, 자연 확산 메커니즘이 알려져 있지 않다. 이와 같이, CYVaV는 질병 및/또는 병충해 관리를 위한, 예를 들어, 작은 RNA (예를 들어, 길이가 약 50 내지 약 250 nt의 비-암호화 RNA 분자) 및/또는 단백질과 같이, 식물 숙주로 작용물(들)을 도입하기 위한 벡터 플랫폼으로서 이상적이다.

방어를 강화하는 (또는 침묵시키는) 단백질, 박테리아를 표적화하는 항균 펩타이드, 및/또는 식물 유전자 발현을 표적화하는 작은 RNA 또는 질병원(disease agent)의 곤충 벡터의 생산은 효과적인 관리 계획을 제공한다. 효과적이기 위해서, 단백질 및 작은 RNA, 특히 표적화된 곤충 또는 균류 병원체에 의해 흡수되도록 디자인된 작은 RNA가 충분한 양으로 생산되고 체관부에 충분한 수준으로 축적되어야 한다.

CYVaV는 접목에 의해서만 나무에서 나무로 전염 가능하지만, 영양가가 풍부한 오렌지를 제외하고 감귤류의 거의 모든 품종을 감염시키는 것으로 나타났으며, 제한되는 것은 아니지만, 시트론, 러프 레몬(rough lemon), 캘러먼딘(calamondin), 당귤(sweet orange), 광귤(sour orange), 자몽, 랑푸르 라임 및 웨스트 인디언 라임,(Rangpur and West Indian lime), 레몬, 각종 만다린, 각종 탄젤로(tangelo), 및 금귤(kumquat)을 감염시키는 것을 포함한다. 그것은 지표 시트론 나무에서 잎맥의 황화를 생산하고 당귤 및 다른 감귤류에서 황화 잎맥 증상을 나타내지 않거나 매우 가벼운 황화 잎맥 증상을 나타내며 과실 품질에 대하여 보고된 영향이 없거나, 또는 그렇지 않으면 나무에 해를 끼치지 않는다.

CYVaV의 폴리뉴클레오타이드 서열 (염기 1 내지 2692)이 하기 제공된다 (서열 번호: 1):

톰버스비리대 바이러스를 포함한 다른 바이러스와의 CYVaV의 관련성은 도 2에 나타나있다. CYVaV 및 유사한 RNA 분자의 게놈 조직은 도 3, 패널 A에 나타나있으며, PEMV2, PMeV2-ES (GenBank: KT921785), PUV (GenBank: KP165407.1), 및 TBTVa (GenBank: EF529625.1)를 포함한다. CYVaV의 RdRp는 움브라바이러스 완두콩 돌기 모자이크 바이러스 RNA2 (Pea enation mosaic virus RNA2: PEMV2)와 가장 밀접하게 관련이 있다. CYVaV의 5' 및 3' 서열의 검사는 움브라바이러스와 상당한 유사성을 나타냈으며, CYVaV가 실제로 완벽한 감염원임을 확인하였다. CYVaV는 복제에 수반된 2개의 단백질만을 암호화하는 플러스-센스 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는다: p21, 관련된 분자에서 레플리카제-회합 단백질; 및 p81, 리보솜 재암호화 (프레임 이동) 이벤트에 의해 합성되는 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRp) (도 3, 패널 A). 시험관 내에서 프레임 이동에 의해 합성된 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRp)의 수준은 PEMV2 및 CYVaV에 대해 나타나있다. CYVaV의 p81과 비교하여 PEMV2의 p94 (RdRp)의 수준은 차이가 크다 (도 3, 패널 C). CYVaV의 프레임 이동 부위는 바이러스학에서 공지된 가장 강력한 것들 중 하나이고 예외적으로 높은 축적의 원인인 것으로 생각된다.

CYVaV의 3' 단부의 폴리뉴클레오타이드 서열 (염기 2468 내지 2692)이 하기 제공된다 (서열 번호: 2):

CYVaV의 3' 캡 독립적 번역 인핸서 (3' CITE)의 폴리뉴클레오타이드 서열 (염기 2468 내지 2551)이 하기 제공된다 (서열 번호: 3):

CYVaV의 3' 단부 (및 3' CITE)는 다음 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들) (상기에서 볼드체 및 밑줄)을 포함한다:

auagcacug (서열 번호: 4); 및/또는

gauuuguga (서열 번호: 5).

단백질 p21을 암호화하는 CYVaV의 폴리뉴클레오타이드 서열 (염기 9 내지 578)이 하기 제공된다 (서열 번호: 6):

단백질 p21의 아미노산 서열이 하기 제공된다 (서열 번호:7):

단백질 p81을 암호화하는 CYVaV의 폴리뉴클레오타이드 서열 (염기 752 내지 2158)이 하기 제공된다 (서열 번호: 8):

단백질 p81의 아미노산 서열이 하기 제공된다 (서열 번호:9):

CYVaV의 복제 요소 (예를 들어, 단백질 p81을 암호화함)는 다음 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다 (상기 강조 및 밑줄):

cguuc (서열 번호: 10);

gaacg (서열 번호: 11);

gguuca (서열 번호: 12);

ggag (서열 번호: 13); 및/또는

aaauggga (서열 번호: 14).

이에 더하여, CYVaV는 다음 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들) (상기 강조 및 밑줄)을 추가적으로 포함할 수 있다:

ucgacg (서열 번호: 15); 및/또는

cuccga (서열 번호: 16).

CYVaV의 재암호화 프레임 이동 부위의 폴리뉴클레오타이드 서열 (또한 도 10 참조)이 하기 제공된다:

ucgcucaggucgcggcgaccuugugguuaacuaggaccuugcaugacaaggccuuggcucgccaccaggguuuucgcgauuugcagugauuggggucgacgggcuagaggcaaaagcagugccucuagcuucuggacuccgacugcuuccgguuccgcgacccgga (서열 번호17)

caaagucgacgacugucucagaccu (서열 번호18)

aggucuuggacagucugcgggcuugggaacgacg (서열 번호19)

고도로 유사한 iRNA가 또한 부채선인장 (GenBank: MH579715), 무화과 나무, 및 에티오피아 옥수수에서 발견되었으며 (도 4), 본원에서 개시된 RNA 벡터에 대한 비정상적으로 크거나 심지어는 제한되지 않는 숙주 범위를 시사한다.

무화과 나무에서 발견된 유사한 iRNA의 폴리뉴클레오타이드 서열 (때때로 본원에서는 "iRNA 친척 1" 또는 "iRNA r1"이라고 불림)이 하기 제공된다 (서열 번호: 20):

또 다른 무화과 나무에서 확인된 iRNA의 폴리뉴클레오타이드 서열 (때때로 본원에서 "iRNA 친척 2" 또는 "iRNA r2"라고 불림)이 하기 제공된다 (서열 번호: 21):

옥수수에서 확인된 iRNA의 폴리뉴클레오타이드 서열 (때때로 본원에서 "iRNA 친척 3" 또는 "iRNA r3"으로 불림)이 하기 제공된다 (서열 번호: 22):

iRNA 친척 (예를 들어, iRNA r1, iRNA r2, 및 iRNA r3)은 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들) (상기에서 볼드체 및 밑줄)을 포함할 수 있다: auagcacug (서열 번호: 4); 및/또는 gauuuguga (서열 번호: 5). 예를 들어, iRNA 분자는 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들) 둘 다를 포함한다: auagcacug (서열 번호: 4); 및 gauuuguga (서열 번호: 5).

이에 더하여, iRNA 친척 (예를 들어, iRNA r1, iRNA r2, 및 iRNA r3)은 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들) (상기에서 볼드체 및 밑줄)을 포함할 수 있다: cguuc (서열 번호: 10); gaacg (서열 번호: 11); gguuca (서열 번호: 12); ggag (서열 번호: 13); 및/또는 aaauggga (서열 번호: 14). 예를 들어, iRNA 분자는 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들) 전부를 포함한다: cguuc (서열 번호: 10); gaacg (서열 번호: 11); gguuca (서열 번호: 12); ggag (서열 번호: 13); 및 aaauggga (서열 번호: 14).

또한, iRNA 친척 (예를 들어, iRNA r1, iRNA r2, 및 iRNA r3)은 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들) (상기에서 볼드체 및 밑줄)을 포함할 수 있다: ucgacg (서열 번호: 15); 및/또는 cuccga (서열 번호: 16). iRNA 분자는 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들) 둘 다를 포함할 수 있다: ucgacg (서열 번호: 15); 및 cuccga (서열 번호: 16). 일부 구체예에서, iRNA 분자는 CYVaV (또는 iRNA r1, iRNA r2, 또는 iRNA r3)와 밀접하게 관련되어 있고, RdRP의 합성을 위한 재암호화 부위에 대해 70% 초과의 동일성, 예를 들어, CYVaV (또는 iRNA r1, iRNA r2, 또는 iRNA r3)의 RdRP의 75% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 98% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

따라서, 개시된 구체예에 빠르면, RNA 벡터 (예를 들어, iRNA 분자로부터 유래됨)는 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRp)의 합성을 위한 프레임 이동 리보솜 재암호화 부위를 포함한다. 이에 더하여, RNA 벡터는 3개의 시티딜레이트로 종결되는 폴리유클레오타이드 서열을 포함하는 3' 단부를 포함할 수 있다 (…CCC). 끝에서 두 번째(penultimate) 3' 단부 헤어핀은 또한 말단 루프에 3개의 구아닐레이트를 함유할 수 있다 (…GGG…). 또한, 3' CITE는 진핵 번역 개시 인자 4 G (eIF4G) 및/또는 진핵 개시 인자 4F (eIF4F)에 결합하는 연장된 헤어핀 또는 그것의 일부를 포함한다.

특정 구체예에서, RNA 벡터는 보존된 서열 auagcacug (서열 번호: 4) 및 gauuuguga (서열 번호: 5)를 포함하는 3' CITE를 포함한다. RNA 벡터는 또한 다음 폴리뉴클레오타이드 서열 (확인된 iRNA 분자의 보존된 서열) 중 하나 이상을 포함할 수 있다: cguuc (서열 번호: 10) and gaacg (서열 번호: 11); 및/또는 gguuca (서열 번호: 12) 및 ggag (서열 번호: 13); 및/또는 aaauggga (서열 번호: 14). 대안으로, 또는 이에 더하여, RNA 벡터는 다음 폴리뉴클레오타이드 서열 (확인된 iRNA 분자의 보존된 서열) 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다: ucgacg (서열 번호: 15) 및 cuccga (서열 번호: 16).

확인된 iRNA 친척은 모두 3'UTR에서 삽입물 및 미지의 기능의 단백질 (p21.2)을 암호화하는 ORF의 생성을 초래하는 다른 뉴클레오타이드 변화를 갖는다. 임의의 식물 바이러스로부터의 CYVaV와 같은 iRNA의 하나의 차별화된 특성 (도 2)은 iRNA가 임의의 이동 단백질(들)을 암호화하지 않는 것이며, 이것은 움브라바이러스를 포함한 모든 공지된 식물 바이러스의 특성이다. CYVaV와 같은 iRNA는 또한 테스트된 감귤류 및 니코티아나 벤타미아나 (실험실 모델 식물)를 포함한 식물을 통한 전신 이동을 위해 임의의 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않는다.

그에 반해, 모든 움브라바이러스와 같이, PEMV2는 2개의 이동 단백질을 암호화한다: p26 (장거리 이동) 및 p27 (세포에서 세포로의 이동) (도 3, 패널 A). p26은 또한 넌센스 매개된 붕괴로부터 게놈을 보호하고, 단일 세포 원형질체에서 PEMV2의 검출 가능한 수준으로의 축적에 필요한 안정화 단백질이다 (Gao, F. and Simon, A.E. (2017), Differential use of 3 ' CITEs by the subgenomic RNA of Pea enation mosaic virus 2, Virology 510:194-204). 움브라바이러스는 코팅 단백질 또는 RNA 침묵 억제자를 암호화하지 않는 대신에, 이들 기능에 대해 헬퍼 바이러스에 의존하기 때문에 코팅 단백질 또는 RNA 침묵 억제자를 암호화하지 않기 때문에 비정상적인 바이러스이지만, 대신에 이들 기능에 대해 헬퍼 바이러스에 의존한다. PEMV2에 대해, 헬퍼 바이러스는 에나모바이러스 PEMV1이다.

PEMV2의 폴리뉴클레오타이드 서열이 하기 제공된다 (서열 번호23):

PEMV2의 유전자간(intergenic) 플러스 영역의 폴리뉴클레오타이드 서열 (상기에서 볼드체 및 밑줄)이 하기 제공된다 (서열 번호24):

PEMV2의 재암호화 프레임 이동 부위의 폴리뉴클레오타이드 서열 (염기 881 내지 1019; 또한 도 10 참조)이 하기 제공된다 (서열 번호: 25):

CYVaV는 NMD에 또한 대항할 수 있는 능력으로 인해 PEMV2의 축적에 필요한 p26 (또는 임의의 다른 이동 단백질)을 암호화하지 않음에도 예상외로 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 원형질체에서 배우 효율적으로 복제된다. 실제로, CYVaV는 비정상적으로 안정했으며, 대부분의 전통적인 바이러스보다 훨씬 더 안정했다. CYVaV는 또한 밀 배아 추출액에서 놀랄 만큼 높은 수준의 p81을 생산하였으며, PEMV2의 p94 오쏠로그(orthologue)보다 적어도 50배 초과였다 (도 3, 패널 C). CYVaV가 니코티아나 벤타미아나의 잎으로 아그로침윤될 때, 그것은 침윤된 조직에서 복제되지만 축적은 상대적으로 약했다 (도 3, 패널 B, 상부; 도 5, 레인 6-8). 수동 접종으로는 복제가 달성되지 않았다. 하지만, CYVaV가 에나모바이러스 감귤류 잎맥 돌기 바이러스 (CVEV)와 동시-침윤될 때, 축적이 이들 세포에서 실질적으로 개선되었다 (도 5, 레인 3-5; 또한 도 6 참조). 하지만, CYVaV + CVEV의 황화 증상 (도 7, 패널 B)은 CYVaV 단독에 의해 나타난 증상에 비해 더 강렬했다 (도 7, 패널 A).

CYVaV는 테스트된 감귤류 바이러스의 임의의 다른 조합과 시너지 효과를 나타내지 않았다. 추가적인 연구에서는 CVEV가 나무에서 나무로의 전염을 허용하기 위해 CYVaV에 대한 헬퍼 바이러스로서 이용될 수 있는 것으로 나타났다. CVEV는 원래의 라임콰트 나무에서 CYVaV의 존재의 원인일 가능성이 크지만; CVEV는 매우 열 민감한 것으로 알려져 있으며 따라서 뜨거운 여름 동안 라임콰트 나무로부터 손실될 가능성이 크다.

CYVaV는 산발적으로 위쪽의 접종되지 않은 잎으로 이동하고 매우 높은 수준으로 축적되며, 때때로 겔 상에서 에티듐 염색에 의해 볼 수 있다. 주요 볼트(bolt)의 9번째 잎에서 시작된 증상은 저형성(stunting), 잎 말림, 및 꽃 조직의 변형을 포함하였다. 엽액 줄기의 잎은 또한 같은 시기에 유사한 증상을 나타내기 시작했다. 이 놀라운 결과는 CYVaV가 임의의 암호화된 이동 단백질(들)의 부재 하에 전신으로 이동하며, 이것은 전통적인 식물 바이러스에 의해 가능하지 않다는 것을 입증하였다. 실험은 CYVaV가 니코티아나 벤타미아나에서 전신으로 이동하고 엄밀하게 체관부로 한정되어, 반세포 및 체관부 유세포에서만 복제된다는 것을 나타낸다. 감귤류에서, CYVaV는 100% 접목-전염 가능하지만, 다른 형태로는 전염시키는 것이 어렵다.

증상성 잎 조직 및 뿌리의 형광 발광 제자리 혼성체화 (FISH)는 CYVaV가 체관부 유세포, 반세포 및 체 요소에 국한된다는 것을 확인하였으며 (도 8, 패널 A-G), 이것은 체관부-제한된 바이러스의 특성이다. CYVaV 수준은 증상성 조직의 잎 꼭지에서 매우 높았고 때때로 전체 RNA의 에티듐-염색된 겔에서 볼 수 있다. 증상은 니코티아나 벤타미아나에서 더 심각하지만, CYVaV는 테스트된 모든 감귤류에서 사실상 증상이 없는 것으로 발견되었다. 실제로, 가장 심각한 증상은 감귤류 바이러스에 대한 지표 나무인 시트론에서 발견되었고, 나무 전반에 걸쳐 흩어져있는 잎 상의 매구 작은 금색 반점(flecking)으로 이루어진다.

CYVaV의 체관부-제한된 이동은 그것이 쉽게 접목-전염 가능하지만, 임의의 다른 수단에 의해서는 전염되지 않는 이유를 설명한다. CYVaV는 상기 언급된 바와 같이 임의의 암호화된 이동 단백질(들)이 없다. 대신에, CYVaV는 숙주 식물의 내인성 이동 단백질(들) 및 반세포, 체관부 유세포, 및 체 요소 사이에서 수송을 위한 경로를 이용한다. 이에 더하여, 숙주 범위가 바이러스 이동 단백질과 숙주 원형질 연락사-회합된 단백질 간의 호환성 상호작용을 수반하는 것으로 생각되기 때문에, CYVaV는 이러한 숙주의 내인성 이동 단백질(들)을 사용하여 많은 다른 목본 및 비-목본 숙주 식물의 체관부를 통해 수송될 수 있다고 생각된다. 이와 같이, CYVaV는 RNA 이동을 검사하고 (예를 들어, 니코티아나 벤타미아나 및/또는 감귤류에서) 많은 용도로 벡터로서 사용하기 위한 특출난 모델 시스템을 제공한다. 실험에서는 CYVaV가 숙주 생물에서 전신으로 이동하고 체관부로 제한되고, 쉽게 접목-전염 가능하지만 다른 형태로는 전염되지 않는다는 것이 확인되었다.

감귤류 나무는 품종들 사이에서 무수정 생식(apomixis) 및 생적 부조화(sexual incompatibility)로 인해 복잡한 생식 생물학을 갖는다. 6년을 초과할 수 있는 긴 청소년기와 함께, 전통적인 번식 방법에 의한 유전적 개선은 복잡하고 시간 소모가 크다. 본 개시물은 RNAi 및 CRISPR/Cas9를 사용하여 치료적 삽입물을 포함하도록 조작된 iRNA-기반 (예를 들어, CYVaV-기반) 벡터를 제공함으로써 이러한 문제를 극복한다. CYVaV와 같은 iRNA는 그것들이 폴리머라제를 암호화하지만 숙주 이동 단백질을 사용하여 바이로이드(viroid)와 유사하게 이동하며, 따라서 감귤류 이외의 식물을 통해 수송 가능하다는 점에서 감염원 중에서도 독특하다. 따라서, 감귤류에 더하여, 다른 목본 식물 (예를 들어, 나무 및 콩과 식물), 특히 올리브 나무 및 포도 덩굴에 대한 본 개시물의 iRNA-기반 벡터가 개발될 수 있다.

개시된 구체예에 따르면, CYVaV는 감귤류 묘목 및 니코티아나 벤타미아나로의 작은 RNA 및 단백질의 전달을 위한 벡터의 개발에 이용된다. CYVaV 벡터 개발에 이용된 절차는 작은 RNA를 생산하도록 베타카르모바이러스(betacarmovirus) TCV를 조작하기 위해 본 발명자에 의해 이용된 것과 유사하였다 (Aguado, L.C. et al. (2017), RNase III nucleases from diverse kingdoms serve as antiviral effectors, Nature 547:114-117). RNase III형 엑소뉴클레아제에 의해 절제되도록 디자인된 1, 2, 3개 이상의 작은 RNA 삽입물을 추가하기 위한 예시적이고 유리한 부위가 확인되었다. 작은 리포터 RNA는 표적화된 조직을 흰색으로 변화시키는 피토엔 불포화 효소(desaturase)를 표적화하는 게놈으로부터 직접적으로 발현되었다.

개시된 구체예에 따르면, 본원에서 개시된 벡터는 다음을 포함하는 다양한 기능성을 가진 작은 RNA를 포함할 수 있다: 필수적인 균류 mRNA를 표적화하는 작은 RNA; 사멸 또는 멸균을 위해 곤충 벡터(들)를 표적화하는 작은 RNA; 및 CVEV를 표적화하는 작은 RNA (이 바이러스는 CYVaV와 함께 강화된 황화 잎맥 증상을 유발하기 때문에). 이에 더하여, 개시된 벡터는 해당 분야에 공지된 다른 작은 RNA 및/또는 치료제를 포함할 수 있다. 따라서, 체관부-제한된 iRNA-기반 벡터는 항-균류 및/또는 항-곤충 및/또는 항-바이러스 성질을 가진 작은 RNA를 생산하도록 조작될 수 있으며, 현재의 방법론과 비교하여 우수한 치료 및 관리 계획을 제공한다.

CYVaV 벡터는 당업자에게 널리 공지된 감귤류 접종 절차, 예를 들어, 감귤류 클론 보호 프로그램 (CCPP) 하에 개발되고 일상적으로 사용되는 절차에 따라 체관부를 절단하여 RNA로서 벡터를 침착시킴으로써, 또는 아그로침윤에 의해, 또는 CVEV의 코팅 단백질에서 캡시드화시킨 후 감염된 또는 감염되지 않은 나무에 수동으로 적용될 수 있다. 이러한 절차는 CTV 및 감귤류의 다른 접목-전염 가능한 병원체의 접종에 대해 일상적이다. CYVaV가 캡시드 단백질을 암호화하지 않기 때문에, 비리온이 만들어지지 않으며 따라서 CYVaV의 자연적인 나무 대 나무 전염은 불가능하다. CYVaV가 CVEV 코팅 단백질에서 캡시드화될 때, CVEV의 다른 구성요소가 존재하지 않는다.

상기 언급된 바와 같이, CYVaV는 단지 2개의 ORF를 갖는다: 복제에 필요한 단백질 p21을 암호화하는 5' 근위 ORF; 및 리보솜이 계속해서 번역하여, p81을 생산하도록 p21을 연장시키는 프레임 이동, 리보솜 재암호화 요소, RNA-의존적 RNA 폴리머라제. 이들 2개의 ORF의 조직은 톰버스비리대 및 루테오비리대(Luteoviridae)의 바이러스의 유사한 ORF의 조직과 유사하다. 하지만, 이들 패밀리에서, 실제로는 모든 공지된 식물 RNA 바이러스에서 모든 바이러스가 이동 단백질을 암호화하거나 이동 단백질(들)을 암호화하는 2차 바이러스와 회합된다. 이동 단백질을 암호화하거나, 또는 이동 단백질(들)을 암호화하는 2차 바이러스와 회합하는 능력은 전신 감염을 확립하기 위해 세포에서 세포로의 이동 및 또한 체관부를 통한 수송에 대한 요건으로 오랫동안 간주되었다. 이와 같이, 벡터로서 iRNA의 사용이 제안되지 않았고, 실제로 iRNA 분자는 앞서 임의의 암호화된 이동 단백질의 결여 및 독립적으로 이동성이 아니라는 믿음으로 인해 독립적인 벡터로서 사용하는데 부적합한 것으로 간주되었다.

이와 같이, 따라서 임의의 외인성 이동 단백질(들)을 암호화하지 않거나 의존적이지 않음에도 식물의 체관부 전반에 걸쳐 iRNA의 독립적인 전신 이동에 대한 능력은 매우 놀랍다. 본 개시물의 CYVaV-기반 벡터는 (형광 발광 제자리 혼성체화 및 다른 기술을 통해) 임의의 헬퍼 바이러스의 도움이 없는 전신 이동을 분명하고 반복적으로 입증하였다. 어리고 침윤되지 않은 (전신) 조직은 잎 돌기 및 뿌리 돌기를 포함한 니코티아나 벤타미아나에서 고도로 가시적인 증상을 나타냈다. 개시된 벡터는 이동성을 위해 내인성 숙주 이동 단백질(들)을 이용한다. 이 점에 있어서, 숙주를 체 요소로 이동시키는 것으로 알려져 있는 숙주 체관부 단백질(들) (25 kDa 체관부 단백질 2 (PP2) 및/또는 26 kDa 오이(Cucumis sativus) 체관부 단백질 2-유사) (Balachandran, S. et al. (1997), Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata, PNAS 94(25):14150-14155; Gomez, G. and Pallas, V. (2004), A long-distance translocatable phloem protein from cucumber forms a ribonucleoprotein complex in vivo with Hop stunt viroid RNA, J Virol 78(18):10104-10110 참조)은 노스웨스턴 블롯을 사용하여 CYVaV와 상호작용하는 것으로 나타날 가능성이 크다. 따라서, 공지된 식물 바이러스는 이동 단백질을 암호화하기 때문에 (또는 그것에 의존적이기 때문에), iRNA는 전통적인 식물 바이러스와 구조적으로 및 기능적으로 매우 상이하다.

CYVaV에 더하여, 유사한 크기의 다른 RNA, 및 폴리머라제를 암호화하는 것들이 유사하게 구성된 iRNA-유사 벡터의 개발에 이용될 수 있다 (예를 들어, Chin, L.S. et al. (1993). The beet western yellows virus ST9-associated RNA shares structural and nucleotide sequence homology with Tombusviruses. Virology 192(2):473-482; Passmore, B.K. et al. (1993). Beet western yellows virus-associated RNA: an independently replicating RNA that stimulates virus accumulation. PNAS 90(31):10168-10172 참조). 상기 언급된 바와 같이, 다른 iRNA 친척 (예를 들어, iRNA r1, iRNA r2, 및 iRNA r3, 각각 부채선인장, 무화과 나무, 및 에티오피아 옥수수에서 확인됨) 및 단백질 p21 및 p81을 암호화하는 것들이 (도 4) 벡터 개발에 이용될 수 있다.

CYVaV는 GenBank 데이터베이스 (GenBank: JX101610)에 존재하지만, iRNA는 이동 단백질을 암호화하는 시스트론(cistron)이 결여된다는 점에서 임의의 공지된 바이러스 분류에 속하지 않는다. iRNA는 숙주 내에서 전신 이동을 위해 헬퍼 바이러스에게 의존하지 않는다. 더욱이, iRNA는 코팅 단백질을 암호화하는 시스트론이 결여되어 있다. iRNA는 또한 바이로이드와 유사하지 않지만, 둘 다 암호화된 이동 단백질의 부재 하에 전신 이동이 가능하다. 바이로이드는 암호화 능력이 없지만 숙주 DNA-의존적 RNA 폴리머라제를 사용하여 핵 또는 엽록체에서 복제되는 원형 단일 가닥 RNA이다. 전형적으로 약 300 내지 400개의 뉴클레오타이드 (nt)를 포함하는 대부분의 작은 바이로이드 게놈이 바이로이드의 비정상적인 존재에 필요하다. 이에 더하여, 바이로이드는 임의의 단백질을 암호화하지 않으며, 이는 그것들을 벡터로서 사용하는데 부적합하게 만든다. 그에 반해, iRNA는 자체의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRp)를 암호화한다.

iRNA는 2개의 분류로 범주화될 수 있다: 첫 번째 분류는 3' 단부의 근위에 움브라바이러스와 유사한 RdRP 및 RNA 구조를 생성하기 위한 프레임 이동 요건을 특징으로 한다. 두 번째 분류는 톰부스바이러스(Tombusvirus)와 유사한 RdRp 및 3' RNA 구조를 생성하기 위한 판독 요건을 특징으로 한다. CYVaV는 움브라바이러스와 유사한 성질을 가진 첫 번째 분류의 구성원이며 프레임 이동 재암호화 부위 및 3' 단부에 유사한 구조, 및 5' 단부에 유사한 서열을 포함한다. 두 번째 분류의 iRNA 구성원은 항상 헬퍼 바이러스와 회합된 상태로 발견되었다.

iRNA는 통상적인 바이러스 벡터와 비교하여 많은 이점을 제공한다. 예를 들어, iRNA는 상대적으로 작아서, 구조적으로 및 기능적으로 맵핑(map)하고 유전적으로 조작하는 것이 더 쉽다. 그에 반해, 바이러스, 예컨대 CTV는 8배 더 커서, 벡터로서 사용하는 것을 더 어렵게 만든다. iRNA는 복제되어 예상외로 높은 수준으로 축적될 수 있으며 (예를 들어, 겔 상에서 에티듐 염색에 의해 볼 수 있고 RNAseq에 의해 판독값의 4%), 이것은 충분한 양의 치료제(들)를 표적 식물에 전달하기 위한 벡터의 능력에 중요하다. 이에 더하여, iRNA는 코팅 단백질 또는 침묵 억제자를 암호화하지 않음에도 많은 바이러스보다 훨씬 더 안정적이며 (도 13), 이것은 숙주 식물에서 긴 수명을 허용하며 따라서 연장된 기간에 걸쳐 이점을 제공한다.

iRNA는 또한 숙주의 체관부에 제한되며, 이는 페이로드가 체관부가 가장 필요로 하는 곳으로 표적화될 것이기 때문에 운반체가 체관부로부터 공급되거나, 또는 그 증상이 체관부에 축적되는, 체관부에 있는 병원체를 표적화하는데 특히 유용하다. 이동 단백질 (특정 숙주 단백질과의 그것들의 상호작용이 숙주 범위를 결정하기 위한 주요 인자임)과 독립적으로 이동함으로써, iRNA는 광범위한 숙주 내에서 수송 가능하며, 이로써 단일 벡터 플랫폼의 적용 가능성을 증가시킨다. 코팅 단백질 발현의 부족 및 전신 식물 감염에 대한 헬퍼 바이러스의 불필요성을 고려할 때, iRNA는 식물에서 식물로 벡터화될 수 없고 대신에 접목을 통해 체관부로 직접적으로 도입되어야 한다. 코팅 단백질의 부족은 감염성 입자의 형성을 방지하며 따라서 환경으로의 야생형 감염원으로의 의도치 않은 반전을 방지한다. 이것은 규제 기관이 종종 도입된 생물학적 작용물의 가능한 제어되지 않는 전염에 대해 우려하기 때문에 규제 승인을 간소화하는데 특히 유익하다.

iRNA는 또한 단리물이 고도로 병원성일 수 있는 바이러스 유사 CTV와 달리 숙주에 대해 사실상 양성이다. 이전에 상기 바이러스로 감염되고 및/또는 상기 바이러스에 노출된 나무가 벡터의 역할을 하는 동일한 바이러스에 의해 추가적으로 감염될 수 없는 경우 벡터로서 일반적인 바이러스, 예컨대 CTV를 사용하면 중복 감염 배제의 위험이 있다 (예를 들어, USA의 대부분의 감귤류 나무는 CTV로 감염됨). 따라서, 최소한으로 중복 감염 배제를 방지하는 것은 공정에 추가적인 단계를 필요로 하며, 그것을 더 비싸고 복잡하게 만든다.

본 개시물은 또한 iRNA 벡터로 조작된 신규한 치료적, 예방적, 또는 특성 강화 삽입물을 제공한다. 특정 병원체, 곤충 벡터, 또는 질병(들)의 징후를 표적화하는 삽입물을 포함하는 다양한 삽입물이 제공된다. 대안으로, 또는 이에 더하여, 식물 건강을 강화하거나 개선하고 및/또는 식물의 원하는 특성을 강화시키는 삽입물이 제공된다.

개시된 감염원은 숙주 식물 전반에 걸친 축적 및 전신 이동이 가능하며, 따라서 상당한 기간 동안 숙주 전반에 걸쳐 요법을 전달할 수 있다. 그러므로 개시된 작용물의 특성은 많은 특정 질병을 치료하는데 고도로 유익하다. RNA 또는 DNA로 구성된 감염원을 사용하는 것은 RNA-기반 치료제의 역할을 하기 위해 감염된 세포 내에서 발현되고 및/또는 유전 물질의 특정 서열 또는 분열 가능한 부분을 함유하도록 감염원을 조작함으로써 치료 단백질 또는 펩타이드를 암호화할 수 있는 추가적인 이점을 갖는다.

식물 병원체에 대해 항균 성질을 가진 생성물은 많은 포맷을 취할 수 있고 리보솜 (데펜신 및 작은 박테리오신) 또는 비-리보솜 합성 (펩타이볼, 사이클로펩타이드 및 슈도펩타이드)을 통해 생산된다. 900개가 넘는 양이온성 항균 펩타이드 (CAP), 예컨대 락토페린 또는 데펜신이 가장 잘 알려져 있으며, 이것들은 일반적으로 50개 미만의 아미노산이고 그 항균 성질이 해당 분야에 널리 공지되어 있다. CAP는 일반적으로 세포벽을 표적화하며, 박테리아 및 균류에 대한 효과가 보고된 비-특이적 작용물이다. 데펜신을 발현하도록 디자인된 삽입물로 조작된 CTV는 플로리다에서 USDA에 의한 방출에 대해 승인을 받았지만, 그것의 광범위한 효험은 알려져 있지 않다. 더욱이, 벡터에 사용된 CTV의 단리물은 그것을 일부 지역 (예를 들어, 캘리포니아)에서 성장하는 나무에 부적합하게 만든다.

바이러스 병원체를 표적화하는 RNA 요법이 또한 식물에서 광범위하게 개발 중에 있다. 이들 요법은 비-암호화 작은 간섭 RNA (siRNA)를 사용하며, 이것은 식물의 게놈에서 생산되어, 숙주의 유전적 변형을 포함한다. 감귤류 나무의 유전적 변형에 대한 일부 재배자 및 소비자의 부정적인 관점에 더하여, 유전적으로 변형된 나무를 생성하기 위한 시간의 길이는 수십 년으로 측정되고 궁극적으로는 수십 년에 걸쳐 개발된 품종과 동일한 속성 (질감/색/맛)을 갖지 못 할 수도 있으며, 따라서 개발하는 비용이 매우 비싸고 과실의 품질에 잠재적으로 영향을 미치는 것에 더하여 현재의 시간이 민감한 농업 질병에 대한 해결책이 아니다.

최근에, 현재의 항생체에 대한 대체물로서 동물 및 인간에서의 사용을 위한 고도로 표적화된 항균성 효소가 개발되었다. 이들 효소는 박테리오파지 용해 단백질로부터 조작되고 효소 항생제로 알려져 있다. 모체 박테리오파지 단백질과 같이, 효소 항생제는 접촉시 박테리아 세포벽을 용해시킬 수 있지만, 그람 양성(gram positive) 및 그람 음성(gram negative) 박테리아의 외부에서 사용되도록 디자인된다. 효소 항생제는 단지 표적화된 박테리아를 용해시키도록 조작되어, 미생물 군집(microbiome)의 다른 구성원들은 영향을 받지 않는다. 일부 실행에서, 효소 항생제와 유사한 항균성 단백질로 번역될 수 있는 비-암호화 RNA 삽입물을 포함하는 iRNA 벡터가 제공된다.

일부 실행에서, 문제가 되는 곤충 벡터의 기능성을 방해하는 RNA 삽입물을 포함하는 iRNA 벡터가 제공된다. 곤충은 식물과 유사한 RNA 침묵 시스템을 갖고; 곤충에 의해 섭취된 작은 RNA는 세포로 흡수되고 곤충 내 번역의 분해 또는 차단을 위해 중요한 mRNA를 표적화한다. 일부 구체예에서, 곤충 벡터의 중요한 생식 기능을 침묵하게 하여, 곤충을 멸균시키는 표적화된 삽입물이 제공된다. 체관부-제한된 병원체를 수송하는 체관부-공급 곤충과 특히 관련이 있으며, 체관부-제한된 벡터로의 비-암호화 RNA 삽입물은 곤충에게 공급함으로써 쉽게 흡수된다.

일부 실행에서, 병원체에 반응성인 식물을 표적화하는 비-암호화 RNA 삽입물을 포함하는 iRNA 벡터가 제공된다. 어떤 경우에, 곤충 벡터에 의해 삽입된 박테리아는 나무에 직접적으로 손상을 입히지 않는다. 하지만, 숙주 나무는 박테리아를 단리시키기 위해 체관부에서 과도한 캘러스를 생산하며, 이것은 궁극적으로 광동화의 흐름을 제한하고 나무를 죽일 수 있다. 따라서, RNA 삽입물은 이러한 캘러스 생산을 침묵하게 하고 및/또는 억제한다.

본 개시물의 추가적인 특성 및 특징이 다음 추가적인 예 및 논의를 참조하여 더 이해될 것이며, 이것은 추가의 예시의 방법으로 제공되며 본 개시물을 제한하려는 의도는 아니다.

CYVaV 구조. CYVaV의 전장 구조를 SHAPE 구조 탐침 및 부채선인장, 무화과 및 옥수수의 CYVaV 친척과의 계통 발생 비교에 의해 결정하였다 (도 9). 삽입물을 수용하기 위한 영역과 함께 재암호화 부위 (도 10 참조) 및 ISS-유사 (I형 구조) 3' CITE (도 11 참조)를 확인하였으며, 예를 들어, 상자 형태의 이중선 영역으로 나타났고 삽입물에 대한 예시의 위치에 관하여 더 상세히 논의하였다.

CYVaV의 게놈 조직은 다른 RNA 분자, 특히 PEMV2에 대해 약간의 유사성을 나타낸다 (도 3, 패널 A). 하지만, 움브라바이러스 PEMV2는 또한 이동에 수반된 단백질 p26 및 p27을 암호화하는 ORF를 소유한다. 침윤된 니코티아나 벤타미아나 잎 및 전체 잎에서 CYVaV 플러스 (+) 가닥의 수준은 도 3, 패널 B에 나타나있다. 전장 CYVaV 및 PEMV2의 밀 배아 추출액에서 시험관 내 프레임 이동에 의해 합성된 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRp)의 수준이 또한 나타나있다 (도 3, 패널 C). CYVaV의 의해 생산된 p81 폴리머라제와 비교하여 PEMV2의 p94의 수준의 유의한 차이를 주목해야 한다. CYVaV의 프레임 이동 부위는 바이러스학에서 공지된 가장 강력한 것들 중 하나이고 예외적으로 높은 축적의 원인인 것으로 생각된다.

CYVaV는 CVEV의 비리온에 캡시드화된다. CYVaV 또는 CVEV 또는 CYVaV + CVEV를 니코티아나 벤타미아나의 잎으로 아그로침윤시켰다. CYVaV를 CVEV의 비리온에 캡시드화시키고, 비리온을 1주일 후에 단리시키고 캡시드화된 RNA를 PCR 분석하였다 (도 5 및 6 참조). CYVaV의 축적은 추정 헬퍼 바이러스 CVEV의 존재 하에 실질적으로 증가하였다. rRNA 로딩 대조군이 하기 나타나있다. p14 침묵 억제자를 모든 잎에서 동시-침윤시켰다. 황화 증상은 CYVaV + CVEV를 가진 잎에서 약간 더 심각하였다 (도 7, 패널 B).

CYVaV는 체관부- 제한된다. 형광 발광 제자리 혼성체화 (FISH) 이미지화는 CYVaV의 플러스 가닥을 분명하게 검출하였으며, 이것은 SE, CC 및 PPC에 완전히 제한되었다 (도 8).

CYVaV는 침묵 억제자를 암호화하지 않는다. 니코티아나 벤타미아나 16C 식물을 GFP (이들 식물에서 침묵함)를 발현하는 작제물 및 CYVaV p21 또는 p81을 발현하는 작제물, 또는 공지된 침묵 억제자 p19 (TBSV) 또는 p38 (TCV)을 발현하는 작제물로 아그로침윤시켰다 (도 13, 패널 A). p19 및 p38만이 GFP의 침묵을 억제하여, 녹색 형광 발광을 발현시켰다 (도 13, 패널 B). GFP 올리고뉴클레오타이드로 탐침된 노던 블롯은 GFP RNA가 p21 또는 p81의 존재 하에서 여전히 침묵한다는 것을 나타냈다 (도 13, 패널 C).

애기장대 원형질체에서 CYVaV의 복제. CYVaV의 감염성 클론을 생성하였다. 야생형 RNA 전사물 (CYVaV) 또는 RdRp (CYVaV-fsm)의 합성을 제거하고, 따라서 복제되지 않는 재암호화 슬리퍼리 부위에서 돌연변이를 함유하는 전사물을 애기장대 원형질체에 접종하였다. RNA를 추출하고 30시간 후 노던 블롯을 수행하였다. CYVaV-fsm의 접종된 전사물은 30시간에 여전히 원형질체에 존재한다 (반면에 전통적인 바이러스에서는 4시간 후 검출 불가능할 것이다).

니코티아나 벤타미아나에서 CYVaV의 복제. 니코티아나 벤타미아나의 침윤된 잎에서 축적되는 CYVaV의 수준을 노던 블롯으로 결정하였다 (도 15, 패널 A). CYVaV로 침윤된 식물은 산발적으로 전신 증상을 나타냈다 (도 15, 패널 B; 또한 도 16 참조). 이들 식물은 높은 수준의 CYVaV를 축적하였다. 전신으로 감염된 식물의 개개의 잎에서 CYVaV의 수준을 결정하였다 (도 15, 패널 C). 잎 4 및 5를 CYVaV로 아그로침윤시켰다. 가장 어린 잎에서 CYVaV의 상당한 축적을 주목해야 한다.

CYVaV로 전신으로 감염된 니코티아나 벤타미아나의 증상. 잎 4 및 5를 CYVaV로 아그로침윤시켰다. 전신으로 감염된 식물의 최조 징후는 "컵 모양의" 잎이며 (도 16), 이것은 거의 항상 잎 9였다. 이후 수주 내에, 식물의 정단 분열 조직 및 각각의 마디에서에서 잎 혹이 나타났다. 전신으로 감염된 식물은 또한 노던 식물 블롯에 의해 증명된 바와 같이 상당한 양의 CYVaV를 함유하는 뿌리 혹을 갖는다.

CYVaV는 예외적인 숙주 범위를 입증한다. 전신 감염된 니코티아나 벤타미아나 식물의 Sap를 토마토의 잎 꼭지에 주사하였다 (도 17). 4개의 식물 중 하나에서 매우 강력한 증상이 나타났고 PCR에 의해 CYVaV에 대해 양성이었다. 표시된 식물은 동일한 연령의 식물로의 감염 후 53일차이다.

CYVaV는 오이의 체관부로부터 추출된 고도로 풍부한 단배질에 결합한다. 라벨링된 전장 CYVaV는 노스웨스턴 블롯에 의해 입증된 바와 같이 주요 단백질에 결합한다 (도 18). SDS 겔 전기영동 이후 단백질을 재생시켰다. 이 단백질은 오이의 체관부에서 반세포로부터의 RNA를 체 요소로 보호하는 것으로 알려져 있는 RRM 모티프를 함유하는 공지된 고도로 보존된 RNA 결합 단백질일 것으로 생각된다. 단백질이 전기영동 이후 변성된 채로 유지될 때 결합을 볼 수 없었다.

CYVaV는 TEV IRES를 사용하여 3'UTR로부터 추가의 단백질을 발현할 수 있다. 담배 식각 바이러스 (TEV) 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)의 다운스트림에서 나노루시퍼라제의 이들 별개의 삽입물의 위치를 확인하였다 (도 19). 이들 작제물의 밀 배아 추출액에서 시험관 내 번역을 평가하였다. 나노루시퍼라제 단백질 (Nluc)의 위치는 겔의 하부 근처이다. 생체 내에서 원형질체에서 나노루시퍼라제의 발현을 조사하였다 (도 19, 패널 C). (A)에서 나타난 작제물의 전장 RNA 전사물을 원형질체로 형질전환하였다. 18시간 후, 전체 단백질을 추출하고 나노루시퍼라제 활성을 광도계로 측정하였다.

위치 2250, 2301 및 2319에서 안정한 헤어핀 삽입물에 대한 예시의 위치를 평가하였다. 각각의 삽입물에 대한 위치는 상기 언급된 예시의 영역 내에 있다 (도 9 참조). 위치 2250에서 상이한 양의 서열을 함유하는 CYVaV-wt, 및 CYVaV VIGS 벡터로부터의 T7 전사물의 밀 배아 추출액 시험관 내 번역 검정을 실행하였다 (도 20). 예를 들어, 작제물 sfPDS60은 식물에서 훌륭한 전신 이동을 입증하였다. 위치 2301 및 2319에서 상이한 양의 서열을 함유하는 CYVaV-wt, 및 CYVaV VIGS 벡터로부터의 T7 전사물의 밀 배아 추출액 시험관 내 번역 검정을 실행하였다 (도 21). CYVaV wt 및 CYVaV VIGS 벡터에 의해 감염된 아라비돕시스 탈리아나 원형질체로부터 단리된 전체 RNA의 노던 블롯 분석. CYVaV-GDD 및 음성 대조군을 실행하였다 (도 20, 패널 D). CYVaV wt 및 CYVaV VIGS 벡터에 의해 감염된 아라비돕시스 탈리아나 원형질체로부터 단리된 전체 RNA의 노던 블롯 분석. CYVaV-GDD 및 음성 대조군을 실행하였다 (도 21, 패널 D). 작제물 CY2250sfPDS60, CY2301PDS60, CY2301sfPDS60, CY2319sfPDS60 (각각 위치 2250, 2301, 2319에서의 삽입물을 포함함)은 모두 삽입으로 훌륭한 전신 이동을 입증하였다. 이에 더하여, 작제물 CY2331PDS60 (위치 2331에서의 삽입물을 포함함)은 또한 숙주 전반에 걸쳐 전신으로 이동하는 능력을 입증하였다. 추가의 작제물, CY2083TAAPDS60은 위치 2083에서의 삽입물을 포함하며, 그 위치는 RdRp ORF (삽입된 종결 코돈이 선행됨) 내에 있다.

전체 잎으로부터 수거된 벡터의 삽입 영역 (하기 밑줄 그어져 있고 도 20, 패널 G, 및 도 21, 패널 G에서 나타난 바와 같음)의 서열이 하기 제공된다:

taggcctcgacacgggaaggtagctgtcccggcactgggttgcacatattccgtgccgacgccac (서열 번호: 26)

ccggcctcgacacgggaaggtagctattccgtgccgacgccgt (서열 번호: 27)

iRNA-기반 벡터 플랫폼

한 구체예에서, 감귤류 산업에서 CLas 박테리아 (HLB)에 의해 유발된 질병을 치료하기 위한 iRNA-기반 벡터가 제공된다. CYVaV의 단리물은 박테리아를 나무에 전달하는 박테리아 및 감귤이 곤충 둘 다를 표적화하기 위한 벡터로 이용된다. 상기 논의된 바와 같이, CYVaV는 그것이 복제되고 최고의 식물 바이러스와 비슷한 매우 높은 수준으로 축적되는 체관부로 제한된다. 이에 더하여, 그것의 상대적으로 작은 크기는 그것을 예외적으로 유전자 조작하기 쉽게 만든다. 따라서, CYVaV의 구조 및 생물학의 고려는 체관부 수송을 위한 벡터 및 모델 시스템으로서 이 신규한 감염원의 개발을 돕는다.

CYVaV의 3'UTR의 구조를 SHAPE RNA 구조 맵핑을 기반으로 결정하였다 (도 9). 이에 더하여, 서열 및/또는 구조 및 위치의 생화학적 검정, 뿐만 아니라 계통 발생 보존 (움브라바이러스를 이용함)을 기반으로 많은 복제 및 번역 요소를 확인하였다 (도 19, 패널 A). 캡-독립적 번역 인핸서 (3' CITE)의 역할을 하는 I형 요소를 또한 확인하였다. 일련의 장거리 키싱-루프(kissing loop) 상호작용 (이중 화살표)을 또한 확인하였으며, 이것은 침묵 억제자의 부재 하에 RNA의 안정화 및 축적에 수반되는 것으로 생각된다. 이 구조를 기반으로 하여, 많은 영역이 서열 삽입에 적합한 위치로 확인되었으며, 이것은 주위 구조를 방해해서는 안 된다.

RNA 헤어핀를 수용할 수 있는 3' UTR 및 RdRp ORF에서 잠재적인 삽입을 위한 특정 부위예를 들어, 공급 곤충을 표적화하는 siRNA를 생성하기 위한, 리포터 ORF를 수용하고 아그로-침윤된 니코티아나 벤타미아나에서 조작된 CYVaV의 복제를 허용하는 부위, 및 시험관 내에서 높은 수준의 리포터 단백질 번역을 촉발시키는 부위를 확인하였다. 추가된 ORF 및 siRNA를 포함하는 조작된 CYVaV가 저장 숙주 나무로 도입된 다음, 그 조각을 접목에 의해 분야 나무 (field tree)로의 간단한 도입에 사용할 수 있다. CYVaV의 희귀성을 고려하면 (지금까지, 1950년대에 Weathers에 의해 4그루의 라임콰트 나무에서만 확인됨), 중복 감염 배제의 위험이 거의 없다.

벡터의 복제 또는 번역 성질이 크게 감소되거나 제거되지 않는 다양한 삽입물 위치를 확인하였다. 이러한 성질에 부정적인 영향을 미치는 (아마도 CYVaV 벡터의 RNA 구조 또는 다른 중요한 양태를 방해하기 때문에) 삽입물 위치를 더 추구하지 않았다. CYVaV-기반 벡터 상의 4개의 예시의 삽입물 위치를 위치 2250, 2301, 2319 및 2331에서 확인하였다. 50 nt 헤어핀 삽입물을 시험관 내에서 번역 또는 원형질체에서 복제에 대한 중단 없이 이들 위치에 성공적으로 배치하였고 CYVaV는 니코티아나 벤타미아나에서 전신으로 이동할 수 있었다.

CYVaV는 추가적인 ORF를 갖지 않지만, 약 500 nt의 게놈 (g)RNA 및 하위 게놈 (sg)RNA 둘 다가 플러스 가닥 및 마이너스 가닥에 대한 프로브를 사용하여 검출 가능하다. sgRNA 프로모터를 함유해야 하는 영역의 조사는 움브라바이러스의 고도로 보존된 sgRNA 프로모터 및 카르모바이러스(carmovirus) TCV의 최소한의, 하지만 고도로 기능적인 sgRNA 프로모터에 대해 상당한 유사성을 가진 요소를 나타냈다. 이에 더하여, RdRp만을 발현하고 톰부스바이러스와 관련이 있는 유사한 RNA는 모두 유사한 크기의 하위 게놈 RNA를 생성하고, 펩타이드 및 단백질의 발현을 간소화할 수 있다.

CYVaV의 sgRNA 프로모터의 다운스트림에서 삽입물이 허용되는지를 결정하기 위해서, 이종성 서열을 삽입할 때 이러한 요소가 방지되도록 CYVaV의 3' UTR에 결정적인 요소가 존재하는지의 평가를 실행하였다. 기재된 바와 같이, CYVaV에 대한 3' CITE, 뿐만 아니라 움브라바이러스에서 고도로 보존되고 복제 및 번역에 중요한 것으로 알려져 있는 여러 추가적인 3' 근위 헤어핀을 확인하였다. 결실/점 돌연변이를 사용하여, 추정상 sgRNA 프로모터의 다운스트림 및 CAS의 업스트림의 서열 (~120 nt)을 원형질체에서 축적 또는 니코티아나 벤타미아나에서 전신 이동에 영향을 미치지 않는 영역에 대해 조사하였다. 이전에 본 발명자들에 의해 유사한 계획을 이용하여 RNase III형 효소에 의해 표적화된 헤어핀을 수용할 수 있는 TCV의 3' UTR 내 영역을 확인하였다 (Aguado, L.C. et al. (2017). RNase III nucleases from diverse kingdoms serve as antiviral effectors. Nature 547:114-117).

결실/돌연변이를 수용하기에 적합한 영역 (예를 들어, 중요한 기능에 수반되지 않는 영역)을 확인한 후, 상이한 길이의 이종성 서열을 그 안에 삽입하여 연장된 3' UTR을 가진 CYVaV 기능성을 평가하였다. 이러한 조사는 이러한 삽입이 CYVaV-기반 벡터에 의해 허용되는 한편 강력한 수준으로 축적되고 전신 움직임에 관여한다는 것을 확인하기 위한 최대 삽입물 길이를 결정하는 것을 돕는다. CYVaV-기반 벡터는 최대 2 kb의 크기를 가진 삽입물을 수용할 수 있다고 생각된다. 이 점에 있어서, 가장 밀접하게 관련된 바이러스 (CYVaV와 유사한 파파야 움브라-유사 바이러스는 레플리카제-관련 단백질 및 RdRp만을 암호화한다)는 1 내지 2 kb 더 크고, 추가 서열 길이 모두가 3' UTR을 연장시킨다 (Quito-Avila, D.F. et al. (2015). Detection and partial genome sequence of a new umbra-like virus of papaya discovered in Ecuador. Eur J Plant Pathol 143:199-204). 50 nt (작은 RNA 생산을 위해 삽입된 헤어핀의 크기)에서 시작하여, 약 600 nt (효소 항생제 ORF의 크기)까지, 다양한 크기의 서열 단편을 평가하였다. 초기 작은 RNA 단편은 조직을 흰색으로 변화시키는 피토엔 불포화 효소의 넉 다운(knock down)을 위한 리포터를 포함한다. 더 긴 크기의 단편은 또한 나노 루시퍼라제 및 GFP ORF를 포함하며, 이것들은 또한 발현 수준을 검사하기 위한 리포터로서 사용될 수 있다. 삽입물은 야생형 (WT) sgRNA 프로모터 및 강화된 sgRNA 프로모터를 함유하는 작제물에서 제조된다.

삽입물의 염기를 안정화시키기 위한 잠금 및 도크 서열. 도 24, 패널 A에 관하여, 잠금 및 도크 서열의 염기 구조가 나타나있다. 도킹 서열과 도킹된 테트라루프 GNRA (GAAA)는 매우 안정한 구조를 생성한다. 도 24, 패널 A에서 나타난 서열은 하기 제공된다:

gaaa (서열 번호: 28)

gauauggau (서열 번호: 29)

guccuaaguc (서열 번호: 30)

caggggaaacuuug (서열 번호: 31).

결정학 스캐폴드(로서 도킹된 테트라루프를 포함하는 스캐폴드의 용도가 제공된다 (도 24, 패널 B). 도 24, 패널 B에서 나타난 서열은 하기 제공된다:

cauuagcuaaggaugaaagucuaugcuaaug (서열 번호: 32).

개시된 구체예에 따르는 잠금 및 도크 구조가 도 24, 패널 C에 나타나있다. 삽입물 (헤어핀 또는 비-헤어핀 서열)이 확인된 추가적인 삽입물 위치에서 제한 부위에 추가될 수 있다. 원형 염기가 테트라루프에 대한 도킹 서열이다. 도 24, 패널 C에 나타난 서열은 하기 제공된다:

gcaccuaaggcgucagggucuagacccugcucaggggaaacuuugucgcuauggugc (서열 번호: 33).

국소적인 3'UTR 구조를 안정화시키는 것은 유해하다; 하지만 근처에 탈안정화 삽입물의 삽입은 생존력을 회복시킨다.

도 25, 패널 A에 관하여, CYVaV-wt의 대표도가 나타나있다. CYVaV-wt 3'stb는 G:U 쌍을 G:C 쌍으로 전환시키는 6 nt 변화를 함유하는 모체 안정화된 작제물이다. 60개의 뉴클레오타이드의 2회 삽입을 위치 2319 및 2330에서 안정화된 모체 작제물에 추가하여 CY2319PDS60_3'stb 및 CY2330PDS60_3'stb를 형성하였다. 구조를 안정화시키고 CYVaV-wt 3'stb를 생성하도록 이루어진 뉴클레오타이드 변화는 패널 B에서 원으로 표시된다. 도 25, 패널 B에서 나타난 서열은 하기 제공된다:

ggcuaguuaaucucauucgugggauggacaggcagccugacguugac (서열 번호: 34)

guuaauguaggugucuuuccguaucuaguc (서열 번호: 35) (변형되지 않은 G:U 쌍)

gu c aa c g c aggug c cu g uccguaucuag c c (서열 번호: 36) (전환된 G:C 쌍).

치료 및 관리를 위한 표적

개시된 벡터에 의한 전달을 위한 항균성 삽입물이 제공되며, 이것은 CLas 박테리아를 파괴시키도록 조작된 효소 항생제 또는 작은 펩타이드를 포함한다. 효소 항생제는 식물 체관부에서 발견된 바와 같은 당이 풍부한 실온 환경을 선호한다. 효소 항생제는 조작된 CYVaV 감염 주기 동안 반세포에서 번역된다. 체관부의 세포질에서 생산된 단백질은 자연적으로 CLas 및 다른 식물 병원성 박테리아가 서식하는 체 요소 (번역된 단백질에 대한 기본 경로)로 빠져나가는 것이 가능하다. 체 요소에서, 효소 분자는 광동화와 함께 트렁크(trunk)의 위 아래로 이동하여 접촉시 임의의 박테리아를 용해시킨다. 효소 항생제는 특정 분류의 박테리아로 표적화되기 때문에, 그것들은 오히려 숙주 나무의 미생물 군집을 방해하지 않는다. CLas를 표적화하는 다양한 작용물이 개발되었다 (예를 들어, Hailing Jin, University of California, Riverside, CA). 따라서, CLas 박테리아를 표적화하는 많은 삽입물이 해당 분야에 공지되어 있고 본 개시물의 CYVaV 벡터와 함께 이용될 수 있다.

추가의 구체예로서, 질병 및 질병 감귤이 벡터를 파괴하기 위해 다수의 경로를 표적화하는 것이 유익할 수 있다. 결과로서, 특정 구체예에서, 개시된 벡터는 상기 기재된 효소 항생제 및/또는 펩타이드, 뿐만 아니라 나무 또는 질병을 가지고 있는 감귤이의 유전자 발현을 방해하는 siRNA의 생산을 촉발시키는 삽입물을 포함한다. ACP의 경우에, RNA는 벡터를 사멸시키거나 또는 날개가 없게(wingless) 하여 무해하게 만들 수 있다.

캘러스 신타제의 CYVaV -기반 벡터 표적화 발현.

숙주 나무에서 캘러스 생산 및 증가의 감소를 촉발시키는 RNA 삽입물을 포함하는 벡터가 제공된다. 박테리아에 반응하여 체관부에서 캘러스를 생산하는 충분히 많은 양의 유전자가 식물에 의해 절제된 siRNA 서열의 삽입을 통해 침묵한다.

CYVaV-기반 벡터는 바이러스-유도된 유전자 침묵 (VIGS) 벡터로서 이용되어 체관부에서 캘러스 신타제의 발현을 하향조절하였다. VIG는 식물의 기능 유전체학을 검사하기 위해 성숙한 식무에서 유전자 발현을 하향조절하는데 널리 사용되었다 (Senthil-Kumar et al. (2008). 유전자를 특성화하는데 있어서 바이러스-유도된 유전자 침묵 및 그것의 용도는 수분 부족 스트레스 내성에 관여하였다. J Plant Physiol 165(13):1404-1421. 상보성 서열은 상기 확인된 바와 같이 적합한 위치에서 CYVaV로 삽입된다 (안티센스 또는 RNase III-분열 가능 헤어핀). 유전자의 감귤류 버전이 공지되어 있다 (Enrique et al. (2011). 감귤류에서 RNAi의 신규한 입증은 잔토모나스 시트리 아종 시트리(Xanthomonas citri subsp. citri)에 대한 방어에 있어서 감귤류 캘러스 신타제의 중요성을 나타낸다. Plant Biotech J 9:394-407).

캘러스는 발달과 생물적 및 비생물적 스트레스 동안에 다양한 조직에서 합성될 수 있는 β 1,3-글루칸이다 (Chen, X.Y. and Kim, J.Y. (2009). Callose synthesis in higher plants. Plant Sig Behav 4(6):489-492). 체 요소의 체판에서 캘러스의 침착은 체관부에서 광동화 흐름을 억제하여, 엽록체에서 캘러스의 과도한 축적을 유도하며, 이는 HLB와 같은 박테리아 감염 동안에 나무의 죽음에 기여한다 (Koh, H. et al. (2012). Silent Information Regulator 2 (Sir2) and Forkhead Box O (FOXO) Complement Mitochondrial Dysfunction and Dopaminergic Neuron Loss in Drosophila PTEN-induced Kinase 1 (PINK1) Null Mutant. J Biol Chem 287(16):12750-12758). 모든 식물은 12-14개의 캘러스 신타제 유전자를 함유하며, 이 유전자 패밀리 중 하나의 구성원인 CalS7 (애기장대 명명법)이 손상 및 다양한 병원체에 반응하여 체관부의 체공에서 신속한 캘러스 침착의 주요 원인이 된다 (Xie et al. (2011). CalS7은 체관부에서 캘러스 침작의 원인이 되는 캘러스 신타제를 암호화한다. Plant J 65(1):1-14). GSL7의 완전한 억제는 애기장대에서 정상적인 체관부 수송 및 화서 형성 둘 다에 영향을 미친다 (Barratt et al. (2011). Callose Synthase GSL7 Is Necessary for Normal Phloem Transport and Inflorescence Growth in Arabidopsis. Plant Physiol 155(1):328-341). CYVaV-기반 벡터는 감소된 (하지만 제거된 것은 아닌) 체판 캘러스 침착의 결과를 조사하기 위해 성숙한 식물에서 CalS7의 니코티아나 벤타미아나 및 오렌지 나무 오쏠로그를 하향조절하는데 이용된다. 대안으로, 또는 이에 더하여, 벡터는 캘러스-분해 효소를 발현하는 삽입물을 제공한다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 바이러스 및/또는 균류 병원체를 표적화하는 삽입물이 제공된다. 일부 구체예에서, CYVaV의 황화 영향을 약간 심화시키고 나무들 사이에서 CYVaV의 수송을 가능하게 하는 것으로 알려져 있기 때문에 직접적으로 CVEV를 표적화하는 siRNA를 생성하는 헤어핀 삽입물이 제공된다. 일부 구체예에서, CTV가 감귤류의 고도로 파괴적인 바이러스 병원체 (CLas에 버금감)이기 때문에 CTV를 표적화하는 헤어핀 삽입물이 제공된다. 다른 구체예에서, 또 다른 감귤류 (또는 다른) 바이러스를 표적화하는 삽입물이 제공된다. 일부 구체예에서, 이러한 병원체(들)가 체관부로부터 siRNA를 흡수할 수 있다는 것을 고려하여, 균류 병원체(들)를 표적화하는 삽입물이 제공된다.

일부 구체예에서, CYVaV-기반 (또는 다른 iRNA) 벡터는 반세포에서 유전자 발현으로부터 유래된 식물의 표현형 성질을 변형시키도록 조작된 삽입물(들)을 포함한다. 한 이식에서, 과실이 수확하기 쉽고 성장 공간 요건이 되도록 난쟁이증을 촉발시키는 삽입물이 제공된다. 원하는 경우 추가적인 및/또는 다른 특성이 또한 표적화될 수 있다. 1, 2, 3개 이상의 삽입물을 포함하는 본 개시물의 iRNA 벡터는 안정성 및 기능성을 입증한다.

본 명세서에서 언급된 모든 확인된 간행물 및 참고문헌은 개개의 간행물이 구체적으로 및 개별적으로 그 전문이 참조로 포함되는 것으로 나타나는 바와 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 그것의 예시적인 구체예에 관하여 기재되어 있지만, 추가의 변형이 가능하고 일반적으로 본 발명의 원칙에 따라 본 출원이 본 발명의 임의의 변화, 용도, 또는 순응을 커버하는 것으로 의도되며 본 발명이 존재하는 분야 내에 공지된 또는 관례적인 실시 내에 있고 상기 제시된 특징들에 적용될 수 있는 바와 같이 본 개시물로부터의 이러한 이탈을 포함한다는 것을 이해할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> University of Maryland, College Park The Regents of the University of California Simon, Anne Elizabeth Liu, Jingyuan Vidalakis, Georgios Kwon, Sun-Jung Bodaghi, Sohrab <120> Plant Vectors, Compositions And Uses Relating Thereto <130> 2105.0071PCT <150> US 62/760,098 <151> 2018-11-13 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2692 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <400> 1 ggguaaauau ggauccuuca ucuuugcccc gugccuguug gcaucaugcc agacaggugu 60 uucgagcauc aacuagcuuc ucaagagagg ugguucgcgc ugcucguaga uggguuacca 120 ugcccaccag ucgccaugca uaugacuuuu caacgagucu aggcauugug auugcugagc 180 cugcagcucg uuuacgacgc cgucugcccu cuguacgaaa gugcgcagag aaguuaguag 240 uccacaagca agucgacacu uugguggacg aauggugcuc uggaauuccc aacccugaua 300 ucguagaagu ugguugggca cuccgucuga gggaccguuu cggucuuccu cccgcuucug 360 agccuacccg gcucaguggu gagagauggg ugcucaaaca acucaauggg guagauccug 420 agucauggaa ugcugaucuu gguaggucag uucauaucca aggagacuac gccccaggga 480 ggaaugccca uaucgcucag gucgcggcga ccuugugguu aacuaggacc uugcaugaca 540 aggccuuggc ucgccaccag gguuuucgcg auuugcagug auuggggucg acgggcuaga 600 ggcaaaagca gugccucuag cuucuggacu ccgacugcuu ccgguuccgc gacccggaca 660 aagucgacga cugucucaga ccuuguuacu uccaacaccu cgugcucaau ucgugaauca 720 cgcgugcucg gcuaacaacc uuggacgugu gaugaccaca cguguguugc aguacaaggg 780 ccgagauccg auccuucccu cuucugaagc ccuucaccga cuuaaccuuc ggauagcuga 840 gcuauauagg ucuagaccuu cuaccgucua uccauuaagu uaugaagggu uucucaauug 900 cuaugaaggc cgacagcgua cucguuacgc ccaagccguc gagcaguuga ugcgguccac 960 ucuugagccg aaagaugcgc gaguugaaac guucauuaag aacgagaaau uugacugggc 1020 guugaaaggg gaggaggcug auccucgagc aauccaacca aggaagccga aauauuuggc 1080 ugagguugga cggugguuca aaccuuugga gcgaaucauc uacaaggauc ucaguaaaag 1140 guuguauggu gagggugcug agccguguau cgccaaaggc cuaaaugcau uagaaucugg 1200 agcgacuuug aggcgcaaau gggagaaguu uucuucucca guuugcguuu cucucgacgc 1260 uuccagguuc gaccugcaug uaagcguugg caugcuaaag uucacacaca agcuauauga 1320 cuauuacugu aagucuccca cucuccagcg cuaucucaaa uggacacucc gcaaccaugg 1380 cgucgccucc ugcaaagaau ugucauauga guaugagguu guuggccgga gaaugagugg 1440 ugacauggac acugcauugg gcaacugcgu cauuaugucg auacuuacau gguuuaugcu 1500 uagugaacuu ggcauuaagc augaauuauu cgauaauggu gacgauuguu uguucauuug 1560 cgagucucac gacgucccca gccccgaggu aauuacaaac ugguuuucgg acuuuggguu 1620 ugugguuagg uuggaaggcg ucacguccgu guuugagcgu auugaguuuu gccaaacuuc 1680 cccaguaugg acugagaggg guuggcugau guguaggaau auuaagucau ugaguaaaga 1740 ccuuacgaau guuaauucgu gcacgggcuc cacgauugaa uauacccacu gguugaaagc 1800 agugggaaag ugcgggucaa uacucaaugc ugguguaccu auauuucagu ccuuucacaa 1860 caugcuggaa aggcuuggca cuaacucucg uauugaucga gggguuuucu ucaaaucagg 1920 gcuaguuaau cucauucgug ggauggacag gcagccugac guugacauca cuacuuccgc 1980 ucggcuuucu uucgaagugg cauucgggau aacacccggg augcaauugg cuauugaacg 2040 guacuaugac ucugucaugg gcucgcugag uaaaauagaa acaacuaagu ggccaauuga 2100 acuaagaaag gaauacgaac acggaaguga gugguacgag gacuuaggcg uccuaggaug 2160 aauaggguca uugguuuacc gaugauaccu guucagaaua ggauugcucg agcuucguug 2220 guuaggguaa cucacauacc uucuuccaua acuggaaaag gucgugugag caaccuaacc 2280 aguuaaugua ggugucuuuc cguaucuagu cacgauggua agcaacccgu uuaucuguac 2340 ggcgcucacc cguggguagg aaggugaagg uuuugugucc uuuaggucuu ggacagucug 2400 cgggcuuggg aacgacgccc cgcuagcaac guacugcucu ccuaccggac ugguagcuua 2460 auugucaucu uggagcgaua gcacuguggg ccucacccuu cgcgcguugg acguguugcg 2520 ugccccccac agauuuguga aacucuaugg agcaguuccg cgagccagaa gggaggaugg 2580 ccgccuggcg uaauccagga gcucuggggg gcuuguacuc agaguagcau ucugcuuuag 2640 acuguuaacu uuaugaacca cgcgugucac guggggagag uuaacagcgc cc 2692 <210> 2 <211> 225 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(225) <223> 3' End of CYVaV <400> 2 ucuuggagcg auagcacugu gggccucacc cuucgcgcgu uggacguguu gcgugccccc 60 cacagauuug ugaaacucua uggagcaguu ccgcgagcca gaagggagga uggccgccug 120 gcguaaucca ggagcucugg ggggcuugua cucagaguag cauucugcuu uagacuguua 180 acuuuaugaa ccacgcgugu cacgugggga gaguuaacag cgccc 225 <210> 3 <211> 84 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(84) <223> The 3' Cap Independent Translation Enhancer (3' CITE) of CYVaV <400> 3 ucuuggagcg auagcacugu gggccucacc cuucgcgcgu uggacguguu gcgugccccc 60 cacagauuug ugaaacucua ugga 84 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <211> 570 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(570) <223> Polynucleotide Sequence of CYVaV Encoding Protein p21 (bases 9 to 578) <400> 6 auggauccuu caucuuugcc ccgugccugu uggcaucaug ccagacaggu guuucgagca 60 ucaacuagcu ucucaagaga ggugguucgc gcugcucgua gauggguuac caugcccacc 120 agucgccaug cauaugacuu uucaacgagu cuaggcauug ugauugcuga gccugcagcu 180 cguuuacgac gccgucugcc cucuguacga aagugcgcag agaaguuagu aguccacaag 240 caagucgaca cuuuggugga cgaauggugc ucuggaauuc ccaacccuga uaucguagaa 300 guugguuggg cacuccgucu gagggaccgu uucggucuuc cucccgcuuc ugagccuacc 360 cggcucagug gugagagaug ggugcucaaa caacucaaug ggguagaucc ugagucaugg 420 aaugcugauc uugguagguc aguucauauc caaggagacu acgccccagg gaggaaugcc 480 cauaucgcuc aggucgcggc gaccuugugg uuaacuagga ccuugcauga caaggccuug 540 gcucgccacc aggguuuucg cgauuugcag 570 <210> 7 <211> 190 <212> PRT <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(190) <223> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) Protein p21 <400> 7 Met Asp Pro Ser Ser Leu Pro Arg Ala Cys Trp His His Ala Arg Gln 1 5 10 15 Val Phe Arg Ala Ser Thr Ser Phe Ser Arg Glu Val Val Arg Ala Ala 20 25 30 Arg Arg Trp Val Thr Met Pro Thr Ser Arg His Ala Tyr Asp Phe Ser 35 40 45 Thr Ser Leu Gly Ile Val Ile Ala Glu Pro Ala Ala Arg Leu Arg Arg 50 55 60 Arg Leu Pro Ser Val Arg Lys Cys Ala Glu Lys Leu Val Val His Lys 65 70 75 80 Gln Val Asp Thr Leu Val Asp Glu Trp Cys Ser Gly Ile Pro Asn Pro 85 90 95 Asp Ile Val Glu Val Gly Trp Ala Leu Arg Leu Arg Asp Arg Phe Gly 100 105 110 Leu Pro Pro Ala Ser Glu Pro Thr Arg Leu Ser Gly Glu Arg Trp Val 115 120 125 Leu Lys Gln Leu Asn Gly Val Asp Pro Glu Ser Trp Asn Ala Asp Leu 130 135 140 Gly Arg Ser Val His Ile Gln Gly Asp Tyr Ala Pro Gly Arg Asn Ala 145 150 155 160 His Ile Ala Gln Val Ala Ala Thr Leu Trp Leu Thr Arg Thr Leu His 165 170 175 Asp Lys Ala Leu Ala Arg His Gln Gly Phe Arg Asp Leu Gln 180 185 190 <210> 8 <211> 1407 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1407) <223> Polynucleotide Sequence of CYVaV Encoding Protein p81 (bases 752 to 2158) <400> 8 augaccacac guguguugca guacaagggc cgagauccga uccuucccuc uucugaagcc 60 cuucaccgac uuaaccuucg gauagcugag cuauauaggu cuagaccuuc uaccgucuau 120 ccauuaaguu augaaggguu ucucaauugc uaugaaggcc gacagcguac ucguuacgcc 180 caagccgucg agcaguugau gcgguccacu cuugagccga aagaugcgcg aguugaaacg 240 uucauuaaga acgagaaauu ugacugggcg uugaaagggg aggaggcuga uccucgagca 300 auccaaccaa ggaagccgaa auauuuggcu gagguuggac ggugguucaa accuuuggag 360 cgaaucaucu acaaggaucu caguaaaagg uuguauggug agggugcuga gccguguauc 420 gccaaaggcc uaaaugcauu agaaucugga gcgacuuuga ggcgcaaaug ggagaaguuu 480 ucuucuccag uuugcguuuc ucucgacgcu uccagguucg accugcaugu aagcguuggc 540 augcuaaagu ucacacacaa gcuauaugac uauuacugua agucucccac ucuccagcgc 600 uaucucaaau ggacacuccg caaccauggc gucgccuccu gcaaagaauu gucauaugag 660 uaugagguug uuggccggag aaugaguggu gacauggaca cugcauuggg caacugcguc 720 auuaugucga uacuuacaug guuuaugcuu agugaacuug gcauuaagca ugaauuauuc 780 gauaauggug acgauuguuu guucauuugc gagucucacg acguccccag ccccgaggua 840 auuacaaacu gguuuucgga cuuuggguuu gugguuaggu uggaaggcgu cacguccgug 900 uuugagcgua uugaguuuug ccaaacuucc ccaguaugga cugagagggg uuggcugaug 960 uguaggaaua uuaagucauu gaguaaagac cuuacgaaug uuaauucgug cacgggcucc 1020 acgauugaau auacccacug guugaaagca gugggaaagu gcgggucaau acucaaugcu 1080 gguguaccua uauuucaguc cuuucacaac augcuggaaa ggcuuggcac uaacucucgu 1140 auugaucgag ggguuuucuu caaaucaggg cuaguuaauc ucauucgugg gauggacagg 1200 cagccugacg uugacaucac uacuuccgcu cggcuuucuu ucgaaguggc auucgggaua 1260 acacccggga ugcaauuggc uauugaacgg uacuaugacu cugucauggg cucgcugagu 1320 aaaauagaaa caacuaagug gccaauugaa cuaagaaagg aauacgaaca cggaagugag 1380 ugguacgagg acuuaggcgu ccuagga 1407 <210> 9 <211> 469 <212> PRT <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <400> 9 Met Thr Thr Arg Val Leu Gln Tyr Lys Gly Arg Asp Pro Ile Leu Pro 1 5 10 15 Ser Ser Glu Ala Leu His Arg Leu Asn Leu Arg Ile Ala Glu Leu Tyr 20 25 30 Arg Ser Arg Pro Ser Thr Val Tyr Pro Leu Ser Tyr Glu Gly Phe Leu 35 40 45 Asn Cys Tyr Glu Gly Arg Gln Arg Thr Arg Tyr Ala Gln Ala Val Glu 50 55 60 Gln Leu Met Arg Ser Thr Leu Glu Pro Lys Asp Ala Arg Val Glu Thr 65 70 75 80 Phe Ile Lys Asn Glu Lys Phe Asp Trp Ala Leu Lys Gly Glu Glu Ala 85 90 95 Asp Pro Arg Ala Ile Gln Pro Arg Lys Pro Lys Tyr Leu Ala Glu Val 100 105 110 Gly Arg Trp Phe Lys Pro Leu Glu Arg Ile Ile Tyr Lys Asp Leu Ser 115 120 125 Lys Arg Leu Tyr Gly Glu Gly Ala Glu Pro Cys Ile Ala Lys Gly Leu 130 135 140 Asn Ala Leu Glu Ser Gly Ala Thr Leu Arg Arg Lys Trp Glu Lys Phe 145 150 155 160 Ser Ser Pro Val Cys Val Ser Leu Asp Ala Ser Arg Phe Asp Leu His 165 170 175 Val Ser Val Gly Met Leu Lys Phe Thr His Lys Leu Tyr Asp Tyr Tyr 180 185 190 Cys Lys Ser Pro Thr Leu Gln Arg Tyr Leu Lys Trp Thr Leu Arg Asn 195 200 205 His Gly Val Ala Ser Cys Lys Glu Leu Ser Tyr Glu Tyr Glu Val Val 210 215 220 Gly Arg Arg Met Ser Gly Asp Met Asp Thr Ala Leu Gly Asn Cys Val 225 230 235 240 Ile Met Ser Ile Leu Thr Trp Phe Met Leu Ser Glu Leu Gly Ile Lys 245 250 255 His Glu Leu Phe Asp Asn Gly Asp Asp Cys Leu Phe Ile Cys Glu Ser 260 265 270 His Asp Val Pro Ser Pro Glu Val Ile Thr Asn Trp Phe Ser Asp Phe 275 280 285 Gly Phe Val Val Arg Leu Glu Gly Val Thr Ser Val Phe Glu Arg Ile 290 295 300 Glu Phe Cys Gln Thr Ser Pro Val Trp Thr Glu Arg Gly Trp Leu Met 305 310 315 320 Cys Arg Asn Ile Lys Ser Leu Ser Lys Asp Leu Thr Asn Val Asn Ser 325 330 335 Cys Thr Gly Ser Thr Ile Glu Tyr Thr His Trp Leu Lys Ala Val Gly 340 345 350 Lys Cys Gly Ser Ile Leu Asn Ala Gly Val Pro Ile Phe Gln Ser Phe 355 360 365 His Asn Met Leu Glu Arg Leu Gly Thr Asn Ser Arg Ile Asp Arg Gly 370 375 380 Val Phe Phe Lys Ser Gly Leu Val Asn Leu Ile Arg Gly Met Asp Arg 385 390 395 400 Gln Pro Asp Val Asp Ile Thr Thr Ser Ala Arg Leu Ser Phe Glu Val 405 410 415 Ala Phe Gly Ile Thr Pro Gly Met Gln Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Tyr 420 425 430 Asp Ser Val Met Gly Ser Leu Ser Lys Ile Glu Thr Thr Lys Trp Pro 435 440 445 Ile Glu Leu Arg Lys Glu Tyr Glu His Gly Ser Glu Trp Tyr Glu Asp 450 455 460 Leu Gly Val Leu Gly 465 <210> 10 <400> 10 000 <210> 11 <400> 11 000 <210> 12 <400> 12 000 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <400> 14 000 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <211> 166 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(166) <223> Polynucleotide Sequence of Recoding Frameshift Sites of CYVaV <400> 17 ucgcucaggu cgcggcgacc uugugguuaa cuaggaccuu gcaugacaag gccuuggcuc 60 gccaccaggg uuuucgcgau uugcagugau uggggucgac gggcuagagg caaaagcagu 120 gccucuagcu ucuggacucc gacugcuucc gguuccgcga cccgga 166 <210> 18 <211> 25 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Polynucleotide Sequence of Recoding Frameshift Sites of CYVaV <400> 18 caaagucgac gacugucuca gaccu 25 <210> 19 <211> 34 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> Polynucleotide Sequence of Recoding Frameshift Sites of CYVaV <400> 19 aggucuugga cagucugcgg gcuugggaac gacg 34 <210> 20 <211> 3132 <212> RNA <213> Ficus carica <220> <221> misc_feature <223> Polynucleotide Sequence of Fig Tree iRNA ("iRNA relative 1" or "iRNA r1") <400> 20 aaauauggau ucgauaucaa ugcccgucgc cugcugguca aaagccaggc aggucuugcg 60 uacaccagcu aacuuuucca aagggguagu gaaggcugcg uaccgguggg ucaacaugcc 120 cagagccaaa uaugucagag augucuccac gagucuuggc auaguugucg cugagccugu 180 ugcugccgug cgccguuaga ugccuucgau aagcagccuu gcggaggagu ugguaacacg 240 ccagagcguc gacacucugg uggacgauug gugucucgga cuuuccaacc cugacaacaa 300 cguggagguu gguugggcac uucgucugag ggaccgcuuu ggucuuccuc ccgccucuga 360 gcccacaagg cucaguggug agagaugggu gcuuaaacaa cucaaugggg uagacccgga 420 gucguggaau guugaucugc aaagcguuuu cgaagacgcu caggaugacu uccaucggga 480 cuacgcccca aggaggaaug cccaaaucgc ucaaauugcg gcaacccuau ggcuuacaaa 540 gaccuuaguc gauaaggcuu uagcacgcca ucaggauuuu cgcaguuugc agugauuggg 600 gucgacgggc uagaggcuaa agcagugccu cuggcugcug gacuccgacu gcuuccgguu 660 ccgcggcccg gacaaagccg acggcugucu caaaccuugc uacucccuac uccccgugcu 720 caauuuguca aucacgcuaa cucagguaau aauuuggggc guguuuugac cacacgggug 780 augcaauaca aaggccgaga cccgauacua cccucccagg aagcccugcg caaacuuaac 840 cuucggauag gacaguugua uaagucuaga ccauccacug ucuauccccu gaguuaugau 900 ggguuucuua auuguuauga uggccgacag cguacucgcu acgcucaugc cgucgagcaa 960 uugaugggug ccgcucugac cccaaaagau gcgcgaguug agacguucau uaagaacgag 1020 aaguuugauu gguuguugaa gggagacgag gcugauccuc gugcaaucca accuaggaag 1080 ccgaaauauu uggccgaggu uggucgaugg uucaaaccgu uggagcgaau caucuacaag 1140 gaucucaguu ugcguuugua cggugauaac gcugaaccuu gcauugccaa aggcuuaaau 1200 gcauuggaau caggggcuac guugagacgu aaaugggaaa aguucgcuaa uccuguuugu 1260 guuucauugg augcuucucg uuucgaccug cacguaagug uuggcuuguu aaaguucacg 1320 cauaaauugu acaacuauua cugcaagucu cccacucuuc aacgauaucu caaauggaca 1380 cuccgcaacu ccgguaucgc cuccuguaag gaaaaaucau augcguauga gguugaaggc 1440 cguagaauga guggcgacau ggacaccgca uuaggcaacu guaucaucau gagauuauua 1500 acuugguuua ugcuuagcga acuuggcgug cggcaugagc uuuucgauaa uggugaugac 1560 uguuuguuua uuugugaaaa agaagacguu ccuagugcug agguaaucac gaacugguuu 1620 acggauuuug gguuuguggu uaagcuagaa ggcgucacgu ccguguuuga gcgcauugag 1680 uucugucaga ccucaccagu auggacugcg aggggauggc ugauguguag aaacaucaag 1740 ucauugagua aagauuuaac gaauguuaau ucgugcacug guucugccgu ugaauacacu 1800 cauugguuga aggcgguggg caagugugga ucuauacuca augcuggugu gcccauauuu 1860 caguccuuuc acaacauguu ggucagguug ggcacgaauu cgcguauaga ucgcggggua 1920 uucuuuaggu guggacuugu uaaucucauu cugggaugga cagacaaccu gaaaguugag 1980 aucacuacuu ccgcucgucu uucuuuugaa guggcauucg ggaucacucc cggcaugcaa 2040 uuggcuauug agcaauuuua ugacucaguc gugggcccuc uggguaaaau aaaaucugua 2100 aaauggccaa uagaucuaag aaaggaauac gauuacggaa gcgcgugguu cgaagaccaa 2160 ggcguccuag ggugaacaag gaacucggau uaccgaugac accuguucaa acuagaaugg 2220 uucggucaac guugaccaag gagaccaaca uaccuucuac ugcaaauagc ggucgggagg 2280 cuguuugggc uuguuggcca aucaacuuua gugucuuucc gcaacuagcc ucacucguga 2340 auaaaccguu auacuggcgu guguccagug ugcaaguugc aauggagccg gcgaugucua 2400 cuuccaccca acauugugga guuggucuca guucuucugg ggccuucacu aacggugaug 2460 gguucgguaa cgucuuuaag cucuugcguu cuuguaacua uacgcggcgc ucucccgugg 2520 gaggaaacgu gauggucaaa uggcccaucu gcaugcccuu cauucuuaac gaugaugcgc 2580 acaagaacac aggauuaacc gccuguguga ucauugcagu caccaauacu ggugugcuaa 2640 cuggucaauc uuggacggag auucuuuuga auguggagua uguagugggu gcauagacag 2700 ucugcgggcu ugggaacgac gccccgcuag caacguacug cucuccuacc ggacugguag 2760 ccguuuaguu aucuuggagc gauagcacug ugagccucac ucaacgcgcg auggacgugg 2820 cgagugcccc ucagagauuu gugaaacucu auagagcuau uucgcgagcc agaagggagg 2880 auggccaccu gguguaagcc agguaucccc ggggggcuug uacucggggu cgcauuacug 2940 cuuagaccac aagguagggu ucgcaucuug gaacugaccc uaugaccuug ugggugcccu 3000 aaccggacug guagccguuu aauaucuugg agcgauuagc acgugugagc ccucacucaa 3060 cggcgcgauu ggacguggcg agugccccuc agaguaaucu gcagagcucc ggcagucgug 3120 ggaggcaagg ca 3132 <210> 21 <211> 3275 <212> RNA <213> Ficus carica <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3275) <223> Polynucleotide Sequence of Fig Tree iRNA ("iRNA relative 2" or "iRNA r2") <400> 21 cucccacgac ugccggagcu cugcagaauu ccaccggggg uaccuggcuu acaccaggug 60 gccauccucc cuucuggcuc gcggaauagc ucuauagagu uucacaaauc ucugaggggc 120 acucgccacg uccaucgcgc guugagugag gcucacagug cuaucgcucc cagaauucgg 180 gauaaauaug gaagaaacuu cuuugcccaa agccugcugg aucaaaagcc aggcaggucu 240 ugcguacacc agcuaacuuu uccaaagggg uagugaaggc ugcguaccgg ugggucaaca 300 ugcccagagc caaauauguc agagaugucu ccacgagucu uggcauaguu gucgcugagc 360 cuguugcugc cgugcgccgu cagaugccuu cgauaagcag ccuugcggag gaguugguaa 420 cacgccagag cgucgacacu cugguggacg auuggugucu cggacuuucc aacccugaca 480 acaacgugga gguugguugg gcacuucguc ugagggaccg cuuuggucuc ccucccgccu 540 cugagcccac aaggcucagu ggugagagau gggugcuuaa acaacucaau ggaguagacc 600 cggaaucuug gaaugacgac uaugcguucg aagacgcuca ggaggauuuu caacgggaau 660 acgucccggg aaggaaugcc cauauugcug caacugcggc aacucuaugg cugacaaaga 720 ccuuguauga caaggcuuua guucgccauc aggguuuucg caguuugcag ugauuggggu 780 cgacgggcug gaggcuaaag cagugccucc agcugcugga cuccgacugc uuccgguucc 840 gcggcccgga caaagccgac ggcugucuca gaccuuacua cuuccuacuc cccgugcuac 900 uuuugucaau caugcaaauu caggcaauaa ucuugagcgu guuuugacca cacgggugau 960 gcaauacaaa ggccgagacc cgauacuacc cucccaggaa gcccugcgca aacuuaaccu 1020 ucggauagga caguuguaua agucuagacc auccacuguc uauccccuga guuaugaugg 1080 guuucuuaau uguuaugaug gccgacagcg uacucgcuac gcucaugccg ucgagcaauu 1140 gaugggugcc gcucugaccc caaaagaugc gcgaguugag acguucauua agaacgagaa 1200 guuugauugg uuguugaagg gagacgaggc ugauccucgu gcaauccaac cuaggaagcc 1260 gaaauauuug gccgagguug gucgaugguu caaaccguug gagcgaauca ucuacaagga 1320 ucucaguuug cguuuguacg gugauaacgc ugaaccuugc auugccaaag gcuuaaaugc 1380 auuggaauca ggggcuacgu ugagacguaa augggaaaag uucgcuaauc cuguuugugu 1440 uucauuggau gcuucucguu ucgaccugca cguaaguguu ggcuuguuaa aguucacgca 1500 uaaauuguac gacuauuacu gcaagucucc cacucuucaa cgauaucuca aauggacacu 1560 ccgcaacucc gguaucgccu ccuguaagga aaaaucauau gcguaugagg uugaaggccg 1620 uagaaugagu ggcgacaugg acaccgcauu aggcaacugu aucaucauga cgauauuaac 1680 uugguuuaug cuuagcgaac uuggcgugcg gcaugagcuu uucgauaaug gugaugauug 1740 uuuguucauu ugcgaagaaa aagacguacc uagccccgag acgaucauga acugguuugc 1800 ggauuuuggg uuugugguua gguuagaagg cgucgugucc guguuugagc gcauugaguu 1860 cugccaaaca ucgccuauau ggacugaucg agguuggcug auguguagaa acaucaaguc 1920 uuugaguaag gaucuuacga acguuaauuc gugcacuggc uccacuguug aauacaccca 1980 uugguugaaa gcaguuggaa aguguggauc ggugcucaau gcgggugugc cuauauuuca 2040 gucauuucac aacauguuga ugcgauuggg uacgaauucg cguauagauc gcgggguauu 2100 cuuuaggugu ggacuuguua aucucauucg ugggauggac agacaaccug aaguugagau 2160 cacuacuucc gcucgucuuu cuuuugaagu ggcauucggg aucacucccg gcaugcaauu 2220 ggcuauugag caauuuuaug acucagucgu gggcccucug gguaaaauaa aaucuguaaa 2280 auggccaaua gaucuaagaa aggaauacga uuacggaagc gcgugguucg aagaccaagg 2340 cguccuaggg ugaacaagga acucggauua ccgaugacac cuguucaaac uagaaugguu 2400 cggucaacgu ugaccaagga gaccaacaua ccuucuacug caaauagcgg ucgggaggcu 2460 guuugggcuu guuggccaau caacuuuagu gucuuuccgc aacuagccuc acucgugaau 2520 aaaccguuau acuggcgugu guccagugug caaguugcaa uggagccugc aaugucuucu 2580 uccacccaac auuguggugu uggucucagu ucuucugggg ccuucacaua acggugaugg 2640 guucgguaac gucuuuaagc ucuugcguuc uuguaacuau acgcggcgcu cucccguggg 2700 aggaaacgug auggucaaau ggccuaucug caugcccuuc auucuuaacg augaugcgca 2760 caagaacaca ggauuaaccg ccugugugau cauugcaguc accaauacug gugugcuaac 2820 uggucaaucu uggacggaga uucuguugaa uguggaguau acgccccgcu agcaucguac 2880 ugcucuccua ccggacuggu agccguuuag uuaucuugga gugauagcac uguggggcca 2940 cauuugacgc gcauuggacg cagacaaugu cccuccacag auuugugaau cucuauggag 3000 cuguaaccuc ggucucucua uagcuugucc gaacaggaaa uggacauaaa auaauugcug 3060 uuccaacacg uuguguuggu aaagaaguua uagauguggu gcgccagaca aguggauggc 3120 aaccuggagu aauccaggcg cucugggggg cuuauacucg gagugcauua cugcuuuaga 3180 ccguuaaucu caagaaccau gugugucgca uggggaggau uaacggcgcc caauucccuu 3240 guuaguuuag guacgccuug gucuucgaac cacgc 3275 <210> 22 <211> 2985 <212> RNA <213> Ficus carica <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2985) <223> Polynucleotide Sequence of Fig Tree iRNA ("iRNA relative 3" or "iRNA r3") <400> 22 gggguaaaua uggagaacca gcacacccau guuugcccac ggucguuccu gcgaaccugc 60 agggcgaucc ucgcggcucc agccaacuac ggucgugaug uggucaaaau cgccuacaaa 120 ugggcaucac gaaaccccgc caccgccccc cgaagugucc gagaauccau cggggucguu 180 gucggaagcg cuguggacuu cuugagcgcu ccucgcaagc guuuagaaga ccgcgcagag 240 caguuggugc aagacgaccg ggucgaccgg aucguccgcg agugggagcu aggaaccgcu 300 gacucccgaa uuccggaagu ugagugggca uaccgucugc gcgaccgcuu cggcgucgug 360 uccgccagcg agccugcuag gcaaacuggu gagagguggg ugcucaagca acuagaggga 420 uuggaggggg gggaguuccg cugcauaccc auugagccau ucuuugguga ugcaccggcc 480 cccguccaua gcccugggag caacagcgug auugcugcua uugcggcgac ccuuuggaug 540 acgccuaccc gccuugaccg ggcguugaga cgucaccagg guuuucgcaa cuagcgguga 600 ucggagucga cggagugucu gcuuuagcgg ugcaggcauc uucugaacuc cgaccgcuac 660 ggguugggcg accccgucaa agucgacguc guucgugguc ucugacuaug ccagcaccca 720 aguccuguuu cgugaaccac gcuaacucug accacaaucu caaaacgguc auggaaaaca 780 gggugcucaa guacaaaggc caagaacccg caaagccccg gguagaagcc uauaagcagc 840 ucuaugaaag gauacgaccg cgauaucguu cucuaccuga cacggucuau ccucuaucau 900 augauggcuu ccucaagugc uacuccggac guaggcgaac acgauacgaa caggccgucc 960 aggaguugag aaacgcgcca cucacacccg aagaugcugu cguuuccacg uucaucaaga 1020 acgagaaauu cgauuggcuc caaaagaaag aacuugcgga ucccagagcu auccaaccuc 1080 ggaaaccgaa auaccuggcc gaaguuggga ggugguucaa gccucuggag cacauaaugu 1140 auaaagacuu ggcaaaacgg uuguacgguc aggaugcguu gccuugcaua gcgaaagggc 1200 ugaacgcuag agaaacggcu gaagugcucc gagccaaaug ggacaaguuc gcuucucccg 1260 uuugcgucuc gcuggaugcc agucgguucg aucugcaugu aaguccugac gcauugcggu 1320 uuacgcaccg ccuguaccac aaguauugcc aaagucggca acuccgcaag uaccuagaau 1380 ggacgcugag aaacgcuggc gucgccucau guccugaaag cgcuuaucag uaugagguug 1440 aggggagacg caugaguggc gacauggaca ccgcacucgg caacugcgua cuuaugcucu 1500 gcuugacaug gaacuuccuc gaucaacaua acaucaagca ugagauaaug gacaacggag 1560 augacugcuu guucaucugu gaagcugccg augugccaac cgacaagcaa aucauggacu 1620 acuaccucga cuuuggguuc gugguucggu uggaaggaaa ggugucugug uucgagcgaa 1680 uagaguucug ucaaaccagu ccgguguuga cugcuaaugg auggcguaug guuagaaauu 1740 ugaaguccau ugcgaaggac cucugcaaug ugaacauggc gacuggguca cucagugaau 1800 acacugcgug gcuuaaagcc gugggaaucu gugguagaau ccugaacgau gggguuccaa 1860 ucuucuccgc cuuccacaac augcuggugc gacauggaac gaacucacga auagauagag 1920 cgguguucug ggaaugugga cugacaaacu ugaucaaagg caugaguuuc gagcaacugg 1980 aaaucacugu cgcugcgcgc gaguccuuuu aucuggcaua cgguaucaca ccggcgagac 2040 aacucgcgau ugaagaguau uacgacucac uccagggccc gguggguaaa auacaacuuc 2100 augaauggcc acuacaacuc aaagaggaau acgcgugcgg cgccgagugg uucgaaggag 2160 acggcgagcg ggcuugaggc ccgcuggcuu gcccuucgug cccggcagcu cucgcacggu 2220 ucggacugcg cucguccucg agaaccacuu gccgaugucc ucggcacagu ugggucaaga 2280 ggccguugcg uauucuaucc cgugcaaugu ucgaaacaug ccuacgaucc ugacucucgc 2340 caccacuccg cucuauuggc guaucaccgc caucacuguc gcgauggagc cugcaaaguc 2400 cacaucgacc caaauugccg guguggggaa ugcugauuca uuucagucug ccaccuacaa 2460 cgguuuuggg aacguguuua agaaaaugcg cgcuuugaau uucgugagac gcucggcgcc 2520 cggaggcaau cuucagguac gcuggccuau caauauggac uggaucuccg cauccgacac 2580 ggacaaggau agcacaaaag ugcccucgcu auucuuugcc gugaccaacc caggugugau 2640 cgaaaccaaa caaggggaca gugaggccug guuggaaugg gaguuggagc uggaguacau 2700 aguuggaggc uaggaacgac ugcccgcuug agaucgacuc ucccguggug agguaccacc 2760 cacucagcug ugucagccgg uuggagaaac ucuggugcga uagcacuguu ggccccugcc 2820 uagcgugugc ugugggaaag ccccaacaga uuugugaaac acuggaguug ucgacccgcg 2880 agacgugcgg cucgaguugu cgcuuccccg ugaggggggc ugccgggggg uagagaaaua 2940 uucccgguau uuauccgcua agaccuacgc gcgacgaaac uggcg 2985 <210> 23 <211> 4252 <212> RNA <213> Pea Enation Mosaic Virus 2 (PEMV2) <400> 23 ggguauuuau agagaucagu augaacugug ucgcuaggau caagcggugg uucacaccug 60 acuucacccc uggcgagggc gugaagucua gagcucaacu ggaaagagag cuggauccca 120 ccugggcgcu ucucgugugc caagaacgag cgcgucguga ugcugacagu auugcuaaug 180 agugguacga gggcagcaug gagugcaacc uccuuauccc ucggcccaca accgaggaug 240 uauuuggccc cuccaucgcc ccugagccug uggcucuagu ggaggaaacu acccguuccc 300 gcgcgccgug cguggauguc ccugccgagg aguccuguaa gucagcggag auugauccug 360 uugaucucgc caaguucgac ucccuccauc gucgccuguu ggcugaagcc aacccuugca 420 gggaaauggu ucugugggug ccuccuggcc uaccagcaga gcgcgacguc cugcccaggg 480 cacguggggu gauaaugauc cccgaagucc cugccucugc acauaccuug uccgugaagg 540 uuauggaggc ugugcgguug gcacaggaag ucuuggcauc ccuugccaag agggccuuag 600 agaaaagguc uacaccaacc cuuaccgccc aggcccagcc agaggcuacc cugucggggu 660 gcgacuaccc guaucaggag acuggagcag cagccgcgug gauaacgccu ggcugcauug 720 ccauggagcu cagagccaaa uuuggcgucu gcaaacgcac ccccgcaaac uuagagaugg 780 ggagucgcgu cgcccgcgag cuccugcggg auaacugugu cacuugcagg gagaccacgu 840 gguacaccag ugccauugcu guggaccugu gguugacccc gaccgucguc gaccuggccu 900 guggccggcg agcggcggau uuuugguagg ggcugugcug ccucggcugg gggaagacac 960 cagugugcgg uuugacaacc ugcaccccag caucgaggua aucaaggcgg cuaggccccg 1020 cccaacccag aggaugucgu uccaaaucga cguugugcgu ccucuuggag auuuuggugu 1080 gcacaacaac ucccuuguua accuagccag gggaauuaau gaaagggugu ucuacacgga 1140 caaugcuagg acagaacccc uccagccuaa gguucccuuc cccucaucac gggagcuaaa 1200 aaccuucaga gucaccccuu ggaccaugga uaggguugug gagaguuaca caggguccca 1260 gcgcacucgc uaugcuaacg cgcgggacag cauauuaucc aacccucuga gucccaaaga 1320 ugcgcggguc aagacguuug ucaaagcuga aaagauaaau uucacagcca aaccugaccc 1380 cgccccucgu gugauacagc cuagggaucc acgauucaac auuguccugg cuaaauacau 1440 caagccuuug gagccaaugu uguacaaagc acuggggaaa cuuuacaagu accccgcagu 1500 ugcuaagggg uuuaacgcgg uugagacggg ggagaucauc gccggcaagu ggcggugcuu 1560 caaagauccu gucgucgugg gauuagacgc uucccgauuu gaucagcaug uaucugucga 1620 ggcguugcag uucacccacg cgguguacag aggguucauc aagucacggg aguuuaacaa 1680 ccuccuacag augauguaca ccaaccgugg ccuagggucc gcuaaggacg gauucguccg 1740 uuacaagguu aaagguagac gcaugagcgg ugacauggac accuccuugg gcaacugugu 1800 gcucauggug uugcucacca ggaaccuuug caagguucua ggcaucccgc acgagcucuu 1860 caacaauggu gaugauugca ucgucuuuuu cgaucguugc cacuuggaga aguucaacaa 1920 ugcugucaag acuuauuuug cggaccuagg guuuaagaug aagguggaac cgccgguuga 1980 cguguuggag aaaauagagu ucugccaaac gcagccuauc uaugacgggg agaaguggcg 2040 caccgugcgu ugcaucucga guaucggaaa agauugcuca uccguuauua guugggacca 2100 auuggagggg ugguggaaug ccaucgccca gaguggucug gcugugugug gcggaaugcc 2160 gauauacacg ucguucuacc gguggcuagc acgggccggu aagaguggga ccaaguguca 2220 gucacacccc uuguggaaaa acgagggguu gaauugguac aggaugggga uggaccuuuc 2280 ucaugagguu aauguuaccc cucaggcgcg ccugucuuuc uucgcggguu uugguauuuc 2340 ccccccgaug caggucgcca uugaggcgcu guaugacaag cugccuccac cgucccccca 2400 ccaugguccu ccgguuaagg cuguaacaca gcgaguguuc accaauuauu ucacgccgga 2460 aagcgccugu guuagcauga gcacgaauga agacaacaaa ucugacuuug cuguuuacgg 2520 cccugugccu acagugaugu cucuuugugc ucaguguuag gcucuuaaau uuuagcgaug 2580 gcgugacacg guuacacccu gaauugacag gguacagauc aagggaagcc ggggagucac 2640 caacccaccc ugaaucgaca gggcaaaaag ggaagccggg caccgcccac guggaaucga 2700 ccacgucacc uuuucgcguc gacuaugccg ucaacacccu uucggcccgc cagccuagga 2760 caauggcggu agggaaauau augacgauaa ucauuaaugu caauaacgac gagcgcaagc 2820 aaccagaagg agcuacuggc agcucuguac ggcgagguga caauaaaaga acucgaggaa 2880 acaaaccucg gagucaucac cccgguucgc gcgaacgaaa agguuacaau caccccucuc 2940 cuacccccaa aaacucaaag cagggucagc uccguacuga agcgguucag gagcacccga 3000 aacacggggg gacugcuuuc cguagagaaa guggugguag uguucacccc ucacaucccc 3060 gacgacgugc uaggagaggu ggagauaugg cuccacgaca gcauccuccc ccaccucggg 3120 agcgucggac caagacugaa acucaagcug agcgaagggc ccaagcucuu agcguucuac 3180 ccacccuacu cgauugcauu gggggacucg aucucgggcc agccgagguc cuucuccauu 3240 gucaccgagc uguucgaagg caacuucgca ccggggugca gcccauucag ccuguuccuc 3300 auguggaguc cacgcaucga agcagugacc cacaacuacu ugagucgucc accacgugcu 3360 cugccaauuu gcagaacgau ggugcgggac gcguuaucgg agguggcauc ccaacagcaa 3420 uaccugaagg gagcgauguc gaacagguau gccaugccuc ucacuacggg ugauggccag 3480 cauagagcca ugaagggggc ucccagugcc cuuccaccaa cgggggugug uacccaggcu 3540 ucuaagugag gcuucgcuuc ccgccggaag accgcggcgg uucuguuccu cccacaggag 3600 uacggcaaca acccaccuug ggaaaguggg gaccccagca cuaacuccuu uaacuaggcg 3660 ggcguguugg uuacaguagg aggggacagu gcgcaucgaa acugagcccc accacaacuc 3720 ucauccacgg ggugguuggg acgcaggugu cggagggauc gccagcccuc aggauaguga 3780 gcucccgcag agggauaagc uaucucccug cgacguagug guagaacacg ugggauaggg 3840 gaugaccuug ucgaccgguu aucggucccc ugcuccuucg agcuggcaag gcgcucacag 3900 guucuacacu gcuacuaaag uugguggugg augucucgcc caaaaagauc acaaacgcgc 3960 gggacaaggu cccuuccacc uucgccgggu aaggcuagag ucagcgcugc augacuauaa 4020 cuugcggccg auccaguugc acgacuggug gucccccuca gugucucggu ugucugccga 4080 gugggcggug gucggauucc accacacccu gccacgaggu gcguggagac uuggccaguc 4140 uaggcucguc guaauuaguu gcagcgacgu uaaucaaccc guccgggcau auaauaggac 4200 cgguugugcu ucuuccuccc uucuuagcca ggugguuacc ucccuggcgc cc 4252 <210> 24 <211> 313 <212> RNA <213> Pea Enation Mosaic Virus 2 (PEMV2) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(313) <223> Intergenic Plus Region of PEMV2 <400> 24 guuagcauga gcacgaauga agacaacaaa ucugacuuug cuguuuacgg cccugugccu 60 acagugaugu cucuuugugc ucaguguuag gcucuuaaau uuuagcgaug gcgugacacg 120 guuacacccu gaauugacag gguacagauc aagggaagcc ggggagucac caacccaccc 180 ugaaucgaca gggcaaaaag ggaagccggg caccgcccac guggaaucga ccacgucacc 240 uuuucgcguc gacuaugccg ucaacacccu uucggcccgc cagccuagga caauggcggu 300 agggaaauau aug 313 <210> 25 <211> 139 <212> RNA <213> Pea Enation Mosaic Virus 2 (PEMV2) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(139) <223> Polynucleotide Sequence of Recoding Frameshift Sites of PEMV2 <400> 25 gaccgucguc gaccuggccu guggccggcg agcggcggau uuuugguagg ggcugugcug 60 ccucggcugg gggaagacac cagugugcgg uuugacaacc ugcaccccag caucgaggua 120 aucaaggcgg cuaggcccc 139 <210> 26 <211> 65 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(65) <223> Sequence of Insertion Region <400> 26 taggcctcga cacgggaagg tagctgtccc ggcactgggt tgcacatatt ccgtgccgac 60 gccac 65 <210> 27 <211> 43 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> Insertion Sequence Region <400> 27 ccggcctcga cacgggaagg tagctattcc gtgccgacgc cgt 43 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <211> 10 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Lock and Dock Sequence <400> 30 guccuaaguc 10 <210> 31 <211> 14 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Lock and Dock Sequence <400> 31 caggggaaac uuug 14 <210> 32 <211> 31 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> Scaffold Comprising Docked Tetraloop <400> 32 cauuagcuaa ggaugaaagu cuaugcuaau g 31 <210> 33 <211> 57 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(57) <223> Lock and Dock Structure <400> 33 gcaccuaagg cgucaggguc uagacccugc ucaggggaaa cuuugucgcu auggugc 57 <210> 34 <211> 47 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(47) <223> Sequence of Insertion into CYVaV <400> 34 ggcuaguuaa ucucauucgu gggauggaca ggcagccuga cguugac 47 <210> 35 <211> 30 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Sequence of CYVaV Insertion (Unmodified; U at Positions 3, 6, 8, 14, 17 and 29) <400> 35 guuaauguag gugucuuucc guaucuaguc 30 <210> 36 <211> 30 <212> RNA <213> Citrus Yellow Vein associated Virus (CYVaV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Sequence of CYVaV Insertion (Modified; G at Positions 3, 6, 8, 14, 17 and 29) <400> 36 gucaacgcag gugccugucc guaucuagcc 30

Claims (43)

1. 복제 요소(들) 및 이종성 분절(들)을 포함하는 플러스-센스 단일 가닥 리보핵산 (RNA) 벡터로서, 상기 RNA 벡터는 기능적 코팅 단백질(들) 오픈 리딩 프레임 (ORF) 및 기능적 이동 단백질(들) ORF가 없는, RNA 벡터.
2. 제1 항에 있어서, 서열 번호: 4 및/또는 서열 번호: 5의 핵산 서열(들)을 포함하는 3' 캡 독립적 번역 인핸서 (3' CITE)를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
3. 제2 항에 있어서, 상기 3' CITE는 서열 번호: 3의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 요소(들)는 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 및/또는 서열 번호: 14의 핵산 서열을 가진 하나 이상의 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 요소(들)는 서열 번호: 15 및/또는 서열 번호: 16의 핵산 서열을 가진 하나 이상의 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 감귤류 황색 잎맥 바이러스 (서열 번호: 1) 또는 그것의 iRNA 친척으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 식물 내에서 전신 및 체관부-제한된 이동 및 복제 가능한 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
8. 제7 항에 있어서, 감염 후 적어도 1개월 동안 숙주 식물 내에서 복제, 이동 및/또는 번역에 대해 기능적으로 안정한 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 분절(들)은 리포터 분자, 펩타이드, 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
10. 제9 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 살충제, 항균제, 항바이러스제, 또는 항진균제인 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
11. 제10 항에 있어서, 상기 항균제는 효소 항생제인 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
12. 제10 항 또는 제11 항에 있어서, 상기 항균제는 박테리아 칸디다투스 리베리박터 종을 표적화하는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
13. 제12 항에 있어서, 상기 칸디다투스 리베리박터 종은 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 (CLas)인 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
14. 제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 분절(들)은 작은 비-암호화 RNA 분자 및/또는 RNA 간섭 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
15. 제14 항에 있어서, 상기 작은 비-암호화 RNA 분자 및/또는 상기 RNA 간섭 분자는 곤충 벡터, 바이러스, 또는 균류를 표적화하는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
16. 제15 항에 있어서, 상기 작은 비-암호화 RNA 분자 및/또는 상기 RNA 간섭 분자는 상기 곤충 벡터, 상기 바이러스, 또는 상기 균류의 핵산을 표적화하는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
17. 제15 항 또는 제16 항에 있어서, 상기 바이러스는 감귤류 잎맥 돌기 바이러스 (CVEV) 및 시트러스 트리스테자 바이러스 (CTV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
18. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 분절(들)은 제1 이종성 분절이며, 제2 이종성 분절(들)을 더 포함하고, 상기 복제 요소(들)는 상기 제1 및 제2 이종성 분절의 중간인 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
19. 제1 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 분절(들)은 표현형 특성을 변화시키는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
20. 제19 항에 있어서, 상기 표현형 특성은 살충제 내성, 제초제 내성, 곤충 저항성, 감소된 캘러스 생산, 증가된 성장 속도, 및 난쟁이증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 RNA 벡터.
21. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 RNA 벡터를 포함하는 숙주 식물로서, 상기 숙주 식물은 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 또는 식물 세포인, 숙주 식물.
22. 제21 항에 있어서, 상기 숙주 식물은 시트러스, 비티스, 피쿠스 및 올레아로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 있는 것을 특징으로 하는 숙주 식물.
23. 제22 항에 있어서, 상기 숙주 식물은 감귤류 나무 또는 감귤류 나무 접목인 것을 특징으로 하는 숙주 식물.
24. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 RNA 벡터로 감염된 식물, 식물 기관, 식물 조직, 또는 식물 세포를 포함하는 조성물.
25. 제24 항에 있어서, 상기 식물은 시트러스, 비티스, 피쿠스 및 올레아로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
26. 제25 항에 있어서, 상기 식물은 감귤류 나무 또는 감귤류 나무 접목인 것을 특징으로 하는 조성물.
27. 이종성 분절(들)을 숙주 식물에 도입하기 위한 방법으로서 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 RNA 벡터를 상기 숙주 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
28. 제27 항에 있어서, 상기 도입 단계는 상기 도입 전에는 RNA 벡터를 포함하지 않는 또 다른 식물의 식물 기관 또는 식물 조직에 RNA 벡터를 포함하는 식물의 식물 기관 또는 식물 조직을 접목시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제27 항 또는 제28 항에 있어서, RNA 벡터는 숙주 식물을 전신으로 감염시키는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 식물, 식물 기관, 식물 조직, 또는 식물 세포에서 이종성 분절(들)을 생산하는 공정으로서, 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 RNA 벡터를 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포로 도입하는 단계를 포함하는, 공정.
31. 제30 항에 있어서, 상기 식물은 시트러스, 비티스, 피쿠스 및 올레아로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 있는 것을 특징으로 하는 공정.
32. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 RNA 벡터를 포함하는 키트.
33. 이종성 분절(들)을 식물, 식물 기관, 식물 조직, 또는 식물 세포로 도입하기 위한 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 RNA 벡터의 용도.
34. 상기 도입 전에는 RNA 벡터를 포함하지 않는 식물 기관 또는 식물 조직으로 RNA 벡터를 도입하기 위한, 제21 항 내지 제23 항 중 어느 한 항의 숙주 식물, 또는 제24 항 내지 제26 항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
35. 제34 항에 있어서, 상기 도입 단계는 RNA 벡터를 포함하지 않는 또 다른 식물의 식물 기관 또는 식물 조직에 RNA 벡터를 포함하는 식물의 식물 기관 또는 식물 조직을 접목시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
36. 식물과 함께 사용하기 위한 벡터를 제조하는 방법으로서 하나 이상의 이종성 분절(들)을 RNA로 삽입하는 단계를 포함하며, RNA는 CYVaV; CYVaV의 친척; CYVaV와 적어도 70% RdRp 동일성을 갖는 다른 RNA 벡터; 및 또 다른 iRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
37. 제36 항의 방법에 의해 생산되는 벡터.
38. 벡터로서의 RNA의 용도로서, RNA는 CYVaV; CYVaV의 친척; CYVaV와 적어도 70% RdRp 동일성을 갖는 다른 RNA 벡터; 및 또 다른 iRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
39. 제38 항에 있어서, RNA는 식물의 치료, 예를 들어, 식물의 바이러스 또는 박테리아 감염의 치료, 예를 들어, 감귤류 식물에서 CTV 감염 또는 감귤류 녹화의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
40. 제38 항 또는 제39 항에 있어서, RNA는 하나 이상의 삽입된 이종성 분절(들), 예를 들어, 효소 항생제로 변형되는 것을 특징으로 하는 용도.
41. 식물의 질병 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에 있는 것을 특징으로 하는 RNA의 용도로서, RNA는 CYVaV; CYVaV의 친척; CYVaV와 적어도 70% RdRp 동일성을 갖는 다른 RNA 벡터; 및 또 다른 iRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
42. 제41 항에 있어서, 질병 또는 병태는 식물의 바이러스 또는 박테리아 감염, 예를 들어, 감귤류 식물에서의 CTV 또는 감귤류 녹화인 것을 특징으로 하는 용도.
43. 의약으로서 또는 식물의 질병 또는 병태의 치료시 사용하기 위한 RNA로서, CYVaV; CYVaV의 친척; CYVaV와 적어도 70% RdRp 동일성을 가진 다른 RNA벡터; 및 또 다른 iRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNA.

Images