BR112021009192A2 - Vetor de ácido ribonucleico (rna) de fita simples e senso positivo, planta hospedeira, composição, método para introduzir um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) em uma planta hospedeira, processo para produzir, em uma planta, um órgão de planta, um tecido de planta ou uma célula de planta, um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos), kit, uso do vetor de rna, uso da planta hospedeira, método de produção de um vetor para uso com uma planta, vetor, uso de um rna como um vetor, uso de um rna, e rna para uso como um medicamento ou no tratamento de uma doença ou afecção de um planta - Google Patents

Vetor de ácido ribonucleico (rna) de fita simples e senso positivo, planta hospedeira, composição, método para introduzir um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) em uma planta hospedeira, processo para produzir, em uma planta, um órgão de planta, um tecido de planta ou uma célula de planta, um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos), kit, uso do vetor de rna, uso da planta hospedeira, método de produção de um vetor para uso com uma planta, vetor, uso de um rna como um vetor, uso de um rna, e rna para uso como um medicamento ou no tratamento de uma doença ou afecção de um planta Download PDF

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Georgios Vidalakis
Sohrab Bodaghi
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Abstract

vetor de ácido ribonucleico (rna) de fita simples e senso positivo, planta hospedeira, composição, método para introduzir um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) em uma plantahospedeira, processo para produzir, em uma planta, um órgão de planta, um tecido de planta ou uma célula de planta, um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos), kit, uso do vetor de rna, uso da planta hospedeira, método de produção de um vetor para uso com uma planta, vetor, uso de um rna como um vetor, uso de um rna, e rna para uso como um medicamento ou no tratamento de uma doença ou afecção de um planta. a presente revelação refere-se a um vetor de rna de fita simples adequado para introduzir um agente terapêutico, como um peptídeo, uma proteína ou uma rna pequeno, em uma planta hospedeira. o vetor não codifica qualquer proteína de movimento ou proteína de revestimento, mas é capaz de realizar replicação e movimento limitados por floema e sistêmicos dentro da planta hospedeira.

Description

VETOR DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) DE FITA SIMPLES E SENSO POSITIVO, PLANTA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA INTRODUZIR UM SEGMENTO HETERÓLOGO (OU SEGMENTOS HETERÓLOGOS) EM UMA PLANTA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA PRODUZIR, EM UMA PLANTA, UM ÓRGÃO DE PLANTA, UM TECIDO DE PLANTA OU UMA CÉLULA DE PLANTA, UM SEGMENTO HETERÓLOGO (OU SEGMENTOS HETERÓLOGOS), KIT, USO DO VETOR DE RNA, USO DA PLANTA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM VETOR PARA USO COM UMA PLANTA, VETOR, USO DE UM RNA COMO UM VETOR, USO DE UM RNA, E RNA PARA USO COMO UM MEDICAMENTO OU NO TRATAMENTO DE UMA DOENÇA OU AFECÇÃO DE UM PLANTA REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido é baseado no Pedido de Patente Provisório número de série US 62/760.098, intitulado "Vectors Useful for Treating Plant Diseases and Method of Using the Same", depositado em 13 de novembro de 2018, cujo pedido é incorporado ao presente documento por referência em sua totalidade e para qual prioridade é reivindicada.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] Este pedido inclui uma ou mais Listagens de Sequência de acordo com 37 C.F.R. 1.821 et seq., que são reveladas em mídia legível por computador (nome do arquivo: 2105_0071PCT_ST25, criado em 12 de novembro de 2019, e que tem um tamanho de 37.755 bytes), cujo arquivo é incorporado ao presente documento por referência em sua totalidade.
DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO À PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL
[003] Essa invenção foi feita com o apoio do governo sob a Concessão nº AP17PPQS e T00C118 concedida pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), e sob a Concessão nº 1411836 concedida pela Fundação Nacional da Ciência (NSF). O governo dos Estados Unidos tem certos direitos sobre esta invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
[004] A presente revelação refere-se a um vetor de RNA de filamento simples adequado para introduzir um agente terapêutico, como um peptídeo, uma proteína ou uma RNA pequeno, em uma planta hospedeira, em que o movimento da mesma é substancialmente limitado ao floema e alvejado para controlar ou gerenciar uma doença ou afecção de planta.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[005] Ambos os agentes antimicrobianos gerais e altamente alvejados foram desenvolvidos para animais (por exemplo, humanos) cujos sistemas circulatórios fornecem um sistema de entrega para aplicação difundida em todo o animal. Em contraste, muito menos pesquisas foram conduzidas para desenvolver agentes terapêuticos gerais ou alvejados para plantas não geneticamente modificadas, uma vez que a falta de um sistema circulatório simplificado complica a entrega em toda a planta hospedeira. Isso é especialmente problemático em árvores grandes e de vida longa (por exemplo, citros), em que a injeção de agentes antimicrobianos pode ser rapidamente diluída. Como resultado, existem poucas soluções para o tratamento de infecções sistêmicas de plantas ou condições além da aplicação externa de pesticidas, por exemplo, para controlar o inserto alvo ou outro vetor durante a estação de crescimento, aplicações foliares para fortalecer a saúde de uma planta em geral, ou injeção cara, de curta duração de agentes alvejados ao patógeno ou vetor.
[006] As doenças e condições que afetam a citricultura são particularmente preocupantes. O Huanglongbing (HLB), também conhecido como Citrus Greening, é uma das doenças mais sérias dos citros em todo o mundo. O HLB está associado a três espécies da bactéria Candidatus Liberibacter spp. (asiaticus, africanus e americanus) e é transmitido por duas espécies de psilídeos, o psilídeo cítrico asiático (ACP) (Diaphorina citri, Kuwayama) e o psilídeo cítrico africano (Trioza erytreae, Del Guercio). O HLB é transmissível por enxerto e se espalha naturalmente quando um psilídeo que contém bactérias se alimenta de uma árvore cítrica e deposita as bactérias patogênicas no floema, em que as bactérias se reproduzem. Quando uma árvore é infectada, não há cura. Embora a fruta doente não represente uma ameaça à saúde humana, o HLB devastou milhões de hectares de plantações de citros em todo o mundo. Só nos Estados Unidos, ACP e CL asiaticus (CLas) dizimaram a citricultura da Flórida, causando bilhões de dólares em perdas de safra em um período de tempo muito curto. Além disso, o HLB se espalhou por todas as regiões produtoras de citros nos Estados Unidos. A maioria das árvores infectadas morre dentro de alguns anos devido à infecção, e as frutas ficam deformadas e com sabor estranho e, portanto, não são adequadas para consumo. De acordo com o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), toda a citricultura está sob risco considerável.
[007] A consideração de fisiologia de planta auxilia no desenvolvimento e implementação de estratégias para o gerenciamento de doenças e afecções de plantas. O sistema vascular das plantas é o principal conduto para açúcares e aminoácidos, bem como moléculas de sinalização, como pequenos ácidos ribonucleicos (RNAs), proteínas, peptídeos e hormônios,
que são necessários para um grande número de processos de desenvolvimento e respostas a estresse biótico e abiótico (Figura 1) (Lee, J.Y. e Frank, M. (2018), Plasmodesmata in phloem: different gateways for different cargoes, Curr Opin Plant Biol 43:119-124; Tugeon, R. e Wolf, S. (2009), Phloem Transport: Cellular Pathways and Molecular Trafficking, Ann Rev Plant Biol 60:207-221). Os RNAs mensageiros (mRNAs) compreendem uma parte dessas moléculas de sinalização, e milhares de mRNAs de células companheiras podem ser isolados de elementos de peneira enucleados vizinhos, em que são transportados bidirecionalmente por pressão hidrostática gerada osmoticamente a partir da fonte (geração de açúcar) do tecido para afundar (utilização de açúcar) tecido, como raízes e pontas de brotos (Folimonova, S.Y. and Tilsner, J. (2018), Hitchhikers, highway tools and roadworks: the interactions of plant viruses com the phloem, Curr Opin Plant Biol 43:82-88; Ham, B.K. e Lucas, W.J. (2017), Phloem-Mobile RNAs as Systemic Signaling Agents, Annual Rev Plant Biol 68:173-195). Acredita- se que até 50% do transcriptoma da célula companheira esteja envolvido em movimento (Kim, G. et al. (2014), Genomic-scale exchange of mRNA between a parasitic plant and its hosts, Science 345:808-811; Thieme, C.J. et al. (2015), Endogenous Arabidopsis messenger RNAs transported to distant tissues, Nature Plants 1(4):15025; Yang, Y. et al. (2015), Messenger RNA exchange between scions and rootstocks in grafted grapevines, BMC Plant Biol 15, 251), o que levanta várias questões em relação a como e por que um subconjunto substancial de mRNAs se move por longas distâncias.
Por exemplo, quão seletivo é o processo de movimento de RNA? Se houver seleção, como é facilitada? Os RNAs em trânsito são modificados (por exemplo, metilados)? Os RNAs em trânsito são encontrados em algum local subcelular específico antes de sair para o SE? Existem “códigos postais” para RNAs em trânsito? Os RNAs em trânsito são ligados por proteínas específicas e existem sequências específicas de interação? Quanto do fluxo de mRNAs é biologicamente significativo e quanto é não seletivo, uma vez que as células coletoras são presumivelmente capazes de transcrever os mesmos mRNAs?
[008] A confusão na literatura do movimento do mRNA é generalizada. Alguns estudos indicaram que o principal determinante da mobilidade do RNA é sua abundância em células companheiras (Kim, G. et al. (2014), Genomic-scale exchange of mRNA between a parasitic plant and its hosts, Science 345:808- 811; Thieme, C.J. et al. (2015), Endogenous Arabidopsis messenger RNAs transported to distant tissues, Nature Plants 1(4):15025; Yang, Y. et al. (2015), Messenger RNA exchange between scions and rootstocks in grafted grapevines, BMC Plant Biol 15, 251). A modelagem matemática foi usada para propor um modelo de difusão browniano não seletivo para o movimento do mRNA baseado principalmente em sua abundância, com meia-vida e comprimento de transcrição que também desempenha papéis (Calderwood, A. et al. (2016), Transcript Abundance Explains mRNA Mobility Data in Arabidopsis thaliana, Plant Cell 28:610- 615). No entanto, outros estudos chegaram a conclusões opostas, constatando-se que a abundância de mRNA em células companheiras não se correlaciona com o movimento (Xia, C. et al. (2018), Elucidation of the Mechanisms of Long-Distance mRNA Movement in a Nicotiana benthamiana/Tomato Heterograft System, Plant Physiol 177:745-758). Além disso, embora seja geralmente assumido que o floema não contém RNases que têm como alvo os
RNAs em trânsito (Morris, R.J. (2018), On the selectivity, specificity and signaling potential of the long-distance movement of messenger RNA, Curr Opin Plant Biol 43:1-7), Xia et al. também constataram que a maioria dos mRNAs móveis são degradados e nunca alcançam a raiz ou o tronco superior. Outros estudos constataram que a presença de uma estrutura semelhante ao tRNA prevista está associada a mais de 11% de mRNAs móveis (Zhang, W.N. et al. (2016), tRNA-Related Sequences Trigger Systemic mRNA Transport in Plants, Plant Cell 28:1237-1249), que sugere que os mRNAs móveis podem abrigar “códigos postais” específicos. No entanto, outros mRNAs abundantes que contêm motivos semelhantes ao tRNA não eram móveis (Xia, C. et al. (2018), Elucidation of the Mechanisms of Long-Distance mRNA Movement in a Nicotiana benthamiana/Tomato Heterograft System, Plant Physiol 177:745-758). Assim, estudos anteriores não conseguiram identificar e desenvolver um sistema modelo consistindo em um RNA móvel altamente abundante, cujo movimento é rastreável em tecidos vivos sob diferentes condições celulares.
[009] Os vírus de plantas, muitos dos quais se movem pela planta como um complexo de ribonucleoproteína (vRNP), evoluíram para usar a mesma via usada pelo movimento de RNA endógeno. Os vírus de plantas podem se acumular em quantidades substanciais e a maioria inicia a infecção em células epidérmicas ou mesofílicas e, em seguida, movem-se célula a célula por meio de conectores intercelulares altamente seletivos chamados plasmodesmas, que permitem a continuidade entre o citoplasma das células vizinhas (Figura 1; consulte também Lee, J.Y. e Frank, M. (2018), Plasmodesmata in phloem: different gateways for different cargoes, Curr Opin Plant Biol
43:119-124; Schoelz, J.E. et al. (2011), Intracellular transport of plant viruses: finding the door out of the cell, Mol Plant 4:813-831). O movimento sistêmico de longa distância (folha a folha) requer que o vírus entre nas células companheiras, em que a replicação ocorre, seguida pela saída da progênie para os elementos da peneira, transitando-se através dos plasmodesmos ramificados especializados que conectam as células companheiras e os elementos da peneira. Uma vez que os elementos da peneira tubular são alcançados, os vírus se movem passivamente com o fluxo de fotoassimilado do floema e estabelecem infecções sistêmicas ao sair (Folimonova, S.Y. e Tilsner, J. (2018), Hitchhikers, highway tolls and roadworks: the interactions of plant viruses with the phloem, Curr Opin Plant Biol 43:82-88).
[0010] Para vírus que transitam pelo floema como vRNPs, o movimento é semelhante ao dos mRNAs do hospedeiro. Todos os vírus de plantas codificam pelo menos uma proteína de movimento necessária para o movimento, que se liga ao RNA viral e também dilata os plasmodesmos. Assim, o movimento do mRNA do hospedeiro provavelmente também requer proteínas de movimento codificadas pelo hospedeiro semelhantes. As proteínas de movimento são proteínas de ligação a RNA não específicas. No entanto, as questões permanecem em relação a como os vRNPs carregam no floema e descarregam nos tecidos distais, embora a reprogramação da expressão do gene da célula companheira possa ser necessária. (Collum, T.D. et al. (2016), Tobacco mosaic virus-directed reprogramming of auxin/indole acetic acid protein transcriptional responses enhances virus phloem loading, Proc Natl Acad Sci USA 113:E2740-E2749). Se o tráfego de mRNA é tão difundido e inespecífico, não ficou claro por que os vírus de RNA requerem suas próprias proteínas de movimento codificadas. Alguns pesquisadores sugeriram que os vírus de RNA requerem proteínas de movimento quando se movem como complexos de replicação pré-formados que incluem uma grande polimerase de RNA dependente de RNA (Heinlein, M. (2015), Plant virus replication and movement, Virology 479:657-671), que está além do limite de exclusão de tamanho (~70 kDa) de plasmodesmata de células companheiras. Também não ficou claro por que e como alguns vírus são limitados pelo floema. Por exemplo, os closterovírus limitados ao floema têm pelo menos 5 proteínas de movimento e a limitação do floema pode ser aliviada pela superexpressão do supressor de silenciamento e regulação negativa das defesas do hospedeiro (Folimonova, S.Y. e Tilsner, J. (2018), Hitchhikers, highway tolls and roadworks: the interactions of plant viruses with the phloem, Curr Opin Plant Biol 43:82-88), o que sugere que a limitação do floema é um processo complexo para alguns vírus. A limitação do floema também pode ser um processo ativo (em oposição à falta de uma proteína de movimento célula a célula). Por exemplo, alterar um domínio da proteína de movimento do vírus de papel da folha da batata conferiu a capacidade de sair do floema (Bendix, C., e Lewis, J.D. (2018), The enemy within: phloem-limited pathogens, Mo Plant Path 19:238-254).
[0011] Uma conexão direta entre o movimento de mRNAs do hospedeiro e o movimento de vRNP foi estabelecida quando a origem das proteínas de movimento do vírus de planta foi resolvida. Foi constatado uma proteína de abóbora (RPB50) relacionada à proteína de movimento do vírus de mosaico de pepino que era capaz de transportar seu próprio mRNA, bem como outros mRNAs, para o floema (Xoconostle-Cazares, B. et al.
(1999), Plant paralog to viral movement protein that potentiates transport of mRNA into the phloem, Science (New York, NY) 283:94-98; Ham, B.K. et al. (2009), A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex, Plant Cell 21:197- 215). Uma população complexa dessas proteínas de movimento endógeno, conhecidas como proteínas autônomas não celulares (NCAPs), foram propostas como sendo responsáveis pelo tráfego de mRNAs de longa distância no floema (Gaupels, F. et al.. (2008), Nitric oxide generation in Vicia faba phloem cells reveals them to be sensitive detectors as well as possible systemic transducers of stress signals, New Phytol 178:634- 646; Gomez, G. et al. (2005), Identification of translocatable RNA-binding phloem proteins from melon, potential components of the long-distance RNA transport system, Plant J 41:107-116; Kim, M. et al. (2001), Developmental changes due to long- distance movement of a homeobox fusion transcript in tomato, Science (New York, NY) 293:287-289; Pallas, V. e Gomez, G. (2013), Phloem RNA-binding proteins as potential components of the long-distance RNA transport system, Front Plant Sci 4:130; Yoo, B.C. et al. (2004), A systemic small RNA signaling system in plants, Plant Cell 16:1979-2000).
[0012] Visto que a constatação do mesmo (Deom, C.M. et al. (1987), The 30-kilodalton gene product of tobacco mosaic virus potentiates virus movement, Science (New York, NY) 237:389-394), uma série de proteínas de movimento viral foram identificadas que são responsáveis pelo tráfego intracelular de vRNPs para os plasmodesmas, bem como pelo movimento célula a célula e de longa distância (Tilsner, J. (2014), Techniques for RNA in vivo imaging in plants, J
Microscopy 258(1):1-5). vírus (por exemplo, umbravírus), o movimento de célula a célula e de longa distância estão associados a múltiplas proteínas de movimento (Ryabov, E.V. et al. (2001), Umbravirus-encoded proteins both stabilize heterologous viral RNA and mediate its systemic movement in some plant species, Virology 288:391-400). Por exemplo, closterovírus, como vírus tristeza de citros, contém três proteínas de movimento. No entanto, para a maioria dos vírus, acredita-se que todas as atividades de movimento estejam associadas a uma única proteína de movimento.
[0013] A distribuição de agentes terapêuticos projetados em plantas para combater doenças, insetos ou outras condições adversas (por exemplo, como HLB e/ou os insetos transportadores) usando vetores de vírus é um meio estabelecido de introdução de traços, como resistência a patógenos ou outras propriedades desejadas em plantas para propósitos de pesquisa. Vários métodos de fornecimento de vetores a plantas são conhecidos na técnica. Isso é frequentemente alcançado pela entrega do vetor de vírus no núcleo de uma célula de planta por "agroinfiltração" mediada por tumefações de agrobactéria, que pode resultar em uma modificação do genoma dessa célula, ou pela entrega do vetor de vírus diretamente no citoplasma de uma célula, o que resulta em infecção sem a necessidade de modificação genômica. No caso de agroinfiltração, o cDNA do genoma viral é introduzido no T-DNA, que é então fornecido às plantas. Esse T-DNA compreende outros componentes reguladores de DNA, que permitem a transcrição do genoma. Um inserto de DNA é anexada a um vetor de cDNA de vírus que é capaz de infectar a planta-alvo. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus e o inserto são transcritos em RNA dentro das células da planta, após o que o vírus se comporta como um vírus de RNA normal (amplificação e movimento). Assim, para atuar como um vetor eficaz, um vírus deve ser projetado para aceitar inserções sem desativar sua funcionalidade e para garantir que o vírus projetado seja capaz de se acumular sistemicamente no hospedeiro a um nível suficiente para entregar e, em alguns casos, expressar o inserto (ou insertos). Esses insertos, sejam estruturas de leitura aberta (ORFs) que serão traduzidas em proteínas ou RNAs que serão usadospara uma função benéfica, devem ser entregues no tecido-alvo de uma maneira que seja eficaz e suficientemente não tóxica para o hospedeiro ou para qualquer consumo a jusante do hospedeiro ou do ambiente. No entanto, existe apenas um número limitado de vetores virais que atendem aos critérios acima e estão disponíveis apenas para certas plantas (por exemplo, vírus do chocalho do tabaco para tabaco). Infelizmente, não existe um vetor viral adequado conhecido, ou apenas vetores virais insuficientes, para a maioria das plantas, particularmente para árvores e videiras de vida longa.
[0014] Assim, a capacidade de implementar terapias de RNA ou DNA em uma ampla base é substancialmente limitada com as tecnologias existentes. Mais de 1.000 vírus de plantas foram identificados com muitas plantas sujeitas a infecção por vários vírus. Por exemplo, as árvores cítricas estão sujeitas a Vírus da mancha da folha cítrica, Vírus da rugose da folha cítrica, Vírus da leprose cítrica C, Vírus da psorose cítrica, Vírus associado à morte súbita de citros, Vírus da tristeza dos citros (CTV), Vírus de variegação de citros, Vírus de enação de nervuras de citros e Vírus do mosaico amarelo de citros, entre outros. No entanto, o CTV, o agente causal de doenças catastróficas dos citros, como o declínio rápido e a corrosão do caule, é atualmente o único vírus desenvolvido como vetor para a liberação de agentes no floema dos citros.
[0015] CTV é um membro do gênero Closterovirus. Possui um vírion em formato de bastão flexível composto por duas proteínas do capsídeo com dimensões de 2.000 nm de comprimento e 12 nm de diâmetro. Com um genoma de mais de 19 kb, o CTV (e outros Closterovírus) são os maiores vírus de RNA conhecidos que infectam plantas. É um patógeno virulento que é responsável por matar ou tornar inúteis milhões de árvores cítricas em todo o mundo, embora a forma de vetor projetada seja derivada de uma cepa menos virulenta, pelo menos para as árvores cítricas da Flórida (ainda altamente virulentas nas árvores da Califórnia). Estudos anteriores demonstraram supostamente que vetores com base em CTV expressam insertos projetados em células de planta (documentos números US 8389804; US 20100017911 A1). No entanto, não foi comercializado devido à sua capacidade inconsistente de se acumular nas plantas e atingir o resultado benéfico desejado. Pensa-se que a incapacidade do CTV de se replicar em níveis suficientemente altos e a sensibilidade ao calor limita sua capacidade de gerar uma quantidade suficiente de RNA para tratamento.
[0016] Assim, os vetores com base em CTV têm uma capacidade muito limitada de entregar uma carga útil benéfica eficaz quando necessário. Além disso, o CTV é difícil de trabalhar devido ao seu grande tamanho. O CTV também está sujeito a exclusão de superinfecção, em que um vetor com base em CTV é incapaz de infectar uma árvore já infectada com CTV. O CTV também é altamente transmissível de planta para planta por meio de várias espécies de pulgões, uma propriedade não apreciada pelos reguladores preocupados com a fuga descontrolada para o meio ambiente, em que pode sofrer mutação ou interagir com outros hospedeiros de maneiras indesejáveis. Além disso, as cepas adequadas para uma região (por exemplo, Flórida) são inadequadas para variedades de árvores em outra região (por exemplo, Califórnia). Apesar de tais problemas, o CTV é a única plataforma de vetor viral disponível para árvores cítricas.
[0017] Consequentemente, há uma necessidade de um agente infeccioso que resolva alguns ou todos os problemas mencionados acima, e que seja capaz de introduzir uma propriedade desejável e/ou distribuir um agente terapêutico (ou agentes terapêuticos) em uma planta, particularmente uma planta de longa vida como uma árvore ou videira.
SUMÁRIO
[0018] A presente revelação se refere a um agente infeccioso (ou agentes infecciosos) inovador capazes de distribuir insertos exógenos em uma planta, composições que compreende uma planta infectada pelo agente (ou agentes) revelado e métodos e usos relacionados aos mesmos. Os agentes revelados são às vezes chamados no presente documento de "RNAs móveis de forma independente" ou "iRNAs". Apesar de serem RNAs de filamento simples infecciosos, os iRNAs não são vírus, pois não codificam para nenhuma proteína de movimento (ou proteínas de movimento) ou supressores de silenciamento de RNA, que são características-chave de todos os vírus de plantas conhecidos. Além disso, ao contrário de praticamente todos os vírus de RNA de plantas, com exceção dos umbravírus, os iRNAs também não codificam uma proteína de revestimento para encapsular o RNA em vírions, que é um requisito para o movimento vetorial dos vírus de planta em planta. Apesar da falta de expressão da proteína de movimento, os iRNAs são capazes de se mover sistemicamente dentro do floema em uma planta hospedeira. Em comparação com os vírus, os iRNAs têm propriedades vantajosas adicionais, como: a capacidade de se acumular em níveis superiores aos da maioria dos vírus de plantas conhecidos; tamanho relativamente pequeno, por exemplo, sendo apenas cerca de dois terços do tamanho do menor vírus de RNA de planta e, portanto, muito mais fácil de trabalhar em comparação com tais vírus de RNA de planta convencionais; e a incapacidade de se espalhar por conta própria para outras plantas (devido à sua incapacidade de codificar qualquer proteína de revestimento).
[0019] De acordo com as modalidades reveladas, um agente infeccioso compreende um vetor com base em iRNA que contém um inserto projetado, que desencadeia uma expressão de planta de um peptídeo alvejado, proteína (ou proteínas) e/ou produz pequenos RNAs alvejados que são clivados do vetor para aplicações benéficas. Os aspectos da presente revelação incluem: um vetor com base em iRNA para distribuição de agentes antipatogênicos alvejados; uma enzima antibiótica antibacteriana direcionada a bactérias que infectam uma planta ou bactérias exigidas pelo vetor de inseto; um enzibiótico que é gerado a partir do TEV IRES; incorporação de siRNAs no genoma de iRNA; incorporação de insertos em uma estrutura de bloqueio e encaixe para estabilizar a base de uma armação que suporta os insertos; incorporação de siRNAs de um genoma de iRNA que foi modificado para aumentar a estabilidade da região local para combater precisamente os efeitos desestabilizadores dos insertos; incorporação de um siRNA que interrompe ou mata um vetor de inseto-alvo; incorporação de um siRNA que mitiga os impactos negativos da produção calejada de uma árvore; incorporação de um siRNA que mitiga o reconhecimento do patógeno pela planta; e incorporação de um inserto que desencadeia um traço particular da planta (por exemplo, nanismo). Assim, os agentes infecciosos e composições revelados no presente documento possuem propriedades superiores e vantajosas em comparação com as tecnologias convencionais.
[0020] Os vetores com base em iRNA da presente revelação são adequados para uso como uma plataforma geral para a expressão de várias proteínas e/ou entrega de pequenos RNAs no floema de citros e outras plantas hospedeiras. Em algumas implementações, um vetor com base em CYVaV é fornecido, o qual se acumula em níveis massivos na célula companheira e na célula do parênquima do floema. Os vetores da presente revelação podem ser utilizados para examinar os efeitos do silenciamento da expressão gênica específica no floema de árvores. Além disso, o CYVaV pode ser desenvolvido em um sistema modelo para examinar o movimento de longa distância de mRNAs através de elementos de peneira. Uma vez que o CYVaV é capaz de infectar virtualmente todas as variedades de citros, com poucos ou nenhum sintoma gerado nas plantas infectadas, o movimento de RNAs dentro das plantas lenhosas pode ser prontamente examinado.
[0021] De acordo com as modalidades reveladas, a presente revelação é direcionada a um vetor de ácido ribonucleico (RNA) de filamento simples e senso positivo que compreende um elemento de replicação (ou elementos de replicação) e um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos), sendo que o vetor de RNA carece de uma fase de leitura aberta (ORF) de proteína de revestimento funcional (ou proteínas de revestimento funcionais) e um ORF de proteína de movimento funcional (ou proteínas de movimento funcionais). Em algumas implementações, o vetor de RNA compreende um Intensificador de Tradução Independente de Cap 3' (3’ CITE) que compreende a sequência de ácidos nucleicos (ou sequências de ácidos nucleicos) de SEQ ID NO: 4 e/ou SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o 3’ CITE compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 3.
[0022] Em algumas modalidades, o elemento de replicação (ou elementos de replicação) do vetor de RNA compreende uma ou mais sequências de polinucleotídeos conservadas com a sequência de ácido nucleico de: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 14. Em algumas implementações, o elemento de replicação (ou elementos de replicação) adicional ou alternativamente compreende uma ou mais sequência de polinucleotídeos (ou sequências de polinucleotídeos) conservadas com a sequência de ácido nucleico de: SEQ ID NO: 15 e/ou SEQ ID NO: 16.
[0023] Em algumas modalidades, o vetor de RNA é derivado do vírus das nervuras amarelas dos citros (SEQ ID NO: 1) ou de um iRNA relativo ao mesmo. Os vetores de RNA da presente revelação são capazes de movimento sistêmico e limitado pelo floema e replicação dentro de uma planta hospedeira. Os vetores de RNA da presente revelação são funcionalmente estáveis para replicação, movimento e/ou tradução dentro da planta hospedeira por pelo menos um mês após a infecção da mesma.
[0024] Em algumas modalidades, o segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) do vetor de RNA da presente revelação compreende um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula repórter, um peptídeo e uma proteína. Em algumas implementações, o polipeptídeo é um inseticida, um antibacteriano, um antiviral ou um antifúngico. Em algumas implementações, o antibacteriano é um enzibiótico. Em algumas implementações, o antibacteriano tem como alvo uma espécie de bactéria Candidatus Liberibacter, por exemplo, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas).
[0025] Em algumas modalidades, o segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) do vetor de RNA da presente revelação compreende uma pequena molécula de RNA não codificante e/ou uma molécula de RNA de interferência. Em algumas implementações, a pequena molécula de RNA não codificante e/ou a molécula de RNA interferente tem como alvo um vetor de inseto, um vírus ou um fungo. Em algumas implementações, a pequena molécula de RNA não codificante e/ou a molécula de RNA interferente tem como alvo um ácido nucleico do vetor de inseto, o vírus ou o dito fungo. Em algumas implementações, o vírus alvejado é selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da enação de nervuras dos citros (CVEV) e vírus da tristeza cítrica (CTV).
[0026] Deve ser entendido que o vetor de RNA pode incluir vários segmentos heterólogos, sendo que cada um fornece a mesma funcionalidade ou uma funcionalidade diferente. Em algumas modalidades, o segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) é um primeiro segmento heterólogo, em que o vetor de RNA compreende ainda um segundo segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos), em que o elemento de replicação (ou elementos de replicação) é intermediário ao primeiro e ao segundo segmentos heterólogos.
[0027] Em algumas modalidades, o segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) do vetor de RNA da presente revelação compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína ou peptídeo que altera um traço fenotípico. Em algumas implementações, o traço fenotípico é selecionado a partir do grupo que consiste em tolerância à pesticida, tolerância à herbicida, resistência a inseto, produção de calose reduzida, aumento na taxa de cultivo e nanismo.
[0028] A presente revelação também é direcionada a uma planta hospedeira que compreende o vetor de RNA da presente revelação. A planta hospedeira pode ser uma planta inteira, um órgão da planta, um tecido da planta ou uma célula de planta. Em algumas implementações, a planta hospedeira está em um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em citros, vitis, ficus e olea. Em algumas implementações, a planta hospedeira é uma árvore cítrica ou um enxerto de árvore cítrica.
[0029] A presente revelação também se refere a uma composição que compreende uma planta, um órgão da planta, um tecido da planta ou uma célula da planta infectada com o vetor de RNA da presente revelação. Em algumas implementações, a planta está em um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em citros, vitis, ficus e olea. Em algumas implementações, a planta é uma árvore cítrica ou um enxerto de árvore cítrica.
[0030] A presente revelação também se refere a um método para a introdução de segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) em uma planta hospedeira, que compreende a introdução na planta hospedeira do vetor de RNA da presente revelação. Em algumas modalidades, a etapa de introdução do segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) na planta hospedeira compreende enxertar um órgão da planta ou tecido da planta de uma planta que compreende o vetor de RNA da presente revelação para um órgão da planta ou tecido da planta de outra planta que não compreende o vetor de RNA antes da dita introdução. Os vetores de RNA da presente revelação são capazes de infectar sistemicamente a planta hospedeira.
[0031] A presente revelação também é direcionada a um processo de produção em uma planta, um órgão da planta, um tecido da planta ou uma célula da planta um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos), que compreende a introdução na dita planta, no dito tecido da planta ou na dita célula da planta, o vetor de RNA da presente revelação. Em algumas modalidades, a planta está em um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em citros, vitis, ficus e olea.
[0032] A presente revelação também se refere a um kit que compreende o vetor de RNA da presente revelação.
[0033] A presente revelação também é direcionada ao uso do vetor (ou vetores) de RNA da presente revelação para a introdução do segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) em uma planta, um órgão da planta, um tecido da planta ou uma célula da planta. A presente revelação também é direcionada ao uso da planta hospedeira (ou plantas hospedeiras) da presente revelação, ou uso da composição (ou composições) da presente revelação, para a introdução do vetor (ou vetores) de RNA em um órgão da planta ou tecido da planta que não, antes da dita introdução, compreender o vetor de RNA. Em algumas implementações, a etapa de introdução do vetor de RNA compreende enxertar um órgão de planta ou tecido de planta de uma planta que compreende o vetor de RNA em um órgão de planta ou tecido de planta de outra planta que não compreende o vetor de RNA.
[0034] A presente revelação também é direcionada a um método de produção de um vetor para uso com uma planta que compreende as etapas de inserto de um ou mais segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) em um RNA, em que o RNA é selecionado a partir do grupo que consiste em: CYVaV; um relativo de CYVaV; outros vetores de RNA que têm pelo menos 70% de identidade de RdRp com CYVaV; e outro iRNA. A presente revelação também se refere a um vetor produzido pelo método (ou métodos) revelado.
[0035] A presente revelação também se refere ao uso de uma molécula de RNA como um vetor, em que o RNA é selecionado a partir do grupo que consiste em: CYVaV; um relativo de CYVaV; outros vetores de RNA que têm pelo menos 70% de identidade de RdRp com CYVaV; e outro iRNA. Em algumas implementações, o RNA é usado no tratamento de uma planta, por exemplo, o tratamento de uma infecção viral ou bacteriana de uma planta, por exemplo, o tratamento de infecção por CTV ou ecologização de citros em uma planta de citros. O RNA é modificado com um ou mais segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) inserido, por exemplo, um enzibiótico.
[0036] A presente revelação também é direcionada ao uso de uma molécula de RNA caracterizada por estar na fabricação de um medicamento para tratar uma doença ou afecção de uma planta, em que o RNA é selecionado a partir do grupo que consiste em: CYVaV; um relativo de CYVaV; outros vetores de RNA que têm pelo menos 70% de identidade de RdRp com CYVaV;
e outro iRNA. Em algumas implementações, a doença ou afecção é uma infecção viral ou bacteriana de uma planta, por exemplo, CTV ou ecologização de Citro em uma planta Citro.
[0037] A presente revelação também é direcionada a uma molécula de RNA para uso como um medicamento ou no tratamento de uma doença ou afecção de um planta, sendo que o RNA é selecionado a partir do grupo que consiste em: CYVaV; um relativo de CYVaV; outros vetores de RNA que têm pelo menos 70% de identidade de RdRp com CYVaV; e outro iRNA.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0038] A Figura 1 ilustra esquematicamente as vias de movimento através do sistema vascular de plantas (Lee, J.Y. e Frank, M. (2018), plasmodosmatos in phloem: different gateways for different cargoes, Curr Opin Plant Biol 43:119- 124).
[0039] A Figura 2 é uma árvore filogênica que mostra relação do CYVaV com algum vírus na família Tombusviridae.
[0040] A Figura 3 ilustra esquematicamente a organização de genoma de CYVaV e moléculas de RNA semelhantes (Painel A). ORFs que codificam para proteínas envolvidas na replicação são identificados em cinza mais escuro (p33 e p94 para PEMV2; p21 e p81 para CYVaV; p35 e p86 para PMeV2-ES; p31 e p85 para PUV; p29 e p89 para TBTVa). O umbravírus PEMV2 também possui ORFs que codificam para as proteínas p26 e p27 envolvidas no movimento (identificadas em caixas cinza claro). O sítio de gravação de ribossomo de deslocamento de quadro (FS) e o sítio de recodificação de ribossomo de leitura (RT) também são identificados. Níveis de filamentos CYVaV positivo (+) em folhas infiltradas de N. benthamiana (Painel B, topo)
e folhas sistêmicas (Painel B, fundo) são mostrados. Os níveis da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) sintetizada por deslocamento in vitro em extratos de germe de trigo de CYVaV e PEMV2 de comprimento total são mostrados (Painel C). A diferença nos níveis de p94 de PEMV2 em comparação com a polimerase de p81 produzida por CYVaV é significativa. O sítio de deslocamento do CYVaV é um dos mais fortes conhecidos em virologia e acredita-se ser o responsável por seu acúmulo excepcionalmente alto.
[0041] A Figura 4 ilustra esquematicamente a organização de genoma de iRNAs adicionais e relativos próximos de CYVaV identificados em Opuntia, figueiras e milho etíope. Todos os relativos de iRNA têm insertos no 3’UTR e outras alterações de nucleotídeos que resultam na geração de uma ORF que codifica para uma proteína (p21.2) de função desconhecida.
[0042] A Figura 5 mostra os níveis de RNA de folhas agro-infiltradas de Nicotiana benthamiana. CVEV (pistas 1-2), CVEV + CYVaV (pistas 3-5) e CYVaV (pistas 5-8) em folhas de Nicotiana benthamiana. A acumulação de CYVaV aumentou substancialmente na presença do vírus auxiliar putativo CVEV. Os filamentos positivos são mostrados acima. Os controles de carregamento de rRNA são mostrados abaixo. O supressor de silenciamento p14 foi co-infiltrado em todas as folhas.
[0043] A Figura 6 mostra os níveis de RNA de outra experiência com folhas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana. CYVaV ou CVEV ou CYVaV + CVEV agroinfiltrado em folhas de N. benthamiana. CYVaV foi encapsidado em vírions de CVEV, e os vírions foram isolados uma semana depois e os RNAs encapsidados submetidos à análise de PCR.
[0044] A Figura 7 mostra os sintomas de amarelecimento de CYVaV (Painel A) e CYVaV + CVEV (Painel B), que são limitados a cidra (foto), limão e lima.
[0045] A Figura 8 mostra o movimento sistêmico e limitado pelo floema do CYVaV em N. benthamiana, em que o CYVaV está confinado aos tecidos de transporte da planta. O imageamento de hibridização in situ fluorescente (FISH) que detecta mais os filamentos de CYVaV foram corados em rosa (com áreas geralmente mostradas no presente documento com linhas brancas tracejadas e círculos) são mostrados nos painéis AG, incluindo vistas longitudinais e transversais dos pecíolos (painéis AD) e tecido de raiz (Painéis EG). O tecido foi manchado com DAPI. Células companheiras (CC), células do parênquima do floema (PPC) e elementos de peneira (SE) e xilema (XL) são identificados. Observe que o iRNA é totalmente restrito ao SE, CC e PPC. Azul (mostrado no presente documento como áreas cinza escuro ou pretas) é da coloração DAPI de DNA endógeno. CYVaV is symptomless in virtually all tested citrus.
[0046] A Figura 9 ilustra esquematicamente a estrutura secundária de comprimento total do CYVaV conforme determinado por sondagem da estrutura SHAPE e comparações filogenéticas com os relativos do CYVaV em Opuntia, figueira e milho. O sítio de recodificação de deslocamento (consulte a Figura 10) é identificado pela região de linha sólida única em caixa, e o ISS-like (estrutura em formato de I) 3’CITE (consulte a Figura 11) é identificado pela região de linha tracejada em caixa. Por exemplo, uma região para acomodar o grampo (ou grampos) inserido é mostrada pela região de linha dupla em caixa.
[0047] A Figura 10 ilustra esquematicamente a estrutura dos sítios de deslocamento de recodificação em CYVaV e PEMV2 (Painel A). CYVaV tem múltiplas conformações das estruturas nessa região (consulte a Figura 9) com apenas uma mostrada. O sítio escorregadio é identificado por uma linha pontilhada em caixa e as bases do códon de parada estão em círculos pretos. As bases identificadas por uma linha sólida em caixa se envolvem em uma interação de longa distância com a extremidade 3'.
[0048] A Figura 11 ilustra esquematicamente o potencializador de tradução independente de Cap 3’semelhante a ISS (3’CITE) de CYVaV. A estrutura da extremidade 3'do CYVaV é mostrada. O 3’CITE é ilustrado na parte mais à esquerda mostrada e com as bases circuladas. A sequência identificada por uma linha contínua em caixa se engaja na interação de longa distância RNA: RNA com o sítio de recodificação.
[0049] A Figura 12 ilustra resultados de um ensaio de trans inibição. CYVaV de comprimento total foi traduzido in vitro na presença de excesso molar de 10 vezes de uma versão truncada do ISS (ISSS) ou ISS de tamanho completo (ISSL).
[0050] A Figura 13 demonstra que CYVaV não codifica um supressor de silenciamento. Com referência aos painéis A e B, as plantas de N. benthamiana 16C foram agroinfiltradas com um construto que expressa GFP (que é silenciado nessas plantas) e construtos que expressam CYVaV p21 ou p81, ou construtos que expressam supressores de silenciamento conhecidos p19 (de TBSV) ou p38 ( de TCV). Apenas p19 e p38 suprimem o silenciamento de GFP, permitindo que a fluorescência verde seja expressa (regiões infiltradas identificadas por linha tracejada circulada no Painel B). Com referência ao Painel C, a mancha norte sondada com o oligonucleotídeo GFP mostrou que o RNA GFP ainda é silenciado na presença de p21 ou p81.
[0051] A Figura 14 demonstra replicação de CYVaV em protoplastos de Arabidopsis. Um clone infeccioso de CYVaV foi gerado. Transcritos de RNA de tipo selvagem (CYVaV) ou transcritos que contêm uma mutação no sítio escorregadio de recodificação que elimina a síntese do RdRp (CYVaV-fsm) e, portanto, não se replica, foram inoculados em protoplastos de Arabidopsis. O RNA foi extraído e uma mancha norte realizada 30 horas depois. Observe que os transcritos inoculados de CYVaV-fsm ainda estavam presentes nos protoplastos em 30 horas (enquanto em um vírus tradicional seriam indetectáveis após 4 horas). os filamentos positivos são mostrados no Painel A e o intermediário de replicação do filamento negativo é mostrado no Painel B.
[0052] A Figura 15 demonstra replicação de CYVaV em N. benthaminana. Com referência ao Painel A, é mostrado o nível de CYVaV que se acumula nas folhas infiltradas de N. benthamiana, conforme determinado por mancha norte. Com referência ao Painel B, as plantas infiltradas com CYVaV esporadicamente mostraram sintomas sistêmicos (consulte a Figura 16). Essas plantas acumularam altos níveis de CYVaV. Com referência ao Painel C, é mostrado o nível de CYVaV em folhas individuais de uma planta infectada sistemicamente. As folhas 4 e 5 foram agroinfiltradas com CYVaV. Observe o acúmulo substancial de CYVaV nas folhas mais novas.
[0053] A Figura 16 mostra sintomas de N. benthamiana sistemicamente infectada com CYVaV. As folhas 4 e 5 foram agroinfiltradas com CYVaV. O primeiro sinal de uma planta infectada sistemicamente é uma folha "em forma de concha" (Painel A), que quase sempre era a folha 9. Nas semanas seguintes, galhas foliares surgiram no meristema apical e em cada nó da planta (Painel B). Uma planta não infectada (Painel C, à esquerda) e uma planta infectada (Painel C, à direita) com a mesma idade são mostradas. As plantas infectadas sistemicamente também tinham galhas na raiz (Painel D), que contém uma quantidade substancial de CYVaV como evidenciado pela mancha norte de planta (Painel E).
[0054] A Figura 17 é uma imagem de um tomateiro 53 dias após a infecção (esquerda) com uma planta da mesma idade (direita), e demonstrando a excepcional variedade de hospedeiros do CYVaV. A seiva de uma planta N. benthamiana infectada sistemicamente foi injetada no pecíolo de um tomateiro. Uma das quatro plantas apresentou sintomas muito fortes e foi positiva para CYVaV por análise de PCR.
[0055] A Figura 18 demonstra que o CYVaV se liga a uma proteína altamente abundante extraída do floema do pepino. Referindo-se ao Painel A, CYVaV de comprimento total marcado ligado a uma proteína proeminente nessa mancha noroeste. As proteínas foram renaturadas após eletroforese em gel de SDS. Acredita-se que esta proteína seja uma proteína de ligação a RNA altamente conservada conhecida, que contém um motivo RRM que é conhecido por acompanhar os RNAs de células companheiras em elementos de peneira no floema do pepino. Com referência ao Painel B, nenhuma ligação foi observada quando as proteínas permaneceram desnaturadas após a eletroforese.
[0056] A Figura 19 demonstra que CYVaV é capaz de expressar uma proteína extra de seu 3’UTR usando um TEV IRES. A localização de três insertos separadas (em três construções separadas) de nanoluciferase a jusante do sítio de entrada do ribossomo interno (IRES) do vírus da gravação do tabaco (TEV)
é mostrada (Painel A). A tradução in vitro foi medida em extratos de germe de trigo para as três construções (Painel B). Observe que a localização da proteína nanoluciferase (Nluc) está perto da parte inferior do gel. A expressão da nanoluciferase foi medida em protoplastos in vivo (Painel C). Os transcritos de RNA de comprimento total das construções (Painel A) foram transformados em protoplastos; 18 horas depois, a proteína total foi extraída e a atividade da nanoluciferase medida em um luminômetro.
[0057] A Figura 20 ilustra um inserto de grampo estável na posição 2250. Uma representação esquemática de CY2250sfPDS60 é mostrada no Painel A. A localização do inserto na estrutura secundária de CYVaV é mostrada no Painel B, cuja localização corresponde a uma região para acomodar grampos inseridos, conforme mostrado pela caixa de linha dupla na Figura 9. Dados de ensaio de tradução in-vitro de extrato de gérmen de trigo de transcritos de T7 de vetores CYVaV-wt e CYVaV VIGS que contêm diferentes quantidades de sequência na posição 2250 são mostrados no Painel C. Por exemplo, o construto sfPDS60 demonstrou excelente movimento sistêmico em plantas. Análise de mancha norte de RNA total isolado de protoplastos de A. thaliana infectados por vetores CYVaV wt e CYVaV VIGS. O controle negativo de CYVaV-GDD é mostrado no Painel D. (+) representa os filamentos positivos e (-) são intermediários de replicação do filamento negativo. Uma imagem de N. benthamiana infectada por CY2250sfPDS60 é mostrada no Painel E. Os produtos de RT-PCR da folha local e folha sistêmica são mostrados no Painel F. O conjunto de iniciadores amplifica as posições 1963-2654 na região 3' de CYVaV. A sequência da região de inserto (sublinhada) do vetor coletado da folha sistêmica é mostrada no Painel G, com sequências de caixa de linha tracejada em cada lado da inserto que forma a haste do grampo.
[0058] A Figura 21 ilustra um inserto de grampo estável na posição 2301. Uma representação esquemática de CY2301sfPDS60 é mostrada no Painel A. A localização do inserto na estrutura secundária de CYVaV é mostrada no Painel B e corresponde a uma região para acomodar grampos inseridos, conforme mostrado pela caixa de linha dupla na Figura 9. Dados de ensaio de tradução in-vitro de extrato de gérmen de trigo de transcritos de T7 de vetores CYVaV-wt e CYVaV VIGS que contêm diferentes quantidades de sequência nas posição 2301 e 2319 são mostrados no Painel C. Por exemplo, o construto PDS60 demonstrou excelente movimento sistêmico em plantas. Análise de mancha norte de RNA total isolado de protoplastos de A. thaliana infectados por vetores CYVaV wt e CYVaV VIGS. O controle negativo e CYVaV-GDD é mostrado no Painel D. (+) representa os filamentos positivos e (-) são intermediários de replicação do filamento negativo. Uma imagem de N. benthamiana infectada por CY2301sfPDS60 é mostrada no Painel E. Os produtos de RT-PCR da folha local e folha sistêmica são mostrados no Painel F. O conjunto de iniciadores amplifica as posições 1963- 2654 na região 3' de CYVaV. A sequência da região de inserto do vetor de vírus coletado da folha sistêmica é mostrada no Painel G, com as sequências em caixa de linha tracejada que forma a haste do grampo.
[0059] A Figura 22 ilustra um inserto de grampo estável na posição 2319. Uma representação esquemática de CY2319sfPDS60 é mostrada no Painel A. A localização do inserto na estrutura secundária de CYVaV é mostrada no Painel B e corresponde à região para acomodar grampos inseridos, mostrado pela caixa de linha dupla na Figura 9. Os dados do ensaio de tradução in-vitro de extrato de gérmen de trigo de transcritos de T7 de vetores CYVaV-wt e CYVaV VIGS que contêm diferentes quantidades de sequência na posição 2301 e 2319 são mostrados na Figura 21, Painel C. Análise de mancha norte de RNA total isolado de protoplastos de A. thaliana infectados pelos vetores CYVaV wt e CYVaV VIGS. CYVaV-GDD e controle negativo também são mostrados na Figura 21, Painel D. Uma imagem de N. benthamiana infectada por CY2319sfPDS60 é mostrada no Painel C. Os produtos de RT-PCR da folha local e folha sistêmica são mostrados no Painel D. O iniciador definir as posições de amplificação 1963-2654 na região 3’ de CYVaV.
[0060] A Figura 23 ilustra a localização de um inserto de 60 nt (sem grampo) na ORF do RdRp de CYVaV (Painel A). A localização do inserto é indicado pela seta preta. Um códon de parada, indicado pelo hexágono preto, foi projetado logo acima do inserto para truncar o RdRp. A mancha norte dos níveis de RNA de filamento positivo em protoplastos de Arabidopsis é mostrado no Painel B. CYVaV-GDD é um controle não replicante.
[0061] A Figura 24 ilustra uma sequência de bloqueio e encaixe para estabilizar a base de insertos. Referindo-se ao Painel A, o encaixe tetraloop GNRA (GAAA) com sua sequência de encaixe gera uma estrutura extremamente estável e representa uma sequência de bloqueio e encaixe básicas. Referindo-se ao Painel B, é mostrado o uso de uma armação que consiste em um tetraloop encaixado como uma armação de cristalografia. Referindo-se ao Painel C, uma sequência de bloqueio e encaixe exclusivas são mostradas. Insertos
(sequências com grampos ou sem grampos) podem ser adicionadas ao sítio de restrição (conforme identificado pela caixa de linha tracejada). As bases circuladas nas sequências são as sequências de encaixe para o tetraloop GAAA.
[0062] A Figura 25 ilustra que estabilizar a estrutura 3’UTR local é altamente prejudicial, mas o inserto de um inserto desestabilizador nas proximidades restaura a viabilidade. Com referência ao Painel A, uma representação esquemática de CYVaV-wt. CYVaV-wt 3’stb é o construto parental estabilizado que contém 6 mudanças nt que convertem pares G:U em pares G:C. Dois insertos de 60 nucleotídeos foram adicionadas ao construto parental estabilizado nas posições 2319 e 2330 que formam CY2319PDS60 _3’stb e CY2330PDS60_3’stb. As alterações de nucleotídeos feitas para estabilizar a estrutura e gerar CYVaV-wt 3’stb são circuladas no Painel B. Os sítios de inserto são indicados pelas setas para cada construto: seta para a esquerda no Painel A que indica o sítio de inserto para o construto CY2319PDS60_3’stb; seta para a direita no Painel A que indica o sítio de inserto para a construção CY2330PDS60_3’stb. Com referência ao Painel C, os dados são mostrados a partir do ensaio de tradução in-vitro de extrato de gérmen de trigo de transcritos de T7 das construções mostradas no Painel A. Observe que os níveis de p81 (o produto de mudança de quadro) são fortemente afetados pela estabilização dessa região. Com referência ao Painel D, é mostrada a análise de mancha norte de RNA total isolado de protoplasto de A. thaliana infectado por CYVaV-wt, CYVaV-wt 3'stb, CY2319PDS60_3'stb, CY2330PDS60_3'stb e CYVaV-GDD (controle não replicante). (+) representa os filamentos positivos e (-) são intermediários de replicação do filamento negativo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES
[0063] A presente revelação se refere a novos agentes infecciosos para uso como vetores para plantas, composições que compreendem uma planta infectada pelo agente (ou agentes) e usos e métodos relacionados aos mesmos. Os agentes infecciosos da presente revelação são algumas vezes chamados no presente documento de "RNAs móveis independentemente" ou "iRNAs" e exibem características superiores em comparação aos vetores virais convencionais. De acordo com as modalidades reveladas, os iRNAs são moléculas de RNA capazes de infectar plantas e codificar para uma RNA polimerase para sustentar sua própria replicação, mas sem a capacidade de codificar para qualquer proteína de movimento ou proteína de revestimento. Além disso, os iRNAs não codificam para nenhum supressor de silenciamento de RNA.
[0064] Conforme usado no presente documento, um "hospedeiro" se refere a uma célula, tecido ou organismo capaz de ser infectado e capaz de replicar um ácido nucleico. Um hospedeiro pode incluir uma planta inteira, um órgão da planta, tecido da planta, um protoplasto da planta e uma célula da planta. Um órgão de planta se refere a uma parte distinta e visivelmente diferenciada de uma planta, como raiz, caule, folha, semente, enxerto ou copa. Tecido de planta se refere a qualquer tecido de uma planta no todo ou em parte. Protoplasto se refere a uma célula isolada sem paredes celulares, que tem a potência de regeneração em cultura de células, tecido ou planta inteira. Célula de planta se refere à unidade estrutural e fisiológica das plantas, que consiste em um protoplasto e da parede de célula.
[0065] Conforme usado no presente documento, “sequência de ácidos nucleicos,” “polinucleotídeo”, “nucleotídeo” e “oligonucleotídeo” são usados indistintamente e se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função. Um "gene" se refere a um polinucleotídeo que contém pelo menos uma estrutura de leitura aberta que é capaz de codificar uma sequência polipeptídica particular. "Expressão" se refere ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito em mRNA e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito é traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.
[0066] Um vetor "derivado de" uma molécula particular significa que o vetor contém elementos genéticos ou porções de sequência de tal molécula. Em algumas modalidades, o vetor compreende um quadro de leitura aberta de replicase (ORF) de tal molécula (por exemplo, iRNA). Um ou mais segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) podem ser adicionados como uma sequência adicional aos vetores da presente revelação. Em algumas implementações, o dito segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) é adicionado de modo que a expressão de alto nível (por exemplo, de uma proteína particular ou RNA pequeno) seja alcançada. O vetor resultante é capaz de se replicar em células de planta que formam outras moléculas de vetor de RNA por polimerização de RNA dependente de RNA usando o vetor de RNA como molde. Um vetor de iRNA pode ser construído a partir da molécula de RNA da qual é derivado (por exemplo, CYVaV).
[0067] Conforme usado no presente documento, uma "infecção" ou "capaz de infectar" inclui a capacidade de um vetor de transferir ou introduzir seu ácido nucleico em um hospedeiro, de modo que o ácido nucleico ou porção (ou porções) do mesmo seja replicado e/ou proteínas ou outro os agentes são sintetizados ou entregues no hospedeiro. A infecção também inclui a capacidade de uma sequência de ácido nucleico selecionada se integrar em um genoma de um hospedeiro alvo.
[0068] Conforme usado no presente documento, um "traço fenotípico" se refere a uma característica ou propriedade observável, mensurável ou detectável resultante da expressão ou supressão de um gene ou genes. O fenótipo inclui traços observáveis, bem como processos bioquímicos.
[0069] Conforme usado no presente documento, "endógeno" se refere a um polipeptídeo, ácido nucleico ou gene que é expresso por um hospedeiro. "Heterólogo" se refere a um polipeptídeo, ácido nucleico ou gene que não é expresso naturalmente por um hospedeiro. Um "ORF heterólogo funcional" se refere a um quadro de leitura aberta (ORF) que não está presente na respectiva molécula não modificada ou nativa e que pode ser expressa para produzir um agente particular, como um peptídeo, proteína ou RNA pequeno. Por ser expressável a partir do vetor em uma planta, tecido de planta ou célula de planta, o vetor que compreende um ORF heterólogo funcional compreende um ou mais promotores subgenômicos ou outra sequência (ou sequências) necessária para a expressão.
[0070] Vários ensaios são conhecidos na técnica para determinar a expressão de um produto específico, incluindo, mas sem limitação: ensaios de hibridização (por exemplo, análise de mancha norte), procedimentos de amplificação (por exemplo, RT-PCR) e tecnologias com base em matriz. A expressão também pode ser determinada usando técnicas conhecidas na técnica para examinar o produto de proteína, incluindo, mas sem limitação: radioimunoensaio, ELISA (ensaios imunorradiométricos ligados a enzima), imunoensaios sanduíche, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios in situ, análise de mancha ocidental, ensaios de imunoprecipitação, ensaios de imunofluorescência, GC-Mass Spec e SDS-PAGE.
[0071] Um "segmento de RNA exógeno" se refere a um segmento de RNA inserido em uma molécula nativa, em que a fonte do segmento de RNA exógeno é diferente da molécula nativa. A fonte pode ser outro vírus, um organismo vivo, como uma planta, animal, bactéria, vírus ou fungo, um material sintetizado quimicamente ou uma combinação dos mesmos. O segmento de RNA exógeno pode fornecer qualquer função apropriada para uma aplicação particular, incluindo, mas sem limitação: um RNA de função não codificante, uma função codificadora em que o RNA atua como um RNA mensageiro que codifica uma sequência que, traduzida pela célula hospedeira, resulta na síntese de um peptídeo (por exemplo, uma molécula que compreende entre cerca de 2 e 50 aminoácidos) ou uma proteína (por exemplo, uma molécula que compreende 50 ou mais aminoácidos) que tem propriedades úteis ou desejadas.
[0072] Conforme usado no presente documento, "proteína de movimento" se refere a uma proteína (ou proteínas) necessária para o movimento célula a célula e/ou de longa distância. "Proteína de revestimento" se refere à proteína (proteínas) que compreendem ou constroem o revestimento do vírus.
[0073] Semelhante aos umbravírus, os iRNAs não possuem uma ORF de proteína de revestimento funcional e/ou codificam qualquer proteína de revestimento. Além disso, a RNA polimerase dos iRNAs é semelhante à dos umbravírus. No entanto, ao contrário dos umbravírus, os iRNAs não possuem uma ORF de proteína (ou proteínas) de movimento funcional e/ou de outra forma codificam para qualquer proteína (ou proteínas) de movimento célula a célula ou qualquer proteína (ou proteínas) de movimento de longa distância que serve como uma proteína de estabilização para combater a decadência mediada por absurdos.
[0074] Os vírus convencionais sem proteínas de revestimento são geralmente menos estáveisdentro de uma célula de planta, pois seus genomas são vulneráveis ao sistema de defesa de silenciamento do RNA do hospedeiro. No entanto, os iRNAs são surpreendentemente estáveisno ambiente intracelular, o que é uma característica importante para um vetor eficaz. Os iRNAs também são restritos à planta hospedeira inoculada na ausência de um vírus auxiliar específico, uma vez que, sem os vírions associados, não são transmissíveis por um vetor de inseto. Acredita-se que os iRNAs são encapsidados em vírions apenas quando na presença de um vírus auxiliar específico, por exemplo, como um enamovírus, incluindo o vírus da enação de nervuras dos citros (CVEV), que é um vírus raramente visto nos Estados Unidos.
[0075] Nas modalidades reveladas, é fornecido um vetor de RNA de filamento simples de sentido positivo recombinante que compreende um elemento de replicação (ou elementos de replicação) e um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos). Os vetores de RNA da presente revelação são capazes de se acumular em níveis elevados no floema e são capazes de entregar um agente terapêutico, como uma proteína, um peptídeo, um antibacteriano e/ou um inseticida (por exemplo, siRNAs) diretamente no tecido da planta. Em certas implementações, o vetor de RNA é derivado de uma molécula de iRNA, que não tem a capacidade de codificar para qualquer proteína de revestimento (ou proteínas de revestimento) ou proteína de movimento (ou proteínas de movimento). Por exemplo, o vetor é derivado de e/ou inclui elementos estruturais da molécula de iRNA conhecida como vírus associado às nervuras amarelas dos citros (CYVaV), uma molécula não classificada associada à doença da nervuras amarela de citros.
[0076] Assim, as modalidades reveladas fornecem um vetor com base em iRNA construído em ou derivado de uma molécula de RNA de filamento simples de sentido positivo usando componentes genéticos de uma molécula de iRNA, por exemplo, CYVaV. Além disso, a presente revelação é direcionada a kits e/ou misturas que compreendem um ou mais vetor (ou vetores) à base de iRNA (por exemplo, à base de CYVaV). Essas misturas podem estar na forma sólida, como um sólido seco ou liofilizado, ou em um líquido, por exemplo, como solução aquosa, suspensão ou dispersão, ou como géis. Essas misturas podem ser usadas para infectar uma planta, tecido de planta ou célula de planta. Tais kits e misturas podem ser usados para infectar com sucesso uma planta ou células de planta com os vetores com base em iRNA da presente revelação e/ou para a expressão de proteínas heterólogas ou entrega de outros agentes terapêuticos a tal planta ou célula de planta (células de planta).
[0077] A presente revelação também se refere a uma planta, tecido de planta ou célula de planta que compreende o dito vetor à base de iRNA, conforme revelado no presente documento, e/ou uma planta, tecido de planta ou célula de planta que compreende um agente terapêutico ou polipeptídeo heterólogo codificado ou distribuído pelo dito vetor . A presente revelação também fornece métodos de isolamento de tal polipeptídeo heterólogo da planta, tecido de planta ou célula de planta. Os métodos para isolar proteínas de uma planta, tecido de planta ou célula de planta são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0078] CYVaV foi encontrado em quatro árvores limequat na década de 1950, independente de qualquer vírus auxiliar (Weathers, L. (1957), A vein-yellowing disease of citrus caused by a graft-transmissible virus, Plant Disease Reporter 41:741-742; Weathers, L.G. (1960), Yellow-vein disease of citrus and studies of interactions between yellow- vein and other viruses of citrus, Virology 11:753-764; Weathers, L.G. (1963), Use of synergy in identification of strain of Citrus yellow vein virus, Nature 200:812-813). Análises adicionais e sequenciamento de CYVaV foram realizadas anos depois por Georgios Vidalakis (Universidade da Califórnia, Davis, CA; GenBank: JX101610). O laboratório do Dr. Vidalakis conduziu análises em amostras coletadas de fontes de árvores previamente estabelecidas (Weathers, L.G. (1963), Use of synergy in identification of strain of Citrus yellow vein virus, Nature 200:812-813) e mantida no banco de doenças do Programa de Proteção Clonal dos Citros (CCPP). Os estudos do laboratório Vidalakis para caracterizar o CYVaV foram inconclusivos. No entanto, muitas das amostras infectadas que contém CYVaV também continham o vírus da enação de nervuras dos citros do enamovírus (CVEV); era relativamente comum nas décadas de 1950 a 1980 que o pessoal do CCPP misturasse plantas infectantes com enação de nervuras amarelas e nervuras para realce dos sintomas.
[0079] CYVaV é uma pequena molécula de iRNA (~2,7 kb) composta por um único filamento de RNA de sentido positivo. Isso se replica em níveis extremamente altos, é muito estável, está limitado ao floema e não tem mecanismo conhecido de propagação natural. Como tal, CYVaV é ideal como uma plataforma de vetor para a introdução de um agente (ou agentes) em uma planta hospedeira, por exemplo, como um pequeno RNA (por exemplo, molécula de RNA não codificante de cerca de 50 a cerca de 250 nt de comprimento) e/ou proteínas para o gerenciamento de doenças e/ou pragas. A produção de proteínas que reforçam (ou silenciam) as defesas, peptídeos antimicrobianos que têm como alvo a bactéria e/ou pequenos RNAs que têm como alvo a expressão de genes de plantas ou insetos vetores de agentes de doenças fornecem uma estratégia de gerenciamento eficaz. Para serem eficazes, as proteínas e pequenos RNAs devem ser produzidos em quantidades suficientes e se acumular em níveis suficientes no floema, particularmente pequenos RNAs projetados para serem absorvidos por insetos-alvo ou patógenos fúngicos.
[0080] CYVaV só é transmissível de árvore para árvore por enxerto, mas foi demonstrado que infecta quase todas as variedades de citros, com exceção da laranja forte, incluindo, mas sem limitação, infectar cidra, limão áspero, calamondina, laranja doce, laranja azeda, toranja, cravo e lima das Índias Ocidentais, limão, variedades de tangerina, variedades de tangelo e cumquat. Produz um amarelecimento das nervuras das folhas na árvore cítrica indicadora e não tem ou tem sintomas de nervuras amarelas muito suaves na laranja doce e em outros cítricos, sem nenhum impacto relatado na qualidade da fruta, ou de outra forma causando danos às árvores.
[0081] A sequência de polinucleotídeos (bases 1 a 2692) do CYVaV é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 1):
[0082] A relação do CYVaV com outros vírus, incluindo os vírus Tombusviridae, é mostrada na Figura 2. A organização do genoma de CYVaV e moléculas de RNA semelhantes é ilustrada na Figura 3, Painel A, incluindo PEMV2, PMeV2-ES (GenBank: KT921785), PUV (GenBank: KP165407.1) e TBTVa (GenBank: EF529625.1). O RdRp do CYVaV está mais intimamente relacionado ao vírus do mosaico de enação de ervilha RNA2 de umbravírus, RNA2 (PEMV2). O exame das sequências 5' e 3' do CYVaV revelou similaridade considerável com as dos umbravírus, o que confirma que o CYVaV é de fato um agente infeccioso completo. O CYVaV tem um genoma de RNA de filamento simples de sentido positivo que codifica apenas duas proteínas envolvidas na replicação: p21, uma proteína associada à replicase em moléculas relacionadas; e p81, a RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) que é sintetizada por um evento de recodificação de ribossomo (deslocamento) (Figura 3, Painel A). Os níveis da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) sintetizada por deslocamento in vitro são mostrados para PEMV2 e CYVaV. A diferença nos níveis de p94 (RdRp) de PEMV2 em comparação com p81 de CYVaV é significativa (Figura 3, Painel C). O sítio de deslocamento do CYVaV é um dos mais fortes conhecidos em virologia e acredita-se ser o responsável por seu acúmulo excepcionalmente alto.
[0083] A sequência de polinucleotídeos da extremidade 3’ do CYVaV (bases 2468 a 2692) é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 2):
[0084] A sequência de polinucleotídeo do potencializador de tradução independente de 3’ Cap (3' CITE)
de CYVaV (bases 2468 a 2551) é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 3):
[0085] A extremidade 3'(e 3' CITE) de CYVaV compreende as seguintes sequências de polinucleotídeos conservadas (em negrito e sublinhado acima): (SEQ ID NO: 4); e/ou (SEQ ID NO: 5).
[0086] A sequência de polinucleotídeos de CYVaV que codifica para a proteína p21 (bases 9 a 578) é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 6):
[0087] A sequência de aminoácidos da proteína p21 é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 7):
[0088] A sequência de polinucleotídeos de CYVaV que codifica para a proteína p81 (bases 752 a 2158) é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 8):
[0089] A sequência de aminoácidos da proteína p81 é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 9):
[0090] O elemento de replicação de CYVaV (por exemplo, que codifica para a proteína p81) compreende as seguintes sequências de polinucleotídeos conservadas (destacadas e sublinhadas acima): cguuc (SEQ ID NO: 10); gaacg (SEQ ID NO: 11); gguuca (SEQ ID NO: 12); ggag (SEQ ID NO: 13); e/ou aaauggga (SEQ ID NO: 14).
[0091] Além disso, CYVaV pode compreender adicionalmente as seguintes sequências de polinucleotídeos conservadas (destacadas e sublinhadas acima):
ucgacg (SEQ ID NO: 15); e/ou cuccga (SEQ ID NO: 16).
[0092] As sequências de polinucleotídeos de sítios de recodificação de deslocamento de CYVaV (consulte também a Figura 10) são apresentadas abaixo:
[0093] IRNAs altamente semelhantes também foram encontrados no Opuntia (GenBank: MH579715), figueiras e milho etíope (Figura 4), que sugerem uma gama de hospedeiros invulgarmente grande ou possivelmente ilimitada para os vetores de RNA revelados no presente documento. A sequência de polinucleotídeos de um iRNA semelhante identificado em uma figueira (às vezes chamada no presente documento de "iRNA relativo 1" ou "iRNA r1") é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 20):
A sequência de polinucleotídeos de um iRNA identificado em outra figueira (às vezes chamada no presente documento de "iRNA relativo 2" ou "iRNA r2") é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 21):
[0094] A sequência de polinucleotídeos de um iRNA identificado no maís (às vezes chamado no presente documento de "iRNA relativo 3" ou "iRNA r3") é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 22):
[0095] Observe que os relativos de iRNA (por exemplo, iRNA r1, iRNA r2 e iRNA r3) podem compreender sequências de polinucleotídeos conservadas (em negrito e sublinhado acima): auagcacug (SEQ ID NO: 4); e/ou gauuuguga (SEQ ID NO: 5). Por exemplo, a molécula de iRNA compreende ambas as sequências de polinucleotídeos conservadas: auagcacug (SEQ ID NO: 4); e gauuuguga (SEQ ID NO: 5).
[0096] Além disso, os relativos de iRNA (por exemplo, iRNA r1, iRNA r2 e iRNA r3) podem compreender sequências de polinucleotídeos conservadas (em negrito e sublinhado acima): cguuc (SEQ ID NO: 10); gaacg (SEQ ID NO: 11); gguuca (SEQ ID NO: 12); ggag (SEQ ID NO: 13); e/ou aaauggga (SEQ ID NO: 14). Por exemplo, a molécula de iRNA compreende todas as sequências de polinucleotídeos conservadas: cguuc (SEQ ID NO: 10); gaacg (SEQ ID NO: 11); gguuca (SEQ ID NO: 12); ggag (SEQ ID NO: 13); e aaauggga (SEQ ID NO: 14).
[0097] Além disso, os relativos de iRNA (por exemplo, iRNA r1, iRNA r2 e iRNA r3) podem compreender sequências de polinucleotídeos conservadas (em negrito e sublinhado acima): ucgacg (SEQ ID NO: 15); e/ou cuccga (SEQ ID NO: 16). A molécula de iRNA pode compreender ambas as sequências de polinucleotídeos conservadas: ucgacg (SEQ ID NO: 15); e cuccga (SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, a molécula de iRNA está altamente relacionada com CYVaV (ou com iRNA r1, iRNA r2 ou iRNA r3) e compreende uma sequência de polinucleotídeos com 70% ou mais de identidade para o sítio de recodificação para a síntese de RdRp do mesmo, por exemplo, 75 % ou 85% ou 90% ou 95% ou 98% identificam do RdRp de CYVaV (ou de iRNA r1, iRNA r2 ou iRNA r3).
[0098] Assim, de acordo com modalidades reveladas, um vetor de RNA (por exemplo, derivado de uma molécula de iRNA) compreende um sítio de recodificação de ribossomo de deslocamento de quadro para a síntese da polimerase de RNA dependente de RNA (RdRp). Além disso, o vetor de RNA pode incluir uma extremidade 3’ que compreende uma sequência de polinucleotídeos que termina com três citidilatos (…CCC). O penúltimo grampo de extremidade 3’ também pode conter três guanilatos no laço terminal (…GGG…). Além disso, o 3’ CITE inclui um grampo estendido ou uma porção do mesmo que se liga ao fator de iniciação da tradução eucariótica 4 G (eIF4G) e/ou fator de iniciação de eucariota 4F (eIF4F).
[0099] Em certas modalidades, um vetor de RNA compreende um 3’CITE que compreende sequências conservadas auagcacug (SEQ ID NO: 4) e gauuuguga (SEQ ID NO: 5). O vetor de RNA também pode compreender uma ou mais das seguintes sequências de polinucleotídeos (sequências conservadas de moléculas de iRNA identificadas): cguuc (SEQ ID NO: 10) e gaacg (SEQ ID NO: 11); e/ou gguuca (SEQ ID NO: 12) e ggag (SEQ ID NO: 13); e/ou aaauggga (SEQ ID NO: 14). Alternativamente, ou além disso, o vetor de RNA pode compreender uma ou ambas das seguintes sequências de polinucleotídeos (sequências conservadas de moléculas de iRNA identificadas): ucgacg (SEQ ID NO: 15) e cuccga (SEQ ID NO: 16).
[00100] Todos os relativos de iRNA identificados têm insertos no 3’UTR e outras alterações de nucleotídeos que resultam na geração de uma ORF que codifica uma proteína (p21.2) de função desconhecida. Uma característica diferenciadora de iRNAs, como CYVaV, de qualquer vírus de planta (Figura 2) é que os iRNAs não codificam nenhuma proteína de movimento, o que é característico de todos os vírus de plantas conhecidos, incluindo umbravírus. Nem os iRNAs como o CYVaV requerem qualquer vírus auxiliar para o movimento sistêmico através das plantas, incluindo citros testados e Nicotiana benthamiana (uma planta modelo de laboratório).
[00101] Em contraste, PEMV2, como com todos os umbravírus, codifica para duas proteínas de movimento: p26 (movimento de longa distância) e p27 (movimento de célula para célula) (Figura 3, Painel A). p26 também é uma proteína de estabilização que protege o genoma de decaimento mediado sem sentido e é necessária para o acúmulo em níveis detectáveis de PEMV2 em protoplastos de célula única (Gao, F. e Simon, A.E. (2017), Differential use of 3 ' CITEs by the subgenomic RNA of Pea enation mosaic virus 2, Virology 510:194-204). Os umbravírus são vírus incomuns, pois não codificam uma proteína de revestimento ou supressor de silenciamento de RNA, mas dependem de um vírus auxiliar para essas funções. Para PEMV2, o vírus auxiliar é o enamovírus PEMV1.
[00102] A sequência de polinucleotídeos de PEMV2 é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 23):
[00103] A sequência de polinucleotídeos da região mais intergênica de PEMV2 (em negrito e sublinhado acima) é apresentada abaixo (SEQ ID NO: 24):
[00104] As sequências de polinucleotídeos de sítios de recodificação de deslocamento de PEMV2 (bases 881 a 1019; consulte também a Figura 10) são apresentadas abaixo (SEQ ID NO: 25):
[00105] O CYVaV se replica inesperadamente de forma muito eficiente em protoplastos de Arabidopsis thaliana, apesar de não codificar p26 (ou qualquer outra proteína de movimento), que é necessária para o acúmulo de PEMV2 devido à sua capacidade de também combater o NMD. Na verdade, o CYVaV era excepcionalmente estável, muito mais estável do que a maioria dos vírus tradicionais. CYVaV também produziu um nível surpreendentemente alto de p81 em extratos de gérmen de trigo, pelo menos 50 vezes mais do que o ortólogo p94 de PEMV2 (Figura 3, Painel C). Quando o CYVaV foi agroinfiltrado nas folhas de Nicotiana benthamiana, se replicou no tecido infiltrado, mas a acumulação foi relativamente fraca (Figura 3, Painel B, topo; Figura 5, pistas 6-8). Nenhuma replicação foi alcançada com inoculação manual. No entanto, quando CYVaV foi co-infiltrado com o vírus da enação de nervuras dos citros de enamovírus (CVEV), a acumulação melhorou substancialmente nessas células (Figura 5, pistas 3-5; consulte também Figura 6). No entanto, os sintomas de amarelecimento de CYVaV + CVEV (Figura 7, Painel
B) foram mais vibrantes em comparação com os sintomas exibidos por CYVaV sozinho (Figura 7, Painel A).
[00106] CYVaV não teve efeito sinérgico com qualquer outra combinação de vírus cítricos testada. Estudos adicionais mostraram que o CVEV pode ser utilizado como um vírus auxiliar do CYVaV para permitir a transmissão de árvore para árvore. O CVEV foi provavelmente o responsável pela presença do CYVaV nas árvores originais do limequat; entretanto, o CVEV é conhecido por ser muito sensível ao calor e, portanto, provavelmente foi perdido das árvores de lima durante um verão quente.
[00107] CYVaV moveu-se esporadicamente para as folhas superiores não inoculadas e acumulou-se em níveis extremamente altos, às vezes visíveis por coloração com etídio nos géis. Os sintomas que começaram na nona folha do parafuso principal incluíam nanismo, ondulação da folha e deformação do tecido floral. As folhas nas hastes axilares também começaram a apresentar sintomas semelhantes na mesma época. Esse resultado surpreendente demonstrou que o CYVaV se move sistemicamente na ausência de qualquer proteína de movimento codificada (ou proteínas de movimento codificadas), o que não é possível para os vírus de plantas tradicionais. Experimentos mostraram que o CYVaV se move sistemicamente em N. benthamiana e está estritamente confinado ao floema, replicando-se apenas em células companheiras e células do parênquima do floema. Em citros, o CYVaV é 100% transmissível por enxerto, mas difícil de transmitir em outras formas.
[00108] A hibridização in situ com fluorescência (FISH) de tecido foliar sintomático e raízes confirmou que o CYVaV está confinado às células do parênquima do floema,
células companheiras e elementos de peneira (Figura 8, Painéis A-G), que é característico de um vírus limitado ao floema. Os níveis de CYVaV eram extremamente altos nos pecíolos do tecido sintomático e às vezes visíveis em géis de RNA total corados com etídio. Embora os sintomas sejam mais graves em N. benthamiana, foi constatado que o CYVaV é virtualmente assintomático em todas as variedades de citros testadas. Na verdade, o sintoma mais grave foi encontrado na cidra, a árvore indicadora dos vírus cítricos, e consistia em pequenas manchas douradas nas folhas espalhadas por toda a árvore.
[00109] O movimento do CYVaV limitado pelo floema explica por que ele é facilmente transmissível por enxerto, mas não por qualquer outro meio. CYVaV carece de qualquer proteína de movimento codificada (ou proteínas de movimento codificadas) como mencionado acima. Em vez disso, o CYVaV utiliza a proteína de movimento endógeno (proteínas de movimento endógeno) da planta hospedeira e a via para o trânsito entre as células companheiras, células do parênquima do floema e elementos de peneira. Além disso, uma vez que se acredita que a gama do hospedeiro envolve interações compatíveis entre as proteínas do movimento viral e as proteínas associadas aos plasmodos do hospedeiro, acredita-se que o CYVaV é capaz de transitar através do floema de várias outras plantas hospedeiras lenhosas e não lenhosas usando a proteína de movimento endógeno do hospedeiro (ou proteínas de movimento endógeno do hospedeiro). Como tal, o CYVaV fornece um sistema de modelo excepcional para examinar o movimento do RNA (por exemplo, em N. benthamiana e/ou citros) e para uso como um vetor para inúmeras aplicações. Os experimentos confirmaram que o CYVaV se move sistemicamente em uma planta hospedeira e é limitado ao floema, e é prontamente transmissível por enxerto, mas não transmissível em outras formas.
[00110] As árvores cítricas têm uma biologia reprodutiva complexa devido à apomixia e incompatibilidade sexual entre as variedades. Juntamente com um longo período juvenil que pode exceder seis anos, o melhoramento genético por métodos tradicionais de criação é complexo e demorado. A presente revelação supera tais problemas ao fornecer um vetor com base em iRNA (por exemplo, com base em CYVaV) projetado para incluir insertos terapêuticos usando RNAi e CRISPR/Cas9. Os iRNAs como o CYVaV são únicos entre os agentes infecciosos, pois codificam uma polimerase, mas se movem como um viróide usando proteínas de movimento do hospedeiro e, portanto, são capazes de transitar por outras plantas além dos cítricos. Assim, além de citros, os vetores à base de iRNA da presente revelação podem ser desenvolvidos para outras plantas lenhosas (por exemplo, árvores e leguminosas) e, em particular, oliveiras e videiras.
[00111] De acordo com as modalidades reveladas, o CYVaV é utilizado no desenvolvimento de um vetor para a entrega de pequenos RNAs e proteínas em mudas de citros e N. benthamiana. O procedimento utilizado para o desenvolvimento do vetor CYVaV foi semelhante ao utilizado pelos presentes inventores para a engenharia de betacarmovírus TCV para produzir pequenos RNAs (consulte Aguado, L.C. et al. (2017), RNase III nucleases from diverse kingdoms serve as antiviral effectors, Nature 547:114-117). Foram identificados sítios exemplares e vantajosos para adicionar uma, duas, três ou mais pequenos insertos de RNA concebidos para serem excisados por exonucleases do tipo RNase III. Um pequeno RNA repórter foi expresso diretamente do genoma que tem como alvo a fitoeno dessaturase, que torna o tecido alvo branco.
[00112] De acordo com as modalidades reveladas, os vetores revelados no presente documento podem incluir pequenos RNAs com várias funcionalidades, incluindo: pequenos RNAs que têm como alvo um mRNA fúngico essencial; pequenos RNAs que têm como alvo um vetor de inseto (ou vetores de inseto) para morte ou esterilidade; e pequenos RNAs que têm como alvo o CVEV (já que esse vírus junto com o CYVaV causam sintomas aumentados das nervuras amarelas). Além disso, os vetores revelados podem incluir outros pequenos RNAs e/ou agentes terapêuticos conhecidos na técnica. Assim, um vetor com base em iRNA restrito ao floema pode ser projetado para produzir pequenos RNAs que têm propriedades antifúngicas e/ou anti-insetos e/ou antivirais, o que fornece um tratamento superior e estratégia de gerenciamento em comparação com as metodologias atuais.
[00113] Os vetores de CYVaV podem ser aplicados manualmente a árvores infectadas ou não infectadas cortando- se o floema e depositando-se o vetor como RNA, ou por agroinfiltração, ou após encapsidação na proteína de revestimento de CVEV, seguindo procedimentos de inoculação de citros bem conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, como procedimentos desenvolvidos e usados rotineiramente no Programa de proteção de clone de citros (CCPP). Tais procedimentos são rotineiros para inoculação de CTV e outros patógenos de citros transmissíveis por enxerto. Uma vez que o CYVaV não codifica uma proteína do capsídeo, nenhum vírion é produzido e, portanto, nenhuma transmissão natural de árvore para árvore do CYVaV é possível. Quando o
CYVaV está encapsidado na proteína de revestimento do CVEV, nenhum outro componente do CVEV está presente.
[00114] Como observado acima, CYVaV tem apenas duas ORFs: uma ORF proximal 5’ que codifica a proteína p21 necessária para replicação; e um elemento de recodificação de ribossomo de deslocamento de quadro que permite aos ribossomos continuar a tradução, que estende p21 para produzir p81, a polimerase de RNA dependente de RNA. A organização dessas duas ORFs é semelhante à organização de ORFs semelhantes em vírus em Tombusviridae e Luteoviridae. No entanto, todos os vírus nessas famílias e, na verdade, em todos os vírus de RNA de plantas conhecidos, codificam proteínas de movimento ou estão associados a um vírus secundário que codifica uma proteína de movimento (ou proteínas de movimento). A capacidade de codificar proteínas de movimento, ou de se associar a um segundo vírus que codifica uma proteína de movimento (ou proteínas de movimento), há muito era considerada um requisito para o movimento de célula para célula e também para o trânsito pelo floema para estabelecer uma infecção sistêmica. Como tal, o uso de iRNAs como vetores não tinha sido proposto e, de fato, as moléculas de iRNA foram anteriormente consideradas inadequadas para uso como um vetor independente devido à falta de qualquer proteína de movimento codificada e à crença de que não eram independentemente móveis.
[00115] Como tal, a capacidade de movimento sistêmico independente de iRNAs em todo o floema de uma planta, apesar de não codificar ou depender de qualquer proteína de movimento proteína de movimento exógeno (ou proteínas de movimento exógeno) é, portanto, bastante surpreendente. Os vetores com base em CYVaV da presente revelação demonstraram de forma inequívoca e repetida (via hibridização in situ fluorescente e outras técnicas) movimento sistêmico sem o auxílio de qualquer vírus auxiliar. Tecido jovem não infiltrado (sistêmico) apresentou sintomas altamente visíveis em N. benthamiana, incluindo galhas nas folhas e galhas nas raízes. Os vetores revelados utilizam proteína de movimento (ou proteínas de movimento) do hospedeiro endógeno para mobilidade. A este respeito, proteína (ou proteínas) do floema hospedeiro (proteína 2 do floema de 25 kDa (PP2) e/ou proteína do floema 2 do Cucumis sativus de 26 kDa) conhecidas por trafegar RNAs do hospedeiro em elementos de peneira (consulte Balachandran, S. et al. (1997), Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata, PNAS 94(25):14150- 14155; Gómez, G. e Pallás, V. (2004), A long-distance translocatable phloem protein from cucumber forms a ribonucleoprotein complex in vivo with Hop stunt viroid RNA, J Virol 78(18):10104-10110) foram provavelmente mostrados para interagir com CYVaV usando manchas de Northwestern. Assim, uma vez que os vírus de plantas conhecidos codificam (ou dependem de) uma proteína de movimento, os iRNAs são bastante diferentes estrutural e funcionalmente dos vírus de plantas tradicionais.
[00116] Além disso, CYVaV, outros RNAs de tamanho semelhante e que codificam uma polimerase podem ser utilizados no desenvolvimento de vetores com base em iRNA estruturados de forma semelhante (consulte, por exemplo, Chin, L.S. et al. (1993). The beet western yellows virus ST9-associated RNA shares structural and nucleotide sequence homology with Tombusviruses. Virology 192(2):473-482; Passmore, B.K. et al. (1993). Beet western yellows virus-associated RNA: an independently replicating RNA that stimulates virus accumulation. PNAS 90(31):10168-10172). Como observado acima, outros relativos de iRNA (por exemplo, iRNA r1, iRNA r2 e iRNA r3, identificados em Opuntia, figueiras e milho etíope, respectivamente) e que codificam as proteínas p21 e p81 (Figura 4) podem ser utilizados para o vetor desenvolvimento.
[00117] Embora o CYVaV esteja presente no banco de dados GenBank (GenBank: JX101610), os iRNAs não pertencem a nenhuma classificação conhecida de vírus, uma vez que não possuem cistrons que codificam proteínas de movimento. Nem os iRNAs dependem de um vírus auxiliar para o movimento sistêmico dentro de um hospedeiro. Além disso, os iRNAs carecem de cistrons que codificam proteínas de revestimento. Os iRNAs também são diferentes dos viróides, embora ambos sejam capazes de movimento sistêmico na ausência de proteínas de movimento codificadas. Os viróides são RNAs circulares de filamento simples que não têm capacidade de codificação e se replicam no núcleo ou no cloroplasto usando uma polimerase de RNA dependente de DNA do hospedeiro. A grande maioria do minúsculo genoma do viróide, normalmente incluindo cerca de 300 a 400 nucleotídeos (nt), é necessária para a existência incomum do viróide. Além disso, os viróides não codificam para nenhuma proteína, o que os torna inadequados para uso como vetores. Em contraste, os iRNAs codificam para sua própria RNA polimerase dependente de RNA (RdRp).
[00118] Os iRNAs podem ser categorizados em duas classes: uma primeira classe é caracterizada por um requisito de deslocamento para gerar as estruturas RdRp e RNA proximais à extremidade 3’ que se assemelham às dos umbravírus. Uma segunda classe é caracterizada por um requisito de leitura para gerar as estruturas de RNA RdRp e 3’ que se assemelham às do Tombusvírus. CYVaV é um membro da primeira classe com propriedades semelhantes aos umbravírus, incluindo um sítio de recodificação de deslocamento de quadro e estruturas semelhantes na extremidade 3’ e sequências semelhantes na extremidade 5'. Membros de iRNA da segunda classe sempre foram descobertos em associação com um vírus auxiliar.
[00119] Os iRNAs fornecem uma série de benefícios em comparação aos vetores virais convencionais. Por exemplo, os iRNAs são relativamente pequenos, tornando-os mais fáceis de mapear estrutural e funcionalmente e manipular geneticamente. Em contraste, vírus como o CTV são 8 vezes maiores, tornando os mesmos mais difíceis de usar como vetor. Os iRNAs podem se replicar e se acumular em níveis inesperadamente altos (por exemplo, visível por coloração de etídio em géis e 4% de leituras por RNAseq), o que é crítico para a capacidade do vetor de entregar uma quantidade suficiente de agente terapêutico (ou agentes terapêuticos) na planta alvo. Além disso, os iRNAs são muito mais estáveis do que muitos vírus, apesar de não codificarem uma proteína de revestimento ou supressor de silenciamento (Figura 13), o que permite uma longa vida útil na planta hospedeira e, portanto, fornece benefícios por um período prolongado.
[00120] Os iRNAs também são limitados ao floema do hospedeiro, o que é especialmente útil para direcionar patógenos que residem ou cujos portadores se alimentam ou cujos sintomas se acumulam no floema, uma vez que a carga útil será direcionada para em que é mais necessária. Movendo-se independentemente das proteínas de movimento (cujas interações com proteínas específicas do hospedeiro são o principal fator para determinar a gama de hospedeiros), os iRNAs são capazes de transitar em uma gama mais ampla de hospedeiros, aumentando assim a aplicabilidade de uma única plataforma de vetor. Dada a falta de expressão da proteína de revestimento e a dispensabilidade de um vírus auxiliar para infecção sistêmica de plantas, os iRNAs não podem ser vetorados planta a planta e, em vez disso, devem ser introduzidos diretamente no floema por meio de enxerto. A falta de uma proteína de revestimento evita a formação de partículas infecciosas e, portanto, a reversão não intencional para agentes infecciosos de tipo selvagem no meio ambiente. Isso é particularmente benéfico para agilizar a aprovação regulatória, já que os reguladores frequentemente estão preocupados com a possível transmissão descontrolada de agentes biológicos introduzidos.
[00121] Os iRNAs também são virtualmente benignos para seus hospedeiros, ao contrário de vírus como o CTV, cujos isolados podem ser altamente patogênicos. Usar um vírus comum como vetor, como o CTV, corre o risco de exclusão de superinfecção, em que árvores previamente infectadas e/ou expostas a esse vírus não podem ser adicionalmente infectadas pelo mesmo vírus que atua como vetor (por exemplo, a maioria dos citros árvores nos EUA estão infectadas com CTV). Assim, evitar a exclusão de superinfecção, no mínimo, requer etapas adicionais do processo que o tornam mais caro e complicado.
[00122] A presente revelação também fornece insertos terapêuticos inovadores, profiláticas ou de intensificação de características que são projetadas no vetor de iRNA. Uma variedade de insertos são fornecidas, incluindo insertos que têm como alvo um patógeno específico, um vetor de inseto ou uma manifestação da doença (ou doenças).
Alternativamente, ou adicionalmente, são fornecidos insertos que fortalecem ou melhoram a saúde da planta e/ou aumentam as características desejadas da planta.
[00123] Os agentes infecciosos revelados são capazes de acumulação e movimento sistêmico em toda a planta hospedeira e podem, assim, administrar terapias em todo o hospedeiro ao longo de um período de tempo substancial. As características dos agentes revelados são, portanto, altamente benéficas para o tratamento de numerosas doenças específicas. O uso de um agente infeccioso composto de RNA ou DNA tem uma vantagem adicional de ser capaz de codificar para proteínas ou peptídeos terapêuticos que seriam expressos dentro das células infectadas e/ou manipular o agente infeccioso para conter uma sequência específica ou porção clivável de sua material para servir como um agente terapêutico com base em RNA.
[00124] Produtos com propriedades antimicrobianas contra fitopatógenos podem assumir diversos formatos e são produzidos por meio da síntese ribossomal (defensinas e pequenas bacteriocinas) ou não ribossomal (peptaibóis, ciclopeptídeos e pseudopeptídeos). Os mais conhecidos são mais de 900 peptídeos antimicrobianos catiônicos (CAPs), como lactoferrina ou defensina, que geralmente têm menos de 50 aminoácidos e cujas propriedades antimicrobianas são bem conhecidas na técnica. Os CAPs são agentes não específicos que têm como alvo as paredes celulares em geral, com efeitos relatados contra bactérias e fungos. CTV projetado com um inserto projetada para expressar defensina recebeu aprovação para lançamento pelo USDA na Flórida, mas sua eficácia difundida é desconhecida. Além disso, o isolado de CTV usado para o vetor o torna inadequado para árvores que crescem em algumas regiões (por exemplo, Califórnia).
[00125] As terapias de RNA que têm como alvo os patógenos virais também estão em amplo desenvolvimento nas plantas. Essas terapias usam pequenos RNAs interferentes não codificantes (siRNAs), que são gerados a partir do genoma da planta e, portanto, incluem a modificação genética do hospedeiro. Além dos pontos de vista negativos de alguns produtores e consumidores em relação à modificação genética de árvores cítricas, o tempo de geração de árvores geneticamente modificadas é medido em décadas e pode acabar não tendo os mesmos atributos (textura/cor/sabor) das variedades desenvolvidas ao longo de décadas e, portanto, não é uma solução para as doenças agrícolas atuais e sensíveis ao tempo, além de ser muito caro para desenvolver e potencialmente impactar a qualidade da fruta.
[00126] Recentemente, enzimas antibacterianas altamente direcionadas foram desenvolvidas para uso em animais e humanos como um substituto para os antibióticos atuais. Essas enzimas são projetadas a partir de proteínas de lise de bacteriófagos e são conhecidas como enzimáticos. Tal como acontece com as proteínas de bacteriófagos parentais, os enzibióticos podem lisar as paredes celulares bacterianas em contato, mas são projetados para serem usados externamente a bactérias gram positivas e gram negativas. Enzibióticos são projetados para lisar apenas bactérias direcionadas, deixando outros membros do microbioma não afetados. Em algumas implementações, é fornecido um vetor de iRNA que inclui um inserto de RNA não codificante que pode ser traduzida em uma proteína antibacteriana como um enzibiótico.
[00127] Em algumas implementações, é fornecido um vetor iRNA que inclui um inserto de RNA que interfere com a funcionalidade do vetor de inseto em questão. Os insetos têm um sistema de silenciamento de RNA semelhante ao das plantas; pequenos RNAs ingeridos por insetos são absorvidos pelas células e têm como alvo mRNAs críticos para degradação ou bloqueio da tradução dentro do inseto. Em algumas modalidades, é fornecido um inserto alvejado que é capaz de silenciar uma função reprodutiva crítica do vetor de inseto, resultando na esterilização do inseto. Os insetos que se alimentam do floema que transmitem patógenos limitados pelo floema são de particular relevância, em que um inserto de RNA não codificante em um vetor limitado pelo floema é prontamente absorvido pelos insetos que se alimentam.
[00128] Em algumas implementações, é fornecido um vetor de iRNA que inclui um inserto de RNA não codificante que tem como alvo uma resposta da planta a um patógeno. Em alguns casos, a bactéria inserida por um vetor de inseto não danifica diretamente a árvore. No entanto, a árvore hospedeira produz calosidades excessivas em seu floema para isolar a bactéria, o que pode restringir o fluxo de fotoassimilados e matar a árvore. Assim, o RNA insere silêncios e/ou deprime essa produção de calose.
[00129] Características e recursos adicionais da presente revelação serão mais bem compreendidos por meio de referência aos seguintes exemplos e discussões adicionais, que são fornecidos a título de ilustração adicional e não se destinam a ser limitantes da presente revelação.
[00130] Estrutura CYVaV. A estrutura de comprimento total do CYVaV foi determinada por sondagem da estrutura SHAPE e comparações filogenéticas com os relativos do CYVaV em Opuntia, Figueira e milho (Figura 9). O sítio de recodificação (consulte a Figura 10) e o tipo ISS (estrutura em forma de I) 3'CITE (consulte a Figura 11) são identificados, juntamente com uma região para acomodar um inserto é, por exemplo, mostrada por uma linha dupla em caixa região e discutido em mais detalhes no que diz respeito a localizações exemplares para insertos.
[00131] A organização do genoma do CYVaV exibe algumas semelhanças com outras moléculas de RNA, em particular PEMV2 (Figura 3, Painel A). No entanto, o umbravírus PEMV2 também possui ORFs que codificam para as proteínas p26 e p27 envolvidas no movimento. Os níveis de filamentos CYVaV positivos (+) em folhas infiltradas de N. benthamiana e folhas sistêmicas são mostrados na Figura 3, Painel B. Os níveis de RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) sintetizada por deslocamento in vitro em extratos de germe de trigo de comprimento total CYVaV e PEMV2 também são mostrados (Figura 3, Painel C). Observe a diferença nos níveis de p94 de PEMV2 em comparação com a polimerase de p81 produzida por CYVaV. O sítio de deslocamento do CYVaV é um dos mais fortes conhecidos em virologia e acredita-se ser o responsável por seu acúmulo excepcionalmente alto.
[00132] CYVaV é encapsulado em vírions de CVEV. CYVaV ou CVEV ou CYVaV + CVEV foram agroinfiltrados em folhas de N. benthamiana. CYVaV foi encapsidado em vírions de CVEV, e os vírions foram isolados uma semana depois e os RNAs encapsidados submetidos à análise de PCR (consulte as Figuras 5 e 6). A acumulação de CYVaV aumentou substancialmente na presença do vírus auxiliar putativo CVEV. Os controles de carregamento de rRNA são mostrados abaixo. O supressor de silenciamento p14 foi co-infiltrado em todas as folhas. Os sintomas de amarelecimento foram ligeiramente mais graves nas folhas com CYVaV + CVEV (Figura 7, Painel B).
[00133] CYVaV é limitado por floema. A imagem de hibridização in situ de fluorescência (FISH) detectou claramente mais os filamentos do CYVaV, que foi completamente restrito ao SE, CC e PPC (Figura 8).
[00134] CYVaV não codifica um supressor de silenciamento. As plantas de N. benthamiana 16C foram agroinfiltradas com um construto que expressa GFP (que é silenciado nessas plantas) e construtos que expressam CYVaV p21 ou p81, ou construtos que expressam supressores de silenciamento conhecidos p19 (de TBSV) ou p38 (de TCV) (Figura 13, Painel A). Apenas p19 e p38 suprimem o silenciamento de GFP, permitindo que a fluorescência verde seja expressa (Figura 13, Painel B). A mancha norte sondada com o oligonucleotídeo GFP mostrou que o RNA GFP ainda é silenciado na presença de p21 ou p81 (Figura 13, Painel C).
[00135] Replicação do CYVaV em protoplastos de Arabidopsis. Um clone infeccioso de CYVaV foi gerado. Transcritos de RNA de tipo selvagem (CYVaV) ou transcritos que contêm uma mutação no sítio escorregadio de recodificação que elimina a síntese do RdRp (CYVaV-fsm) e, portanto, não se replica, foram inoculados em protoplastos de Arabidopsis. O RNA foi extraído e uma mancha norte realizada 30 horas depois. Observe que os transcritos inoculados de CYVaV-fsm ainda estavam presentes nos protoplastos em 30 horas (enquanto em um vírus tradicional seriam indetectáveis após 4 horas).
[00136] Replicação de CYVaV em N. benthaminana. O nível de acumulação de CYVaV nas folhas infiltradas de N.
benthamiana foi determinado por mancha norte (Figura 15, Painel A). As plantas infiltradas com CYVaV esporadicamente mostraram sintomas sistêmicos (Figura 15, Painel B; consulte também Figura 16). Essas plantas acumularam altos níveis de CYVaV. O nível de CYVaV em folhas individuais de uma planta infectada sistemicamente foi determinado (Figura 15, Painel C). As folhas 4 e 5 foram agroinfiltradas com CYVaV. Observe o acúmulo substancial de CYVaV nas folhas mais novas.
[00137] Sintomas de N. benthamiana infectada sistemicamente com CYVaV. As folhas 4 e 5 foram agroinfiltradas com CYVaV. O primeiro sinal de uma planta infectada sistemicamente é uma folha em forma de concha (Figura 16), que quase sempre era a folha 9. Nas semanas seguintes, galhas foliares surgiram no meristema apical e em cada nó da planta. As plantas infectadas sistemicamente também tinham galhas na raiz, que contém uma quantidade substancial de CYVaV como evidenciado pela mancha norte de planta.
[00138] CYVaV demonstra uma gama de hospedeiros excepcional. A seiva de uma planta N. benthamiana infectada sistemicamente foi injetada no pecíolo do tomate (Figura 17). Uma das quatro plantas apresentou sintomas muito fortes e foi positiva para CYVaV por PCR. A planta mostrada está 53 dias após a infecção com uma planta da mesma idade.
[00139] CYVaV se liga a uma proteína altamente abundante extraída do floema do pepino. O CYVaV de comprimento total marcado se liga a uma proteína proeminente, conforme demonstrado na mancha de noroeste (Figura 18). As proteínas foram renaturadas após eletroforese em gel de SDS. Acredita- se que esta proteína seja uma proteína de ligação a RNA altamente conservada conhecida, que contém um motivo RRM conhecido por acompanhar os RNAs de células companheiras em elementos de peneira no floema do pepino. Nenhuma ligação foi observada quando as proteínas permaneceram desnaturadas após a eletroforese.
[00140] CYVaV pode expressar uma proteína extra de seu 3’UTR usando um TEV IRES. Identificou-se a localização de três insertos separadas de nanoluciferase a jusante do sítio de entrada do ribossomo interno (IRES) do vírus de ataque de tabaco (TEV) (Figura 19). A tradução in vitro em extratos de gérmen de trigo das três construções foi avaliada. A localização da proteína nanoluciferase (Nluc) é próxima ao fundo do gel. A expressão de nanoluciferase em protoplastos in vivo foi investigada (Figura 19, Painel C). Transcritos de RNA de comprimento total das construções mostradas em (A) foram transformados em protoplastos. 18 horas depois, a proteína total foi extraída e a atividade da nanoluciferase medida em um luminômetro.
[00141] Localizações exemplares para insertos de grampo estáveis nas posições 2250, 2301 e 2319 foram avaliadas. A localização para cada uma das insertos cai dentro de uma região exemplar observada acima (consulte a Figura 9). O ensaio de tradução in-vitro do extrato de gérmen de trigo de transcritos de T7 de CYVaV-wt e vetores VIGS de CYVaV que contêm diferentes quantidades de sequência na posição 2250 foi conduzido (Figura 20). Por exemplo, o construto sfPDS60 demonstrou excelente movimento sistêmico em plantas. O ensaio de tradução in-vitro do extrato de gérmen de trigo de transcritos de T7 dos vetores CYVaV-wt e CYVaV VIGS que contêm diferentes quantidades de sequência nas posições 2301 e 2319 foi conduzido (Figura 21). Análise de mancha norte de RNA total isolado de protoplastos de A. thaliana infectados por vetores CYVaV wt e CYVaV VIGS. CYVaV-GDD e controle negativo foi conduzido (Figura 20, Painel D). Análise de mancha norte de RNA total isolado de protoplastos de A. thaliana infectados por vetores CYVaV wt e CYVaV VIGS. CYVaV-GDD e controle negativo foi conduzido (Figura 21, Painel D). Os construtos CY2250sfPDS60, CY2301PDS60, CY2301sfPDS60, CY2319sfPDS60 (incluindo insertos nas posições 2250, 2301, 2319, respectivamente) demonstraram excelente movimento sistêmico com inserto. Além disso, os construtos CY2331PDS60 (incluindo insertos na posição 2331) também demonstraram a capacidade de se mover sistemicamente por todo o hospedeiro. Um outro construto, CY2083TAAPDS60, inclui um inserto na posição 2083, cuja localização está na ORF RdRp (precedida por um códon de parada inserido).
[00142] As sequências das regiões de inserto (sublinhadas abaixo e conforme mostrado na Figura 20, Painel G e Figura 21, Painel G) do vetor coletado da folha sistêmica são apresentadas abaixo:
PLATAFORMA DE VETOR COM BASE EM IRNA
[00143] Em uma modalidade, um vetor com base em iRNA é fornecido para o tratamento de doenças na indústria cítrica causada por bactérias CLas (HLB). Um isolado de CYVaV é utilizado como vetor para atingir as bactérias e os insetos psilídeos que transportam as bactérias para as árvores. Como discutido acima, CYVaV é limitado ao floema, em que se replica e se acumula em níveis extremamente altos comparáveis aos melhores vírus de plantas. Além disso, seu tamanho relativamente pequeno o torna excepcionalmente fácil de fazer a engenharia genética. Assim, a consideração da estrutura e biologia do CYVaV ajudou no desenvolvimento deste novo agente infeccioso como um vetor e sistema modelo para o trânsito no floema.
[00144] A estrutura do 3’UTR do CYVaV foi determinada com base no mapeamento de estrutura de SHAPE RNA (Figura 9). Além disso, uma série de elementos de replicação e tradução foram identificados com base em ensaios bioquímicos, bem como a conservação filogenética (com umbravírus) de sua sequência e/ou estrutura e posição (Figura 19, Painel A). Um elemento em formato de I também foi identificado que serve como um intensificador de tradução independente de tampa (3’CITE). Uma série de interações de laço de beijo de longa distância (setas duplas) também foram identificadas, que se acredita estarem envolvidas na estabilização do RNA e no acúmulo na ausência de um supressor de silenciamento. Com base nessa estrutura, diversas áreas foram identificadas como locais adequados para a inserto da sequência, que não deve atrapalhar a estrutura circundante.
[00145] Certos sítios foram identificados para potenciais insertos na 3'UTR e no RdRp ORF que podem acomodar grampos de ARN, por exemplo, para a geração de siRNAs que têm como alvo insetos que se alimentam, sítios que acomodam ORFs repórter e ainda permitem a replicação de um CYVaV modificado em N. benthamiana agroinfiltrada e sítios que desencadeiam a tradução de alto nível de proteínas repórter in vitro. Um CYVaV projetado que incorpora o ORF e os siRNAs adicionados é introduzido em uma árvore hospedeira de armazenamento e, em seguida, peças do mesmo são utilizáveis para introdução direta em árvores de campo por enxerto. Dada a raridade do CYVaV (até o momento, só foi identificado nas quatro árvores de limaquat por Weathers na década de 1950), há pouco risco de exclusão de superinfecção.
[00146] Vários locais de inserto foram identificados em que as propriedades de replicação ou tradução do vetor não foram significativamente reduzidas ou eliminadas. Os locais de inserto que afetam adversamente tais propriedades (provavelmente devido ao rompimento da estrutura do RNA ou outro aspecto importante do vetor CYVaV) não foram prosseguidos. Quatro locais de inserto exemplares no vetor com base em CYVaV foram identificados nas posições 2250, 2301, 2319 e 2331. Os insertos de grampo de 50 nt foram implantadas com sucesso nesses locais sem interrupção da tradução in vitro ou replicação em protoplastos e o CYVaV foi capaz de se mover sistemicamente em N. benthamiana.
[00147] Embora o CYVaV não tenha ORFs adicionais, tanto o RNA genômico (g) quanto o RNA subgenômico (sg) de cerca de 500 nt são detectáveis usando sondas para cadeias positivas e negativas. A investigação da região que deve conter um promotor sgRNA revelou um elemento com semelhança significativa com o promotor sgRNA altamente conservado dos umbravírus e com um promotor sgRNA mínimo, mas altamente funcional, do carmovírus TCV. Além disso, RNAs semelhantes que também expressam apenas o RdRp e estão relacionados aos vírus de Tombus, todos geram um RNA subgenômico de tamanho semelhante e podem simplificar a expressão de peptídeos e proteínas.
[00148] Para determinar em que os insertos são tolerados a jusante do promotor sgRNA em CYVaV, uma avaliação de em que existem elementos críticos na 3'UTR de CYVaV foi realizada, de modo que tais elementos sejam evitados ao inserir sequências heterólogas. Conforme descrito sobre, o 3'CITE para CYVaV foi identificado, bem como vários grampos proximais 3' adicionais que são altamente conservados em umbravírus e conhecidos por serem críticos para replicação e tradução. Usando deleções/mutações pontuais, a sequência a jusante do promotor sgRNA putativo e a montante do CAS (~120 nt) foi investigada para regiões que não afetam o acúmulo em protoplastos ou o movimento sistêmico em N. benthamiana. Uma estratégia semelhante foi utilizada anteriormente pelos presentes inventores para identificar regiões na 3’ UTR de TCV que podem acomodar grampos alvejados por enzimas do tipo RNase III (Aguado, L.C. et al. (2017). RNase III nucleases from diverse kingdoms serve as antiviral effectors. Nature 547:114- 117).
[00149] Depois de identificar regiões adequadas para acomodar deleções/mutações (por exemplo, regiões não envolvidas em funções críticas), sequências heterólogas de diferentes comprimentos foram inseridas nas mesmas para avaliar a funcionalidade de CYVaV com uma 3'UTR estendida. Tal investigação auxilia na determinação do comprimento máximo da inserto para garantir que tal inserto será tolerada pelo vetor com base em CYVaV enquanto ainda acumula a níveis robustos e se engaja no movimento sistêmico. Acredita-se que o vetor com base em CYVaV pode ser capaz de acomodar um inserto com um tamanho de até 2 kb. A esse respeito, os vírus relacionados mais próximos (vírus do tipo umbra de mamão, que como o CYVaV, codificam apenas uma proteína associada à replicase e o RdRp) são 1 a 2 kb maiores, com todo o comprimento da sequência adicional que expande seus 3'UTRs (Quito-Avila, DF et al. (2015). Detecção e sequência parcial do genoma de um novo vírus semelhante à umbra do mamão constatado no Equador. Eur J Plant Pathol 143:199-204). Vários fragmentos de sequência de tamanho foram avaliados, começando em 50 nt (o tamanho de um grampo inserido para a produção de RNA pequeno), até cerca de 600 nt (o tamanho de um ORF enzimático). Os pequenos fragmentos de RNA iniciais incluem um repórter para derrubar a fitoeno dessaturase, que torna o tecido branco. Os fragmentos de tamanho mais longos incluem nano luciferase e ORFs de GFP, que também podem ser usados como repórteres para examinar o nível de expressão. Os insertos são feitos em construções que contém o promotor sgRNA de tipo selvagem (WT) e o promotor sgRNA aprimorado.
[00150] Sequência de bloqueio e encaixe para estabilizar a base dos insertos. Com referência à Figura 24, Painel A, é mostrada a estrutura básica da sequência de bloqueio e encaixe. O encaixe de Tetraloop GNRA (GAAA) com sua sequência de encaixe gera uma estrutura extremamente estável. As sequências mostradas na Figura 24, Painel A, são apresentadas abaixo: gaaa (SEQ ID NO: 28) gauauggau (SEQ ID NO: 29) guccuaaguc (SEQ ID NO: 30) caggggaaacuuug (SEQ ID NO: 31)
[00151] O uso de uma armação que compreende um tetraloop encaixado como uma armação de cristalografia é fornecido (Figura 24, Painel B). A sequência mostrada na Figura 24, Painel B, é apresentada abaixo: cauuagcuaaggaugaaagucuaugcuaaug (SEQ ID NO: 32)
[00152] Uma estrutura de bloqueio e encaixe de acordo com modalidades reveladas é mostrada na Figura 24, Painel C. Os insertos (grampos ou sequências não fixas) podem ser adicionadas ao sítio de restrição no local de inserto adicional identificado. As bases circuladas são sequências de encaixe para o tetraloop. A sequência mostrada na Figura 24, Painel C, é apresentada abaixo: gcaccuaaggcgucagggucuagacccugcucaggggaaacuuugucgcua uggugc (SEQ ID NO: 33)
[00153] Estabilizar a estrutura 3’UTR local é prejudicial; no entanto, o inserção de um inserto desestabilizador nas proximidades restaura a viabilidade. Com referência à Figura 25, Painel A, é mostrada uma representação de CYVaV-wt. CYVaV-wt 3’stb é o construto parental estabilizado que contém 6 mudanças nt que convertem pares G:U em pares G:C. Dois insertos de 60 nucleotídeos foram adicionadas ao construto parental estabilizado nas posições 2319 e 2330 que formam CY2319PDS60_3’stb e CY2330PDS60_3’stb. As alterações de nucleotídeos feitas para estabilizar a estrutura e gerar CYVaV- wt 3’stb estão circuladas no Painel B. As sequências mostradas na Figura 25, Painel B, são apresentadas abaixo: ggcuaguuaaucucauucgugggauggacaggcagccugacguugac (SEQ ID NO: 34) guuaauguaggugucuuuccguaucuaguc (SEQ ID NO: 35) (pares G:U não modificados) gucaacgcaggugccuguccguaucuagcc (SEQ ID NO: 36) (pares G:C convertidos) Alvos para tratamento e gestão
[00154] É fornecido um inserto antibiótico para entrega pelo vetor revelado, que compreende um enzibiótico ou um pequeno peptídeo projetado para destruir a bactéria CLas. Os enzibióticos preferem ambientes ricos em açúcar, à temperatura ambiente, como os encontrados no floema da planta. O enzimático é traduzido em células companheiras durante o ciclo de infecção do CYVaV projetado. As proteínas produzidas no citoplasma do floema são naturalmente capazes de sair para o elemento de peneira (a via padrão para proteínas traduzidas), em que CLas e outras bactérias fitopatogênicas fixam residência. No elemento de peneira, as moléculas de enzima se movem com o fotoassimilado para cima e para baixo no tronco e lisam qualquer bactéria ao entrar em contato. Uma vez que os enzibióticos são alvejados para uma classe específica de bactérias, preferencialmente não perturbam o microbioma da árvore hospedeira. Vários agentes que têm como alvo CLas foram desenvolvidos (por exemplo, Hailing Jin, Universidade da Califórnia, Riverside, CA). Assim, numerosos insertos que têm como alvo a bactéria CLas são conhecidos na técnica e podem ser utilizados com os vetores CYVaV da presente revelação.
[00155] Como outra modalidade, pode ser benéfico direcionar múltiplas vias para destruir a doença e o vetor psilídeo da doença. Como resultado, em certas modalidades, os vetores revelados incluem o enzibiótico e/ou peptídeos descritos acima, bem como insertos que desencadeiam a produção de siRNAs que interferem com a expressão gênica da árvore ou do psilídeo portador da doença. No caso do ACP, o RNA poderia matar o vetor ou tornar o mesmo sem asas e, portanto, inofensivo. EXPRESSÃO DE alvejamento de vetor com base em CYVaV de sintase calose.
[00156] É fornecido um vetor que compreende um inserto de RNA que desencadeia a redução da produção de calosidades e acúmulo em uma árvore hospedeira. Uma quantidade suficientemente grande do gene que produz calosidade no floema em resposta a bactérias é silenciada por meio da inserto de uma sequência de siRNA que é extirpada pela planta.
[00157] O vetor com base em CYVaV pode ser utilizado como um vetor de silenciamento de gene induzido por vírus (VIGS) para regular negativamente a expressão da sintase calose no floema. VIGS tem sido amplamente utilizado para regular negativamente a expressão gênica em plantas maduras para examinar a genômica funcional das plantas (Senthil-Kumar et al. (2008). Silenciamento de genes induzido por vírus e sua aplicação na caracterização de genes envolvidos na tolerância ao déficit hídrico e ao estresse. J Plant Physiol 165 (13):1404-1421). Uma sequência complementar é inserida no CYVaV em um local adequado conforme identificado acima (seja anti-sentido ou um grampo clivável por RNase III). Uma versão cítrica do gene é conhecida (Enrique et al. (2011). Novel demonstration of RNAi in citrus reveals importance of citrus callose synthase in defense against Xanthomonas citri subsp. citri. Plant Biotech J 9: 394-407).
[00158] Calose é um β 1,3-glucano que é sintetizado em vários tecidos durante o desenvolvimento e estresse biótico e abiótico (Chen, X.Y. e Kim, J.Y. (2009). Callose synthesis in higher plants. Plant Sig Behav 4(6):489-492). A deposição de calosidade nas placas da peneira de elementos da peneira inibe o fluxo de fotoassimilados no floema, levando ao acúmulo excessivo de calosidade nos cloroplastos, o que contribui para a morte de árvores durante infecções bacterianas como o HLB (Koh, H. et al. (2012). Silent Information Regulator 2 (Sir2)
and Forkhead Box O (FOXO) Complement Mitochondrial Dysfunction and Dopaminergic Neuron Loss in Drosophila PTEN-induced Kinase 1 (PINK1) Null Mutant. J Biol Chem 287(16):12750-12758). Todas as plantas contêm 12-14 genes de sintase calose; um membro desta família de genes, CalS7 (nomenclatura de Arabidopsis), é principalmente responsável pela rápida deposição calose em poros de peneira do floema em resposta a ferimentos e vários patógenos (Xie et al. (2011). CalS7 encodes a callose synthase responsible for callose deposition in the phloem. Plant J 65(1):1-14). A inibição completa de GSL7 impactou tanto o transporte normal do floema quanto o desenvolvimento da inflorescência em Arabidopsis (Barratt et al. (2011). Callose Synthase GSL7 Is Necessary for Normal Phloem Transport and Inflorescence Growth in Arabidopsis. Plant Physiol 155(1):328- 341). Um vetor com base em CYVaV é utilizado para regular negativamente os ortólogos de N. benthamiana e laranjeira de CalS7 em plantas maduras, para investigar as consequências da deposição calose de placa de peneira reduzida (mas não eliminada). Alternativamente, ou adicionalmente, o vetor fornece um inserto que expressa uma enzima degradante calose.
[00159] Em algumas modalidades, é fornecida um inserto que tem como alvo um ou mais vírus e/ou patógenos fúngicos. Em algumas modalidades, é fornecido um inserto em grampo que gera um siRNA que tem como alvo diretamente CVEV, uma vez que CVEV é conhecido por intensificar ligeiramente os impactos de amarelecimento de CYVaV e permitir o transporte de CYVaV entre árvores. Em algumas modalidades, é fornecida um inserto em grampo que tem como alvo CTV, uma vez que CTV é um patógeno viral altamente destrutivo de citros (perdendo apenas para CLas). Em outras modalidades, é fornecida um inserto que tem como alvo outro vírus cítrico (ou outro). Em algumas modalidades, é fornecido um inserto que tem como alvo um patógeno fúngico (ou patógenos fúngicos), uma vez que tal patógeno (ou patógenos) é capaz de pegar siRNAs do floema.
[00160] Em algumas modalidades, o vetor com base em CYVaV (ou outro iRNA) inclui um inserto projetado (ou insertos projetados) para modificar uma propriedade fenotípica de uma planta que emana da expressão gênica em células companheiras. Em uma implantação, é fornecido um inserto que ativa o nanismo, de modo que a fruta é mais fácil de colher e os requisitos de espaço de crescimento são reduzidos. Traços adicionais e/ou outras também podem ser direcionadas conforme desejado. Os vetores de iRNA da presente revelação que compreendem 1, 2, 3 ou mais insertos demonstram estabilidade e funcionalidade.
[00161] Todas as publicações identificadas e referências mencionadas neste relatório descritivo são no presente documento incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência em sua totalidade. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades exemplificativas da mesma, será entendido que a mesma tem capacidade de modificações adicionais e este pedido se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios do invenção e incluindo tais desvios da presente revelação como abrangido da prática conhecida ou habitual dentro da técnica à qual a invenção pertence e como podem ser aplicados aos recursos no presente documento estabelecidos anteriormente.

Claims (43)

REIVINDICAÇÕES
1. VETOR DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) DE FITA SIMPLES E SENSO POSITIVO, que compreende um elemento de replicação (ou elementos de replicação) e um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos), sendo que o dito vetor de RNA é caracterizado por carecer de uma fase de leitura aberta (ORF) de proteína de revestimento funcional (ou proteínas de revestimento funcionais) e um ORF de proteína de movimento funcional (ou proteínas de movimento funcionais).
2. VETOR DE RNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender um Intensificador de Tradução Independente de Cap 3' (3’ CITE) que compreende a sequência de ácidos nucleicos (ou sequências de ácidos nucleicos) de SEQ ID NO: 4 e/ou SEQ ID NO: 5.
3. VETOR DE RNA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo dito 3’ CITE compreender a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 3.
4. VETOR DE RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo dito elemento de replicação (ou elementos de replicação) compreender uma ou mais sequências de polinucleotídeos conservadas com a sequência de ácidos nucleicos de: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 14.
5. VETOR DE RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo dito elemento de replicação (ou elementos de replicação) compreender, ainda, uma ou mais sequências de polinucleotídeos conservadas com a sequência de ácidos nucleicos de: SEQ ID NO: 15 e/ou SEQ ID NO: 16.
6. VETOR DE RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser derivado de vírus das nervuras amarelas dos citros (SEQ ID NO:1) ou de um iRNA relativo do mesmo.
7. VETOR DE RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser capaz de realizar replicação e movimento limitados por floema e sistêmicos em uma planta hospedeira.
8. VETOR DE RNA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser funcionalmente estável para replicação, movimento e/ou tradução na planta hospedeira por pelo menos um mês após a infecção do mesmo.
9. VETOR DE RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo dito segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) compreender um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula repórter, um peptídeo e uma proteína.
10. VETOR DE RNA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo dito polipeptídeo ser um inseticida, um antibacteriano, um antiviral ou um antifúngico.
11. VETOR DE RNA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo dito antibacteriano ser um enzibiótico.
12. VETOR DE RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pelo dito antibacteriano ter como alvo uma bactéria da espécie Candidatus Liberibacter.
13. VETOR DE RNA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela dita espécie Candidatus Liberibacter ser Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas).
14. VETOR DE RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo dito segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) compreender uma molécula de RNA não codificadora pequena e/ou uma molécula interferente de RNA.
15. VETOR DE RNA, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela dita molécula de RNA não codificadora pequena e/ou a dita molécula interferente de RNA ter como alvo um vetor de inseto, um vírus ou um fungo.
16. VETOR DE RNA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela dita molécula de RNA não codificadora pequena e/ou a dita molécula interferente de RNA ter como alvo um ácido nucleico do dito vetor de inseto, dito vírus ou dito fungo.
17. VETOR DE RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo dito vírus ser selecionado a partir do grupo que consiste em Vírus da enação de nervuras dos citros (CVEV) e vírus da tristeza dos citros (CTV).
18. VETOR DE RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo dito segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) ser um primeiro segmento heterólogo que compreende, ainda, um segundo segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos), em que o dito elemento de replicação (ou elementos de replicação) é intermediário em relação ao dito primeiro e ao segundo segmentos heterólogos.
19. VETOR de RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo dito segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) compreender um polinucleotídeo que codifica uma proteína ou peptídeo que altera um traço fenotípico.
20. VETOR DE RNA, de acordo com a reivindicação 19,
caracterizado pelo dito traço fenotípico ser selecionado a partir do grupo que consiste em tolerância à pesticida, tolerância à herbicida, resistência a inseto, produção de calose reduzida, aumento na taxa de cultivo e nanismo.
21. PLANTA HOSPEDEIRA que compreende o vetor de RNA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada por ser uma planta inteira, um órgão de planta, um tecido de planta ou uma célula de planta.
22. PLANTA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por ser de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em citros, vitis, ficus e olea.
23. PLANTA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por ser uma árvore cítrica ou um enxerto de árvore cítrica.
24. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender uma planta, um órgão de planta, um tecido de planta ou uma célula de planta infectada pelo vetor de RNA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
25. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pela dita planta ser de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em citros, vitis, ficus e olea.
26. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pela dita planta ser uma árvore cítrica ou um enxerto de árvore cítrica.
27. MÉTODO PARA INTRODUZIR UM SEGMENTO HETERÓLOGO (OU SEGMENTOS HETERÓLOGOS) EM UMA PLANTA HOSPEDEIRA caracterizado por compreender introduzir, na dita planta hospedeira, o vetor de RNA conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pela dita etapa de introdução compreender enxertar um órgão de planta ou tecido de planta de uma planta que compreende o vetor de RNA em um órgão de planta ou tecido de planta de outra planta que não compreende o vetor de RNA antes da dita introdução.
29. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 e 28, caracterizado pelo vetor de RNA infectar sistematicamente a planta hospedeira.
30. PROCESSO PARA PRODUZIR, EM UMA PLANTA, UM ÓRGÃO DE PLANTA, UM TECIDO DE PLANTA OU UMA CÉLULA DE PLANTA, UM SEGMENTO HETERÓLOGO (OU SEGMENTOS HETERÓLOGOS), caracterizado por compreender introduzir, na dita planta, no dito tecido de planta ou na dita célula de planta, o vetor de RNA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
31. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela dita planta ser de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em citros, vitis, ficus e olea.
32. KIT, caracterizado por compreender o vetor de RNA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
20.
33. USO DO VETOR DE RNA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por se destinar a introduzir o segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) em uma planta, um órgão de planta, um tecido de planta ou uma célula de planta.
34. USO DA PLANTA HOSPEDEIRA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 21 a 23, OU DA COMPOSIÇÃO, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado por se destinar a introduzir o vetor de RNA em um órgão de planta ou um tecido de planta que, antes da dita introduzir, não compreende o vetor de RNA.
35. USO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pela dita introdução compreender enxertar um órgão de planta ou tecido de planta de uma planta que compreende o vetor de RNA em um órgão de planta ou tecido de planta de outra planta que não compreende o vetor de RNA.
36. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM VETOR PARA USO COM UMA PLANTA, caracterizado por compreender as etapas de inserir um ou mais segmentos heterólogos em um RNA, em que o RNA é selecionado a partir do grupo que consiste em: CYVaV; um relativo de CYVaV; outros vetores de RNA que têm pelo menos 70% de identidade de RdRp com CYVaV; e outro iRNA.
37. VETOR, caracterizado por ser produzido pelo método conforme definido na reivindicação 36.
38. USO DE UM RNA COMO UM VETOR, caracterizado pelo RNA ser selecionado a partir do grupo que consiste em: CYVaV; um relativo de CYVaV; outros vetores de RNA que têm pelo menos 70% de identidade de RdRp com CYVaV; e outro iRNA.
39. USO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo RNA ser usado no tratamento de uma planta, por exemplo, no tratamento de uma infecção viral ou bacteriana de uma planta, por exemplo, no tratamento de infecção por CTV ou ecologização de Citro em uma planta Citro.
40. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 e 39, caracterizado pelo RNA ser modificado com um ou mais segmentos heterólogos inseridos, por exemplo, um enzibiótico.
41. USO DE UM RNA, caracterizado por se destinar à fabricação de um medicamento para tratar uma doença ou afecção de uma planta, em que o RNA é selecionado a partir do grupo que consiste em: CYVaV; um relativo de CYVaV; outros vetores de RNA que têm pelo menos 70% de identidade de RdRp com CYVaV; e outro iRNA.
42. USO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pela doença ou afecção ser uma infecção viral ou bacteriana de uma planta, por exemplo, CTV ou ecologização de Citro em uma planta Citro.
43. RNA PARA USO COMO UM MEDICAMENTO OU NO TRATAMENTO DE UMA DOENÇA OU AFECÇÃO DE UM PLANTA, sendo que o RNA é caracterizado por ser selecionado a partir do grupo que consiste em: CYVaV; um relativo de CYVaV; outros vetores de RNA que têm pelo menos 70% de identidade de RdRp com CYVaV; e outro iRNA.
BR112021009192-0A 2018-11-13 2019-11-12 Vetor de ácido ribonucleico (rna) de fita simples e senso positivo, planta hospedeira, composição, método para introduzir um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos) em uma planta hospedeira, processo para produzir, em uma planta, um órgão de planta, um tecido de planta ou uma célula de planta, um segmento heterólogo (ou segmentos heterólogos), kit, uso do vetor de rna, uso da planta hospedeira, método de produção de um vetor para uso com uma planta, vetor, uso de um rna como um vetor, uso de um rna, e rna para uso como um medicamento ou no tratamento de uma doença ou afecção de um planta BR112021009192A2 (pt)

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EP4058568A4 (en) * 2019-11-12 2024-04-03 Univ Maryland PLANT VECTORS, COMPOSITIONS AND RELATED USES
AU2022203005A1 (en) * 2021-05-21 2022-12-08 Silvec Biologics Inc. Plant vectors, compositions and uses relating thereto
US20240002881A1 (en) * 2022-05-04 2024-01-04 University Of Maryland, College Park RNA Vectors with Hairpin-like Inserts
CN115976277B (zh) * 2022-10-11 2024-01-19 云南农业大学 一种pemv-1和pemv-2的rt-pcr同步检测试剂盒及检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1100924A1 (en) * 1998-07-24 2001-05-23 Scottish Crop Research Institute Polynucleotide transporter protein
KR20030004305A (ko) * 1999-11-22 2003-01-14 플랜트 바이오사이언스 리미티드 전사 후 유전자 사일런싱（ｐｔｇｓ）의 억제제와 함께발현시킴으로써 이식 유전자의 발현을 증가시키는 방법
EP1686176A1 (en) * 2005-01-28 2006-08-02 Icon Genetics AG Production of antibodies in plants with plus-sense single-stranded viral RNA vectors
EP2418283A1 (en) * 2010-08-07 2012-02-15 Nomad Bioscience GmbH Process of transfecting plants

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