JP2022509553A - 植物ベクター、これに関連する組成物及び使用 - Google Patents

Abstract

本開示は、ペプチド、タンパク質又は小分子ＲＮＡといった治療剤を宿主植物に導入するために好適な一本鎖ＲＮＡベクターに関する。上記ベクターは、いずれの移行タンパク質又はコートタンパク質もコードしないが、上記宿主植物内での全身的な及び師部に限定された移行及び複製が可能である。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１８年１１月１３日出願の米国仮特許出願第６２／７６０，０９８号「Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」をベースとしており、上記出願は参照によりその全体が本出願に援用され、また上記出願に対して優先権が主張される。

配列表の参照
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ以上の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：２１０５＿００７１ＰＣＴ＿ＳＴ２５、２０１９年１１月１２日作成、サイズ：３７，７５５バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。

連邦政府資金による研究又は開発に関する声明
本発明は、米国農務省（ＵＳＤＡ）によって授与された助成金番号ＡＰ１７ＰＰＱＳ及びＴ００Ｃ１１８、並びに国立科学財団（ＮＳＦ）によって授与された助成金番号１４１１８３６の下で、政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

本開示は、ペプチド、タンパク質又は小分子ＲＮＡといった治療剤を宿主植物に導入するために好適な一本鎖ＲＮＡベクターに関し、その移行は師部に略限定され、植物の病気又は状態の制御又は管理を目標とする。

全体的な抗菌剤及び高度に標的化された抗菌剤が動物（例えばヒト）用に開発されており、ここで動物の循環器系は、該動物の全身にわたる広範な適用のための送達システムを提供する。対照的に、非遺伝子組み換え植物用の全体的な又は標的化された治療剤の開発のために実施されている研究ははるかに少なかった。というのは、単純化された循環器系の欠如により、宿主植物全体にわたる送達が複雑なものとなるためである。これは特に、抗菌剤の注入が急速に希釈される可能性がある、大型で長寿命の樹木（例えば柑橘類）において問題となる。その結果、例えば成長期の標的インサート若しくは他のベクターを制御するための殺虫剤の外部塗布、植物の健康を全体的に強化するための葉面塗布、又は病原体若しくはベクターを標的とする作用剤の、高コストな短期注入の他には、植物の全身にわたる感染症又は状態を治療するための解決策はほとんど存在しない。

特に懸念されるのは、柑橘類産業に影響を与える病気及び状態である。カンキツグリーニング病としても知られるＨｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ（ＨＬＢ：黄竜病）は、世界的に最も深刻な柑橘類の病気の１つである。ＨＬＢは細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ種の中の３種（ａｓｉａｔｉｃｕｓ、ａｆｒｉｃａｎｕｓ、及びａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）が関連するものであり、２種のキジラミＡｓｉａｎ ｃｉｔｒｕｓ ｐｓｙｌｌｉｄ（ＡＣＰ）（Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ ｃｉｔｒｉ、Ｋｕｗａｙａｍａ）及びＡｆｒｉｃａｎ ｃｉｔｒｕｓ ｐｓｙｌｌｉｄ（Ｔｒｉｏｚａ ｅｒｙｔｒｅａｅ、Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏ）によって伝播する。ＨＬＢは移植片伝染性であり、細菌を含有するキジラミが柑橘類の樹木を食べ、病原性細菌を師部に沈着させ、そこで細菌が繁殖すると、自然に拡散される。樹木が感染すると治療法は存在しない。罹病した果実はヒトに対して健康上の脅威をもたらすことはないものの、ＨＬＢは、世界中の柑橘類作物を何百万エーカーも荒廃させた。米国だけでも、ＡＣＰ及びＣＬ ａｓｉａｔｉｃｕｓ（ＣＬａｓ）がフロリダの柑橘類産業を壊滅させ、極めて短期間に数十億ドルの作物損失を引き起こした。更にＨＬＢは、米国の全ての柑橘類生産地域に広がった。感染した樹木の大半は感染から数年以内に枯死し、果実は形状が崩れて風味が損なわれるため、消費に適さない。米国農務省（ＵＳＤＡ）によると、柑橘類産業全体が相当なリスクにさらされている。

植物生理学の考察は、植物の病気及び状態の管理のための戦略の開発及び実装に役立つ。植物の導管系は、糖及びアミノ酸、並びに多数の発生プロセス並びに生物的及び非生物的ストレスへの応答に必要な、小分子リボ核酸（ＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、及びホルモンといったシグナリング分子のための主要な導管である（図１）（非特許文献１、２）。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、これらのシグナリング分子の一部分を構成し、数千の伴細胞のｍＲＮＡを、隣接する除核師要素から分離でき、これらは、ソース（糖を生成する）組織から、根や茎の先端等のシンク（糖を利用する）組織への、浸透圧によって生成された静水圧によって、双方向に輸送される（非特許文献３、４）。伴細胞のトランスクリプトームのうちの５０％もが、移行に関与すると考えられており（非特許文献５～７）、ここから、ｍＲＮＡの大半のサブセットが長距離を移行する方法及び理由に関する様々な疑問が生じる。例えば、ＲＮＡ移行のプロセスはどの程度選択的なのか。選択が行われる場合、選択はどのように促進されるのか。通過ＲＮＡは改変されている（例えばメチル化されている）か。通過ＲＮＡは、ＳＥへと出てゆく前にいずれの特定の細胞内の場所に見られるか。通過ＲＮＡの「ジップコード（ｚｉｐ ｃｏｄｅ）」は存在するか。通過ＲＮＡは特定のタンパク質と結合するか、及び特定の相互作用配列が存在するか。ｍＲＮＡの流れのうちどの程度が生物学的に意味があり、どの程度が非選択的であるか（シンク細胞はおそらく同一のｍＲＮＡを転写できるため）。

ｍＲＮＡの移行に関する文献には混乱が蔓延している。いくつかの研究は、ＲＮＡの移行度の主要な決定要因が、伴細胞の量であることを示している（非特許文献８、６、７）。数学的モデリングを用いて、主にｍＲＮＡの量に基づく、ｍＲＮＡの移行に関する非選択的なブラウン運動モデルが提案されており、半減期及び転写産物の長さもある役割を果たしている（非特許文献９）。しかしながら、他の研究はその反対の結論に達しており、伴細胞中のｍＲＮＡの量は、移行と相関しないことを発見した（非特許文献１０）。更に、師部は通過ＲＮＡを標的とするＲＮＡｅを含有しないと一般に想定される（非特許文献１１）が、非特許文献１０は、移行性のｍＲＮＡの大半が分解され、根及び上部茎に到達しないことも発見した。他の研究は、予測されたｔＲＮＡ様構造の存在が移行性ｍＲＮＡの１１％以上に関連していることを発見し（非特許文献１２）、これは、移行性ｍＲＮＡが特定の「ジップコード」を有している可能性があることを示唆している。しかしながら、同様のｔＲＮＡ様モチーフを含有する他の豊富なｍＲＮＡは、移行性ではなかった（非特許文献１０）。よって、過去の研究は、様々な細胞条件下の生体組織中で移行を追跡できる、多量の移行性ＲＮＡからなるモデルシステムを、同定及び開発できなかった。

植物ウイルスの多くは、リボ核タンパク質複合体（ｖＲＮＰ）として植物中を移行するが、これらは、内因性ＲＮＡ移行によって使用される経路と同一の経路を使用するように進化してきた。植物ウイルスは大量に蓄積する可能性があり、ほとんどが表皮又は葉肉細胞で感染を開始させた後、隣接する細胞の細胞質の間の連続を可能とする原形質連絡と呼ばれる選択性の高い細胞間コネクタを通して細胞間を移行する（図１；非特許文献１、１３も参照）。長距離の（葉から葉への）全身移行には、ウイルスが伴細胞に入り、そこで複製が行われ、その後、子孫が、伴細胞と師要素とを接続する特殊な分岐した原形質連絡を通過することによって、師要素へと出てゆくことが必要である。ウイルスは、管状の師要素に到達すると、師部の光合成産物の流れによって受動的に移行して、出てゆくときに全身的な感染を確立する（非特許文献３）。

ｖＲＮＰとして師部を通過するウイルスに関して、移行は、宿主ｍＲＮＡの移行と同様である。全ての植物ウイルスは、移行に必要な少なくとも１つの移行タンパク質をコードし、これはウイルスＲＮＡに結合し、また原形質連絡を拡張する。従って、宿主ｍＲＮＡの移行も、同様の宿主にコードされた移行タンパク質を必要とすると思われる。移行タンパク質は非特異的ＲＮＡ結合タンパク質である。しかしながら、ｖＲＮＰがどのようにして師部に入り、遠位組織から出るのかに関する疑問は残るものの、伴細胞遺伝子発現の再プログラミングが必要となる可能性がある（非特許文献１４）。ｍＲＮＡの往来が非常に広範で非特異的である場合、ＲＮＡウイルスが固有のコードされた移行タンパク質を必要とする理由は不明のままである。一部の研究者は、ＲＮＡウイルスが、伴細胞の原形質連絡のサイズ排除限界（～７０ｋＤａ）を超える大きなＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む、事前に形成された複製複合体として移行する場合に、移行タンパク質を必要とすることを示唆している（非特許文献１５）。また、一部のウイルスが師部に限定される理由及び方法も不明のままである。例えば師部限定クロステロウイルスは少なくとも５つの移行タンパク質を有し、また師部への限定は、サイレンシングサプレッサの過剰発現、及び宿主の防御の下方制御によって緩和でき（非特許文献３）、これは、師部への限定が一部のウイルスにとって複雑なプロセスであることを示唆している。師部への限定は（細胞間移行タンパク質の欠如とは対照的に）アクティブなプロセスとすることもできる。例えば、ジャガイモ葉巻ウイルスの移行タンパク質のドメインを変更すると、師部を出る能力が付与された（非特許文献１６）。

植物ウイルスの運動タンパク質の起源が解明されたときに、ｍＲＮＡの宿主移行とｖＲＮＰの移行との間の直接的な関係が確立された。キュウリモザイクウイルスの移行タンパク質に関連するカボチャタンパク質（ＲＰＢ５０）が発見され、これは、それ自体のｍＲＮＡ、及び他のｍＲＮＡを、師部へと移送できるものであった（非特許文献１７、１８）。非細胞自律タンパク質（ＮＣＡＰ）として知られるこれらの内因性移行タンパク質の複雑な集団は、ｍＲＮＡの、長距離にわたる師部の往来の原因として提案されている（非特許文献１９～２３）。

その発見（非特許文献２４）以来、原形質連絡へのｖＲＮＰの細胞間往来、並びに細胞間及び長距離移行の原因となる、多数のウイルス移行タンパク質が同定されている（非特許文献２５）。一部のウイルス（例えばウンブラウイルス）に関して、細胞間長距離移行は、複数の移行タンパク質に関連する（非特許文献２６）。例えば、柑橘トリステザウイルス等のクロステロウイルスは、３つの移行タンパク質を含有する。しかしながらほとんどのウイルスに関して、全ての移行活性は単一の移行タンパク質に関連すると考えられる。

ウイルスベクターを用いて、病気、昆虫、又は他の有害な状態（例えばＨＬＢ及び／若しくはキャリア昆虫）と戦うために、操作された治療剤を植物に送達することは、病原体に対する耐性又は他の望ましい特性といった特色を研究目的の植物に導入する確立された手段である。ベクターを植物に提供する様々な方法が、当該技術分野において公知である。これは多くの場合、当該細胞のゲノム改変をもたらすことができるアグロバクテリウム腫瘍形成によって仲介される「アグロ浸潤（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による、植物細胞の核へのウイルスベクターの送達によって、又はゲノム改変を必要としない感染をもたらす、細胞の細胞質へのウイルスベクターの直接送達によって、達成される。アグロ浸潤の場合、ウイルスゲノムのｃＤＮＡがＴ‐ＤＮＡに導入され、これが植物に提供される。このようなＴ‐ＤＮＡは、ゲノムの転写を可能にする調節ＤＮＡ成分を更に含む。ＤＮＡインサートを、標的植物に感染できるウイルスｃＤＮＡベクターに付着させる。ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、ウイルス及びインサートは植物細胞内でＲＮＡに転写され、その後、ウイルスは通常のＲＮＡウイルスとして作用する（増幅及び移行）。従って、有効なベクターとして機能するためには、その機能を無効化することなくインサートを受け入れるように、及び操作されたウイルスが、１つ以上の上記インサートを送達し、場合によっては発現するために十分なレベルまで、宿主の全身に確実に蓄積するように、ウイルスを操作する必要がある。これらのインサートは、タンパク質に翻訳されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるか、又は有益な機能に使用されるＲＮＡであるかにかかわらず、宿主に対して、又は宿主若しくは環境のいずれの下流消費に対して、有効かつ十分に無毒な方法で、標的組織に送達する必要がある。しかしながら、上述の基準を満たすウイルスベクターはごく限られた数しか存在せず、特定の植物にしか利用できない（例えばタバコに対するタバコラトルウイルス）。残念ながら、大半の植物、特に長寿命の樹木及びつる性植物に関して、好適なウイルスベクターは知られていないか、最適でないウイルスベクターしか存在しない。

よって、ＲＮＡ又はＤＮＡ療法を広範に実装する能力は、既存の技術では実質的に制限されている。１０００を超える植物ウイルスが同定されており、多くの植物が複数のウイルスに感染する。例えば柑橘類の樹木は、特にカンキツ葉枯ウイルス、カンキツリーフルゴースウイルス、カンキツらい症ウイルスＣ、カンキツソローシスウイルス、カンキツ突然死関連ウイルス、カンキツトリステザウイルス（ＣＴＶ）、カンキツ斑入りウイルス、カンキツベインエネーションウイルス、及びカンキツ黄斑モザイクウイルスに感染する。しかしながら、ＣＴＶは急速な衰え及び茎の穴あき等の壊滅的な柑橘類の病気の原因であり、作用剤を柑橘類の師部に送達するためのベクターとして開発されている現時点で唯一のウイルスである。

ＣＴＶは、クロステロウイルス属の一種である。これは、長さ２０００ｎｍ、直径１２ｎｍの寸法を有する２つのカプシドタンパク質で構成される柔軟な桿状ビリオンを有する。１９ｋｂを超えるゲノムを有するＣＴＶ（及び他のクロステロウイルス）は、植物に感染する既知のＲＮＡウイルスで最大のものである。これは、世界中で数百万の柑橘類の樹木を枯死させた、又は役に立たなくした、有毒な病原体であるが、少なくともフロリダの柑橘類の樹木では、操作されたベクター形式が比較的毒性の低い株から導出されている（カリフォルニアの樹木では依然として毒性が強い）。これまでの研究により、ＣＴＶ系ベクターが植物細胞内で操作されたインサートを発現することが実証されたと言われる（特許文献１、２）。しかしながら、これは、植物中での蓄積、及び目標とする有益な結果の達成に関する能力が一貫していないため、市販されていない。ＣＴＶが十分に高いレベルまで複製できないこと、及び熱に対する感受性により、治療に十分な量のＲＮＡを生成する能力が制限されていると考えられる。

よって、ＣＴＶ系ベクターは、ここで必要とされる有効かつ有益なペイロードを送達する能力が非常に限られている。更にＣＴＶは、サイズが大きいため操作が困難である。またＣＴＶは重感染排除を受け、ＣＴＶに既に感染した樹木にＣＴＶ系ベクターを感染させることはできない。またＣＴＶは、いくつかのアブラムシ種を介して植物から植物に極めて伝染しやすく、この特性は、望ましくない突然変異又は他の宿主との相互作用を発生させ得る環境への制御不能な逃避に関する規制当局に嫌われるものである。更に、ある地域（例えばフロリダ）に適した株が、別の地域（例えばカリフォルニア）の複数の品種の樹木には適していない。このような問題にもかかわらず、ＣＴＶは柑橘類樹木に使用できる唯一のウイルスベクターでプラットフォームある。

米国特許第８３８９８０４号 米国公開特許第２０１０００１７９１１Ａ１号

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従って、上述の問題の一部又は全てを解決し、また植物、特に樹木又はつる性植物等の長寿命の植物に、所望の特性を導入できる、及び／又は１つ以上の治療剤を送達できる、感染因子に対する需要が存在する。

本開示は：１つ以上の外因性インサートを植物に送達できる、１つ以上の新規の感染因子；本開示の１つ以上の因子に感染する植物を含む組成物；並びにこれに関する方法及び使用に関する。本開示の因子は、本明細書中において「独立移行性ＲＮＡ」又は「ｉＲＮＡ」と呼ばれる場合がある。感染性の一本鎖ＲＮＡ、ｉＲＮＡは、全ての既知の植物ウイルスの主要な特徴であるいずれの移行タンパク質又はＲＮＡサイレンシングサプレッサをコードしないため、ウイルスではない。更に、ウンブラウイルスを除く略全ての植物ＲＮＡウイルスとは異なり、ｉＲＮＡは、植物から植物へのウイルスのベクターによる移行の要件である、ＲＮＡをビリオンにカプシド化するためのコートタンパク質もコードしない。移行タンパク質の発現がないにもかかわらず、ｉＲＮＡは、宿主植物の師部内で全身的に移行できる。ウイルスと比較して、ｉＲＮＡは例えば：ほとんどの既知の植物ウイルスのレベルを超えるレベルで蓄積される能力；比較的小さなサイズ、例えば最小の植物ＲＮＡウイルスのサイズの約２／３しかなく、従ってこのような従来の植物ＲＮＡウイルスに比べて操作がはるかに容易であること；及び他の植物に自力で拡散できないこと（いずれのコートタンパク質をコードする能力がないため）といった、更なる有利な特性を有する。

本開示の実施形態によると、感染因子は、操作されたインサートを含有するｉＲＮＡ系ベクターを含み、これは、植物内での標的ペプチド及び１つ以上のタンパク質の発現をトリガする、並びに／又は有益な用途のために上記ベクターから切断される標的小分子ＲＮＡを生成する。本開示の態様は、以下を含む：標的化された抗病原剤の送達のためのｉＲＮＡ系ベクター；植物に感染する細菌、又は昆虫ベクターが必要とする細菌を標的とする、抗細菌性酵素抗生物質（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃ）；ＴＥＶ ＩＲＥＳから生成される酵素抗生物質；ｉＲＮＡゲノムへのｓｉＲＮＡの取り込み；インサートを支持する足場の基部を安定させるための、ロック・アンド・ドック構造へのインサートの取り込み；インサートの不安定化効果に正確に対抗するために局所領域の安定性を高めるよう改変されたｉＲＮＡゲノムからの、ｓｉＲＮＡの取り込み；標的昆虫ベクターを破壊又は殺滅するｓｉＲＮＡの取り込み；樹木のカロース産生の悪影響を軽減するｓｉＲＮＡの取り込み；植物による病原体の認識を軽減するｓｉＲＮＡの取り込み；及び特定の樹木の特色（例えば萎縮症）をトリガするインサートの取り込み。よって本開示の感染因子及び組成物は、従来技術と比較して優れた有利な特性を有する。

本開示のｉＲＮＡ系ベクターは、様々なタンパク質の発現、並びに／又は柑橘類及び他の宿主植物の師部内への小分子ＲＮＡの送達のための、一般的なプラットフォームとしての使用に好適である。いくつかの実装形態では、ＣＹＶａＶ系ベクターが提供され、これは、伴細胞及び師部実質細胞中に大量に蓄積される。本開示のベクターを用いて、樹木の師部における特定の遺伝子発現のサイレンシングの効果を検査できる。更に、師要素を通るｍＲＮＡの長距離移行を検査するために、ＣＹＶａＶをモデルシステムへと成長させることができる。ＣＹＶａＶは、略全ての柑橘類の種に感染でき、感染した植物で生成される症状は存在するとしてもわずかであるため、樹木性植物内でのＲＮＡの移行を容易に検査できる。

本開示の実施形態によると、本開示は、１つ以上の複製要素及び１つ以上の異種セグメントを含む一本鎖プラス鎖リボ核酸（ＲＮＡ）ベクターを対象とし、上記ＲＮＡベクターは、１つ以上の機能性コートタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び１つ以上の機能性移行タンパク質のＯＲＦを含まない。いくつかの実装形態では、上記ＲＮＡベクターは、配列番号４及び／又は配列番号５の１つ以上の核酸配列を有する３’キャップ非依存的翻訳促進領域（３’ Ｃａｐ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ：３’ＣＩＴＥ）を含む。いくつかの実施形態では、上記３’ＣＩＴＥは、配列番号３の核酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、上記ＲＮＡベクターの上記１つ以上の複製要素は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び／又は配列番号１４の核酸配列を有する、１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実装形態では、上記１つ以上の複製要素は更に、又はあるいは、配列番号１５及び／又は配列番号１６の核酸配列を有する、１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列を有する。

いくつかの実施形態では、上記ＲＮＡベクターは、カンキツ葉脈黄化ウイルス（配列番号１）、又はその近縁のｉＲＮＡに由来する。本開示のＲＮＡベクターは、宿主植物内における、全身的な及び師部に限定された移行及び複製が可能である。本開示のＲＮＡベクターは、感染後少なくとも１か月にわたって、宿主植物内での複製、移行、及び／又は翻訳に関して機能的に安定している。

いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡベクターの上記１つ以上の異種セグメントは、レポータ分子、ペプチド、及びタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実装形態では、上記ポリペプチドは殺虫剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤、又は抗真菌剤である。いくつかの実装形態では、上記抗細菌剤は酵素抗生物質である。いくつかの実装形態では、上記抗細菌剤は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ種の細菌、例えばＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ（ＣＬａｓ）を標的とする。

いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡベクターの上記１つ以上の異種セグメントは、ノンコーディングＲＮＡ小分子及び／又はＲＮＡ干渉分子を含む。いくつかの実装形態では、上記ノンコーディングＲＮＡ小分子及び／又は上記ＲＮＡ干渉分子は、昆虫ベクター、ウイルス、又は真菌を標的とする。いくつかの実装形態では、上記ノンコーディングＲＮＡ小分子及び／又は上記ＲＮＡ干渉分子は、上記昆虫ベクター、上記ウイルス、又は上記真菌の核酸を標的とする。いくつかの実装形態では、標的化されるウイルスは、カンキツベインエネーションウイルス（ＣＶＥＶ）及びカンキツトリステザウイルス（ＣＴＶ）からなる群から選択される。

上記ＲＮＡベクターは、それぞれ同一の又は異なる機能を提供する、複数の異種セグメントを含んでよいことを理解されたい。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の異種セグメントは第１の異種セグメントであり、ここで上記ＲＮＡベクターは第２の１つ以上の異種セグメントを更に含み、上記１つ以上の複製要素は上記第１の異種セグメントと上記第２の異種セグメントとの間にある。

いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡベクターの上記１つ以上の異種セグメントは、表現型の特色を改変するタンパク質又はペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実装形態では、上記表現型の特色は、農薬耐性、除草剤耐性、昆虫耐性、カロース産生の減少、成長速度の上昇、及び萎縮症からなる群から選択される。

本開示はまた、本開示のＲＮＡベクターを含む宿主植物も対象とする。上記宿主植物は、植物全体、植物器官、植物組織、又は植物細胞であってよい。いくつかの実装形態では、上記宿主植物は、ミカン属、ブドウ属、イチジク属、及びオリーブ属からなる群から選択される属のものである。いくつかの実装形態では、上記宿主植物は、柑橘類の樹木又は柑橘類の樹木の移植片である。

本開示はまた、本開示のＲＮＡベクターに感染した植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞を含む組成物に関する。いくつかの実装形態では、上記植物は、ミカン属、ブドウ属、イチジク属、及びオリーブ属からなる群から選択される属のものである。いくつかの実装形態では、上記植物は、柑橘類の樹木又は柑橘類の樹木の移植片である。

本開示はまた、１つ以上の異種セグメントを宿主植物に導入する方法に関し、上記方法は、上記宿主植物に、本開示のＲＮＡベクターを導入することを含む。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の異種セグメントを上記宿主植物に導入する上記ステップは、本開示のＲＮＡベクターを含む植物の植物器官又は植物組織を、導入の前には上記ＲＮＡベクターを含まない別の植物の植物器官又は植物組織に移植することを含む。本開示のＲＮＡベクターは、上記宿主植物に全身的に感染できる。

本開示はまた、植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞中で、１つ以上の異種セグメントを生成するプロセスも対象とし、上記プロセスは、上記植物、上記植物組織、又は上記植物細胞に本開示のＲＮＡベクターを導入するステップを含む。いくつかの実施形態では、上記植物は、ミカン属、ブドウ属、イチジク属、及びオリーブ属からなる群から選択される属のものである。

本開示はまた、本開示のＲＮＡベクターを含むキットに関する。

本開示はまた、上記１つ以上の異種セグメントを、植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞に導入するための、本開示の１つ以上のＲＮＡベクターの使用も対象とする。本開示はまた、１つ以上の上記ＲＮＡベクターを、導入の前には上記ＲＮＡベクターを含まない植物器官又は植物組織に導入するための、本開示の１つ以上の宿主植物の使用、又は本開示の１つ以上の組成物の使用も対象とする。いくつかの実装形態では、上記ＲＮＡベクターを導入する上記ステップは、上記ＲＮＡベクターを含む植物の植物器官又は植物組織を、上記ＲＮＡベクターを含まない別の植物の植物器官又は植物組織に移植するステップを含む。

本開示はまた、植物と共に使用するためのベクターを作製する方法も対象とし、上記方法は、１つ以上の異種セグメントをＲＮＡに挿入するステップを含み、上記ＲＮＡは：ＣＹＶａＶ；ＣＹＶａＶの近縁種；ＣＹＶａＶと少なくとも７０％のＲｄＲｐ同一性を有する他のＲＮＡベクター；及び別のｉＲＮＡからなる群から選択される。本開示はまた、本開示の１つ以上の方法によって生成されるベクターに関する。

本開示はまた、ベクターとしてのＲＮＡ分子の使用にも関し、上記ＲＮＡは：ＣＹＶａＶ；ＣＹＶａＶの近縁種；ＣＹＶａＶと少なくとも７０％のＲｄＲｐ同一性を有する他のＲＮＡベクター；及び別のｉＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの実装形態では、上記ＲＮＡは、植物の治療、例えば植物のウイルス又は細菌感染の治療、例えば柑橘類植物のＣＴＶ感染又はカンキツグリーニング病の治療に使用される。上記ＲＮＡは、挿入された１つ以上の異種セグメント、例えば酵素抗生物質によって改変される。

本開示はまた、植物の病気又は状態の治療のための薬剤の製造におけるものであることを特徴とする、ＲＮＡ分子の使用も対象とし、上記ＲＮＡは：ＣＹＶａＶ；ＣＹＶａＶの近縁種；ＣＹＶａＶと少なくとも７０％のＲｄＲｐ同一性を有する他のＲＮＡベクター；及び別のｉＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの実装形態では、上記病気又は状態は、植物のウイルス又は細菌感染、例えば柑橘類植物のＣＴＶ感染又はカンキツグリーニング病である。

本開示はまた、薬剤としての、又は植物の病気若しくは状態の治療における使用のための、ＲＮＡ分子も対象とし、上記ＲＮＡは：ＣＹＶａＶ；ＣＹＶａＶの近縁種；ＣＹＶａＶと少なくとも７０％のＲｄＲｐ同一性を有する他のＲＮＡベクター；及び別のｉＲＮＡからなる群から選択される。

図１は、植物の導管系を通る移行経路の概略図を示す（Lee, J.Y. and Frank, M. (2018), Plasmodesmata in phloem: different gateways for different cargoes, Curr Opin Plant Biol 43:119-124）。 図２は、ＣＹＶａＶと、トンブスウイルス科のいくつかのウイルスとの関連性を示す系統樹である。 図３は、ＣＹＶａＶ及び類似のＲＮＡ分子のゲノム構成の概略図（パネルＡ）を示す。複製に関与するタンパク質（ＰＥＭＶ２のｐ３３及びｐ９４；ＣＹＶａＶのｐ２１及びｐ８１；ＰＭｅＶ２‐ＥＳのｐ３５及びｐ８６；ＰＵＶのｐ３１及びｐ８５；ＴＢＴＶａのｐ２９及びｐ８９）をコードするＯＲＦは、濃い灰色で識別される。ウンブラウイルスＰＥＭＶ２は、移行に関与するタンパク質ｐ２６及びｐ２７をコードするＯＲＦも有する（薄い灰色のボックスで識別される）。フレームシフトリボソーム記録部位（ＦＳ）及びリードスルーリボソーム記録部位（ＲＴ）も識別されている。浸潤済みのＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉（パネルＢ、上）及び全身の葉（パネルＢ、下）における、ＣＹＶａＶプラス（＋）鎖のレベルを示す。全長ＣＹＶａＶ及びＰＥＭＶ２の小麦胚芽抽出物中での試験管内フレームシフトによって合成された、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のレベルを示す（パネルＣ）。ＣＹＶａＶによって生成されたｐ８１ポリメラーゼと比較した場合のＰＥＭＶ２由来のｐ９４のレベルの差は重要である。ＣＹＶａＶのフレームシフト部位は、ウイルス学において知られる最も強力な部位の１つであり、その著しく高い蓄積の原因であると考えられている。 図４は、追加のｉＲＮＡ、並びにウチワサボテン、イチジクの木、及びエチオピアトウモロコシにおいて同定されたＣＹＶａＶの近縁種のゲノム構成の概略図である。ｉＲＮＡ近縁種は全て、３’ＵＴＲにおけるインサートと、未知の機能のタンパク質（ｐ２１．２）をコードするＯＲＦの生成をもたらす他のヌクレオチド変化とを有する。 図５は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのアグロ浸潤済みの葉からのＲＮＡレベルを示す。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉におけるＣＶＥＶ（レーン１～２）、ＣＶＥＶ＋ＣＹＶａＶ（レーン３～５）、及びＣＹＶａＶ（レーン６～８）。ＣＹＶａＶの蓄積は、推定ヘルパーウイルスＣＶＥＶの存在下で有意に増大した。プラス鎖は上側に示されている。ｒＲＮＡローディングコントロールは下側に示されている。ｐ１４サイレンシングサプレッサは、全ての葉に同時浸潤された。 図６は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのアグロ浸潤済みの葉を用いた別の実験からのＲＮＡレベルを示す。Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉にアグロ浸潤されたＣＹＶａＶ、又はＣＶＥＶ、又はＣＹＶａＶ＋ＣＶＥＶ。ＣＹＶａＶはＣＶＥＶのビリオンにカプシド化され、ビリオンは１週間後に単離されて、カプシド化されたＲＮＡはＰＣＲ分析に供された。 図７は、ＣＹＶａＶ（パネルＡ）及びＣＹＶａＶ＋ＣＶＥＶ（パネルＢ）の黄化症状を示し、これらはシトロン（写真）、レモン、及びライムに限定される。 図８は、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるＣＹＶａＶの全身的な移行及び師部に限定された移行を示し、ＣＹＶａＶは、該植物の輸送組織に閉じ込められている。ＣＹＶａＶのプラス鎖がピンク色に染色されたことを検出する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ）撮像が、パネルＡ～Ｇに示されており、これらは、葉柄（パネルＡ～Ｄ）及び根組織（パネルＥ～Ｇ）の長手方向断面図を含む。組織はＤＡＰＩによって染色した。伴細胞（ＣＣ）、師部実質細胞（ＰＰＣ）、及び師要素（ＳＥ）、並びに木部（ＸＬ）が識別されている。なお、ｉＲＮＡは完全にＳＥ、ＣＣ、及びＰＰＣに制限されている。青色（ここでは濃い灰色又は黒色の領域として示される）は、内因性ＤＮＡのＤＡＰＩ染色によるものである。ＣＹＶａＶは、試験した略全ての柑橘類において無症状である。 図９は、ＳＨＡＰＥ構造プロービング、並びにウチワサボテン、イチジク、及びトウモロコシにおけるＣＹＶａＶ近縁種との系統発生学的比較によって決定された、ＣＹＶａＶの全長二次構造の概略図である。記録フレームシフト部位（図１０参照）は、単一の実線で囲まれた領域によって識別されており、ＩＳＳ様（Ｉ字型構造）３’ＣＩＴＥ（図１１参照）は、破線で囲まれた領域によって識別されている。例えば挿入された１つ以上のヘアピンに対応する領域は、二重線で囲まれた領域によって示されている。 図１０は、ＣＹＶａＶ及びＰＥＭＶ２（パネルＡ）における記録フレームシフト部位の構造の概略図である。ＣＹＶａＶは、この領域の構造の複数のコンフォメーションを有し（図９参照）、そのうちの１つだけが図示されている。「スリップしやすい（ｓｌｉｐｐｅｒｙ）」部位は、破線で囲んで識別されており、停止コドン塩基は黒い円内である。実線で囲んで識別されている塩基は、３’末端との長距離相互作用に関わる。 図１１は、ＣＹＶａＶのＩＳＳ様３’キャップ非依存的翻訳促進領域（３’ＣＩＴＥ）の概略図である。ＣＹＶａＶの３’末端の構造が示されている。３’ＣＩＴＥは、図示された最も左側の部分に示されており、塩基は円で囲まれている。実線で囲んで識別されている配列は、記録部位との長距離ＲＮＡ：ＲＮＡ相互作用に関わる。 図１２は、トランス阻害（ｔｒａｎｓ‐ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）アッセイの結果を示す。全長ＣＹＶａＶは、１０倍モル過剰量のＩＳＳ（ＩＳＳ_S）の切断バージョン、又はフルサイズＩＳＳ（ＩＳＳ_L）の存在下で、試験管内で翻訳された。 図１３は、ＣＹＶａＶがサイレンシングサプレッサをコードしないことを実証している。パネルＡ及びＢを参照すると、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ １６Ｃ植物に、（これらの植物においてサイレンシングされる）ＧＦＰを発現する構築物と、ＣＹＶａＶ ｐ２１若しくはｐ８１を発現する構成物、又は既知のサイレンシングサプレッサｐ１９（ＴＢＳＶ由来）若しくはｐ３８（ＴＣＶ由来）を発現する構築物とをアグロ浸潤させた。ｐ１９及びｐ３８だけがＧＦＰのサイレンシングを抑制し、緑色蛍光を発現させる（浸潤済みの領域はパネルＢにおいて破線の円で囲んで識別されている）。パネルＣを参照すると、ＧＦＰオリゴヌクレオチドでプローブしたノーザンプロットは、ＧＦＰ ＲＮＡがｐ２１又はｐ８１の存在下で依然としてサイレンシングされることを示した。 図１４は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ原形質体におけるＣＹＶａＶの複製を実証している。ＣＹＶａＶの感染性クローンが生成された。野生型ＲＮＡ転写産物（ＣＹＶａＶ）、又はＲｄＲｐの合成を排除するため複製しない、「スリップしやすい」記憶部位に突然変異を含有する転写産物（ＣＹＶａＶ‐ｆｓｍ）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ原形質体に接種した。ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットを３０時間後に実施した。なお、接種されたＣＹＶａＶ‐ｆｓｍの転写産物は、３０時間の時点において依然として原形質体中に存在していた（従来のウイルスでは４時間後には検出されなくなる）。プラス鎖はパネルＡに示されており、マイナス鎖複製中間体はパネルＢに示されている。 図１５は、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉｎａｎａにおけるＣＹＶａＶの複製を実証している。パネルＡを参照すると、ノーザンブロットによって決定された、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの浸潤済みの葉に蓄積されるＣＹＶａＶのレベルが示されている。パネルＢを参照すると、ＣＹＶａＶが浸潤された植物は散発的に全身症状を示した（図１６参照）。これらの植物は、高いレベルのＣＹＶａＶを蓄積した。パネルＣを参照すると、全身的に感染した植物の個々の葉におけるＣＹＶａＶのレベルが示されている。葉４及び５には、ＣＹＶａＶがアグロ浸潤された。最も若い葉にＣＹＶａＶが相当量蓄積されていることに注目されたい。 図１６は、ＣＹＶａＶに全身的に感染したＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの症状を示す。葉４及び５には、ＣＹＶａＶがアグロ浸潤された。全身的に感染した植物の最初の兆候は、「カップ状の（ｃｕｐｐｅｄ）」葉（パネルＡ）であり、これは略常に葉９であった。次の数週間で、葉粒が植物の頂端分裂組織及び各節に出現した（パネルＢ）。同一年齢の未感染植物（パネルＣ左）及び感染した植物（パネルＣ右）が示されている。全身的に感染した植物は、根粒も有しており（パネルＤ）、これは植物のノーザンブロット（パネルＥ）によって証明されるように、相当な量のＣＹＶａＶを含んでいた。 図１７は、感染後５３日目のトマト（左）と、同一年齢の植物（右）との画像であり、ＣＹＶａＶの例外的な宿主範囲を実証するものである。全身的に感染したＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａからの樹液をトマトの葉柄に注入した。４つの植物のうちの１つが極めて強い症状を示し、ＰＣＲ分析によりＣＹＶａＶに関して陽性であった。 図１８は、ＣＹＶａＶが、キュウリの師部から抽出される非常に豊富なタンパク質に結合することを実証している。パネルＡを参照すると、標識された全長ＣＹＶａＶは、このノースウェスタンブロットにおいて顕著なタンパク質に結合した。タンパク質は、ＳＤＳゲル電気泳動後に復元された。このタンパク質は、ＲＲＭモチーフを含有する既知の高度に保存されたＲＮＡ結合タンパク質であると考えられ、上記ＲＲＭモチーフは、ＲＮＡに対して伴細胞からキュウリの師部の師要素へのシャペロンとして機能することが知られている。パネルＢを参照すると、電気泳動後にタンパク質が変性したままである場合には、結合は見られなかった。 図１９は、ＣＹＶａＶがＴＥＶ ＩＲＥＳを用いて、その３’ＵＴＲから余剰タンパク質を発現できることを実証している。タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流のナノルシフェラーゼの（３つの別個の構築物中の）３つの別個のインサートの位置が示されている（パネルＡ）。上記３つの構築物に関して、小麦胚芽抽出物において試験管内翻訳を測定した（パネルＢ）。ナノルシフェラーゼタンパク質（Ｎｌｕｃ）の位置がゲルの底部付近であることに注目されたい。ナノルシフェラーゼの発現を、原形質体で生体内で測定した（パネルＣ）。上記構築物（パネルＡ）の全長ＲＮＡ転写物を、原形質体に形質転換し、１８時間後に総タンパク質を抽出し、ナノルシフェラーゼ活性をルミノメータで測定した。 図２０は、２２５０位における安定したヘアピンインサートを示す。ＣＹ２２５０ｓｆＰＤＳ６０の模式図がパネルＡに示されている。ＣＹＶａＶの二次構造中のインサートの位置がパネルＢに示されており、この位置は、図９において二重線で囲んで示されているような、挿入されたヘアピンに対応するための領域に対応する。ＣＹＶａＶ‐ｗｔ、及び２２５０位に異なる量の配列を含有するＣＹＶａＶ ＶＩＧＳベクターからのＴ７転写物の、小麦胚芽抽出物試験管内翻訳アッセイからのデータが、パネルＣに示されている。例えば、構築物ｓｆＰＤＳ６０は、植物中での優れた全身的移行を実証した。ＣＹＶａＶ ｗｔ及びＣＹＶａＶ ＶＩＧＳベクター、ＣＹＶａＶ‐ＧＤＤ陰性対照に感染したＡ． ｔｈａｌｉａｎａ原形質体から単離された総ＲＮＡのノーザンブロット分析は、パネルＤに示されている。（＋）はプラス鎖を表し、（‐）はマイナス鎖複製中間体である。ＣＹ２２５０ｓｆＰＤＳ６０に感染したＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの画像がパネルＥに示されている。局所的な葉、及び全身の葉からのＲＴ‐ＰＣＲ産物が、パネルＦに示されている。プライマセットは、ＣＹＶａＶの３’領域の１９６３～２６５４位を増幅する。全身の葉から収集されたベクターの挿入領域（下線）の配列がパネルＧに示されており、インサートの両側の破線で囲まれた配列は、ヘアピンのステムを形成する。 図２１は、２３０１位における安定したヘアピンインサートを示す。ＣＹ２３０１ｓｆＰＤＳ６０の模式図がパネルＡに示されている。ＣＹＶａＶの二次構造中のインサートの位置が、パネルＢに示されており、図９において二重線で囲んで示されているような、挿入されたヘアピンに対応するための領域に対応する。ＣＹＶａＶ‐ｗｔ、及び２３０１位及び２３１９位に異なる量の配列を含有するＣＹＶａＶ ＶＩＧＳベクターからのＴ７転写物の、小麦胚芽抽出物試験管内翻訳アッセイからのデータが、パネルＣに示されている。例えば、構築物ＰＤＳ６０は、植物中での優れた全身的移行を実証した。ＣＹＶａＶ ｗｔ及びＣＹＶａＶ ＶＩＧＳベクター、ＣＹＶａＶ‐ＧＤＤ及び陰性対照に感染したＡ． ｔｈａｌｉａｎａ原形質体から単離された総ＲＮＡのノーザンブロット分析は、パネルＤに示されている。（＋）はプラス鎖を表し、（‐）はマイナス鎖複製中間体である。ＣＹ２３０１ｓｆＰＤＳ６０に感染したＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの画像がパネルＥに示されている。局所的な葉、及び全身の葉からのＲＴ‐ＰＣＲ産物が、パネルＦに示されている。プライマセットは、ＣＹＶａＶの３’領域の１９６３～２６５４位を増幅する。全身の葉から収集されたウイルスベクターの挿入領域の配列がパネルＧに示されており、破線で囲まれた配列は、ヘアピンのステムを形成する。 図２２は、２３１９位における安定したヘアピンインサートを示す。ＣＹ２３１９ｓｆＰＤＳ６０の模式図がパネルＡに示されている。ＣＹＶａＶの二次構造中のインサートの位置が、パネルＢに示されており、図９において二重線で囲んで示されている、挿入されたヘアピンに対応するための領域に対応する。ＣＹＶａＶ‐ｗｔ、及び２３０１位及び２３１９位に異なる量の配列を含有するＣＹＶａＶ ＶＩＧＳベクターからのＴ７転写物の、小麦胚芽抽出物試験管内翻訳アッセイからのデータが、図２１のパネルＣに示されている。ＣＹＶａＶ ｗｔ及びＣＹＶａＶ ＶＩＧＳベクター、ＣＹＶａＶ‐ＧＤＤ及び陰性対照に感染したＡ． ｔｈａｌｉａｎａ原形質体から単離された総ＲＮＡのノーザンブロット分析もまた、図２１のパネルＤに示されている。ＣＹ２３１９ｓｆＰＤＳ６０に感染したＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの画像がパネルＣに示されている。局所的な葉、及び全身の葉からのＲＴ‐ＰＣＲ産物が、パネルＤに示されている。プライマセットは、ＣＹＶａＶの３’領域の１９６３～２６５４位を増幅する。 図２３は、ＣＹＶａＶのＲｄＲｐのＯＲＦ上への６０ｎｔ挿入（非ヘアピン）の位置を示す（パネルＡ）。インサートの位置は黒色の矢印で示されている。黒色の六角形で示されている停止コドンは、インサートのすぐ上流で、ＲｄＲｐを切断するように操作された。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ原形質体のプラス鎖ＲＮＡレベルのノーザンブロットがパネルＢに示されている。ＣＹＶａＶ‐ＧＤＤは非複製対照である。 図２４は、インサートの塩基を安定させるためのロック・アンド・ドック配列を示す。パネルＡを参照すると、そのドッキング配列とドッキングするテトラループＧＮＲＡ（ＧＡＡＡ）は、極めて安定した構造を生成し、基本的なロック・アンド・ドック配列を表す。パネルＢを参照すると、ドッキングされたテトラループからなる足場の、結晶学的足場としての使用が示されている。パネルＣを参照すると、独自のロック・アンド・ドック構造が示されている。インサート（ヘアピン又は非ヘアピン配列）を、（破線で囲んで識別されているような）制限部位に付加してよい。配列中の円で囲まれた塩基は、ＧＡＡＡテトラループのためのドッキング配列である。 図２５は、局所３’ＵＴＲ構造の安定化が非常に有害であるものの、不安定化インサートを付近に挿入することで活性が回復することが示されている。パネルＡを参照すると、ＣＹＶａＶ‐ｗｔの概略図である。ＣＹＶａＶ‐ｗｔ ３’ｓｔｂは、Ｇ：ＵペアをＧ：Ｃペアに変換する６ｎｔの変更を含む、安定化された親構築物である。６０個のヌクレオチドの２つの挿入を、２３１９位及び２３３０位において、上記安定化された親構築物に付加して、ＣＹ２３１９ＰＤＳ６０＿３’ｓｔｂ及びＣＹ２３３０ＰＤＳ６０＿３’ｓｔｂを形成した。構造を安定させてＣＹＶａＶ‐ｗｔ ３’ｓｔｂを生成するためになされたヌクレオチドの変更は、パネルＢにおいて円で囲まれている。挿入部位は、各構築物について矢印で示されており、パネルＡの左の矢印は、構築物ＣＹ２３１９ＰＤＳ６０＿３’ｓｔｂに関する挿入部位を示し、パネルＡの右の矢印は、構築物ＣＹ２３３０ＰＤＳ６０＿３’ｓｔｂに関する挿入部位を示す。パネルＣを参照すると、パネルＡに示した構築物からのＴ７転写物の小麦胚芽抽出物試験管内翻訳アッセイからのデータが示されている。ｐ８１レベル（フレームシフト産物）は、この領域を安定化することによって強く影響を受けることに注目されたい。パネルＤを参照すると、ＣＹＶａＶ‐ｗｔ、ＣＹＶａＶ‐ｗｔ ３’ｓｔｂ、ＣＹ２３１９ＰＤＳ６０＿３’ｓｔｂ、ＣＹ２３３０ＰＤＳ６０＿３’ｓｔｂ、及びＣＹＶａＶ‐ＧＤＤ（非複製対照）に感染したＡ． ｔｈａｌｉａｎａ原形質体から単離された総ＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。（＋）はプラス鎖を表し、（‐）はマイナス鎖複製中間体である。

本開示は：植物のためのベクターとして使用するための新規の感染因子；本開示の１つ以上の因子に感染する植物を含む組成物；並びにこれに関する方法及び使用に関する。本開示の感染因子は、本明細書中において「独立移行性ＲＮＡ」又は「ｉＲＮＡ」と呼ばれる場合があり、従来のウイルスベクターに比べて優れた特性を示す。本開示の実施形態によると、上記ｉＲＮＡは、植物に感染でき、ＲＮＡポリメラーゼをコードすることによってそれ自体の複製を持続できるものの、いずれの移行タンパク質又はコートタンパク質をコードする能力を有しない、ＲＮＡ分子である。更に、ｉＲＮＡはいずれのＲＮＡサイレンシングサプレッサをコードしない。

本明細書中で使用される場合、「宿主（ｈｏｓｔ）」は、感染が可能であり、また核酸の複製が可能である、細胞、組織、又は有機体を指す。宿主としては、植物全体、植物器官、植物組織、植物の原形質体、及び植物細胞が挙げられる。植物器官は、根、茎、葉、種子、移植片、又は接ぎ穂といった、植物の明確な、目に見えて区別される部分を指す。植物組織は、植物の全体又は一部のいずれの組織を指す。原形質体は、細胞培養物、組織、又は植物全体への再生能力を有する、細胞壁を有しない単離された細胞を指す。植物細胞は、原形質体と細胞壁とからなる、植物の構造的及び生理学的単位を指す。

本明細書中で使用される場合、「核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、及び「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、相互交換可能なものとして使用され、いずれの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、いずれの３次元構造を有してよく、いずれの機能を実行してよい。「遺伝子（ｇｅｎｅ）」は、ある特定のポリペプチド配列をコードできる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。

特定の分子「に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」ベクターとは、このベクターが、該分子の遺伝子要素又は配列部分を含有することを意味する。いくつかの実施形態では、ベクターは、このような分子（例えばｉＲＮＡ）に由来するレプリカーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。１つ以上の異種セグメントを、追加の配列として本開示のベクターに付加してよい。いくつかの実装形態では、上記１つ以上の異種セグメントを付加することによって、（例えばある特定のタンパク質又は小分子ＲＮＡの）高レベルの発現が達成される。得られるベクターは、該ＲＮＡベクターを鋳型として用いるＲＮＡ依存性ＲＮＡ重合によって更なるＲＮＡベクター分子を形成することにより、植物細胞内で複製可能である。ｉＲＮＡベクターは、それが由来するＲＮＡ分子（例えばＣＹＶａＶ）から構築できる。

本明細書中で使用される場合、「感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」又は「…に感染できる（ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ）」は、あるベクターが、その核酸を宿主内へと、上記核酸又はその１つ以上の部分が複製される、及び／又はタンパク質若しくは他の因子が宿主の体内で合成される、若しくは宿主の体内に送達されるように、移送又は導入できることを指す。感染は、選択された核酸配列を標的宿主のゲノムに組み込むことができることも含む。

本明細書中で使用される場合、「表現型の特色（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｔｒａｉｔ）」は、１つ以上の遺伝子の発現又は抑制によってもたらされる、観察可能、測定可能、又は検出可能な特徴又は特性を指す。表現型は、観察可能な特色、及び生化学的プロセスを含む。

本明細書中で使用される場合、「内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」は、宿主によって発現されるポリペプチド、核酸、又は遺伝子を指す。「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、宿主によって自然には発現されないポリペプチド、核酸、又は遺伝子を指す。「機能性異種ＯＲＦ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ＯＲＦ）」は、未改変分子又は天然分子それぞれの中には存在せず、発現することによってペプチド、タンパク質、又は小分子ＲＮＡといった特定の因子を得ることができる、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を指す。植物、植物組織、又は植物細胞中でベクターから発現できるようにするために、機能性異種ＯＲＦを含むベクターは、発現に必要な１つ以上のサブゲノムプロモータ又は他の１つ以上の配列を含む。

ある特定の産物の発現を判定するために、当該技術分野では、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンブロット分析）、増幅手順（例えばＲＴ‐ＰＣＲ）、及びアレイベースの技術を含むがこれらに限定されない、様々なアッセイが公知である。発現は、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法：ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫放射定量測定法、ｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウェスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、ＧＣ‐Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ、及びＳＤＳ‐ＰＡＧＥを含むがこれらに限定されない、タンパク質産物を検査するための当該技術分野で公知の技法を用いて、判定してもよい。

「外因性ＲＮＡセグメント（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＲＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔ）」は、天然分子に挿入されたＲＮＡのセグメントを指し、従って、外因性ＲＮＡセグメントのソースは該天然分子とは異なる。上記ソースは：別のウイルス；植物、動物、細菌、ウイルス、若しくは真菌といった生体；化学的に合成された材料；又はこれらの組み合わせであってよい。外因性ＲＮＡセグメントは、特定の用途に適したいずれの機能を提供でき、上記機能は、限定するものではないが：ノンコーディング機能ＲＮＡ；宿主細胞によって翻訳されて、有用な又は望ましい特性を有するペプチド（例えば約２～５０のアミノ酸を含む分子）又はタンパク質（例えば５０以上のアミノ酸を含む分子）の合成をもたらす配列をコードする、メッセンジャーＲＮＡとして機能するコーディング機能を含む。

本明細書中で使用される場合、「移行タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、細胞間及び／又は長距離移行に必要な１つ以上のタンパク質を指す。「コートタンパク質（ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、ウイルスコートを含む、又はウイルスコートを構築する１つ以上のタンパク質を指す。

ウンブラウイルスと同様、ｉＲＮＡは、１つ以上の機能性コートタンパク質ＯＲＦを有さず、及び／又はいずれのコートタンパク質をコードしない。更に、ｉＲＮＡのＲＮＡポリメラーゼはウンブラウイルスのものと類似している。しかしながらウンブラウイルスとは異なり、ｉＲＮＡは、１つ以上の機能性移行タンパク質のＯＲＦを有さず、及び／又はナンセンス介在性崩壊に対抗するためのいずれの１つ以上の細胞間移行タンパク質若しくはいずれの１つ以上の長距離移行タンパク質をコードしない。

コートタンパク質を有しない従来のウイルスは一般に、そのゲノムが宿主ＲＮＡサイレンシング防御システムに対して脆弱であるため、植物細胞内において安定性が低い。しかしながら、ｉＲＮＡは驚くべきことに、細胞内環境において安定しており、これは有効なベクターのための重要な特徴である。ｉＲＮＡはまた、関連するビリオンが存在しなければ昆虫ベクターによって伝達できないため、特定のヘルパーウイルスの不在下で、接種された宿主植物に制限される。ｉＲＮＡは、米国では滅多に見られないカンキツベインエネーションウイルス（ＣＶＥＶ）を含むエナモウイルス等の特定のヘルパーウイルスの存在下でのみ、ビリオンへとカプシド化されると考えられる。

本開示の実施形態では、１つ以上の複製要素及び１つ以上の異種セグメントを含む、組み換え一本鎖プラス鎖ＲＮＡベクターが提供される。本開示のＲＮＡベクターは、師部に高いレベルまで蓄積されることができ、またタンパク質、ペプチド、抗細菌剤及び／又は殺虫剤（例えばｓｉＲＮＡ）といった１つ以上の治療剤を植物組織内に直接送達できる。特定の実装形態では、上記ＲＮＡベクターは、いずれの１つ以上のコートタンパク質及び／又は１つ以上の移行タンパク質をコードする能力を有しないｉＲＮＡ分子に由来する。例えば上記ベクターは、柑橘類の葉脈黄化病に関連する未分類の分子である、カンキツ葉脈黄化関連ウイルス（ＣＹＶａＶ）として知られるｉＲＮＡ分子の構造要素に由来する、及び／又は上記構造要素を含む。

よって、本開示の実施形態は、例えばＣＹＶａＶであるｉＲＮＡ分子からの遺伝子構成成分を用いて、一本鎖プラス鎖ＲＮＡ分子上で構築される、又は一本鎖プラス鎖ＲＮＡ分子に由来する、ｉＲＮＡ系ベクターを提供する。更に本開示は、１つ以上のｉＲＮＡ系（例えばＣＹＶａＶ系）ベクターを含むキット及び／又は混合物を対象とする。上記混合物は、乾燥若しくは凍結乾燥固体等の固体形態、又は例えば水溶液、懸濁液若しくは分散液としての液体、又はゲルであってよい。上記混合物は、植物、植物組織、又は植物細胞への感染に使用できる。上記キット及び混合物は、１つ以上の植物若しくは１つ以上の植物細胞に、本開示のｉＲＮＡ系ベクターを良好に感染させるため、及び／又はこのような植物若しくは１つ以上の植物細胞に対する異種タンパク質の発現若しくは他の治療剤の送達のために、使用できる。

本開示はまた、本明細書で開示される上記ｉＲＮＡ系ベクターを含む植物、植物組織、若しくは植物細胞、及び／又は上記ベクターによってコードされる若しくは送達される治療剤若しくは異種ポリペプチドを含む植物、植物組織、若しくは植物細胞にも関する。本開示は、
上記異種ポリペプチドを植物、植物組織、又は植物細胞から単離する方法も提供する。植物、植物組織、又は植物細胞からタンパク質を単離する方法は、当業者には公知である。

ＣＹＶａＶは、いずれのヘルパーウイルスとは独立して、１９５０年代に４つのライムカットの木で発見された（Weathers, L. (1957), A vein-yellowing disease of citrus caused by a graft-transmissible virus, Plant Disease Reporter 41:741-742; Weathers, L.G. (1960), Yellow-vein disease of citrus and studies of interactions between yellow-vein and other viruses of citrus, Virology 11:753-764; Weathers, L.G. (1963), Use of synergy in identification of strain of Citrus yellow vein virus, Nature 200:812-813）。ＣＹＶａＶの更なる分析及び配列決定は、数年後にＧｅｏｒｇｉｏｓ Ｖｉｄａｌａｋｉｓによって実施された（カリフォルニア大学デービス校、カリフォルニア州；ＧｅｎＢａｎｋ： ＪＸ１０１６１０）。Ｖｉｄａｌａｋｉｓ博士の研究室は、既に確立されており（Weathers, L.G. (1963), Use of synergy in identification of strain of Citrus yellow vein virus, Nature 200:812-813）、かつＣｉｔｒｕｓ Ｃｌｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＣＣＰＰ）の病気バンクに保持されている、樹木のソースから収集した試料に対して分析を実施した。ＣＹＶａＶの特性を決定するためのＶｉｄａｌａｋｉｓ研究室による研究は、決定的なものではなかった。しかしながら、ＣＹＶａＶを含む感染試料の多くが、エナモウイルスであるカンキツベインエネーションウイルス（ＣＶＥＶ）も含んでいた。１９５０年代から１９８０年代にかけて、症状を強化するために、植物を葉脈黄化及びベインエネーションに混合感染させることは、ＣＣＰＰ職員にとって比較的一般的であった。

ＣＹＶａＶは、ＲＮＡの一本鎖プラス鎖で構成される小分子（～２．７ｋｂ）ｉＲＮＡ分子である。これは極めて高いレベルまで複製され、極めて安定しており、師部に限定されており、また自然に拡散される機序は知られていない。従ってＣＹＶａＶは、例えば病気及び／又は害虫管理のための小分子ＲＮＡ（例えば長さ約５０～約２５０ｎｔのノンコーディングＲＮＡ分子）及び／又はタンパク質等の１つ以上の因子を植物宿主に導入するためのベクタープラットフォームとして理想的である。防御を支持（若しくはサイレンシング）するタンパク質、細菌を標的とする抗菌ペプチド、及び／又は遺伝子発現若しくは病原体の昆虫ベクターを標的とする小分子ＲＮＡの生成は、有効な管理戦略を提供する。タンパク質及び小分子ＲＮＡは、有効であるためには、十分な量で生産されて師部に十分なレベルで蓄積する必要があり、特に小分子ＲＮＡは、標的の昆虫又は真菌病原体に取り込まれるように設計される。

ＣＹＶａＶは、移植によってしか樹木間で伝染できないが、シトロン、ラフレモン、カラマンシー、アマダイダイ、ダイダイ、グレープフルーツ、ラングプール及びメキシカンライム、レモン、マンダリンの複数の品種、タンジェロの複数の品種、並びに金柑を含むがこれらに限定されない、カラタチを除く柑橘類の略全ての品種に感染することが示されている。ＣＹＶａＶは、指標となるシトロンの木の葉脈の黄化を引き起こし、アマダイダイ及び他の柑橘類では葉脈黄化症状を全く又は極めて軽度にしか有さず、果実の品質への影響又は樹木への害の報告はない。

ＣＹＶａＶのポリヌクレオチド配列（塩基１～２６９２）を以下に示す（配列番号１）：
ggguaaauau ggauccuuca ucuuugcccc gugccuguug gcaucaugcc 50
agacaggugu uucgagcauc aacuagcuuc ucaagagagg ugguucgcgc 100
ugcucguaga uggguuacca ugcccaccag ucgccaugca uaugacuuuu 150
caacgagucu aggcauugug auugcugagc cugcagcucg uuuacgacgc 200
cgucugcccu cuguacgaaa gugcgcagag aaguuaguag uccacaagca 250
agucgacacu uugguggacg aauggugcuc uggaauuccc aacccugaua 300
ucguagaagu ugguugggca cuccgucuga gggaccguuu cggucuuccu 350
cccgcuucug agccuacccg gcucaguggu gagagauggg ugcucaaaca 400
acucaauggg guagauccug agucauggaa ugcugaucuu gguaggucag 450
uucauaucca aggagacuac gccccaggga ggaaugccca uaucgcucag 500
gucgcggcga ccuugugguu aacuaggacc uugcaugaca aggccuuggc 550
ucgccaccag gguuuucgcg auuugcagug auuggggucg acgggcuaga 600
ggcaaaagca gugccucuag cuucuggacu ccgacugcuu ccgguuccgc 650
gacccggaca aagucgacga cugucucaga ccuuguuacu uccaacaccu 700
cgugcucaau ucgugaauca cgcgugcucg gcuaacaacc uuggacgugu 750
gaugaccaca cguguguugc aguacaaggg ccgagauccg auccuucccu 800
cuucugaagc ccuucaccga cuuaaccuuc ggauagcuga gcuauauagg 850
ucuagaccuu cuaccgucua uccauuaagu uaugaagggu uucucaauug 900
cuaugaaggc cgacagcgua cucguuacgc ccaagccguc gagcaguuga 950
ugcgguccac ucuugagccg aaagaugcgc gaguugaaac guucauuaag 1000
aacgagaaau uugacugggc guugaaaggg gaggaggcug auccucgagc 1050
aauccaacca aggaagccga aauauuuggc ugagguugga cggugguuca 1100
aaccuuugga gcgaaucauc uacaaggauc ucaguaaaag guuguauggu 1150
gagggugcug agccguguau cgccaaaggc cuaaaugcau uagaaucugg 1200
agcgacuuug aggcgcaaau gggagaaguu uucuucucca guuugcguuu 1250
cucucgacgc uuccagguuc gaccugcaug uaagcguugg caugcuaaag 1300
uucacacaca agcuauauga cuauuacugu aagucuccca cucuccagcg 1350
cuaucucaaa uggacacucc gcaaccaugg cgucgccucc ugcaaagaau 1400
ugucauauga guaugagguu guuggccgga gaaugagugg ugacauggac 1450
acugcauugg gcaacugcgu cauuaugucg auacuuacau gguuuaugcu 1500
uagugaacuu ggcauuaagc augaauuauu cgauaauggu gacgauuguu 1550
uguucauuug cgagucucac gacgucccca gccccgaggu aauuacaaac 1600
ugguuuucgg acuuuggguu ugugguuagg uuggaaggcg ucacguccgu 1650
guuugagcgu auugaguuuu gccaaacuuc cccaguaugg acugagaggg 1700
guuggcugau guguaggaau auuaagucau ugaguaaaga ccuuacgaau 1750
guuaauucgu gcacgggcuc cacgauugaa uauacccacu gguugaaagc 1800
agugggaaag ugcgggucaa uacucaaugc ugguguaccu auauuucagu 1850
ccuuucacaa caugcuggaa aggcuuggca cuaacucucg uauugaucga 1900
gggguuuucu ucaaaucagg gcuaguuaau cucauucgug ggauggacag 1950
gcagccugac guugacauca cuacuuccgc ucggcuuucu uucgaagugg 2000
cauucgggau aacacccggg augcaauugg cuauugaacg guacuaugac 2050
ucugucaugg gcucgcugag uaaaauagaa acaacuaagu ggccaauuga 2100
acuaagaaag gaauacgaac acggaaguga gugguacgag gacuuaggcg 2150
uccuaggaug aauaggguca uugguuuacc gaugauaccu guucagaaua 2200
ggauugcucg agcuucguug guuaggguaa cucacauacc uucuuccaua 2250
acuggaaaag gucgugugag caaccuaacc aguuaaugua ggugucuuuc 2300
cguaucuagu cacgauggua agcaacccgu uuaucuguac ggcgcucacc 2350
cguggguagg aaggugaagg uuuugugucc uuuaggucuu ggacagucug 2400
cgggcuuggg aacgacgccc cgcuagcaac guacugcucu ccuaccggac 2450
ugguagcuua auugucaucu uggagcgaua gcacuguggg ccucacccuu 2500
cgcgcguugg acguguugcg ugccccccac agauuuguga aacucuaugg 2550
agcaguuccg cgagccagaa gggaggaugg ccgccuggcg uaauccagga 2600
gcucuggggg gcuuguacuc agaguagcau ucugcuuuag acuguuaacu 2650
uuaugaacca cgcgugucac guggggagag uuaacagcgc cc 2692

ＣＹＶａＶの、トンブスウイルス科のウイルスを含む他のウイルスとの関連性を、図２に示す。ＣＹＶａＶ及び類似のＲＮＡ分子のゲノム構成を図３のパネルＡに示し、これはＰＥＭＶ２、ＰＭｅＶ２‐ＥＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＴ９２１７８５）、ＰＵＶ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＰ１６５４０７．１）、及びＴＢＴＶａ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ５２９６２５．１）を含む。ＣＹＶａＶのＲｄＲｐは、ウンブラウイルスであるエンドウマメエネーションモザイクウイルスＲＮＡ２（ＰＥＭＶ２）と極めて近縁である。ＣＹＶａＶの５’及び３’配列の検査によって、ウンブラウイルスのこれらの配列に対する相当な類似性が明らかとなり、これにより、ＣＹＶａＶが実際に完全な感染因子であることが確認された。ＣＹＶａＶは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを有し、これは、複製に関与する２つのタンパク質：関連分子中のレプリカーゼ関連タンパク質であるｐ２１；及びリボソーム記録（フレームシフト）イベントによって合成されるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）であるｐ８１のみをコードする（図３、パネルＡ）。試験管内でのフレームシフトによって合成されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のレベルが、ＰＥＭＶ２及びＣＹＶａＶに関して示されている。ＣＹＶａＶ由来のｐ８１と比較したＰＥＭＶ２由来のｐ９４（ＲｄＲｐ）のレベルの差は重要である（図３、パネルＣ）。ＣＹＶａＶのフレームシフト部位は、ウイルス学において知られる最も強力な部位の１つであり、その著しく高い蓄積の原因であると考えられている。

ＣＹＶａＶの３’末端のポリヌクレオチド配列（塩基２４６８～２６９２）を以下に示す（配列番号２）：
ucu uggagcgaua gcacuguggg ccucacccuu cgcgcguugg acguguugcg
ugccccccac agauuuguga aacucuaugg agcaguuccg cgagccagaa gggaggaugg
ccgccuggcg uaauccagga gcucuggggg gcuuguacuc agaguagcau ucugcuuuag
acuguuaacu uuaugaacca cgcgugucac guggggagag uuaacagcgc cc

ＣＹＶａＶの３’キャップ非依存的翻訳促進領域（３’ＣＩＴＥ）のポリヌクレオチド配列（塩基２４６８～２５５１）を以下に示す（配列番号３）：
ucu uggagcgaua gcacuguggg ccucacccuuc gcgcguugg acguguugcg
ugccccccac agauuuguga aacucuaugg a

ＣＹＶａＶの３’末端（及び３’ＣＩＴＥ）は、（上で太字で下線を付して示されている）以下の１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列を含む：
auagcacug（配列番号４）；及び／又は
gauuuguga（配列番号５）

タンパク質ｐ２１をコードするＣＹＶａＶのポリヌクレオチド配列（塩基９～５７８）を以下に示す（配列番号６）：
au ggauccuuca ucuuugcccc gugccuguug gcaucaugcc agacaggugu
uucgagcauc aacuagcuuc ucaagagagg ugguucgcgc ugcucguaga uggguuacca
ugcccaccag ucgccaugca uaugacuuuu caacgagucu aggcauugug auugcugagc
cugcagcucg uuuacgacgc cgucugcccu cuguacgaaa gugcgcagag aaguuaguag
uccacaagca agucgacacu uugguggacg aauggugcuc uggaauuccc aacccugaua
ucguagaagu ugguugggca cuccgucuga gggaccguuu cggucuuccu cccgcuucug
agccuacccg gcucaguggu gagagauggg ugcucaaaca acucaauggg guagauccug
agucauggaa ugcugaucuu gguaggucag uucauaucca aggagacuac gccccaggga
ggaaugccca uaucgcucag gucgcggcga ccuugugguu aacuaggacc uugcaugaca
aggccuuggc ucgccaccag gguuuucgcg auuugcag

タンパク質ｐ２１のアミノ酸配列を以下に示す（配列番号７）：
MDPSSLPRACWHHARQVFRASTSFSREVVRAARRWVTMPTSRHAYDFSTSLGIVIAEPAARLRRRLPSVRKCAEKLVVHKQVDTLVDEWCSGIPNPDIVEVGWALRLRDRFGLPPASEPTRLSGERWVLKQLNGVDPESWNADLGRSVHIQGDYAPGRNAHIAQVAATLWLTRTLHDKALARHQGFRDLQ

タンパク質ｐ８１をコードするＣＹＶａＶのポリヌクレオチド配列（塩基７５２～２１５８）を以下に示す（配列番号８）：
augaccaca cguguguugc aguacaaggg
ccgagauccg auccuucccu cuucugaagc ccuucaccga cuuaaccuuc ggauagcuga
gcuauauagg ucuagaccuu cuaccgucua uccauuaagu uaugaagggu uucucaauug
cuaugaaggc cgacagcgua cucguuacgc ccaagccguc gagcaguuga ugcgguccac
ucuugagccg aaagaugcgc gaguugaaac guucauuaag aacgagaaau uugacugggc
guugaaaggg gaggaggcug auccucgagc aauccaacca aggaagccga aauauuuggc
ugagguugga cggugguuca aaccuuugga gcgaaucauc uacaaggauc ucaguaaaag
guuguauggu gagggugcug agccguguau cgccaaaggc cuaaaugcau uagaaucugg
agcgacuuug aggcgcaaau gggagaaguu uucuucucca guuugcguuu cucucgacgc
uuccagguuc gaccugcaug uaagcguugg caugcuaaag uucacacaca agcuauauga
cuauuacugu aagucuccca cucuccagcg cuaucucaaa uggacacucc gcaaccaugg
cgucgccucc ugcaaagaau ugucauauga guaugagguu guuggccgga gaaugagugg
ugacauggac acugcauugg gcaacugcgu cauuaugucg auacuuacau gguuuaugcu
uagugaacuu ggcauuaagc augaauuauu cgauaauggu gacgauuguu uguucauuug
cgagucucac gacgucccca gccccgaggu aauuacaaac ugguuuucgg acuuuggguu
ugugguuagg uuggaaggcg ucacguccgu guuugagcgu auugaguuuu gccaaacuuc
cccaguaugg acugagaggg guuggcugau guguaggaau auuaagucau ugaguaaaga
ccuuacgaau guuaauucgu gcacgggcuc cacgauugaa uauacccacu gguugaaagc
agugggaaag ugcgggucaa uacucaaugc ugguguaccu auauuucagu ccuuucacaa
caugcuggaa aggcuuggca cuaacucucg uauugaucga gggguuuucu ucaaaucagg
gcuaguuaau cucauucgug ggauggacag gcagccugac guugacauca cuacuuccgc
ucggcuuucu uucgaagugg cauucgggau aacacccggg augcaauugg cuauugaacg
guacuaugac ucugucaugg gcucgcugag uaaaauagaa acaacuaagu ggccaauuga
acuaagaaag gaauacgaac acggaaguga gugguacgag gacuuaggcg uccuagga

タンパク質ｐ８１のアミノ酸配列を以下に示す（配列番号９）：
MTTRVLQYKGRDPILPSSEALHRLNLRIAELYRSRPSTVYPLSYEGFLNCYEGRQRTRYAQAVEQLMRSTLEPKDARVETFIKNEKFDWALKGEEADPRAIQPRKPKYLAEVGRWFKPLERIIYKDLSKRLYGEGAEPCIAKGLNALESGATLRRKWEKFSSPVCVSLDASRFDLHVSVGMLKFTHKLYDYYCKSPTLQRYLKWTLRNHGVASCKELSYEYEVVGRRMSGDMDTALGNCVIMSILTWFMLSELGIKHELFDNGDDCLFICESHDVPSPEVITNWFSDFGFVVRLEGVTSVFERIEFCQTSPVWTERGWLMCRNIKSLSKDLTNVNSCTGSTIEYTHWLKAVGKCGSILNAGVPIFQSFHNMLERLGTNSRIDRGVFFKSGLVNLIRGMDRQPDVDITTSARLSFEVAFGITPGMQLAIERYYDSVMGSLSKIETTKWPIELRKEYEHGSEWYEDLGVLG

（例えばタンパク質ｐ８１をコードする）ＣＹＶａＶの複製要素は、（上で強調されて下線を付して示されている）以下の１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列を含む：
cguuc（配列番号１０）；
gaacg（配列番号１１）；
gguuca（配列番号１２）；
ggag（配列番号１３）；及び／又は
aaauggga（配列番号１４）

ＣＹＶａＶは更に、（上で強調されて下線を付して示されている）以下の１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列を含んでよい：
ucgacg（配列番号１５）；及び／又は
cuccga（配列番号１６）。

ＣＹＶａＶの記録フレームシフト部位のポリヌクレオチド配列（図１０も参照）を以下に示す：
ucgcucaggucgcggcgaccuugugguuaacuaggaccuugcaugacaaggccuuggcucgccaccaggguuuucgcgauuugcagugauuggggucgacgggcuagaggcaaaagcagugccucuagcuucuggacuccgacugcuuccgguuccgcgacccgga（配列番号１７）
caaagucgacgacugucucagaccu（配列番号１８）
aggucuuggacagucugcgggcuugggaacgacg（配列番号１９）

ウチワサボテン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＨ５７９７１５）、イチジクの木、及びエチオピアトウモロコシ（図４）でも極めて類似したｉＲＮＡが発見され、これは、本開示のＲＮＡベクターに関する、異常に広い、又は無限でさえあるかもしれない宿主範囲を示唆している。

イチジクの木で同定された類似のｉＲＮＡ（本明細書では「ｉＲＮＡ近縁種１」又は「ｉＲＮＡ ｒ１」と呼ばれる場合もある）のポリヌクレオチド配列を以下に示す（配列番号２０）：
aaauauggauucgauaucaaugcccgucgccugcuggucaaaagccaggcaggucuugcguacaccagcuaacuuuuccaaagggguagugaaggcugcguaccggugggucaacaugcccagagccaaauaugucagagaugucuccacgagucuuggcauaguugucgcugagccuguugcugccgugcgccguuagaugccuucgauaagcagccuugcggaggaguugguaacacgccagagcgucgacacucugguggacgauuggugucucggacuuuccaacccugacaacaacguggagguugguugggcacuucgucugagggaccgcuuuggucuuccucccgccucugagcccacaaggcucaguggugagagaugggugcuuaaacaacucaaugggguagacccggagucguggaauguugaucugcaaagcguuuucgaagacgcucaggaugacuuccaucgggacuacgccccaaggaggaaugcccaaaucgcucaaauugcggcaacccuauggcuuacaaagaccuuagucgauaaggcuuuagcacgccaucaggauuuucgcaguuugcagugauuggggucgacgggcuagaggcuaaagcagugccucuggcugcuggacuccgacugcuuccgguuccgcggcccggacaaagccgacggcugucucaaaccuugcuacucccuacuccccgugcucaauuugucaaucacgcuaacucagguaauaauuuggggcguguuuugaccacacgggugaugcaauacaaaggccgagacccgauacuacccucccaggaagcccugcgcaaacuuaaccuucggauaggacaguuguauaagucuagaccauccacugucuauccccugaguuaugauggguuucuuaauuguuaugauggccgacagcguacucgcuacgcucaugccgucgagcaauugaugggugccgcucugaccccaaaagaugcgcgaguugagacguucauuaagaacgagaaguuugauugguuguugaagggagacgaggcugauccucgugcaauccaaccuaggaagccgaaauauuuggccgagguuggucgaugguucaaaccguuggagcgaaucaucuacaaggaucucaguuugcguuuguacggugauaacgcugaaccuugcauugccaaaggcuuaaaugcauuggaaucaggggcuacguugagacguaaaugggaaaaguucgcuaauccuguuuguguuucauuggaugcuucucguuucgaccugcacguaaguguuggcuuguuaaaguucacgcauaaauuguacaacuauuacugcaagucucccacucuucaacgauaucucaaauggacacuccgcaacuccgguaucgccuccuguaaggaaaaaucauaugcguaugagguugaaggccguagaaugaguggcgacauggacaccgcauuaggcaacuguaucaucaugagauuauuaacuugguuuaugcuuagcgaacuuggcgugcggcaugagcuuuucgauaauggugaugacuguuuguuuauuugugaaaaagaagacguuccuagugcugagguaaucacgaacugguuuacggauuuuggguuugugguuaagcuagaaggcgucacguccguguuugagcgcauugaguucugucagaccucaccaguauggacugcgaggggauggcugauguguagaaacaucaagucauugaguaaagauuuaacgaauguuaauucgugcacugguucugccguugaauacacucauugguugaaggcggugggcaaguguggaucuauacucaaugcuggugugcccauauuucaguccuuucacaacauguuggucagguugggcacgaauucgcguauagaucgcgggguauucuuuagguguggacuuguuaaucucauucugggauggacagacaaccugaaaguugagaucacuacuuccgcucgucuuucuuuugaaguggcauucgggaucacucccggcaugcaauuggcuauugagcaauuuuaugacucagucgugggcccucuggguaaaauaaaaucuguaaaauggccaauagaucuaagaaaggaauacgauuacggaagcgcgugguucgaagaccaaggcguccuagggugaacaaggaacucggauuaccgaugacaccuguucaaacuagaaugguucggucaacguugaccaaggagaccaacauaccuucuacugcaaauagcggucgggaggcuguuugggcuuguuggccaaucaacuuuagugucuuuccgcaacuagccucacucgugaauaaaccguuauacuggcguguguccagugugcaaguugcaauggagccggcgaugucuacuuccacccaacauuguggaguuggucucaguucuucuggggccuucacuaacggugauggguucgguaacgucuuuaagcucuugcguucuuguaacuauacgcggcgcucucccgugggaggaaacgugauggucaaauggcccaucugcaugcccuucauucuuaacgaugaugcgcacaagaacacaggauuaaccgccugugugaucauugcagucaccaauacuggugugcuaacuggucaaucuuggacggagauucuuuugaauguggaguauguagugggugcauagacagucugcgggcuugggaacgacgccccgcuagcaacguacugcucuccuaccggacugguagccguuuaguuaucuuggagcgauagcacugugagccucacucaacgcgcgauggacguggcgagugccccucagagauuugugaaacucuauagagcuauuucgcgagccagaagggaggauggccaccugguguaagccagguauccccggggggcuuguacucggggucgcauuacugcuuagaccacaagguaggguucgcaucuuggaacugacccuaugaccuugugggugcccuaaccggacugguagccguuuaauaucuuggagcgauuagcacgugugagcccucacucaacggcgcgauuggacguggcgagugccccucagaguaaucugcagagcuccggcagucgugggaggcaaggca

別のイチジクの木で同定されたｉＲＮＡ（本明細書では「ｉＲＮＡ近縁種２」又は「ｉＲＮＡ ｒ２」と呼ばれる場合もある）のポリヌクレオチド配列を以下に示す（配列番号２１）：
cucccacgacugccggagcucugcagaauuccaccggggguaccuggcuuacaccagguggccauccucccuucuggcucgcggaauagcucuauagaguuucacaaaucucugaggggcacucgccacguccaucgcgcguugagugaggcucacagugcuaucgcucccagaauucgggauaaauauggaagaaacuucuuugcccaaagccugcuggaucaaaagccaggcaggucuugcguacaccagcuaacuuuuccaaagggguagugaaggcugcguaccggugggucaacaugcccagagccaaauaugucagagaugucuccacgagucuuggcauaguugucgcugagccuguugcugccgugcgccgucagaugccuucgauaagcagccuugcggaggaguugguaacacgccagagcgucgacacucugguggacgauuggugucucggacuuuccaacccugacaacaacguggagguugguugggcacuucgucugagggaccgcuuuggucucccucccgccucugagcccacaaggcucaguggugagagaugggugcuuaaacaacucaauggaguagacccggaaucuuggaaugacgacuaugcguucgaagacgcucaggaggauuuucaacgggaauacgucccgggaaggaaugcccauauugcugcaacugcggcaacucuauggcugacaaagaccuuguaugacaaggcuuuaguucgccaucaggguuuucgcaguuugcagugauuggggucgacgggcuggaggcuaaagcagugccuccagcugcuggacuccgacugcuuccgguuccgcggcccggacaaagccgacggcugucucagaccuuacuacuuccuacuccccgugcuacuuuugucaaucaugcaaauucaggcaauaaucuugagcguguuuugaccacacgggugaugcaauacaaaggccgagacccgauacuacccucccaggaagcccugcgcaaacuuaaccuucggauaggacaguuguauaagucuagaccauccacugucuauccccugaguuaugauggguuucuuaauuguuaugauggccgacagcguacucgcuacgcucaugccgucgagcaauugaugggugccgcucugaccccaaaagaugcgcgaguugagacguucauuaagaacgagaaguuugauugguuguugaagggagacgaggcugauccucgugcaauccaaccuaggaagccgaaauauuuggccgagguuggucgaugguucaaaccguuggagcgaaucaucuacaaggaucucaguuugcguuuguacggugauaacgcugaaccuugcauugccaaaggcuuaaaugcauuggaaucaggggcuacguugagacguaaaugggaaaaguucgcuaauccuguuuguguuucauuggaugcuucucguuucgaccugcacguaaguguuggcuuguuaaaguucacgcauaaauuguacgacuauuacugcaagucucccacucuucaacgauaucucaaauggacacuccgcaacuccgguaucgccuccuguaaggaaaaaucauaugcguaugagguugaaggccguagaaugaguggcgacauggacaccgcauuaggcaacuguaucaucaugacgauauuaacuugguuuaugcuuagcgaacuuggcgugcggcaugagcuuuucgauaauggugaugauuguuuguucauuugcgaagaaaaagacguaccuagccccgagacgaucaugaacugguuugcggauuuuggguuugugguuagguuagaaggcgucguguccguguuugagcgcauugaguucugccaaacaucgccuauauggacugaucgagguuggcugauguguagaaacaucaagucuuugaguaaggaucuuacgaacguuaauucgugcacuggcuccacuguugaauacacccauugguugaaagcaguuggaaaguguggaucggugcucaaugcgggugugccuauauuucagucauuucacaacauguugaugcgauuggguacgaauucgcguauagaucgcgggguauucuuuagguguggacuuguuaaucucauucgugggauggacagacaaccugaaguugagaucacuacuuccgcucgucuuucuuuugaaguggcauucgggaucacucccggcaugcaauuggcuauugagcaauuuuaugacucagucgugggcccucuggguaaaauaaaaucuguaaaauggccaauagaucuaagaaaggaauacgauuacggaagcgcgugguucgaagaccaaggcguccuagggugaacaaggaacucggauuaccgaugacaccuguucaaacuagaaugguucggucaacguugaccaaggagaccaacauaccuucuacugcaaauagcggucgggaggcuguuugggcuuguuggccaaucaacuuuagugucuuuccgcaacuagccucacucgugaauaaaccguuauacuggcguguguccagugugcaaguugcaauggagccugcaaugucuucuuccacccaacauugugguguuggucucaguucuucuggggccuucacauaacggugauggguucgguaacgucuuuaagcucuugcguucuuguaacuauacgcggcgcucucccgugggaggaaacgugauggucaaauggccuaucugcaugcccuucauucuuaacgaugaugcgcacaagaacacaggauuaaccgccugugugaucauugcagucaccaauacuggugugcuaacuggucaaucuuggacggagauucuguugaauguggaguauacgccccgcuagcaucguacugcucuccuaccggacugguagccguuuaguuaucuuggagugauagcacuguggggccacauuugacgcgcauuggacgcagacaaugucccuccacagauuugugaaucucuauggagcuguaaccucggucucucuauagcuuguccgaacaggaaauggacauaaaauaauugcuguuccaacacguuguguugguaaagaaguuauagauguggugcgccagacaaguggauggcaaccuggaguaauccaggcgcucuggggggcuuauacucggagugcauuacugcuuuagaccguuaaucucaagaaccaugugugucgcauggggaggauuaacggcgcccaauucccuuguuaguuuagguacgccuuggucuucgaaccacgc

トウモロコシで同定されたｉＲＮＡ（本明細書では「ｉＲＮＡ近縁種３」又は「ｉＲＮＡ ｒ３」と呼ばれる場合もある）のポリヌクレオチド配列を以下に示す（配列番号２２）：
gggguaaauauggagaaccagcacacccauguuugcccacggucguuccugcgaaccugcagggcgauccucgcggcuccagccaacuacggucgugauguggucaaaaucgccuacaaaugggcaucacgaaaccccgccaccgccccccgaaguguccgagaauccaucggggucguugucggaagcgcuguggacuucuugagcgcuccucgcaagcguuuagaagaccgcgcagagcaguuggugcaagacgaccgggucgaccggaucguccgcgagugggagcuaggaaccgcugacucccgaauuccggaaguugagugggcauaccgucugcgcgaccgcuucggcgucguguccgccagcgagccugcuaggcaaacuggugagaggugggugcucaagcaacuagagggauuggaggggggggaguuccgcugcauacccauugagccauucuuuggugaugcaccggcccccguccauagcccugggagcaacagcgugauugcugcuauugcggcgacccuuuggaugacgccuacccgccuugaccgggcguugagacgucaccaggguuuucgcaacuagcggugaucggagucgacggagugucugcuuuagcggugcaggcaucuucugaacuccgaccgcuacggguugggcgaccccgucaaagucgacgucguucguggucucugacuaugccagcacccaaguccuguuucgugaaccacgcuaacucugaccacaaucucaaaacggucauggaaaacagggugcucaaguacaaaggccaagaacccgcaaagccccggguagaagccuauaagcagcucuaugaaaggauacgaccgcgauaucguucucuaccugacacggucuauccucuaucauaugauggcuuccucaagugcuacuccggacguaggcgaacacgauacgaacaggccguccaggaguugagaaacgcgccacucacacccgaagaugcugucguuuccacguucaucaagaacgagaaauucgauuggcuccaaaagaaagaacuugcggaucccagagcuauccaaccucggaaaccgaaauaccuggccgaaguugggaggugguucaagccucuggagcacauaauguauaaagacuuggcaaaacgguuguacggucaggaugcguugccuugcauagcgaaagggcugaacgcuagagaaacggcugaagugcuccgagccaaaugggacaaguucgcuucucccguuugcgucucgcuggaugccagucgguucgaucugcauguaaguccugacgcauugcgguuuacgcaccgccuguaccacaaguauugccaaagucggcaacuccgcaaguaccuagaauggacgcugagaaacgcuggcgucgccucauguccugaaagcgcuuaucaguaugagguugaggggagacgcaugaguggcgacauggacaccgcacucggcaacugcguacuuaugcucugcuugacauggaacuuccucgaucaacauaacaucaagcaugagauaauggacaacggagaugacugcuuguucaucugugaagcugccgaugugccaaccgacaagcaaaucauggacuacuaccucgacuuuggguucgugguucgguuggaaggaaaggugucuguguucgagcgaauagaguucugucaaaccaguccgguguugacugcuaauggauggcguaugguuagaaauuugaaguccauugcgaaggaccucugcaaugugaacauggcgacugggucacucagugaauacacugcguggcuuaaagccgugggaaucugugguagaauccugaacgaugggguuccaaucuucuccgccuuccacaacaugcuggugcgacauggaacgaacucacgaauagauagagcgguguucugggaauguggacugacaaacuugaucaaaggcaugaguuucgagcaacuggaaaucacugucgcugcgcgcgaguccuuuuaucuggcauacgguaucacaccggcgagacaacucgcgauugaagaguauuacgacucacuccagggcccgguggguaaaauacaacuucaugaauggccacuacaacucaaagaggaauacgcgugcggcgccgagugguucgaaggagacggcgagcgggcuugaggcccgcuggcuugcccuucgugcccggcagcucucgcacgguucggacugcgcucguccucgagaaccacuugccgauguccucggcacaguugggucaagaggccguugcguauucuaucccgugcaauguucgaaacaugccuacgauccugacucucgccaccacuccgcucuauuggcguaucaccgccaucacugucgcgauggagccugcaaaguccacaucgacccaaauugccgguguggggaaugcugauucauuucagucugccaccuacaacgguuuugggaacguguuuaagaaaaugcgcgcuuugaauuucgugagacgcucggcgcccggaggcaaucuucagguacgcuggccuaucaauauggacuggaucuccgcauccgacacggacaaggauagcacaaaagugcccucgcuauucuuugccgugaccaacccaggugugaucgaaaccaaacaaggggacagugaggccugguuggaaugggaguuggagcuggaguacauaguuggaggcuaggaacgacugcccgcuugagaucgacucucccguggugagguaccacccacucagcugugucagccgguuggagaaacucuggugcgauagcacuguuggccccugccuagcgugugcugugggaaagccccaacagauuugugaaacacuggaguugucgacccgcgagacgugcggcucgaguugucgcuuccccgugaggggggcugccgggggguagagaaauauucccgguauuuauccgcuaagaccuacgcgcgacgaaacuggcg

ｉＲＮＡ近縁種（例えばｉＲＮＡ ｒ１、ｉＲＮＡ ｒ２、及びｉＲＮＡ ｒ３）は、（上で太字で下線を付して示されている）１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列：auagcacug（配列番号４）；及び／又はgauuuguga（配列番号５）を含むことができることに注目されたい。例えば上記ｉＲＮＡ分子は、１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列：auagcacug（配列番号４）；及びgauuuguga（配列番号５）を両方とも含む。

更に、ｉＲＮＡ近縁種（例えばｉＲＮＡ ｒ１、ｉＲＮＡ ｒ２、及びｉＲＮＡ ｒ３）は、（上で太字で下線を付して示されている）１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列：cguuc（配列番号１０）；gaacg（配列番号１１）；gguuca（配列番号１２）；ggag（配列番号１３）；及び／又はaaauggga（配列番号１４）を含むことができる。例えばｉＲＮＡ分子は、１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列：cguuc（配列番号１０）；gaacg（配列番号１１）；gguuca（配列番号１２）；ggag（配列番号１３）；及びaaauggga（配列番号１４）を全て含む。

更に、ｉＲＮＡ近縁種（例えばｉＲＮＡ ｒ１、ｉＲＮＡ ｒ２、及びｉＲＮＡ ｒ３）は、（上で太字で下線を付して示されている）１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列：ucgacg（配列番号１５）；及び／又はcuccga（配列番号１６）を含むことができる。上記ｉＲＮＡ分子は、１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列：ucgacg（配列番号１５）；及びcuccga（配列番号１６）を両方とも含む。いくつかの実施形態では、上記ｉＲＮＡ分子は、ＣＹＶａＶと（又はｉＲＮＡ ｒ１、ｉＲＮＡ ｒ２、若しくはｉＲＮＡ ｒ３と）非常に近縁であり、そのＲｄＲｐの合成のための記録部位と７０％以上の同一性、例えばＣＹＶａＶの（又はｉＲＮＡ ｒ１、ｉＲＮＡ ｒ２、若しくはｉＲＮＡ ｒ３の）ＲｄＲｐと７５％又は８５％又は９０％又は９５％又は９８％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。

よって、本開示の実施形態によると、（例えばｉＲＮＡ分子由来の）ＲＮＡベクターは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の合成のためのフレームシフトリボソーム記録部位を有する。更に上記ＲＮＡベクターは、３つのシチジル酸で終端するポリヌクレオチド配列（…CCC）を有する３’末端を含んでよい。また、最後から２番目の３’末端ヘアピンは、末端ループに３つのグアニル酸を含んでよい（…GGG…）。更に、３’ＣＩＴＥは、真核生物翻訳開始因子４Ｇ（ｅＩＦ４Ｇ）及び／又は真核生物開始因子４Ｆ（ｅＩＦ４Ｆ）に結合する、伸長したヘアピン又はその一部分を含む。

特定の実施形態では、上記ＲＮＡベクターは、保存配列auagcacug（配列番号４）及びgauuuguga（配列番号５）を有する３’ＣＩＴＥを含む。上記ＲＮＡベクターはまた、以下のポリヌクレオチド配列（同定されたｉＲＮＡ分子の保存配列）：cguuc（配列番号１０）及びgaacg（配列番号１１）；並びに／又はgguuca（配列番号１２）及びggag（配列番号１３）；並びに／又はaaauggga（配列番号１４）のうちの１つ以上を含んでよい。あるいは、又は更に、上記ＲＮＡベクターは、以下のポリヌクレオチド配列（同定されたｉＲＮＡ分子の保存配列）：ucgacg（配列番号１５）及びcuccga（配列番号１６）のうちの一方又は両方を含んでよい。

同定されたｉＲＮＡ近縁種は全て、３’ＵＴＲのインサートと、未知の機能のタンパク質（ｐ２１．２）をコードするＯＲＦの生成をもたらす他のヌクレオチドの変化とを有する。ＣＹＶａＶ等のｉＲＮＡをいずれの植物ウイルス（図２）から区別する１つの特性は、ｉＲＮＡがいずれの１つ以上の移行タンパク質をコードしない点であり、これはウンブラウイルスを含む全ての既知の植物ウイルスの特徴である。またＣＹＶａＶ等のｉＲＮＡは、試験した柑橘類及びＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（研究室モデル植物）を含む植物を通る全身的移行に、いずれのヘルパーウイルスを必要としない。

対照的に、ＰＥＭＶ２は、全てのウンブラウイルスと同様に、２つの移行タンパク質：ｐ２６（長距離移行）及びｐ２７（細胞間移行）をコードする（図３、パネルＡ）。ｐ２６はまた、ゲノムをナンセンス介在性崩壊から保護する安定化タンパク質であり、単一細胞原形質体中における検出可能なレベルのＰＥＭＶ２の蓄積を必要とする（Gao, F. and Simon, A.E. (2017), Differential use of 3 ' CITEs by the subgenomic RNA of Pea enation mosaic virus 2, Virology 510:194-204）。ウンブラウイルスは、コートタンパク質又はＲＮＡサイレンシングサプレッサをコードせず、これらの機能についてヘルパーウイルスに依存する、珍しいウイルスである。ＰＥＭＶ２の場合、ヘルパーウイルスウイルスはエナモウイルスＰＥＭＶ１である。

ＰＥＭＶ２のポリヌクレオチド配列を以下に示す（配列番号２３）：
ggguauuuau agagaucagu augaacugug ucgcuaggau caagcggugg uucacaccug
acuucacccc uggcgagggc gugaagucua gagcucaacu ggaaagagag cuggauccca
ccugggcgcu ucucgugugc caagaacgag cgcgucguga ugcugacagu auugcuaaug
agugguacga gggcagcaug gagugcaacc uccuuauccc ucggcccaca accgaggaug
uauuuggccc cuccaucgcc ccugagccug uggcucuagu ggaggaaacu acccguuccc
gcgcgccgug cguggauguc ccugccgagg aguccuguaa gucagcggag auugauccug
uugaucucgc caaguucgac ucccuccauc gucgccuguu ggcugaagcc aacccuugca
gggaaauggu ucugugggug ccuccuggcc uaccagcaga gcgcgacguc cugcccaggg
cacguggggu gauaaugauc cccgaagucc cugccucugc acauaccuug uccgugaagg
uuauggaggc ugugcgguug gcacaggaag ucuuggcauc ccuugccaag agggccuuag
agaaaagguc uacaccaacc cuuaccgccc aggcccagcc agaggcuacc cugucggggu
gcgacuaccc guaucaggag acuggagcag cagccgcgug gauaacgccu ggcugcauug
ccauggagcu cagagccaaa uuuggcgucu gcaaacgcac ccccgcaaac uuagagaugg
ggagucgcgu cgcccgcgag cuccugcggg auaacugugu cacuugcagg gagaccacgu
gguacaccag ugccauugcu guggaccugu gguugacccc gaccgucguc gaccuggccu
guggccggcg agcggcggau uuuugguagg ggcugugcug ccucggcugg gggaagacac
cagugugcgg uuugacaacc ugcaccccag caucgaggua aucaaggcgg cuaggccccg
cccaacccag aggaugucgu uccaaaucga cguugugcgu ccucuuggag auuuuggugu
gcacaacaac ucccuuguua accuagccag gggaauuaau gaaagggugu ucuacacgga
caaugcuagg acagaacccc uccagccuaa gguucccuuc cccucaucac gggagcuaaa
aaccuucaga gucaccccuu ggaccaugga uaggguugug gagaguuaca caggguccca
gcgcacucgc uaugcuaacg cgcgggacag cauauuaucc aacccucuga gucccaaaga
ugcgcggguc aagacguuug ucaaagcuga aaagauaaau uucacagcca aaccugaccc
cgccccucgu gugauacagc cuagggaucc acgauucaac auuguccugg cuaaauacau
caagccuuug gagccaaugu uguacaaagc acuggggaaa cuuuacaagu accccgcagu
ugcuaagggg uuuaacgcgg uugagacggg ggagaucauc gccggcaagu ggcggugcuu
caaagauccu gucgucgugg gauuagacgc uucccgauuu gaucagcaug uaucugucga
ggcguugcag uucacccacg cgguguacag aggguucauc aagucacggg aguuuaacaa
ccuccuacag augauguaca ccaaccgugg ccuagggucc gcuaaggacg gauucguccg
uuacaagguu aaagguagac gcaugagcgg ugacauggac accuccuugg gcaacugugu
gcucauggug uugcucacca ggaaccuuug caagguucua ggcaucccgc acgagcucuu
caacaauggu gaugauugca ucgucuuuuu cgaucguugc cacuuggaga aguucaacaa
ugcugucaag acuuauuuug cggaccuagg guuuaagaug aagguggaac cgccgguuga
cguguuggag aaaauagagu ucugccaaac gcagccuauc uaugacgggg agaaguggcg
caccgugcgu ugcaucucga guaucggaaa agauugcuca uccguuauua guugggacca
auuggagggg ugguggaaug ccaucgccca gaguggucug gcugugugug gcggaaugcc
gauauacacg ucguucuacc gguggcuagc acgggccggu aagaguggga ccaaguguca
gucacacccc uuguggaaaa acgagggguu gaauugguac aggaugggga uggaccuuuc
ucaugagguu aauguuaccc cucaggcgcg ccugucuuuc uucgcggguu uugguauuuc
ccccccgaug caggucgcca uugaggcgcu guaugacaag cugccuccac cgucccccca
ccaugguccu ccgguuaagg cuguaacaca gcgaguguuc accaauuauu ucacgccgga
aagcgccugu guuagcauga gcacgaauga agacaacaaa ucugacuuug cuguuuacgg
cccugugccu acagugaugu cucuuugugc ucaguguuag gcucuuaaau uuuagcgaug
gcgugacacg guuacacccu gaauugacag gguacagauc aagggaagcc ggggagucac
caacccaccc ugaaucgaca gggcaaaaag ggaagccggg caccgcccac guggaaucga
ccacgucacc uuuucgcguc gacuaugccg ucaacacccu uucggcccgc cagccuagga
caauggcggu agggaaauau augacgauaa ucauuaaugu caauaacgac gagcgcaagc
aaccagaagg agcuacuggc agcucuguac ggcgagguga caauaaaaga acucgaggaa
acaaaccucg gagucaucac cccgguucgc gcgaacgaaa agguuacaau caccccucuc
cuacccccaa aaacucaaag cagggucagc uccguacuga agcgguucag gagcacccga
aacacggggg gacugcuuuc cguagagaaa guggugguag uguucacccc ucacaucccc
gacgacgugc uaggagaggu ggagauaugg cuccacgaca gcauccuccc ccaccucggg
agcgucggac caagacugaa acucaagcug agcgaagggc ccaagcucuu agcguucuac
ccacccuacu cgauugcauu gggggacucg aucucgggcc agccgagguc cuucuccauu
gucaccgagc uguucgaagg caacuucgca ccggggugca gcccauucag ccuguuccuc
auguggaguc cacgcaucga agcagugacc cacaacuacu ugagucgucc accacgugcu
cugccaauuu gcagaacgau ggugcgggac gcguuaucgg agguggcauc ccaacagcaa
uaccugaagg gagcgauguc gaacagguau gccaugccuc ucacuacggg ugauggccag
cauagagcca ugaagggggc ucccagugcc cuuccaccaa cgggggugug uacccaggcu
ucuaagugag gcuucgcuuc ccgccggaag accgcggcgg uucuguuccu cccacaggag
uacggcaaca acccaccuug ggaaaguggg gaccccagca cuaacuccuu uaacuaggcg
ggcguguugg uuacaguagg aggggacagu gcgcaucgaa acugagcccc accacaacuc
ucauccacgg ggugguuggg acgcaggugu cggagggauc gccagcccuc aggauaguga
gcucccgcag agggauaagc uaucucccug cgacguagug guagaacacg ugggauaggg
gaugaccuug ucgaccgguu aucggucccc ugcuccuucg agcuggcaag gcgcucacag
guucuacacu gcuacuaaag uugguggugg augucucgcc caaaaagauc acaaacgcgc
gggacaaggu cccuuccacc uucgccgggu aaggcuagag ucagcgcugc augacuauaa
cuugcggccg auccaguugc acgacuggug gucccccuca gugucucggu ugucugccga
gugggcggug gucggauucc accacacccu gccacgaggu gcguggagac uuggccaguc
uaggcucguc guaauuaguu gcagcgacgu uaaucaaccc guccgggcau auaauaggac
cgguugugcu ucuuccuccc uucuuagcca ggugguuacc ucccuggcgc cc

（上で太字で下線を付して示されている）ＰＥＭＶ２の遺伝子間プラス領域のポリヌクレオチド配列を以下に示す（配列番号２４）：
guuagcauga gcacgaauga agacaacaaa ucugacuuug cuguuuacgg cccugugccu
acagugaugu cucuuugugc ucaguguuag gcucuuaaau uuuagcgaug gcgugacacg
guuacacccu gaauugacag gguacagauc aagggaagcc ggggagucac caacccaccc
ugaaucgaca gggcaaaaag ggaagccggg caccgcccac guggaaucga ccacgucacc
uuuucgcguc gacuaugccg ucaacacccu uucggcccgc cagccuagga caauggcggu
agggaaauau aug

ＰＥＭＶ２の記録フレームシフト部位（塩基８８１～１０１９；図１０も参照）のポリヌクレオチド配列を以下に示す（配列番号２５）：
gaccgucgucgaccuggccuguggccggcgagcggcggauuuuugguaggggcugugcugccucggcugggggaagacaccagugugcgguuugacaaccugcaccccagcaucgagguaaucaaggcggcuaggcccc

予想外にも、ＣＹＶａＶは、ＮＭＤにも対抗するその能力のため、ＰＥＭＶ２の蓄積に必要なｐ２６（又は他のいずれの移行タンパク質）をコードしないにもかかわらず、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ原形質体中で非常に効率的に複製される。実際、ＣＹＶａＶは驚くほど安定しており、ほとんどの従来のウイルスよりはるかに安定していた。ＣＹＶａＶはまた、小麦胚芽抽出物中で、驚くほど高いレベルのｐ８１を生成し、これはＰＥＭＶ２からのｐ９４オーソログの少なくとも５０倍であった（図３、パネルＣ）。ＣＹＶａＶをＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉にアグロ浸潤すると、浸潤済み組織内で複製されるが、蓄積は比較的弱かった（図３、パネルＢ、上；図５、レーン６～８）。手作業での接種では複製は達成されなかった。しかしながら、ＣＹＶａＶをエナモウイルスであるカンキツベインエネーションウイルス（ＣＶＥＶ）と同時浸潤すると、これらの細胞において蓄積が大幅に改善された（図５、レーン３～５；図６も参照）。しかしながら、ＣＹＶａＶ＋ＣＶＥＶの黄化症状（図７、パネルＢ）は、ＣＹＶａＶが単独で示す症状（図７、パネルＡ）に比べて鮮やかであった。

ＣＹＶａＶは、試験した柑橘類ウイルスの他のいずれの組み合わせとも相乗効果を有していなかった。更なる研究により、ＣＶＥＶを、樹木間の伝染を可能とするための、ＣＹＶａＶのためのヘルパーウイルスとして利用できることが示された。ＣＶＥＶは、元のライムカットの木におけるＣＹＶａＶの存在の原因であると思われていたが、ＣＶＥＶは、熱感受性が極めて高いことが知られているため、暑い夏の間はライムカットの木から失われると思われていた。

ＣＹＶａＶは、上部の未接種の葉へと散発的に移行し、極めて高いレベルで蓄積した。これはゲル上のエチジウム染色によって視認できることがある。主枝の９番目の葉で始まった症状は、発育阻害、葉のカール、及び花組織の変形が含まれていた。副枝の葉も、略同時に同様の症状を示し始めた。この驚くべき結果により、ＣＹＶａＶが、コードされたいずれの１つ以上の移行タンパク質の不在下で全身的に移行することが実証されたが、これは従来の植物ウイルスでは不可能である。実験により、ＣＹＶａＶはＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ内で全身的に移行し、また師部に厳密に限定され、伴細胞及び師部実質細胞中でしか複製されないことが示された。柑橘類では、ＣＹＶａＶは１００％移植片伝染性であるが、他の形態での伝染は困難である。

症状を有する葉組織及び根の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により、ＣＹＶａＶが師部実質細胞、伴細胞、及び師要素に限定されることが確認され（図８、パネルＡ～Ｇ）、これは師部限定ウイルスの特徴である。ＣＹＶａＶレベルは、症状を有する組織の葉柄において極めて高く、また総ＲＮＡのエチジウム染色ゲルにおいて視認できる場合もあった。症状はＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて比較的重篤であるものの、ＣＹＶａＶは、試験した全ての柑橘類種において実質的に無症状であることが分かった。実際、最も重篤な症状は、柑橘類ウイルスの指標となる樹木であるシトロンで見られ、樹木全体に分散した複数の葉における、極めて微小な金色の斑点からなっていた。

ＣＹＶａＶの師部に限定された移行は、ＣＹＶａＶが容易に移植片伝染するにもかかわらず、他のいずれの手段でも伝染しない理由を説明するものである。ＣＹＶａＶは、上述のように、コードされたいずれの１つ以上の移行タンパク質を含まない。その代わりにＣＹＶａＶは、宿主植物の１つ以上の内因性移行タンパク質と、伴細胞、師部実質細胞、及び師要素の間を通過するための経路とを利用する。更に、宿主の範囲が、ウイルスの移行タンパク質と宿主の原形質連絡関連タンパク質との間の互換性のある相互作用を含むと考えられるため、ＣＹＶａＶは、多数の他の木質及び非木質宿主細胞の師部を、このような宿主の内因性移行タンパク質を用いて通過できると考えられる。従ってＣＹＶａＶは、（例えばＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ及び／又は柑橘類における）ＲＮＡ移行を検査するための、並びに多数の用途のためのベクターとして使用するための、優れたモデルシステムを提供する。実験により、ＣＹＶａＶは宿主植物内で全身的に移行し、師部に限定され、容易に移植片伝染するが、他の形態では伝染しないことが確認された。

柑橘類の樹木は、アポミクシス及び品種間での性的不適合性を理由とする複雑な生殖生物学を有する。６年を超える場合がある長い幼年期とあいまって、従来の育種法での遺伝子改良は複雑なものであり、また時間がかかる。本開示は、ＲＮＡｉ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて治療用インサートを含むように設計されたｉＲＮＡ系（例えばＣＹＶａＶ系）ベクターを提供することで、このような問題を克服する。ＣＹＶａＶ等のｉＲＮＡは、ポリメラーゼをコードしながらも、宿主の移行タンパク質を用いてウイロイドのように移行し、これにより柑橘類以外の植物を通過できる点で、感染因子の中でも独特なものである。よって、柑橘類に加えて、本開示のｉＲＮＡ系ベクターは、他の木質植物（例えば樹木及びマメ科植物）、並びに特にオリーブの木及びブドウの木のために開発できる。

本開示の実施形態によると、ＣＹＶａＶは、小分子ＲＮＡ及びタンパク質を柑橘類の苗木及びＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａに送達するためのベクターの開発に利用される。ＣＹＶａＶベクターの開発のために利用した手順は、ベータカルモウイルスＴＣＶを操作して小分子ＲＮＡを生成するために本発明者raによって利用されたものと同様であった（Aguado, L.C. et al. (2017), RNase III nucleases from diverse kingdoms serve as antiviral effectors, Nature 547:114-117を参照）。ＲＮＡｅ ＩＩＩタイプのエキソヌクレアーゼによって切除されるように設計された１つ、２つ、３つ、又はそれより多数の小分子ＲＮＡインサートを付加するための、例示的かつ有利な部位を識別した。少分子レポータＲＮＡは、標的組織を白色化するフィトエン不飽和化酵素を標的とするゲノムから直接発現された。

本開示の実施形態によると、本明細書で開示されるベクターは、以下を含む様々な機能を有する小分子ＲＮＡを含んでよい：必須の真菌ｍＲＮＡを標的とする小分子ＲＮＡ；死亡又は不妊のための１つ以上の昆虫ベクターを標的とする小分子ＲＮＡ；及びＣＶＥＶを標的とする小分子ＲＮＡ（というのは、このウイルスはＣＹＶａＶと合わさって、葉脈黄化症状の増強を引き起こすためである）。更に本開示のベクターは、当該技術分野で公知の他の小分子ＲＮＡ及び／又は治療剤を含んでよい。師部限定ｉＲＮＡ系ベクターを操作することによって、抗真菌及び／又は抗昆虫及び／又は抗ウイルス特性を有する小分子ＲＮＡを生成でき、これは、現行の方法と比較して優れた治療及び管理戦略を提供する。

ＣＹＶａＶベクターは、例えばＣｉｔｒｕｓ Ｃｌｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＣＣＰＰ）の下で開発されて日常的に使用されている手順のような、当業者に公知の柑橘類接種手順に従って、師部へと切り込みを入れ、上記ベクターを、ＲＮＡとして若しくはアグロ浸潤によって、又はＣＶＥＶのコートタンパク質にカプシド化した後で、沈着させることにより、感染した又は未感染の樹木に手作業で適用できる。このような手順は、ＣＴＶ及び柑橘類の他の移植片伝染性病原体の接種の慣用手順である。ＣＹＶａＶはカプシドタンパク質をコードしないため、ビリオンは形成されず、従ってＣＹＶａＶが自然に樹木間伝染することは不可能である。ＣＹＶａＶはＣＶＥＶコートタンパク質にカプシド化され、ＣＶＥＶの他の成分は存在しない。

上述のように、ＣＹＶａＶは以下の２つのＯＲＦしか有しない：複製に必要なタンパク質ｐ２１をコードする５’近位ＯＲＦ；及びリボソームに翻訳を続けさせ、ｐ２１を伸長させてｐ８１、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを生成する、フレームシフトリボソーム記録要素。これら２つのＯＲＦの構成は、トンブスウイルス科及びルテオウイルス科のウイルスにおける同様のＯＲＦの構成と類似している。しかしながら、これらの科の全てのウイルス、及び実際には全ての既知の植物ＲＮＡウイルスは、移行タンパク質をコードするか、又は１つ以上の移行タンパク質をコードする二次ウイルスと関連している。移行タンパク質をコードできること、又は１つ以上の移行タンパク質をコードする第２のウイルスと関連できることは、細胞間の移行のため、及び全身感染を確立するための師部の通過のための要件であると長い間考えられてきた。従って、ベクターとしてのｉＲＮＡの使用は提案されたことがなく、実際にｉＲＮＡ分子はこれまで、コードされるいずれの移行タンパク質が存在しないこと、及び独立して移行できないと考えられていたことを理由として、独立ベクターとしての使用には適していないと考えられていた。

従って、いずれの１つ以上の外因性移行タンパク質をコードしない、又はこれに依存しないにもかかわらず、植物の師部全体を通ってｉＲＮＡが独立して全身的に移行できることは、非常に驚くべきことである。本開示のＣＹＶａＶ系ベクターは、いずれのヘルパーウイルスに支援されることなく、全身移行を（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の技法によって）明確に繰り返し実証した。若年の非浸潤（全身）組織は、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて、葉粒及び根粒を含む極めて視認しやすい症状を示した。本開示のベクターは、移行性のために内因性の宿主の１つ以上の移行タンパク質を利用する。この点について、宿主ＲＮＡを師要素へと輸送することが知られている、宿主の１つ以上の師部タンパク質（２５ｋＤａの師部タンパク質２（ＰＰ２）及び／又は２６ｋＤａのキュウリ師部タンパク質２様）（Balachandran, S. et al. (1997), Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata, PNAS 94(25):14150-14155; Gomez, G. and Pallas, V. (2004), A long-distance translocatable phloem protein from cucumber forms a ribonucleoprotein complex in vivo with Hop stunt viroid RNA, J Virol 78(18):10104-10110を参照）は、ノースウェスタンブロットを用いて、ＣＹＶａＶと相互作用する可能性が高いことが示された。従って、既知の植物ウイルスは移行タンパク質をコードする（又は移行タンパク質に依存する）ため、ｉＲＮＡは従来の植物ウイルスとは構造的にも機能的にも大きく異なっている。

ＣＹＶａＶに加えて、同様のサイズの、ポリメラーゼをコードする他のＲＮＡを、同様の構造のｉＲＮＡ系ベクターの開発に利用してよい（例えばChin, L.S. et al. (1993). The beet western yellows virus ST9-associated RNA shares structural and nucleotide sequence homology with Tombusviruses. Virology 192(2):473-482; Passmore, B.K. et al. (1993). Beet western yellows virus-associated RNA: an independently replicating RNA that stimulates virus accumulation. PNAS 90(31):10168-10172を参照）。上述のように、タンパク質ｐ２１及びｐ８１をコードする他のｉＲＮＡ近縁種（例えば、それぞれウチワサボテン、イチジクの木、及びエチオピアトウモロコシで同定された、ｉＲＮＡ ｒ１、ｉＲＮＡ ｒ２、及びｉＲＮＡ ｒ３）（図４）を、ベクターの開発に利用してよい。

ＣＹＶａＶはＧｅｎＢａｎｋデータベースに存在する（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＸ１０１６１０）が、ｉＲＮＡは、移行タンパク質をコードするシストロンを有しないため、ウイルスのいずれの既知の分類にも属していない。またｉＲＮＡは、宿主内での全身移行について、ヘルパーウイルスに依存しない。更にｉＲＮＡは、コートタンパク質をコードするシストロンを有しない。ｉＲＮＡはウイロイドとも異なっているが、これらはいずれも、コードされた移行タンパク質の不在化で全身移行できる。ウイロイドは、コーディング能力を有さず、宿主ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて核又は葉緑体内で複製される、環状の一本鎖ＲＮＡである。典型的には約３００～４００ヌクレオチド（ｎｔ）を含む小さなウイロイドゲノムの大部分が、ウイロイドの異常な存在に必要である。更に、ウイロイドはいずれのタンパク質をコードせず、従ってベクターとしての使用には不適である。対照的に、ｉＲＮＡは、独自のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードする。

ｉＲＮＡは、以下の２つのクラスに分類できる：第１のクラスは、ウンブラウイルスのものに類似した、３’末端に近接するＲｄＲｐ及びＲＮＡ構造を生成するためのフレームシフト要件を特徴とする。第２のクラスは、トンブスウイルスのものに類似したＲｄＲｐ及び３’ＲＮＡ構造を生成するためのリードスルー要件を特徴とする。ＣＹＶａＶは、ウンブラウイルスに類似した特性を有する第１のクラスのメンバーであり、フレームシフト記録部位及び類似の構造を３’末端に、そして類似の配列を５’末端に含む。第２のクラスのｉＲＮＡメンバーは、常にヘルパーウイルスに関連して発見されている。

ｉＲＮＡは、従来のウイルスベクターと比較して多数の利益を提供する。例えばｉＲＮＡは比較的小さいため、構造的及び機能的なマッピング、並びに遺伝子的な設計が比較的簡単である。対照的に、ＣＴＶのようなウイルスは８倍大きいため、ベクターとして使用するには煩雑である。ｉＲＮＡは、予想外の高いレベルで複製及び蓄積でき（例えばゲル上でのエチジウム染色によって視認可能であり、ＲＮＡｅｑによる読み取り値の４％である）、これは、十分な量の１つ以上の治療剤を標的植物に送達するベクターの能力にとって重要である。更に、ｉＲＮＡは、コートタンパク質又はサイレンシングサプレッサをコードしないにもかかわらず、多くのウイルスよりもはるかに安定しており（図１３）、これにより、宿主細胞内での寿命が長く、従って長期間にわたって利益を提供する。

ｉＲＮＡはまた、宿主の師部に限定され、これは、師部に存在する、又はキャリアが師部から供給される、又は症状が師部に蓄積される病原体を標的とするために特に有益である。というのは、ペイロードが、それが最も必要とされる場所に標的化されることになるためである。移行タンパク質（この移行タンパク質と特定の宿主タンパク質との相互作用が、宿主の範囲の決定の主要な因子である）とは独立して移行することにより、ｉＲＮＡは宿主の比較的広い範囲内を通過できるため、単一のベクタープラットフォームの適用可能性が上昇する。コートタンパク質の発現がなく、また全身的な植物感染のためにヘルパーウイルスが不要となるため、ｉＲＮＡは、植物間でのベクター化が不可能である代わりに、移植によって師部に直接導入しなければならない。コートタンパク質が存在しないことにより、感染性粒子の形成が防止され、従って、意図に反して野生型感染因子が環境に復帰するのが防止される。これは、規制当局の承認を合理化する上で特に有益である。というのは、規制当局は多くの場合、導入された生物学的因子の、発生し得る非制御下での伝染を懸念しているためである。

ｉＲＮＡはまた、分離株が高い病原性を示す可能性があるＣＴＶのようなウイルスとは異なり、宿主に対して実質的に良性である。ＣＴＶ等の一般的なウイルスをベクターとして使用すると、重感染排除のリスクが生じ、以前にそのウイルスに感染した及び／又は曝露された樹木は、ベクターとして作用する同一のウイルスに更に感染できない（例えば米国のほとんどの柑橘類樹木はＣＴＶに感染している）。よって、重感染排除を回避するためには、プロセスに追加のステップが最低限必要になるため、コストが高くなり、また煩雑になる。

本開示はまた、ｉＲＮＡベクターに入るように設計された新規の治療用、予防用、又は特色増強用インサートを提供する。多様なインサートが提供され、これには、特定の病原体、昆虫ベクター、又は１つ以上の病気の発現を標的とするインサートが含まれる。あるいは、又は更に、植物の健康を強化若しくは改善する、及び／又は植物の所望の特徴を増強する、インサートが提供される。

本開示の感染因子は、宿主植物全体にわたる蓄積及び全身移行が可能であるため、相当な期間にわたって宿主全体に治療を送達できる。従って本開示の因子の特徴は、多数の具体的感染細胞内で発現される病気の治療に極めて有益である。ＲＮＡ又はＤＮＡで構成された感染因子を使用すると、感染細胞内で発現されることになる治療用タンパク質若しくはペプチドをコードできるという追加の利点、及び／又はその遺伝物質の特定の配列又は切断可能な部分を含むように感染因子を設計して、ＲＮＡ系治療剤として機能させることによる、追加の利点が得られる。

植物病原体に対する抗菌特性を有する生成物は、多数のフォーマットを取ることができ、リボソーム合成（ディフェンシン及び小分子バクテリオシン）、又は非リボソーム合成（ペプタイボール、シクロペプチド、及びシュードペプチド）によって生成される。最もよく知られているのは、ラクトフェリン又はディフェンシン等の、９００を超えるカチオン性抗菌ペプチド（ＣＡＰ）であり、これらは一般に５０アミノ酸未満であり、その抗菌特性は当該技術分野で公知である。ＣＡＰは、細胞壁を全体的に標的とする非特異的作用剤であり、細菌及び真菌に対する効果が報告されている。ディフェンシンを発現するよう設計されたインサートを用いて操作されたＣＴＶは、フロリダのＵＳＤＡによってリリースの承認を得ているが、その広範な有効性は不明である。更に、ベクターに使用されるＣＴＶの分離株は、一部の地域（例えばカリフォルニア）で成長する樹木には不適である。

ウイルス性病原体を標的とするＲＮＡ療法も、植物において広範に開発されている。これらの療法は、ノンコーディング小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用し、これは植物のゲノムから生成されるため、宿主の遺伝子改変が含まれる。一部の生産者及び消費者の、柑橘類の樹木の遺伝子改変に対する否定的な見方に加えて、遺伝子改変された樹木の生成にかかる時間の長さは数十年と測定されており、最終的に、数十年にわたって開発された品種と同一の属性（テクスチャ／色／味）を持たない可能性があり、従って、現在の、時間に敏感な農業における病気に対する解決策にはならず、更に、開発に極めて高いコストがかかり、果実の品質に影響を及ぼす可能性がある。

近年、高度に標的化された抗細菌酵素が、現行の抗生物質の代替として動物及びヒトに使用するために開発されている。これらの酵素は、バクテリオファージ溶解タンパク質から設計されたものであり、酵素抗生物質として知られる。親バクテリオファージタンパク質と同様に、酵素抗生物質は細菌の細胞壁を接触時に溶解できるが、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の療法の外部で使用されるように設計されている。酵素抗生物質は、標的の細菌のみを溶解し、マイクロバイオームの他のメンバーは影響を受けないままとなるように設計される。いくつかの実装形態では、酵素抗生物質のような抗細菌タンパク質に翻訳できるノンコーディングＲＮＡインサートを含むｉＲＮＡベクターが提供される。

いくつかの実装形態では、問題となっている昆虫ベクターの機能に干渉するＲＮＡインサートを含む、ｉＲＮＡベクターが提供される。昆虫は、植物に類似したＲＮＡサイレンシングシステムを有し、昆虫に摂取された小分子ＲＮＡは、細胞に取り込まれ、昆虫の体内での分解又は翻訳の遮断のために重要なｍＲＮＡを標的とする。いくつかの実施形態では、昆虫ベクターの重要な生殖機能をサイレンシングでき、これによって昆虫を不妊化できる、標的化インサートが提供される。特に関連するのは、師部限定病原体を伝達する、師部食性昆虫であり、この場合、師部限定ベクターへのノンコーディングＲＮＡインサートが、摂食する昆虫によって容易に取り込まれる。

いくつかの実装形態では、病原体に対する植物の応答を標的とするノンコーディングＲＮＡインサートを含む、ｉＲＮＡベクターが提供される。場合によっては、昆虫ベクターによって挿入された細菌は、樹木に直接的な損傷を与えない。しかしながら、宿主樹木は、その師部において過剰なカロースを産生することによって細菌を隔離し、これが最終的に光合成産物の流れを制限して、樹木を枯死させる場合がある。よってＲＮＡインサートは、このようなカロース産生をサイレンシング及び／又は抑制する。

本開示の更なる特徴及び特質は、更なる例示として提供される、本開示の限定を意図したものではない以下の更なる例及び議論を参照することにより、更に理解されるだろう。

ＣＹＶａＶ構造
ＣＹＶａＶの全長構造を、ＳＨＡＰＥ構造プロービング、並びにウチワサボテン、イチジク、及びトウモロコシにおけるＣＹＶａＶ近縁種との系統発生学的比較によって決定した（図９）。記録部位（図１０を参照）及びＩＳＳ様（Ｉ字型構造）３’ＣＩＴＥ（図１１を参照）を同定し、これと共に、インサートに対応するための領域は、例えば二重線で囲まれた領域によって示されており、インサートのための例示的な位置に関して更に詳細に議論する。

ＣＹＶａＶのゲノム構成は、他のＲＮＡ分子、特にＰＥＭＶ２とある程度の類似性を示す（図３、パネルＡ）。しかしながら、ウンブラウイルスＰＥＭＶ２は、移行に関与するタンパク質ｐ２６及びｐ２７をコードするＯＲＦも有している。浸潤済みのＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉及び全身の葉における、ＣＹＶａＶプラス（＋）鎖のレベルが、図３のパネルＢに示されている。全長ＣＹＶａＶ及びＰＥＭＶ２の小麦胚芽抽出物中での試験管内フレームシフトによって合成された、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のレベルも示されている（図３、パネルＣ）。ＣＹＶａＶによって生成されたｐ８１ポリメラーゼと比較した場合のＰＥＭＶ２由来のｐ９４のレベルの大きな差に注目されたい。ＣＹＶａＶのフレームシフト部位は、ウイルス学において知られる最も強力な部位の１つであり、その著しく高い蓄積の原因であると考えられている。

ＣＹＶａＶはＣＶＥＶのビリオンにカプシド化される
Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉に、ＣＹＶａＶ、又はＣＶＥＶ、又はＣＹＶａＶ＋ＣＶＥＶをアグロ浸潤させた。ＣＹＶａＶはＣＶＥＶのビリオンにカプシド化され、ビリオンは１週間後に単離されて、カプシド化されたＲＮＡはＰＣＲ分析に供された（図５及び６を参照）。ＣＹＶａＶの蓄積は、推定ヘルパーウイルスＣＶＥＶの存在下で有意に増大した。ｒＲＮＡローディングコントロールは下側に示されている。ｐ１４サイレンシングサプレッサは、全ての葉に同時浸潤された。黄化症状は、ＣＹＶａＶ＋ＣＶＥＶを用いた葉においてわずかに重篤であった（図７、パネルＢ）。

ＣＹＶａＶは師部限定性である
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）撮像により、ＣＹＶａＶのプラス鎖が明確に検出され、これは完全にＳＥ、ＣＣ、及びＰＰＣに限定されていた（図８）。

ＣＹＶａＶはサイレンシングサプレッサをコードしない
Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ １６Ｃ植物に、（これらの植物においてサイレンシングされる）ＧＦＰを発現する構築物と、ＣＹＶａＶ ｐ２１若しくはｐ８１を発現する構成物、又は既知のサイレンシングサプレッサｐ１９（由来ＴＢＳＶ）若しくはｐ３８（由来ＴＣＶ）を発現する構築物とをアグロ浸潤させた（図１３、パネルＡ）。ｐ１９及びｐ３８だけがＧＦＰのサイレンシングを抑制し、緑色蛍光を発現させる（図１３、パネルＢ）。ＧＦＰオリゴヌクレオチドでプローブしたノーザンプロットは、ＧＦＰ ＲＮＡがｐ２１又はｐ８１の存在下で依然としてサイレンシングされることを示した（図１３、パネルＣ）。

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ原形質体におけるＣＹＶａＶの複製
ＣＹＶａＶの感染性クローンが生成された。野生型ＲＮＡ転写産物（ＣＹＶａＶ）、又はＲｄＲｐの合成を排除するため複製しない、「スリップしやすい」記憶部位に突然変異を含有する転写産物（ＣＹＶａＶ‐ｆｓｍ）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ原形質体に接種した。ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットを３０時間後に実施した。なお、接種されたＣＹＶａＶ‐ｆｓｍの転写産物は、３０時間の時点において依然として原形質体中に存在していた（従来のウイルスでは４時間後には検出されなくなる）。

Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉｎａｎａにおけるＣＹＶａＶの複製
ノーザンブロットによって、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの浸潤済みの葉に蓄積されるＣＹＶａＶのレベルを決定した（図１５、パネルＡ）。ＣＹＶａＶが浸潤された植物は散発的に全身症状を示した（図１５、パネルＢ；図１６も参照）。これらの植物は、高いレベルのＣＹＶａＶを蓄積した。全身的に感染した植物の個々の葉におけるＣＹＶａＶのレベルを決定した（図１５、パネルＣ）。葉４及び５には、ＣＹＶａＶがアグロ浸潤された。最も若い葉にＣＹＶａＶが相当量蓄積されていることに注目されたい。

ＣＹＶａＶに全身的に感染したＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの症状
葉４及び５には、ＣＹＶａＶがアグロ浸潤された。全身的に感染した植物の最初の兆候は、「カップ状の」葉（図１６）であり、これは略常に葉９であった。次の数週間で、葉粒が植物の頂端分裂組織及び各節に出現した。全身的に感染した植物は、根粒も有しており、これは植物のノーザンブロットによって証明されるように、相当な量のＣＹＶａＶを含んでいた。

ＣＹＶａＶは例外的な宿主範囲を示す
全身的に感染したＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａからの樹液をトマトの葉柄に注入した（図１７）。４つの植物のうちの１つが極めて強い症状を示し、ＰＣＲによりＣＹＶａＶに関して陽性であった。図示されている植物は感染後５３日目であり、同一年齢の植物と共に示されている。

ＣＹＶａＶは、キュウリの師部から抽出される非常に豊富なタンパク質に結合する
標識された全長ＣＹＶａＶは、ノースウェスタンブロットにおいて実証されるように、顕著なタンパク質に結合する（図１８）。タンパク質は、ＳＤＳゲル電気泳動後に復元された。このタンパク質は、ＲＲＭモチーフを含有する既知の高度に保存されたＲＮＡ結合タンパク質であると考えられ、上記ＲＲＭモチーフは、ＲＮＡに対して伴細胞からキュウリの師部の師要素へのシャペロンとして機能することが知られている。電気泳動後にタンパク質が変性したままである場合には、結合は見られなかった。

ＣＹＶａＶは、ＴＥＶ ＩＲＥＳを用いて、その３’ＵＴＲから余剰タンパク質を発現できる
タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流のナノルシフェラーゼの３つの別個のインサートの位置を同定した（図１９）。上記３つの構築物の小麦胚芽抽出物における試験管内翻訳を評価した。ナノルシフェラーゼタンパク質（Ｎｌｕｃ）の位置は、ゲルの底部付近である。ナノルシフェラーゼの発現を、原形質体で生体内で調査した（図１９、パネルＣ）。（Ａ）に示されている構築物の全長ＲＮＡ転写物を、原形質体に形質転換し、１８時間後に総タンパク質を抽出し、ナノルシフェラーゼ活性をルミノメータで測定した。

２２５０位、２３０１位、及び２３１９位における安定したヘアピンインサートのための例示的な位置を評価した。各インサートのための位置は、上述の例示的領域内である（図９を参照）。ＣＹＶａＶ‐ｗｔ、及び２２５０位に異なる量の配列を含有するＣＹＶａＶ ＶＩＧＳベクターからの、Ｔ７転写物の小麦胚芽抽出物試験管内翻訳アッセイを実施した（図２０）。例えば、構築物ｓｆＰＤＳ６０は、植物内で優れた全身移行を示した。ＣＹＶａＶ‐ｗｔ、及び２３０１位及び２３１９位に異なる量の配列を含有するＣＹＶａＶ ＶＩＧＳベクターからのＴ７転写物の、小麦胚芽抽出物試験管内翻訳アッセイを実施した（図２１）。ＣＹＶａＶ ｗｔ及びＣＹＶａＶ ＶＩＧＳベクター、ＣＹＶａＶ‐ＧＤＤ及び陰性対照に感染したＡ． ｔｈａｌｉａｎａ原形質体から単離された総ＲＮＡのノーザンブロット分析を実施した（図２０、パネルＤ）。ＣＹＶａＶ ｗｔ及びＣＹＶａＶ ＶＩＧＳベクター、ＣＹＶａＶ‐ＧＤＤ及び陰性対照に感染したＡ． ｔｈａｌｉａｎａ原形質体から単離された総ＲＮＡのノーザンブロット分析を実施した（図２１、パネルＤ）。構築物ＣＹ２２５０ｓｆＰＤＳ６０、ＣＹ２３０１ＰＤＳ６０、ＣＹ２３０１ｓｆＰＤＳ６０、ＣＹ２３１９ｓｆＰＤＳ６０（それぞれ２２５０位、２３０１位、２３１９位にインサートを含む）は全て、挿入によって優れた全身移行を示した。更に、（２３３１位にインサートを含む）構築物ＣＹ２３３１ＰＤＳ６０もまた、宿主の全体を全身的に移行する能力を示した。更なる構築物ＣＹ２０８３ＴＡＡＰＤＳ６０は、２０８３位にインサートを含み、この位置はＲｄＲｐ ＯＲＦ内である（挿入された停止コドンに先行される）。

全身の葉から収集されたベクターの、（以下で下線を付して示されており、また図２０のパネルＧ及び図２１のパネルＧに図示されている）挿入領域の配列を以下に示す：
taggcctcgacacgggaaggtagctgtcccggcactgggttgcacatattccgtgccgacgccac（配列番号２６）
ccggcctcgacacgggaaggtagctattccgtgccgacgccgt（配列番号２７）

ｉＲＮＡ系ベクタープラットフォーム
一実施形態では、ＣＬａｓ細菌によって引き起こされる柑橘類産業における病気（ＨＬＢ）を治療するための、ｉＲＮＡ系ベクターが提供される。ＣＹＶａＶの分離株をベクターとして利用して、上記細菌、及びこの細菌を樹木の中へと送達するキジラミを標的とする。上述のように、ＣＹＶａＶは師部に限定され、この師部において、最良の植物ウイルスに匹敵する極めて高いレベルまで複製及び蓄積される。更に、サイズが比較的小さいため、遺伝子的な操作が極めて容易である。このように、ＣＹＶａＶの構造及び生物学を考察することで、師部の通過のためのベクター及びモデルシステムとしてのこの新規の感染因子の開発が支援された。

ＣＹＶａＶの３’ＵＴＲの構造を、ＳＨＡＰＥ ＲＮＡ構造マッピングに基づいて決定した（図９）。更に、多数の複製及び翻訳要素を、生化学的アッセイ、並びにその配列並びに／又は構造及び位置の（ウンブラウイルスとの）系統発生学的比較によって同定した（図１９、パネルＡ）。３’キャップ非依存的翻訳促進領域（３’ＣＩＴＥ）として機能するＩ字型要素も同定した。一連の長距離キッシングループ相互作用（二重矢印）も同定した。これは、サイレンシングサプレッサの不在下でのＲＮＡの安定化と蓄積に関与すると考えられる。この構造に基づいて、多数のエリアを、周囲の構造を妨害してはならない配列挿入に好適なものとして同定した。

例えば摂食する昆虫、レポータＯＲＦに対応しながらアグロ浸潤済みのＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ内で操作済みのＣＹＶａＶの複製を可能とする部位、及び試験管内でのレポータタンパク質の高レベルの翻訳をトリガする部位を標的とするｓｉＲＮＡの生成のための、ＲＮＡヘアピンに対応できる３’ＵＴＲ及びＲｄＲｐ ＯＲＦの可能なインサートに関して、特定の部位が同定されている。付加されたＯＲＦ及びｓｉＲＮＡを組み込んだ操作済みのＣＹＶａＶを、貯蔵された宿主樹木に導入し、その後、その複数の片が、移植による野外の樹木への直接導入に使用できるようになる。ＣＹＶａＶの希少性（これまでのところ、１９５０年代にＷｅａｔｈｅｒｓによって４つのライムカットの木においてしか同定されていない）を考えると、重感染排除のリスクはほとんどない。

ベクターの複製又は翻訳特性が有意に低減又は排除されない様々なインサート位置を同定した。（恐らくＲＮＡ構造、又はＣＹＶａＶベクターの他の重要な側面の破壊によって）このような特性に悪影響を及ぼすインサート位置については、それ以上追求しなかった。ＣＹＶａＶ系ベクターにおける４つの例示的なインサート位置を、２２５０位、２３０１位、２３１９位、及び２３３１位において同定した。試験管内での翻訳、又は原形質体中での複製を中断することなく、５０ｎｔのヘアピンインサートがこれらの位置に良好に展開され、ＣＹＶａＶはＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの中で全身的に移行できた。

ＣＹＶａＶは追加のＯＲＦを有しないが、約５００ｎｔのゲノム（ｇ）ＲＮＡ及びサブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡの両方が、プラス鎖及びマイナス鎖に対してプローブを使用することで検出可能である。ｓｇＲＮＡプロモータを含むはずの領域の調査により、ウンブラウイルスの高度に保存されたｓｇＲＮＡプロモータと、カルモウイルスＴＣＶの最小であるものの高度に機能的なｓｇＲＮＡプロモータとに対して、有意な類似性を有する要素が明らかになった。更に、ＲｄＲｐのみを発現し、またトンブスウイルスに関連する、類似のＲＮＡは、全て同様のサイズのサブゲノムＲＮＡを生成し、ペプチド及びタンパク質の発現を簡素化できる。

ＣＹＶａＶのｓｇＲＮＡプロモータの下流でインサートが許容される場所を決定するために、ＣＹＶａＶの３’ＵＴＲ中のどこに重要な要素が存在するかの評価が実施され、これにより、上記要素は異種配列を挿入する際に回避される。上述のように、ＣＹＶａＶのための３’ＣＩＴＥと、ウンブラウイルス中で高度に保存された、複製及び翻訳にとって重要であることが分かっている、複数の追加の３’近位ヘアピンとを同定した。欠失／点突然変異を用いて、推定ｓｇＲＮＡプロモータの下流及びＣＡＳの上流の配列（～１２０ｎｔ）を、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの原形質体内での蓄積又は全身移行に影響を及ぼさない領域に関して調査した。同様の戦略は、ＲＮＡｅ ＩＩＩ型酵素が標的とするヘアピンに対応できるＴＣＶの３’ＵＴＲ内の領域を同定するために、本発明者らが過去に利用した（Aguado, L.C. et al. (2017). RNase III nucleases from diverse kingdoms serve as antiviral effectors. Nature 547:114-117）。

欠失／突然変異に対応するために好適な領域（例えば重要な機能に関与しない領域）を同定した後、異なる長さの異種配列をそこに挿入して、伸長した３’ＵＴＲを有するＣＹＶａＶの機能を評価した。このような調査は、最大インサート長を、このようなインサートが、依然としてロバストなレベルまで蓄積して全身移行に関わりながらもＣＹＶａＶ系ベクターに確実に許容されるように、決定するのに役立つ。ＣＹＶａＶ系ベクターは、最大２ｋｂのサイズのインサートに対応できる可能性があると考えられる。この点に関して、最も近縁のウイルス（ＣＹＶａＶと同様にレプリカーゼ関連タンパク質及びＲｄＲｐしかコードしない、パパイヤウンブラ様ウイルス）は、１～２ｋｂ大きく、全ての追加の配列長がその３’ＵＴＲを伸長させる（Quito-Avila, D.F. et al. (2015). Detection and partial genome sequence of a new umbra-like virus of papaya discovered in Ecuador. Eur J Plant Pathol 143:199-204）。５０ｎｔ（小分子ＲＮＡ産生のために挿入されるヘアピンのサイズ）から始めて約６００ｎｔ（酵素抗生物質ＯＲＦのサイズ）まで、様々なサイズの配列断片を評価した。最初の小さなＲＮＡ断片は、フィトエン不飽和化酵素をノックダウンするためのレポータを含み、これは組織を白化させる。より長いサイズの断片は、ナノルシフェラーゼ及びＧＦＰ ＯＲＦを含み、これらは発現レベルを検査するためのレポータとしても使用できる。インサートは、野生型（ＷＴ）ｓｇＲＮＡプロモータ及び強化されたｓｇＲＮＡプロモータを含有する構築物で作製される。

インサートの塩基を安定させるためのロック・アンド・ドック配列
図２４のパネルＡを参照すると、ロック・アンド・ドック配列の基本的な構造が示されている。そのドッキング配列とドッキングするテトラループＧＮＲＡ（ＧＡＡＡ）は、極めて安定した構造を生成する。図２４のパネルAに図示された配列を以下に示す：
gaaa（配列番号２８）
gauauggau（配列番号２９）
guccuaaguc（配列番号３０）
caggggaaacuuug（配列番号３１）

ドッキングされたテトラループからなる足場の、結晶学的足場としての使用が提供される（図２４、パネルＢ）。図２４のパネルＢに図示された配列を以下に示す：
cauuagcuaaggaugaaagucuaugcuaaug（配列番号３２）

本開示の実施形態によるロック・アンド・ドック構造が、図２４のパネルＣに示されている。インサート（ヘアピン又は非ヘアピン配列）を、同定された追加の挿入位置の制限部位に付加してよい。円で囲まれた塩基は、テトラループのためのドッキング配列である。図２４のパネルＣに図示された配列を以下に示す：
gcaccuaaggcgucagggucuagacccugcucaggggaaacuuugucgcuauggugc（配列番号３３）

局所３’ＵＴＲ構造の安定化は有害であるものの、不安定化インサートを付近に挿入することでｖｉａｂｉｌｉｔｙが回復する
図２５のパネルＡを参照すると、ＣＹＶａＶ‐ｗｔが示されている。ＣＹＶａＶ‐ｗｔ ３’ｓｔｂは、Ｇ：ＵペアをＧ：Ｃペアに変換する６ｎｔの変更を含む、安定化された親構築物である。６０個のヌクレオチドの２つの挿入を、２３１９位及び２３３０位において、上記安定化された親構築物に付加して、ＣＹ２３１９ＰＤＳ６０＿３’ｓｔｂ及びＣＹ２３３０ＰＤＳ６０＿３’ｓｔｂを形成した。構造を安定させてＣＹＶａＶ‐ｗｔ ３’ｓｔｂを生成するためになされたヌクレオチドの変更は、パネルＢにおいて円で囲まれている。図２５のパネルＢに図示された配列を以下に示す：
ggcuaguuaaucucauucgugggauggacaggcagccugacguugac（配列番号３４）
guuaauguaggugucuuuccguaucuaguc（配列番号３５）（未改変のＧ：Ｕペア）
gucaacgcaggugccuguccguaucuagcc（配列番号３６）（変換されたＧ：Ｃペア）

治療及び管理の標的

酵素抗生物質、又はＣＬａｓ細菌を破壊するように操作された小分子ペプチドを含む、本開示のベクターによる送達のための抗生物質インサートが提供される。酵素抗生物質は、植物の師部に見られるような、糖が豊富な室温環境を好む。酵素抗生物質は、操作されたＣＹＶａＶの感染サイクル中に、伴細胞内で翻訳される。師部の細胞質内で産生されたタンパク質は、ＣＬａｓ及び他の植物病原細菌が居住する師要素から自然に出ることができる（翻訳されたタンパク質のデフォルトの経路）。師要素内では、酵素分子は、光合成産物と共に幹を上下に移行し、いずれの細菌に接触してこれを溶解する。酵素抗生物質は特定のクラスの細菌に対して標的化されているため、好ましいことに、宿主樹木のマイクロビオームを乱さない。ＣＬａｓを標的とする様々な因子が開発されている（例えばHailing Jin, University of California, Riverside, CA）。よって、ＣＬａｓ細菌を標的とする多数のインサートが当該技術分野で公知であり、本開示のＣＹＶａＶベクターと共に利用できる。

更なる実施形態として、病気及び病気キジラミベクターを破壊するための複数の経路を標的とすることが有益であり得る。その結果、特定の実施形態では、本開示のベクターは上述の酵素抗生物質及び／又はペプチドと、樹木又は病気媒介性キジラミの遺伝子発現に干渉するｓｉＲＮＡの産生をトリガするインサートとを含む。ＡＣＰの場合、ＲＮＡはベクターを死滅させるか、又はウイングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）として無害化することができる。

カロースシンターゼの発現を標的とするＣＹＶａＶ系ベクター
宿主である木におけるカロース生成及び構築の低減をトリガするＲＮＡインサートを含むベクターが提供される。細菌に応答して師部にカロースを生成する、十分に多量の遺伝子を、植物によって切除されるｓｉＲＮＡ配列の挿入によってサイレンシングする。

ＣＹＶａＶ系ベクターは、ウイルス誘発遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）ベクターとして利用して、師部におけるカロースシンターゼの発現を下方制御できる。ＶＩＧＳは、成熟した植物の遺伝子発現を下方制御して、植物の機能的ゲノミクスを検査するために、広く使用されている（Senthil-Kumar et al. (2008). Virus-induced gene silencing and its application in characterizing genes involved in water-deficit-stress tolerance. J Plant Physiol 165(13):1404-1421）。相補的配列を、上で同定されているような好適な位置において、ＣＹＶａＶに挿入する（アンチセンス、又はＲＮＡｅ ＩＩＩで切断可能なヘアピン）。上記遺伝子の柑橘類のバージョンは公知である（Enrique et al. (2011). Novel demonstration of RNAi in citrus reveals importance of citrus callose synthase in defense against Xanthomonas citri subsp. citri. Plant Biotech J 9:394-407）。

カロースは、発生並びに生物的及び非生物的ストレスの間に様々な組織内で合成される、β１，３‐グルカンである（Chen, X.Y. and Kim, J.Y. (2009). Callose synthesis in higher plants. Plant Sig Behav 4(6):489-492）。師要素の篩板におけるカロースの沈着は、師部内での光合成産物の流れを阻害し、葉緑体内のカロースの過剰蓄積につながり、これはＨＬＢ等の細菌感染中の樹木の枯死に寄与する（Koh, H. et al. (2012). Silent Information Regulator 2 (Sir2) and Forkhead Box O (FOXO) Complement Mitochondrial Dysfunction and Dopaminergic Neuron Loss in Drosophila PTEN-induced Kinase 1 (PINK1) Null Mutant. J Biol Chem 287(16):12750-12758）。全ての植物は、１２～１４のカロースシンターゼ遺伝子を含み、この遺伝子ファミリーの１つのメンバーであるＣａｌＳ７（シロイヌナズナの遺伝子命名法）は、傷及び様々な病原体に応答して師部の篩孔に急速にカロースが沈着する主な原因である（Xie et al. (2011). CalS7 encodes a callose synthase responsible for callose deposition in the phloem. Plant J 65(1):1-14）。ＧＳＬ７を完全に阻害すると、シロイヌナズナの正常な師部での輸送及び花序の発達の両方に影響があった（Barratt et al. (2011). Callose Synthase GSL7 Is Necessary for Normal Phloem Transport and Inflorescence Growth in Arabidopsis. Plant Physiol 155(1):328-341）。ＣＹＶａＶ系ベクターを利用して、成熟した植物のＣａｌＳ７のＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ及びオレンジの木のオーソログを下方制御することにより、篩板におけるカロースの沈着の低減（ただし排除ではない）の結果を調査する。あるいは、又は更に、上記ベクターは、カロース分解酵素を発現するインサートを提供する。

いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルス及び／又は真菌病原体を標的とするインサートが提供される。いくつかの実施形態では、ＣＶＥＶを直接標的とするｓｉＲＮＡを生成するヘアピンインサートが提供される。というのは、ＣＶＥＶは、ＣＹＶａＶの黄化の影響をわずかに強め、また樹木間でのＣＹＶａＶの輸送を可能にすることが知られているためである。いくつかの実施形態では、ＣＴＶを標的とするヘアピンインサートが提供される。というのは、ＣＴＶは柑橘類の極めて破壊的な（ＣＬａｓに次ぐ）ウイルス病原体であるためである。他の実施形態では、別の柑橘類（又は他の）ウイルスを標的とするインサートが提供される。いくつかの実施形態では、１つ以上の真菌病原体が師部からｓｉＲＮＡを取り込むことができる場合に、このような１つ以上の病原体を標的とするインサートが提供される。

いくつかの実施形態では、ＣＹＶａＶ系（又は他のｉＲＮＡ）ベクターは、伴細胞内での遺伝子発現から発生する植物の表現型の特性を改変するように操作された、１つ以上のインサートを含む。一実装形態では、萎縮症をトリガすることによって、果実の収穫を容易にし、また成長スペースの要件を削減するインサートが提供される。更なる及び／又は他の特色も、必要に応じて標的としてよい。１つ、２つ、３つ、又はそれより多数のインサートを含む本開示のｉＲＮＡベクターは、安定性及び機能性を示す。

本明細書中で言及されている全ての特定された刊行物及び参考文献は、個々の刊行物それぞれの全体が参照によって援用されると具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照によって本出願に援用される。本発明について、その例示的実施形態に関連して説明してきたが、更なる修正が可能であること；並びに本出願が、いずれの変形、使用、又は適合であって、本発明の原理に全体として従っており、また本発明が関係する技術分野の既知の又は慣習的な慣行の範囲内にあるような、及び前述の特徴に適用され得るような、本開示からの逸脱を含む、いずれの変形、使用、又は適合を包含することを意図していることが理解されるだろう。

Claims (43)

1. １つ以上の複製要素及び１つ以上の異種セグメントを含む、一本鎖プラス鎖リボ核酸（ＲＮＡ）ベクターであって、
   前記ＲＮＡベクターは、１つ以上の機能性コートタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び１つ以上の機能性移行タンパク質のＯＲＦを含まない、一本鎖プラス鎖リボ核酸（ＲＮＡ）ベクター。
2. 前記ＲＮＡベクターは、配列番号４及び／又は配列番号５の１つ以上の核酸配列を有する３’キャップ非依存的翻訳促進領域（３’ Ｃａｐ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ：３’ＣＩＴＥ）を含む、請求項１に記載のＲＮＡベクター。
3. 前記３’ＣＩＴＥは、配列番号３の核酸配列を有する、請求項２に記載のＲＮＡベクター。
4. 前記１つ以上の複製要素は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び／又は配列番号１４の核酸配列を有する、１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のＲＮＡベクター。
5. 上記１つ以上の複製要素は更に、配列番号１５及び／又は配列番号１６の核酸配列を有する、１つ以上の保存ポリヌクレオチド配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡベクター。
6. カンキツ葉脈黄化ウイルス（配列番号１）、又はカンキツ葉脈黄化ウイルスの近縁のｉＲＮＡに由来する、請求項１～５のいずれか１項に記載のＲＮＡベクター。
7. 宿主植物内における、全身的な及び師部に限定された移行及び複製が可能である、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡベクター。
8. 感染後少なくとも１か月にわたって、前記宿主植物内での複製、移行、及び／又は翻訳に関して機能的に安定している、請求項７に記載のＲＮＡベクター。
9. 前記１つ以上の異種セグメントは、レポータ分子、ペプチド、及びタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＲＮＡベクター。
10. 前記ポリペプチドは殺虫剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤、又は抗真菌剤である、請求項９に記載のＲＮＡベクター。
11. 前記抗細菌剤は酵素抗生物質である、請求項１０に記載のＲＮＡベクター。
12. 前記抗細菌剤は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ種の細菌を標的とする、請求項１０又は１１に記載のＲＮＡベクター。
13. 前記Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ種はＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ（ＣＬａｓ）である、請求項１２に記載のＲＮＡベクター。
14. 前記１つ以上の異種セグメントは、ノンコーディングＲＮＡ小分子及び／又はＲＮＡ干渉分子を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＲＮＡベクター。
15. 前記ノンコーディングＲＮＡ小分子及び／又は前記ＲＮＡ干渉分子は、昆虫ベクター、ウイルス、又は真菌を標的とする、請求項１４に記載のＲＮＡベクター。
16. 前記ノンコーディングＲＮＡ小分子及び／又は前記ＲＮＡ干渉分子は、前記昆虫ベクター、前記ウイルス、又は前記真菌の核酸を標的とする、請求項１５に記載のＲＮＡベクター。
17. 前記ウイルスは、カンキツベインエネーションウイルス（ＣＶＥＶ）及びカンキツトリステザウイルス（ＣＴＶ）からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載のＲＮＡベクター。
18. 前記１つ以上の異種セグメントは、第２の１つ以上の異種セグメントを更に含む第１の異種セグメントであり、
    前記１つ以上の複製要素は、前記第１の異種セグメントと前記第２の異種セグメントとの間にある、請求項１～１７のいずれか１項に記載のＲＮＡベクター。
19. 前記１つ以上の異種セグメントは、表現型の特色を改変するタンパク質又はペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のＲＮＡベクター。
20. 前記表現型の特色は、農薬耐性、除草剤耐性、昆虫耐性、カロース産生の減少、成長速度の上昇、及び萎縮症からなる群から選択される、請求項１９に記載のＲＮＡベクター。
21. 請求項１～２０のいずれか１項に記載のＲＮＡベクターを含む、宿主植物であって、
    前記宿主植物は、植物全体、植物器官、植物組織、又は植物細胞である、宿主植物。
22. 前記宿主植物は、ミカン属、ブドウ属、イチジク属、及びオリーブ属からなる群から選択される属のものである、請求項２１に記載の宿主植物。
23. 前記宿主植物は、柑橘類の樹木又は柑橘類の樹木の移植片である、請求項２２に記載の宿主植物。
24. 請求項１～２０のいずれか１項に記載のＲＮＡベクターに感染した植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞を含む、組成物。
25. 前記植物は、ミカン属、ブドウ属、イチジク属、及びオリーブ属からなる群から選択される属のものである、請求項２４に記載の組成物。
26. 前記植物は、柑橘類の樹木又は柑橘類の樹木の移植片である、請求項２５に記載の組成物。
27. １つ以上の異種セグメントを宿主植物に導入する方法であって、
    前記方法は、前記宿主植物に、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＲＮＡベクターを導入するステップを含む、方法。
28. 前記導入するステップは、前記ＲＮＡベクターを含む植物の植物器官又は植物組織を、前記導入の前には前記ＲＮＡベクターを含まない別の植物の植物器官又は植物組織に移植するステップを含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ＲＮＡベクターは、前記宿主植物に全身的に感染する、請求項２７又は２８に記載の方法。
30. 植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞中で、１つ以上の異種セグメントを生成するプロセスであって、
    前記プロセスは、前記植物、前記植物組織、又は前記植物細胞に、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＲＮＡベクターを導入するステップを含む、プロセス。
31. 前記植物は、ミカン属、ブドウ属、イチジク属、及びオリーブ属からなる群から選択される属のものである、請求項３０に記載のプロセス。
32. 請求項１～２０のいずれか１項に記載ＲＮＡベクターを含む、キット。
33. １つ以上の異種セグメントを、植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞に導入するための、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＲＮＡベクターの使用。
34. ＲＮＡベクターを、導入の前には前記ＲＮＡベクターを含まない植物器官又は植物組織に導入するための、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の宿主植物の使用、又は請求項２４～２６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
35. 前記導入は、前記ＲＮＡベクターを含む植物の植物器官又は植物組織を、前記ＲＮＡベクターを含まない別の植物の植物器官又は植物組織に移植するステップを含む、請求項３４に記載の使用。
36. 植物と共に使用するためのベクターを作製する方法であって、
    前記方法は、１つ以上の異種セグメントをＲＮＡに挿入するステップを含み、
    前記ＲＮＡは：ＣＹＶａＶ；ＣＹＶａＶの近縁種；ＣＹＶａＶと少なくとも７０％のＲｄＲｐ同一性を有する他のＲＮＡベクター；及び別のｉＲＮＡからなる群から選択される、方法。
37. 請求項３６に記載の方法によって生成されるベクター。
38. ベクターとしてのＲＮＡの使用であって、
    前記ＲＮＡは：ＣＹＶａＶ；ＣＹＶａＶの近縁種；ＣＹＶａＶと少なくとも７０％のＲｄＲｐ同一性を有する他のＲＮＡベクター；及び別のｉＲＮＡからなる群から選択される、使用。
39. 前記ＲＮＡは、植物の治療、例えば植物のウイルス又は細菌感染の治療、例えば柑橘類植物のＣＴＶ感染又はカンキツグリーニング病の治療に使用される、請求項３８に記載の使用。
40. 前記ＲＮＡは、挿入された１つ以上の異種セグメント、例えば酵素抗生物質によって改変される、請求項３８又は３９に記載の使用。
41. 植物の病気又は状態の治療のための薬剤の製造におけるものであることを特徴とする、ＲＮＡの使用であって、
    前記ＲＮＡは：ＣＹＶａＶ；ＣＹＶａＶの近縁種；ＣＹＶａＶと少なくとも７０％のＲｄＲｐ同一性を有する他のＲＮＡベクター；及び別のｉＲＮＡからなる群から選択される、使用。
42. 前記病気又は状態は、植物のウイルス又は細菌感染、例えば柑橘類植物のＣＴＶ感染又はカンキツグリーニング病である、請求項４１に記載の使用。
43. 薬剤としての、又は植物の病気若しくは状態の治療における使用のための、ＲＮＡであって、
    前記ＲＮＡは：ＣＹＶａＶ；ＣＹＶａＶの近縁種；ＣＹＶａＶと少なくとも７０％のＲｄＲｐ同一性を有する他のＲＮＡベクター；及び別のｉＲＮＡからなる群から選択される、ＲＮＡ。
    

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