MX2013004623A - Metodos para obtener plantas geneticamente modificadas resistentes a bacterias fitopatogenas que crecen en sus tejidos vasculares. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la generación de plantas transgénicas con resistencia a infecciones causadas por microorganismos restringidos al floema y que comprende la inducción de la expresión de una proteína quimérica ó de fusión que comprende una proteína de floema de Citrus aurantifolia (CsPP16), un péptido linker y un péptido con actividad antimicrobiana, por ejemplo con actividad antibacteriana ó una enzima hidrolítica antibacteriana. La porción de la proteína de fusión que corresponde a la proteína CsPP16 puede ejercer su función de movimiento simplásmico el cual ocurre a través de plasmodesmos de la planta hasta llegar a los tubos cribosos del floema, mientras que la porción antimicrobiana puede actuar para eliminar al microorganismo que se establece en el floema. La invención permite controlar por ejemplo la enfermedad causante de amarillamiento de los cítricos o Huanglongbing (HLB), aplicándose también al tratamiento de otras enfermedades causadas por bacterias y otros microorganismos que se establecen en el tejido vascular de las plantas superiores. La invención abarca los vectores moleculares diseñados que portan y expresan a la proteína de fusión, así como las plantas transgénicas obtenidas con expresión estable de dicha proteína de fusión y el método de transformación de plantas adultas, sanas o enfermas para expresar las proteínas quiméricas y controlar por ejemplo la enfermedad de HLB. Siendo la transformación de plantas enfermas con la proteína de fusión un método para producir brotes sanos libres del microorganismo causante de la enfermedad, por ejemplo libres de la bacteria causante de HLB.

Description

i ; Métodos para obtener plantas genéticamente modificadas resistentes a bacterias fitopatógenas que crecen en sus tejidos vasculares i Campo de la invención. ; I La presente invención se refiere al campo de aplicación de técnicas de biología molecular para generar plantas resistentes a microorganismos fitopatógenos que residen en el tejido vascular de plantas, a ¡través de la expresión de proteínas con actividad antimicrobiana fusionadas traduccionalmente a proteínas con capacidad de movimiento supracelular y sistémico. En una de sus modalidades, la invención se refiere a métodos para controlar a la bacteria causante de amarillamiento de los cítricos o Huanglongbing (HLB), mediante la expresión constitutiva y tejido específico de proteínas antimicrobianas fusionadas a proteínas vasculares de movimiento simplásmico. ¡ Antecedentes de la invención.

Huanglongbing (literalmente "dragón amarillo", en chino) es una enfermedad de cítricos que ha cobrado gran importancia en México; también se le conoce por las iniciales HLB y por el nombre en inglés Greening o Ex-Greening. La enfermedad es bastante destructiva, ya que causa pérdidas totales en la producción en cítricos. , Los síntomas de HLB incluyen, pero no están restringidos a un amarillamiento de las hojas] menor producción de frutos, y prácticamente ausencia de semillas en éstos (figura 1). Por otra parte, y de1 manera coincidente con la inmensa mayoría de enfermedades en plantas de interés agrícola, no existe un tratamiento eficaz para HLB. Por tal razón un diagnóstico temprano es de suma importancia, así como un tratamiento sería esencial para revertir la enfermedad. Cabe destacar que esta enfermedad se ha expandido rápidamente a diferentes partes del mundo desde su detección en Asia oriental, donde actualmente se ha detectado en Florida y en México. Además se considera como la principal amenaza a la producción de cítricos a nivel mundial (www.senasica.sagarpa.gob.mx).

La enfermedad HLB fue reportada inicialmente en China en 1929, la cual se ha diseminado rápidamente, pues en 1947 fue detectada en Sudáfrica, siendo un problema importante en la producción de cítricos en Taiwán desde 1951. Desde entonces se encuentra diseminada sobre todo en regiones productoras de cítricos tanto tropicales como subtropicales, incluida Florida, EE.UU. desde 1998. En el caso de México, ya se ha reportado en varias regiones productoras del país a partir de 2009, desde Sinaloa hasta Campeche. Es probable que esta enfermedad ya se encuentre presente en otras regiones productoras de cítricos en i México, por lo que resulta prioritario su control. j ¡ i En el caso de México existen 23 Estados productores de cítricos, en 13 de los cuales ya ha sido detectada la bacteria causante de HLB y al insecto vector que la transmite. Este problema fitosanitario es muy importante ya que los cítricos se cultivan en 549 mil hectáreas, con una producción de siete millones de toneladas anuales, cuyo valor asciende a $10,206 millones de pesos (SENASICA, 2011) i Entre los cítricos susceptibles a ser infectados por HLB, los síntomas más graves se dan en limón mexicano, naranjos (Citrus sinensis), mandarinas (Citrus reticulata) y tángelos (Citrus reticulata x Citrus paradisi), ¡ mientras que los síntomas menos graves se manifiestan en los limones (Citrus limón) y toronjas (Citrus I paradisi), Citrus limonia, Citrus limettioides (McCIean & Schwarz, citados en EPPO quarantine pest, ¡1990).

I Sin embargo, a nivel mundial la lista de plantas infectadas es mayor, donde a continuación se listan las t especies susceptibles (Halbert y Manjunath, 2004): Aeglopsis chevalieri Swingle, Atalantia missionis' Oliver, Balsamocitrus dawei Stapf., Calodendrum capensis Thunb, Catharanthus roseus (L.) G. Don X Citroncirus webberi J. Ingram & H.E. Moore,Citrus amblycarpa Ochse, Citrus aurantiifolia (Christm.) Swingíe,Citrus aurantium L, Citrus depressa Hayata, Citrus grandis (L.) Osbeck, Citrus hassaku Hort. ex Tanaka, Citrus hystrix DC, Citrus ichangensis Swingle, Citrus jambhiri Lushington, Citrus junos Sieb. ex Tanaka, Citrus kabuchi Hort. ex Tanaka, Citrus limón (L.) Burm., Citrus x limonia Osbeck, Citrus x nobilis Lour. "Ortqnique", Citrus máxima (pomelo/shaddock), Citrus x nobilis Lour., Citrus oto Hort. ex Tanaka, Citrus x paradisi Macfad., Citrus reticulata Blanco, Citrus sinensis (L.) Osbeck, Citrus sunki Hort. ex Tanaka, Citrus unshiu (Mack.) Marc, Clausena indica Oliver, Clausena lansium (Lour.) Skeels, Cuscuta australis R. Br. (Convolvulaceae, Cuscutaceae), Fortunella spp., Limonia acidissima L., Microcitrus australasica (F.J. Muell.) Swingle, Murraya koenigii (L), Murraya paniculata (L.) Jack, Poncirus trifoliata (L.) Raf., Swinglea glutinosa (Blanco) Merr., Toddalia lanceolata Lam, y Triphasia trifolio (Burm. f) P. Wilson. j Así mismo, los posibles no hospederos incluyen Citrus indica Tanaka, Citrus limetta Risso, ¡y Citrus macroptera Montrons (Gómez (2008). ' Se reconoce que la etiología de la enfermedad es bacteriana (liberibacterias); sin embargo, hay diferentes variedades asociadas (tabla 1). Se ha encontrado que HLB es transmitida por insectos pertenecientes al grupo de los psílidos (Hemíptera), que incluye otros vectores importantes, tales como por ejemplo la mosquita blanca y áfidos. De manera semejante a otras enfermedades transmitidas por vectores, lina de las estrategias usadas para el control de esta enfermedad es precisamente el control de los vectores asociados a ella. Si bien no se conocen con precisión los mecanismos por los cuales los psílidos transmiten a la bacteria causante de HLB, es evidente que estos insectos son capaces de transmitirla de manera sumamente eficiente. Por otra parte, los psílidos transmiten patógenos de manera semejante a los áfidos, por lo que cabe esperar que los detalles de la transmisión de esta bacteria sean semejantes a otros patógenos restringidos al floema. También son capaces de transmitir virus, lo que hace aún más necesario el control de estos vectores.

Tabla 1. Bacterias asociadas a Huanglongbing (HLB)*.

Vector Agente Hospedero Característica Distribución natural Liberibacter asociado a HLB a Citrus spp.; transmisible a Catharantus roseus), México, Gram negativa, Diaphorina tabaco (Nicotiana Asia, Candidatos no cultivable, citri tabacum) Arabia Liberibacter restringida a (psílido jitomate, [Lycopersicon saudita, asiaticus tejido vascular, asiático esculentum) a través de Florida, tolerante al calor de los cítricos) plantas parásitas (Cuscuta Brasil campestrís) b Liberibacter de hospederos no rutáceos 97% de similitud Bactericera en secuencia con Candidatus Texas, Cockerell Candidatus Liberibacter Solanáceas Guatemala, (Psílido de Liberibacter causante psyllarous México las papas de "zebra crup" y jitomates) en papas Fitoplasma asociado con HLB Restringido a tubo criboso, sin pared celular, con 99% de Fitoplasma c Citrus, Crotolaria júncea Brasil Desconocido 1 homología j en DNA al fitoplasma , escoba de bruja del I chícharo (16Sr IX) ¡ Fitoplasma d Citrus China Desconocido Referencias: * Strategic Planning for the Florida Citrus Industry: Addressing Citrus Greening; a j Bové et al., 1974; Garnier y Bové, 1983; Jagoueix et al., 1994, 1997; Garnier et al., 2000, ¡' Duan et al., 2008; b Gudmestad y Secor, 2007; Hansen et al., 2008; Lin et al., 2009; c Teixeira : et al., 2008; Wulffet et al., 2009; d Chen et al., 2009. I Uno de los vectores de la bacteria Candidatus Libéribacter spp causante de HLB es Diaphorínb citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae); este insecto tiene un período embrionario que varía de 9.7 días a 15°C a 3.5 días a 28°C; los huevos son colocados en el extremo de los brotes tiernos de la planta, sobre y! entre hojas tiernas desplegadas, apareciendo con frecuencia un gran número en una misma ramita; la oviposición está condicionada a la presencia de brotes tiernos, donde la hembra alcanza a poner 800 huevos en toda su vida, siendo las ninfas sedentarias y se establecen sobre las ramitas tiernas y sobre los pecíolos, formando i colonias con un número variable de individuos. Las ninfas excretan una sustancia blanca cerosa a manera de hilos que se deposita sobre las hojas, mientras que los adultos tienen poca capacidad para sostener vuelos muy largos, pero pueden ser transportados a grandes distancias por las corrientes de aire. La duración del ciclo biológico del insecto (huevo-adulto) varía de 14.1 a 49.3 días a 28°C y 15°C, respectivamente, siendo las temperaturas de 25 a 28°C las más adecuadas para su desarrollo, ya que el psílido no se desarrolla a temperaturas de 33°C y 10°C. El insecto presenta un pico poblacional al final de la primavera e inicios del i verano (coincidente con el período de brotación de los cítricos). La presencia del psílido no implica que esté infectado con la bacteria, aunque en el caso de México, existen ambos elementos.

Se ha determinado que HLB es causada por un grupo de bacterias que forman un ciado coherente, denominadas de forma general Candidatus Libéribacter, Candidatus Libéribacter asiaticus, Candidatus Libéribacter africanus y Candidatus Libéribacter americanus. En México se ha descrito que Candidatus I Libéribacter asiaticus es la bacteria que es transmitida por el psílido Diaphorina citri y está presente en la familia de las rutáceas, aunque hay reportes también de la existencia de Candidatus Libéribacter psyllaurous, cuya planta hospedante son las solanáceas. En Brasil y China se han descrito fitoplasmas asociados a HLB, también restringidos al sistema vascular de las plantas infectadas. i Estos grupos bacterianos a la fecha no han podido ser cultivados, lo que ha impedido una mayor caracterización de estos patógenos. Si bien la relación taxonómica de Candidatus Libéribacter spp. con otros i grupos no es completamente clara, las secuencias de DNA disponibles indican que se trata de üna alfa-proteobacteria. La información disponible permite suponer que se encuentra relacionada con rhizobacterias í como Bradyrhizobium, y, de forma un poco más distante, con Agrobacterium. Estos grupos bacterianos tienen una pared celular compuesta con peptidoglicana y por lo tanto, podrían ser susceptibles a enzimas que la destruyen como la lisozima. i Las bacterias Candidatus Libéribacter (CaL) se restringen al floema de su huésped; existen una gran' variedad de patógenos de plantas que también se acumulan en el floema, o bien están restringidos a este tejido, desde virus (como por ejemplo, geminivirus y luteovirus) hasta bacterias (por ejemplo, fitoplasmas principalmente). El caso de hongos ha sido poco estudiado, pero es posible que muchos endófitosicolonicen el floema. El conocimiento de la función de este tejido es esencial para desarrollar estrategias para el control de estos patógenos. ; Cabe resaltar que las bacterias Gram negativas son susceptibles a lisozima en condiciones de alta presión hidrostática (por ejemplo, amortiguador con 10 mM de fosfato de potasio ( arsschalk et al., 2001), condición que es encontrada en el floema de la planta. Los síntomas que ocasiona su infección en ocasiones son confundidos por deficiencias nutricionales, pero conforme avanza la infección la asimetría !de las manchas cloróticas presentes en esta enfermedad se distingue de las manchas simétricas a ambos lados de las nervaduras centrales, precisamente productos de una deficiencia nutricional (figura 1).

En particular, la acumulación en el floema de estos patógenos parece causar la mayor parte de la sintomatología observada. El análisis ultraestructural de tejido infectado ha demostrado que el libi-e flujo del floema es bloqueado por depósitos masivos de callosa (beta 1-3 glucanasa) en las placas cribosas. Los órganos de la planta que están interconectadas a través de los haces vasculares bloqueados desarrollan clorosis; esto seguramente causa una menor tasa en el crecimiento de las plantas infectadas. La i acumulación de callosa podría ser una respuesta descontrolada a la presencia de estas bacterias en el floema, lo que también sugiere un tratamiento en contra de esta enfermedad (es decir, inducir la expresión de glucanasas en el floema, por ejemplo). ¡ El movimiento de los solutos del floema se debe a una diferencia de presión entre los tejidos fuente y los tejidos consumidores que están interconectados, ya que en éstos los solutos, sobre todo sacarosa y otros Í azúcares, así como aminoácidos son rápidamente consumidos, resultando en una entrada de agua en estas células por osmosis, y la consecuente dilución de los solutos, además existe una mayor acumulación de solutos por fijación de carbono en los tejidos fuente. La interconexión entre ambos tejidos permite el movimiento de solutos entre estos tejidos. El floema es, asimismo, conducto por el que señales químicas son transportadas entre órganos distantes, involucradas en su comunicación, donde dicha comunicación es necesaria para coordinar el crecimiento y desarrollo de plantas vasculares, tanto en respuesta a un programa genético como de estímulos externos.

El transporte en el floema se encuentra alterado en plantas infectadas con Candidatus Liberibacter, en i particular el transporte simplásmico que ocurre a través de los canales citoplasmáticos o plasmodésmos. La infección por Candidatus Liberibacter ocasiona una excesiva acumulación de almidón en las hojas, esto es reminiscente de mutantes en la función del transporte simplásmico a través del floema, como por ejemplo sxd en maíz (Provencher et al., 1999). La mutante sxd tiene un defecto en la movilización de azucares vía I simplásmica, lo cual hace que los azúcares se polimericen a almidón, dando el síntoma de moteado difuso asimétrico, como el encontrado en cítricos enfermos con HLB. ! I í Para la comprensión de la enfermedad HLB, también es importante describir las funciones y estructuras de los tejidos conductores de las plantas superiores cuya especialización les han conferido ventajas evolutivas, donde este tejido se conforma del xilema (conductor unidireccional de agua y minerales) y del floema, que transloca fotoasimilados, minerales, proteínas y ácidos nucleicos y que consta fundamentalmente de dos tipos celulares, la célula acompañante (CA) y el elemento criboso (EC) que puede ser un tubo criboso !(TC), y que están interconectadas entre sí por medio de plasmodesmos modificados. El tejido vascular en angiospermas se diferencia a partir de células de cambium, las cuales sufren una división longitudinal asimétrica (Esau, 1953) para posteriormente en maduración perder el núcleo y dar lugar al tubo cribóso, En la figura 2 se esquematiza el tejido vascular de plantas superiores, así como la ontogenia de un tubo criboso y su relación con la célula acompañante. En la figura 3 se puede observar la presencia de la bacteria en los tubos cribosos (TC) donde en este sitio se establece y coloniza, mientras que en la figura 4 se presenta la estructura del plasmodesmo (PD) que es la conexión simplásmica entre el tubo criboso y la célula acompañante, donde la micrografía muestra su aspecto cuando está obstruido por material fibrilar y amorfo debido a la infección. La identificación bioquímica de estos depósitos de material fibrilar sugiere! que se trata de beta 1-3 glucana (callosa) y proteína "cicatrizante" denominada PP2, donde ambas moléculas son ? sintetizadas y depositadas en los plasmodesmos como una reacción de hipersensibilidad.

Los plasmodesmos son canales que atraviesan la membrana y la pared celular, no son pasivos, son especializados y actúan como compuertas que facilitan y regulan la comunicación y el transporte ele agua, nutrientes, metabolitos y macromoléculas entre las células vegetales; contienen una forma del¡ retículo endoplásmico apresado que interconectan virtualmente todas las células vegetales, con excepción de las células guarda. Los plasmodesmos parecen permitir el movimiento de moléculas de hasta 30 kD entre ambos tipos celulares; en contraste, los plasmodesmos interconectando las células de mesófilo tienen un límite de exclusión de 1 kD aproximadamente.

Los mecanismos de transporte de macromoléculas a través del plasmodesmo son complejos. El modelo descrito por Haywood y col. 2004, considera la presencia de moléculas estructurales y facilitadoras de la translocación, donde una proteína de reconocimiento de la naturaleza sistémica de moléculas forma un complejo que es reconocido por una proteína anclada al Inicio del plasmodesmo; debe existir! una gran diversidad de complejos para reconocer a las familias tan diversas en secuencia que son capaces de atravesar esta barrera simplásmica; moléculas tipo chaperonas desdoblan a las proteínas e !inician su i translocación al tubo criboso. El control del sistema es ejercido por el núcleo, que transcribe RNAs codificantes para proteínas de naturaleza supracelular, las moléculas se pliegan después ¡ de haber atravesado el plasmodesmo y son a su vez reconocidas por otras moléculas que presumiblemente les indicarán su tejido blanco. Se han descubierto un gran número de proteínas que tienen la capacidad de í desplazarse a través de los plasmodesmos, aumentando su límite de exclusión, donde algunas de estas proteínas tienen la capacidad de unir a RNA de manera más bien inespecífica, mientras que en otros casos se ha demostrado su papel en la comunicación a larga distancia en el fenómeno de inducción floral; también se tienen antecedentes de la capacidad del RNA para atravesar un heteroinjerto y alcanzar tejidos distantes tales como meristemos florales y vegetativos como se reporta para calabaza por Ruíz-Medrano y col (Í999).

I Debido a las restricciones espaciales del plasmodesmo existe un límite de exclusión molecular como ya se i ha mencionado, sin embargo, la presencia de proteínas de peso molecular superior de 1 hasta 250j kD así como de RNAs sugiere que el transporte es altamente selectivo y regulado por mecanismos todavía no claramente conocidos en la entrada del plasmodesmo. La naturaleza de las señales químicas involucradas se desconoce en su mayoría, aunque en el floema se han encontrado diversas moléculas que podrían constituir tales señales; entre ellas cabe mencionar a las fitohormonas y otras moléculas de bajo peso molecular, lípidos, proteínas y una gran diversidad de especies de RNA. ! I En la actualidad se desarrollan estrategias experimentales para el tratamiento de HLB que incluyen la i aplicación de pesticidas para el control del vector, sin embargo su toxicidad y actividad residual limita su aplicación, mientras que el empleo de antibióticos que logren ser distribuidos sistémicamente dentro del floema, tiene la limitante de que su aplicación necesariamente debe ser continua lo que implica una inversión considerable para esta estrategia. j Para controlar el bacterias, o bien celular de bacterias. Aunque el resultado fue una marcada reducción de síntomas, se desechó el uso del bacteriostático tetraciclina por la fitotoxicidad presentada, además que el uso de antibióticos en plantas y animales que son para consumo humano no es recomendado. j Se ha obtenido recientemente la secuencia del genoma de Candidatus Liberíbacter asiaticus, así como de una bacteria estrechamente relacionada Candidatus Liberíbacter ZC, que ocasiona la enfermedad jen papa conocida como Zebra chip; ambas presentan una elevada semejanza entre sí (Hartung et al., 2011; Lin et al., 2011); sin embargo, la comparación de las secuencias disponibles de ambos patógenos sugiere rearreglos divergentes en sus genomas, en los que la ganancia y pérdida de material genético ha contribuido a diferencias en sus respectivos genomas. De cualquier forma, la información disponible indica claramente que Candidatus Liberíbacter conforma un ciado compacto con un "estilo de vida" adaptado al floema de plantas, que incluye por ejemplo una capacidad limitada de síntesis de ciertos aminoácidos ! y ácidos nucleicos. La comparación con el genoma de una rhizobacteria, Sinorhizobium meliloti, indica que, si bien ambas bacterias están claramente emparentadas, Candidatus Liberíbacter presenta un genoma más pequeño, con un contenido de A/T mucho más elevado, y con una capacidad potencial de reparar DNA I I limitada deducida de la ausencia de dominios de exonucleasa en su DNA polimerasa y la presencia de un solo gen para DNA ligasa, contra 10 genes de 5. meliloti (Hartung et al., 2011).

Los estudios indican la susceptibilidad a antibióticos beta-lactámicos que tiene C. Liberibacter ZC, lo que indica que su pared celular es semejante a la de otras bacterias que presentan peptidoglicano, y por tanto susceptible a la enzima lisozima. Por otra parte, C. Liberibacter asiaticus presenta claramente una pared celular típica de bacterias Gram negativas, lo que también indica que el tratamiento con antibióticos beta lactámicos es posible, lo cual es una estrategia que está utilizándose de manera experimentad en la Universidad de Florida y USDA para el control de esta bacteria (Bové, 2006). j Otra estrategia que se ha considerado es la de inducir la expresión de genes involucrados en resistencia sistémica adquirida o de respuesta a patógenos. Sin embargo, desde el punto de vista comercial no es deseable, ya que las plantas de manera general reducen su productividad en situaciones de estrés. Estrategias paralelas han considerado el silenciamiento de genes clave en el insecto vector. El RNA de interferencia (RNAi) expresado en planta para controlar psílidos, sería expresado en la planta, de manera que el vector al momento de alimentarse de la planta, el RNAi se introduciría al vector, apagando genes esenciales en el insecto y así causando la disminución de su población. | Diversas estrategias se han propuesto para el control de bacterias que viven en el dominio simplásmico y específicamente del agente causal de HLB. Diversos laboratorios, principalmente en los Estados Unidos han propuesto diferentes estrategias para controlar a la bacteria Candidatus Liberibacter. Por ejemplo, la transformación genética de cítricos se ha realizado exitosamente a través de técnicas mediadas por i Agrobacterium tumefaciens y biobalística. La tabla 2 describe la expresión de diferentes genes dé interés agronómico, por ejemplo en especies de cítricos. ! A la fecha, la utilización de péptidos antimicrobianos, la inducción de la respuesta inmune innata y él uso de RNA de interferencia contra psílidos se han empleado con resultados limitados. Algunos ejemplos de i péptidos antimicrobianos son el péptido mieloide antimicrobial, Beta-defensina-1, Polifeniusina-1, Taquiplesina, Protegrina-1, Magainina, Indolicidina (de origen animal); Cecropinas, Sarcotoxina IA, Pirrocoricina (originados de Insectos) y Defensinas que son de origen vegetal. La expresión de estas moléculas ha sido ya evaluada, sin embargo los resultados no han producido los efectos deseados de control. 1 En la actualidad existen numerosos protocolos para la transformación genética de plantas con] fines de control de enfermedades. ¡ Por ejemplo, la patente US6455759 se refiere a la producción de múltiples proteínas en una planta i transgénica, e incluye la construcción de DNA que expresa dos proteínas de fusión unidas por un linker y que son escindidas por enzimas de la planta quedando ambas proteínas libres. ¡ I I La patente US7196057 se refiere a la producción de proteínas de fusión para proteger plantas de insectos patógenos, donde una parte de estas proteínas es tóxica para el insecto y la otra en parte transloca a la Tabla 2. Expresión de diferentes genes de interés agronómico en especies de cítricos*.

Nombre común Nombre científico Gene introducido Referencia Genes asociados al Kayim et al, 2004 tizón de los cítricos Citrus sinensis x Citrange carrizo HAL2 Cervera, et al, 2000 Poncirus trifoliata LEAFY Peña et al, 2001 APETALA1 Genes de biosíntesis Costa et al, 2002 de carotenoides Toronja C. paradisi Proteína de la Moore, et al, 2000 cápside de VTC Genes de VTC Febres, et al, 2003 Proteína de la Limón mexicano C. aurantifolia Domínguez et al., 2000 cápside de VTC C. reticulata Gen quimérico de Mandarína pokan Li et al., 2002 Blanco ribonucleasa Gen bO Limón Rangpur C. limonia Azevedo et al., 2006 (bacteriopsina) Proteína de la Gutiérrez-E et al., 1997; Naranja agria C. aurantium cápside de VTC Ghorbel et al., 2000 Poliproteína de la Iwanami et al., 2004 cápside pCP Citrus FT (CiFT) Endo et al., 2005 Naranja trifoliada P. trifoliata Factor de crecimiento Kobayashi et al., 1996 epidermal humano aneyoshi y rolC Kobayashi, 1999 Versión truncada de Piestun et al., 2000 C. sinensis x VTC y gen Bar Citrange Troyer P. trifoliata Gentile et al., 2002, Genes rolABC Cirvilleri et al., 2005 Gen de petina Naranja valenciana C. sinensis Guo ert al., 2005 metilesterasa í Limón del oeste Genes para disminución Citrus aurantifolia Koltunow et al., 2000 i de la India de semillas misma toxina a través del intestino del insecto, mencionándose solo la posibilidad de obtener plantas transgénicas que expresen los vectores de estas proteínas de fusión sin mostrar pruebas de su desempeño. La solicitud de patente WO2009/064255 se refiere al uso de una señal de anclaje que localiza a proteínas de fusión a los apoplastos de los elementos vasculares de una planta, lo cual puede ser útil para producir proteínas de secreción en las células de plantas transgénicas diseñadas con este fin como biorreactor s. La solicitud de patente W099/28484 se refiere a un método para generar resistencia a patógenos en la descendencia de una planta que consiste en expresar una proteína de fusión que comprende un ( primer dominio con actividad anti-patógena, un linker y un segundo dominio también con actividad anti-patógena; I describe también las construcciones de expresión, la expresión en E. coli, su introducción en Agrobacterium sp para mediar la transformación de plantas y su desempeño contra nemátodos patógenos.

A pesar de lo anterior, es indispensable contar con métodos y/o estrategias eficientes de control de enfermedades de plantas, causadas por microorganismos que invaden el floema de las mismas, ya que hasta antes de la presente invención no existían procedimientos efectivos para su combate y/o control.

I Breve descripción de la invención.

La presente invención describe métodos eficientes para el tratamiento de enfermedades causadas por microorganismos patógenos que invaden el floema de las plantas. Específicamente la invención describe la transformación genética de explantes de cítricos transformados con Agrobacterium tumefaciens conteniendo el gen CsPP16 de cítricos, que es homólogo al CmPP16 probado en calabaza (Xoconostle-Cázares et al., 1999). Este gen CsPP16 se fusionó traduccionalmente a péptidos antimicrobianos seleccionados del grupo que comprende alfa-defensina humana, lisozima humana, indolisina, mágainina, cecropina, sarcotoxina, lisozima y mezclas de las mismas. Para este fin se empleó un "hinge" o bisagra que permite que las proteínas CsPP16 y los péptidos antimicrobianos se doblen de manera independiente. Conforme a la presente invención, las proteínas empleadas en el control de bacterias patógenas presentes en el floema son fusionadas hacia el extremo amino con la bisagra y la proteína de movimiento supracelular CsPP16. ! Todas las construcciones genéticas descritas aquí contienen como promotor 1 al promotor d35S! del virus del mosaico de la coliflor CaMV 35S y como secuencia terminadora a la secuencia NOS. Adicionalmente, otro grupo de construcciones contienen al promotor de expresión específica en floema 59880 de Arabidopsis thaliana (Ruiz-Medrano et al., 2011) dirigiendo la expresión de los antimicrobianos peptídicos mencionados anteriormente, lo cual permite la expresión solamente en el tejido vascular, ídonde se encuentra por ejemplo, la bacteria fitopatógena. Todas las construcciones descritas aquí contienen los i bordes izquierdo y derecho del T-DNA de Agrobacterium en sus extremos, y carecen de marcadores de selección (figura 24).

El primer método de transformación con las construcciones anteriormente descritas, comprende por ejemplo la transformación genética de tallos y brotes de cítricos, los cuales se regeneran in vitro hasta obtener una plántula genéticamente modificada, la cual es injertada en un portainjerto o patrón, por ejemplo de naranja agria de las variedades macrophylla o volkameriana. El patrón puede provenir de una plántula de al menos un centímetro, proveniente de la germinación por ejemplo de una semilla de naranja agria, o bien el patrón es una planta joven de cítricos, a la cual, se le injerta lateralmente la yema i genéticamente modificada para su crecimiento. | El segundo método de transformación con las construcciones anteriormente descritas, comprende promover la generación de pequeñas áreas genéticamente transformadas de plantas adultas, sean sanas o enfermas con la bacteria que produce HLB. Este consiste en exponer el tejido vascular de tallos ó ramas localizadas entre tejidos consumidores y productores (fotosintéticos). Esto se realiza por raspado hasta observar tejido verde fotosintético, donde sobre éste se coloca un algodón humedecido con la solución de Agrobacterium pretratada con acetosiringona y diluida en amortiguador con inductores de crecimiento vegetal (auxinas y citocininas). La planta o rama tratada se coloca en una bolsa para mantener en elevada humedad el parche con la bacteria Agrobacterium tumefaciens hasta por tres días, retirando el apósito después del tratamiento indicado. Las plantas son expuestas a los tratamientos de dos días hasta un mes, i obteniéndose en todos los casos la expresión de los antimicrobianos en los tejidos vasculares y acumulados en los tejidos consumidores, que son los sitios de infección de la bacteria. I Conforme a la presente invención, posterior a la transformación de las plantas enfermas, se monitorea la presencia de la bacteria causante de HLB, la cual disminuye debido a los tratamientos de expresión de los antimicrobianos aplicados solos o en combinaciones. Las plantas enfermas que fueron tratadas mediante la invención recuperaron su fotosíntesis, indicando que los tejidos vasculares ya no estaban bloqueados y que las plantas fueron capaces de florear y llevar a cabo un adecuado llenado de fruto. Por su parte, las plantas i con tratamiento con Defensina florecieron, mostrándose en la figura 21A dos limones obtenidos, de 101 y 84 gramos, los cuales fueron partidos en su eje transversal, mostrando que el mesocarpo es simétrico. Esta apariencia es normal en frutos sanos, en contraste a los infectados, los cuales contienen mesocarípo (gajos) asimétricos (figura 21B). ¡ Los resultados obtenidos en la transformación de plantas enfermas de 1.20 m de altura mediante la presente invención y su evaluación hasta 210 días, muestran una disminución sustancial en los síntomas de la enfermedad HLB así como la recuperación de las condiciones fisiológicas normales de! la planta i (crecimiento, producción de brotes, aumento de fotosíntesis, floración y llenado de frutos) (Figura 17). i Por otra parte, la transformación genética de árboles jóvenes de 1.20 m, certificados en su sanidad, provenientes del vivero certificado Emiliano Zapata, los cuales fueron expuestos a psílidos infectados con la bacteria Candidatus Liberibacter en campo en Tecomán Colima, bajo condiciones de bioseguridad (figura 22), obtuvieron nula o baja cantidad de bacteria, en contraste con los árboles control que fueron transformados con Agrobacterium con plásmidos sin genes codificantes para los antimicrobianos arriba citados. Los árboles descritos fueron expuestos a psílidos infectados con la bacteria Candidatus Liberibacter y fue evaluada la presencia de la bacteria después de 60 días. Dicha evaluación consistió en colectar 2 hojas fotosintéticas maduras y 2 hojas jóvenes, denominadas brotes. Se aisló DNA total de la vena central y se estimó la cantidad de bacteria mediante PC en tiempo real del gen 16S de Candidatus Liberibacter, i empleando sondas fluorescentes. Los valores obtenidos fueron normalizados con el gen endógeno dé limón COX (figura 23) Los resultados obtenidos muestran que en los tratamientos con lisozima, defensina y una combinación de ambos (Lis y Def), la cantidad de bacteria se reduce o no es detectable, en contrastejcon las plantas control que no expresan a los antimicrobianos. ¡ Por otra parte, el segundo método que comprende la transformación de explantes y su regeneración vía cultivo de tejidos conforme a la presente invención, demuestra que las plantas son capaces de regenerarse y son vigorosas. En estos experimentos, se obtuvieron plantas injertadas vigorosas expresando los antimicrobianos anteriormente mencionados, de los cuales se seleccionaron diez transformantes I independientes para futuros ensayos en campo "bajo condiciones de bioseguridad. < i Breve descripción de las figuras. ! Figura 1. Se muestran los síntomas característicos de HLB en árboles (superior izquierda) y én hojas (superior derecha), y síntomas de HLB en hojas y frutas (inferior). Se observan frutos deformes con semillas abortadas y haces vasculares color marrón (Tomado de Strategic Planning for the Florida Citrus Industry, Addressing Citrus (2010).

Figura 2. Se muestra el tejido vascular de plantas superiores. Se observa (izquierda) corte transversal de un haz vascular, (A) ontogenia de un elemento criboso; (B) división longitudinal de células de cambium y (C) crecimiento asimétrico; (D) fragmentación de núcleo y (E) su desaparición; (F) acumulación de cuerpos mucilaginosos y (G) perforación de placa cribosa en un tubo funcional (G). El elemento criboso maduro (derecha) muestra los poros abiertos en la placa' cribosa, bordeados de callosa, y la proteína P dispersa en el citoplasma periférico con RE y plástidos.

Figura 3. Se muestra una micrografía electrónica que muestra la presencia de Candidatus liberibacter sp restringida al floema vascular de un árbol cítrico (Tomado de Strategic Planning for the Florida Citrus Industry, Addressing Citrus (2010)). Se observa célula acompañante (CA), plasmodesmo (PD) y tubo criboso (TC). ! Se muestra la localización y estructura de un plasmodesmo. Se observa (superior) el sitio de la pared donde se encuentra cada poro o desmotúbulo que está atravesado por un plasmodesmo, donde frecuentemente en ese lugar la pared es más gruesa, se atraviesan cisternas del retículo endoplásmico o endoplasmático próximas a la pared y asociadas al plasmodesmo en ambas células. Se observa también (inferior Izquierda) la representación de un tubo criboso (morado) y una célula acompañante (rosa) (inferior derecha) así como una micrografía de transmisión de un plasmodesmo ramificado presente entre la célula acompañante (CA) y tubo o elemento criboso (EC). Nótese el retículo endoplásmico (ÉR) que atraviesa al plasmodesmo. ,' Se muestra evidencia de la capacidad de movimiento de la proteína CmPP16 (Xocpnostle-Cázares et al., 1999). Se observa que (a) la proteína fue microinyectada en células del mesófilo de hojas de Nicotiana benthamiana y fue capaz de moverse de célula a célula; (d y g) cuando la proteína fue acomplejada con RNA, ésta medió el movimiento de RNA a células vecinas. Como controles se muestra el RNA sentido de CmPP16 y RNA2 de RCNMV, los cuales no se translocan fuera de la célula por sí mismos. El movimiento de la proteína marcada con otra molécula fluorescente (TRITC) hacia otras células se muestra en (e) y (h). j Se muestra que CmPP16 se sintetiza en la célula acompañante y viaja al tubo criboso, coincidiendo con la localización de Candidatus Liberibacter. Se observa (izquierda) una imagen ¡ de microscopía confocal de una hibridación in situ, detectando al RNA que codifica para la proteína CmPP16, localizada en el haz vascular (en verde), así como (derecha) la inmunolocalización de la proteína en color morado. Se emplearon anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína CmPP16 y fueron revelados con fosfatasa alcalina cromogénica (produce color morado) (Xoconostle-Cázares et al., 1999).

Transformación de plantas maduras de cítricos. Se muestra la transformación de tallos con A. tumefaciens. Inicialmente (izquierda) se crece el cultivo in vitro en condiciones aerobias de la bacteria conteniendo el gen que codifica las proteínas antimicrobianas. Aparte (centro) se remueve la corteza de los árboles a tránsformar, con el objeto de exponer el tejido vascular. En el esquema (derecha) se muestra que (1) la célula reconoce señales de la planta, que son compuestos de bajo peso molecular, (2) estos compuestos son reconocidos por la bacteria a través de un sistema de dos componentes de fosforelay, (3) se induce la síntesis del T-DNA presente en el plásmido binario, dando como resultado T-DNA de cadena sencilla, el cual forma complejos con proteínas, (5) genes adicionales de virulencia son encendidos, los cuales ayudan a movilizar (6) el T-DNA a la célula vegetal. En este proceso, se inserta de manera estable una copia de T-DNA en el genoma de las células vegetales. i Figura 8. Se muestra el procedimiento de transformación de la presente invención por medio de A. i tumefaciens y A. rhizogenes de plantas maduras de limón mexicano. En el invernadero (superior izquierda) se remueve la corteza del tallo a infectar y (superior derecha) se coloca la solución conteniendo A. tumefaciens o rhizogenes sobre el algodón. Posteriormente (centro i izquierda), este se coloca sobre el tallo, el cual (centro derecha) se envuelve en plástico flexible i y se asegura con una cinta. Las plantas (inferior izquierda) se transfieren a bolsas de plástico I para mantener una elevada humedad relativa, la cual favorece la transformación genética de plantas. Posterior a la transformación (inferior derecha), las plantas se evalúan ' por su capacidad fotosintética, como indicativo de que sus haces vasculares están permeables. J Figura 9. Se muestra el desarrollo de pequeñas áreas fotosintéticas protuberantes a manera de callos en las plantas inoculadas conforme a la presente invención (zquierda). En el panel derjecho se delinearon los tumores con una línea para poderse localizar visualmente.

Figura 10. Se muestra la estimación de fotosíntesis de las plantas tratadas conforme a la presente invención. Se midió la fotosíntesis a 500 micromoles de intensidad luminosa. Los valores de fotosíntesis corresponden a micromoles de C02 fijados por cm^.seg"1. El control corresponde a los valores promedios de cinco plantas infectadas inoculadas con agua. La barra con GUS corresponde a plantas infectadas transformadas con el gen GUS (que codifica a ; la beta- glucuronidasa). La barra DEF corresponde a la transformación con el gen que codifica para la i defensina fusionado con CsPP16, la barra LIS, lisozima-CsPP16 y LYD-CsPP16, la combinación de ambos antibacterianos. Como control positivo se emplearon plantas sanas de limón. Como se muestra, después del tratamiento, las plantas de limón infectadas y transformadas con antimicrobianos, aumentan su capacidad fotosintética. ; Figura 11. Se muestra el número de brotes nuevos en las plantas tratadas conforme a la ¡presente invención. La gráfica indica el tamaño de brotes en plantas tratadas, donde las plantas con brotes más grandes fueron aquellas que recibieron los tratamientos con antimicrobianos conforme a la invención. Los tratamientos fueron: GUS (plantas expresando una' proteína reportera, sin capacidad antimicrobiana), DEF/LIS: Plantas expresando defensina humana fusionada con CsPP16 y Lisozima fusionada con CsPP16, ambos genes se expresan a !partir del promotor CaMV 35S y están flanqueados por los bordes izquierdo y derecho de T-DNA.

Figura 12. La tabla superior muestra el tamaño de los brotes nuevos en las plantas, posteriores al tratamiento indicado. La gráfica inferior indica la longitud promedio de los brotes nuevos. Las plantas con brotes más grandes fueron aquellas que recibieron los tratamientos con antimicrobianos conforme a la presente invención. Se muestra (derecha inferior) el aspecto de los brotes nuevos sin síntomas en plantas tratadas con antimicrobianos. Los tratamientos fueron: GUS (plantas expresando una proteína reportera, sin capacidad antímicrpbiana), DEF/LIS: Plantas expresando defensina humana fusionada con CsPP16 y Lisozima fusionada con CsPP16, ambos genes se expresan a partir del promotor CaMV 35S y están flanqueados; por los ¡ bordes izquierdo y derecho de T-DNA.

Figura 13. Se muestra el aspecto de las plantas tratadas después de 100 días de tratamiento. ¡ Figura 14. Se muestra la comparación de las áreas foliares de las plantas antes y después del tratamiento con los antimicrobianos conforme a la presente invención.

Figura 15. Se muestra el desarrollo de pequeños tumores hiperproductores de antimicrobianos en los tallos de las plantas producidos por la transformación genética conforme a la invenciónj Figura 16. Se muestra la cuantificación de la bacteria Candidatus Liberibacter a 60 días en plantas tratadas con antimicrobianos conforme a la presente invención. Los datos son unidades arbitrarias calculadas por PCR en tiempo real. i Figura 17. Se muestra (A) la detección de Candidatus Liberibacter en plantas adultas infectadas con HLB i mediante PCR cuantitativo. Se midió la carga bacteriana por PCR en tiempo real, los 'datos se normalizaron con el gen endógeno COX de cítricos. Al mayor valor se le asignó ! el valor arbitrario de 1 (plantas no tratadas). El asterisco amarillo muestra el valor que se obtienen en plantas sanas. Los asteriscos rojos muestras las plantas que estando enfermas inicialmente, disminuyeron la carga bacteriana comparable a las plantas sanas. (B) Representación simplificada de la evaluación a 210 días del tratamiento, donde más de un tercio de las plantas están sanas, mientras que los dos tercios restantes han disminuido el 99% del contenido I bacteriano. I i Figura 18. Se muestra el cultivo in vitro de semillas de limón mexicano. Se observa (izquierda) día 1, I (centro) 3ra. semana incubado a temperatura ambiente en la oscuridad y (derecha) 5ta. semana incubado a temperatura ambiente en presencia de luz. ¡ Figura 19. Se muestra el proceso de regeneración de explantes transformados con A. rhizogenes y A. i tumefaciens conforme a la presente invención. Se observan (superior izquierda) explantes en medio de cocultivo, (superior derecha) explantes en medio de regeneración (SRM) por 30 días en condiciones de oscuridad y (inferior) explantes en medio de regeneración (SRM) por 60 días en condiciones de luz- oscuridad. ' Figura 20. Se muestra el desarrollo y regeneración de injerto (izquierda) a 15 días (centro)y 60 días (derecha) después de la generación de injertos en diversos patrones. i Figura 21. Se muestran limones obtenidos de plantas enfermas con HLB y sometidas a tratamiento con el i antimicrobiano defensina conforme a la presente invención. Se observa (A) aspecto de limones i expresando defensina (notar que su peso ,101 y 84 g, es comparado con el peso dé limón comercial de un peso promedio de 90 g; (B) limón sano (izquierda), limón infectado con gajos I desiguales y frutos más pequeños (centro) y limón expresando CsPP16-defensina (derecha), donde la simetría del mesocarpo es comparable al presente en frutos sanos. i Figura 22. Se muestra el aspecto del ensayo de 120 plantas sanas transformadas con CsPP16-lisozima, CsPP16-defensina y su combinación. Se realizó en microtúneles cubiertos con malla antiáfidos en Tecomán, Colima, zona endémica de HLB (superior). Los dos paneles de la izquierda contienen 160 plantas con plantas sanas tratadas con los siguientes antimicrobianos y expuestos al psilido infectado con la bacteria Candidatus Liberibacter. CsPP16-defensina, CsPP16-indolisina, CsPP16-magainina, CsPP16-cecropina, CsPP16-sarcotoxina, CsPP16 lisozima y sus combinaciones en pares. Se muestra (inferior) el aspecto del interior de uno de los túneles. ' i Figura 23. Se muestra la cuantificación de la bacteria Candidatus Liberibacter en árboles jóvenes de limón mexicano expresando CsPP16-defensina, CsPP16-defensina y ambas a 60 días def haberse I expuesto a psílidos infectados. Los tratamientos con antimicrobianos acorde a la presente invención (izquierda) muestran menor cantidad de bacteria y se compararon con el control negativo. En contraste, las plantas control sin antimicrobianos (derecha) muestran en general mayor cantidad de bacteria. En defensina se detectó a bajos niveles la bacteria eni una sola planta, mientras que en el tratamiento con lisozima se detectaron dos plantas, también a bajos niveles, En la combinación, puede apreciarse la detección de Candidatus Liberibacter en dos plantas. Estas plantas correlacionan con bajos niveles de antimicrobianos. ¡ Figura 24. Se muestran las unidades de expresión de proteínas con actividad antimicrobiana acorde con la presente invención, capaces de expresar dichas proteínas en floema. Se observa (superior) la unidad de expresión conteniendo el promotor AT5G59880 y (inferior) la unidad de 'expresión conteniendo el promotor CaMV 35S.

I 17 Descripción detallada de la invención.

La presente invención se refiere a métodos eficientes para el tratamiento de enfermedades causadas por microorganismos patógenos que invaden el floema de las plantas, particularmente a métodos para la generación de plantas transgénicas, en particular de cítricos, resistentes a la infección por bacterias del ciado de Candidatus Liberobacter (Cal.) que ocasionan la enfermedad HLB; estas bacterias se localizan de manera restringida en el floema, por lo que los protocolos donde se utilizan antibióticos no han sido exitosos. 1 Hasta antes de la presente invención, la solución a esta enfermedad no se había abordado por métodos de ingeniería genética, con la finalidad de que las plantas generadas adquieran una construcción genética que se encuentra y expresa de manera estable. 1 Se considera que el método más efectivo para el manejo a largo plazo de enfermedades asociadas con Liberibacterias se basa en la adquisición de resistencia en las plantas hospederas, por lo que la presente invención se basa en la adquisición de resistencia en las plantas utilizando ingeniería genética, por lo que la invención comprende un método de transformación genética adecuado para especies de cítricos dirigido a transferir un mecanismo de defensa para eliminar o combatir la infección ocasionada por al menos un microorganismo patógeno que invade el floema de las plantas, como por ejemplo bacterias del grupo que comprende Candidatus Liberobacter, Candidatus Liberobacter asiaticus, Candidatus Liberobacter africanas y/o Candidatus Liberobacter amerícanus, y así controlar las enfermedades asociadas a estas infecciones, tales como por ejemplo HLB y Zebra chip (ZC). El éxito del método de la presente invención tiene como base utilizar un mecanismo utilizado por las plantas para la translocación de moléculas con ¡ actividad antimicrobiana a través del tejido vascular. ' La presente invención se basa en el hecho de que por ejemplo, las bacterias Candidatus Liberibacter spp. al tener una pared celular compuesta con peptidoglicana, se asume que son susceptibles a ser destruidas por enzimas como la lisozima. Así mismo la presente invención se refiere a una estrategia de control de la infección donde se aprovecha la necesidad de Candidatus Liberibacter spp. para establecerse en' el floema de la planta.

El método de la presente invención comprende lograr la expresión de un gen quimérico que codifica para una proteína de fusión que posee una doble función, donde por un lado tiene la capacidad para transportarse dentro del tejido vascular de la planta y por el otro tiene capacidad y actividad antimicrobiana, por ejemplo para destruir la pared celular de bacterias patógenas que invaden el floema de las plantas, como por ejemplo Candidatus Liberibacter spp. i Durante el desarrollo de la presente invención se llevó a cabo un protocolo de transformación con el cual se logró obtener una eficiencia de transformación razonable y una integración exitosa y estable del transgene i quimérico propuesto aquí, como se pudo confirmar por los datos experimentales mostrados más adelante, los cuales también muestran que la protección por ejemplo contra la infección HLB mediante el método de la presente invención, también resultó exitosa debido a la transferencia, la expresión y la funcionalidad del gen trasferido.

Nuestro equipo de investigación ha caracterizado con detalle una proteína que une RNA de manera i independiente de su secuencia, a la que hemos denominado CmPP16, donde esta proteína no solo se asocia a diferentes RNAs in vitro, sino que es capaz de transportarlos de una célula a otra a través de plasmodesmos (Xoconostle-Cázares et al., 1999). CmPP16 es por tanto funcionalmente semejante a las proteínas de movimiento de virus de RNA, aunque como ya ha quedado implícito, su función en, plantas sanas se desconoce. Este trabajo pionero demostró la presencia de un sistema endógeno que tiene la planta sana para translocar proteínas y ácidos nucleicos, mismo que es usado por los virus por ejemplo para moverse sistémicamente. Homólogos de la proteína CmPP16 se han encontrado en diferentes especies vegetales, aunque su conservación no es tan elevada. Nuestras investigaciones también indican que CmPP16, fusionada a proteínas de mayor tamaño, no pierde su capacidad de transporte intercelular a través de plasmodesmos. Una evidencia de la capacidad de movimiento que tiene la proteína CmPP16, son los resultados que se presentan en la figura 5, donde las imágenes de microscopía confocal muestran que la proteína CmPP16 al ser microinyectada en células del mesófilo de hojas de Nicotíana benthamiana es capaz de moverse de célula a célula, y cuando CmPP16 fue acomplejada con RNA, también medió el movimiento del RNA a células vecinas. En la figura 6 se muestra la localización de CmPP16 en el floema. > Con respecto a patógenos que circulan por el floema, y que normalmente y durante el proceso infeccioso rara vez salen de él, es evidente que una limitante en el tratamiento de enfermedades causadas por estos patógenos es la incapacidad de agentes químicos (por ejemplo, antibióticos) de alcanzar los elementos cribosos que albergan el patógeno. Con base en estos antecedentes, para el desarrollo de la presente invención hemos considerado que la proteína CsPP16 funciona como vehículo para transportar proteínas al interior de los elementos cribosos, a los que normalmente no se puede acceder. Por lo tanto, se plantea que una proteína, por ejemplo con actividad antibacteriana fusionada a CsPP16 podría tener acceso al floema, y en particular al elemento criboso, donde el péptido ejerce su actividad, por ejemplo antimicrobiana y/o antibacteriana; para conseguir éxito en el planteamiento estratégico de la presente invención se requirió del diseño del vector de expresión de las proteínas de fusión CsPP16-péptido descrito aquí y de llevar a cabo i alguna estrategia de transformación. 1 La presente invención propone el uso de un gen que codifique para la proteína CsPP16 fusionada por ejemplo con una proteína con actividad antimicrobiana, por ejemplo antibacteriana, en esté caso por ejemplo una lisozima humana. La expresión de dicha proteína de fusión debe ser dirigida por un promotor i específico de floema que previamente por ejemplo, ya hemos caracterizado. Dicho promotor regula la expresión de una proteína que es requerida para mantener la elevada conductividad del floema, siendo este por ejemplo el factor de despolimerización de actina 3 (ADF3), aunque otros factores que consigan eí mismo i efecto pueden utilizarse en la presente invención. j En base a la literatura se seleccionaron péptidos con actividad antimicrobiana probada en otros sistemas, seleccionando a aquellos con actividad antimicrobiana en plantas. Se empleo lisozima humana y défensina i humana, ya que los cítricos a emplear serán para consumo humano y así que de estas moléculas recombinantes no se espera la generación de problemas inmunes en el ser humano. ¡ I Conforme a la presente invención, las secuencias de los antibióticos peptídicos fueron obtenidas dé la base de datos del Genbank (NCBI) y su secuencia de aminoácidos se transformó a secuencia de bases con el uso de codones más común en cítricos. En la tabla 3 se incluye la información necesaria para cambiar él uso de codones. ! Para proveer de los elementos esenciales para poder llevar a cabo la invención, en seguida se incluye la lista de codones de uso común para cítricos, disponible en la base de datos: http://www.kazusa.or.ip/codon/.

Iridian citrus ringspot virus [gbvrl]: 12 Citrus idaeovirus [gbvrl]: 1 Citrus sinensis x Poncirus trífoliata [gbpln]: 3 Citrus tatter leaf virus [gbvrl]: 3 Citrus natsudaidai [gbpln]: 1 Cytoplasmic citrus leprosis virus [gbvrl]: 18 Citrus leaf blotch virus [gbvrl]: 3 Citrus leaf rugóse virus [gbvrl]: 4 mitochondrion Citrus junos [gbpln]: 1 Citrus variegation virus [gbvrl]: 17 Citrus junos [gbpln]: 7 Citrus máxima [gbpln]: 8 Citrus sinensis x Citrus reticulata [gbpln]: 1 Citrus x paradisi [gbpln]: 28 Citrus aurantiifolia [gbpln]: 1 Citrus kinokuni [gbpln] : 1 Citrus ¡atipes [gbpln]: 1 Citrus cv. Shiranuhi [gbpln]: 12 Citrus hystrix [gbpln]: 1 Citrus unshiu [gbpln]: 64 Microcitrus sp. citrusparkOl [gbpln]: 1 Mitochondrion Citrus jambhiri [gbpln]: 1 Citrus hybrid cultivar [gbpln]: 1 Citrus jambhiri [gbpln]: 15 Citrus yellow mosaic virus [gbvrl]: 6 Citrus psorosis virus [gbvrl]: 9 Citrus limón [gbpln]: 11 Citrus cv. Sainumphung [gbpln]: 5 j Chloroplast Citrus sinensis [gbpln]: 89 Citrus iyo [gbpln]: 2 | Citrus sinensis [gbpln]: 116 Citrus reticulata [gbpln]: 3 ¡ Citrus macrophylla [gbpln]: 2 Citrus clementina [gbpln]: 4 i Citrus sudden death-associated virus [gbvrl]: 4 Citrus ringspot virus [gbvrl]: 1 i i Citrus tristeza virus [gbvrl]: 476 Citrus clementina x Citrus reticulata [gbpln]: 4 Para el diseño de las construcciones de los vectores utilizados en la presente invención, una vez obtenida la secuencia de los genes sintéticos, a éstos se agregaron secuencias regulatorias, por ejemplo del prómotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y el terminador NOS, aunque otras secuencias regulatorias que funcionen de la misma manera pueden utilizarse para los fines de la presente invención. j Todas las construcciones genéticas descritas en la presente invención contienen como promotor 1 al promotor d35S del virus del mosaico de la coliflor Ca V 35S y como secuencia terminadora a la secuencia i NOS. Adicionalmente, otro grupo de construcciones contienen al promotor de expresión específica en floema 59880 de Arabidopsis thaliana dirigiendo la expresión de los antimicrobianos peptídicos mencionados anteriormente, lo cual permite la expresión solamente en el tejido vascular, donde se encuentra por ejemplo, el microorganismo fitopatógeno. Todas las construcciones descritas aquí contienen los bordes izquierdo y derecho del T-DNA de Agrobacterium en sus extremos, y carecen de marcadores de selección.

Tabla 3. Uso de codones comunes en Citrus sinensis x Citrus reticulata.

Citrus sinensis x Citrus reticulata [gbpln]: CD's (354 codones) Campos: [triplete] [frecuencia: por miles] ([número]) NOTA: Al codificar GC 43.22% 1? letra GC 51.98% 2^ letra GC 34.75% 3^ letra GC 42.94% La presente invención tiene como objetivo principal proporcionar métodos para obtener plantas transgénicas o genéticamente modificadas que expresan una proteína de fusión con la que adquieren resistencia a ser infectadas por microorganismos que afectan el floema de las plantas generando enfermedades, por ejemplo bacterias que ocasionan HLB, siendo uno de los métodos el que comprende los siguientes pasos: J 1) a partir de un vector de DNA de expresión de la proteína CsPP16 fusionada a una molécula ? antibacteriana, se conjuga a una cepa de Agrobacterium, j 2) inocular, a una planta susceptible a ser infectada por agentes microbianos que causan enfermedades, por I ejemplo agentes bacterianos que ocasionan HLB o enfermedades causadas por microorganismos que afectan el floema de las plantas, con dicha cepa de Agrobacterium que posee al vector de expresión, 3) verificar la adquisición del vector así como su expresión, su estabilidad en las plantas transformadas y sus I descendientes y verificar la resistencia adquirida. i En una de sus modalidades, el método anterior comprende en la etapa 2), la inoculación a plantas infectadas previamente con el agente antimicrobiano causante de la enfermedad, con los vectores descritos I aquí.

I Conforme a la presente invención, se proporciona la construcción del vector de expresión el cual básicamente debe poseer el gen que codifica para CsPP16 unido al gen que codifica para un péptido antimicrobiano con especificidad para eliminar microorganismos que afecten el floema de las plantas, como por ejemplo bacterias localizadas en el floema de las plantas, en particular bacterias como por ejemplo Candidatus Liberibacter, Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter áfrica ñus y/o Candidatus Liberibacter americanus, que ocasionan la infección HLB en especies de cítricos; quedando dentro de las i modalidades de la invención aquellos vectores de expresión que faciliten la expresión de una proteína de fusión seleccionada del grupo que comprende CsPP16-péptido con actividad antimicrobianá, CsPP16-péptido mieloide antimicrobial, CsPP16-lisozima, CsPP16-Beta-defensina-l, CsPP16-Polifemusina-l, CsPP16-Taquiplesina, CsPP16-Protegrina-l, CsPP16-Magainina, CsPP16-lndolicidina, CsPP16-Cecropina, CsPP16-Sarcotoxina IA, CsPP16-Pirrocoric¡na y CsPP16-Defensinas, así como mezclas de las mismas. 1 Queda también como una modalidad de la invención la posibilidad de generar resistencia al padecimiento t de "Zebra chip" (ZC) que ocurre en papas por infección con Candidatus Liberibacter sotanacearurñ. i Así mismo, son parte de las modalidades de la invención las construcciones de los vectores de expresión que se muestran en la figura 24, los cuales se caracterizan por poseer las siguientes secuencias: • Unidad de expresión CsPP16-Lisozima, que contiene el borde izquierdo del T-DNA de A. tumefaciens (SEQ. ID. No. 1), el promotor 35S versión corta del virus del mosaico de la coliflor (SEQ. ID. No. 2), el gen que codifica para la proteína 16K del floema de Citrus aurantifolia ortóloga en cítricos o protéína CsPP16 (SEQ. ID. No. 3), un polilinker flexible (SEQ. ID. No. 4), lisozima humana con uso de codones en cítricos (SEQ. ID. No. 5) y el terminador NOS y borde derecho de T-DNA de A tumefaciens (SEQ. ID. No. 6).

• Unidad de expresión CsPP16-Defensina, que contiene el borde izquierdo del T-DNA de A. tumefaciens (SEQ. ID. No. 1), el promotor 35S largo del virus del mosaico de la coliflor (SEQ. ID. No. 7), el gen que codifica para la proteína 16K del floema de Citrus aurantifolia ortóloga en cítricos o proteína CsPP16 (SEQ. ID. No. 3), un polilinker flexible (SEQ. ID. No. 4), defensina humana con uso de codones en cítricos (SEQ. ID. No. 8), el terminador NOS y borde derecho del T-DNA de A. tumefaciens (SEQ. ID. No. 6).

Así mismo y para efectos de la invención, quedan comprendidas también las siguientes unidades de expresión: i I · Unidad de expresión CsPP16-Magainina que contiene todos los elementos indicados para la unidad de expresión CsPP16-Defensina, con excepción del elemento Defensina humana con uso de codones en cítricos (SEQ. ID. No. 8) el cual se sustituye por Magainina con uso de codones en cítricos (SEQ. ID. No. 9) · : • Unidad de expresión CsPP16-Cecropina que contiene todos los elementos indicados para la unidad de expresión CsPP16-Defensina, con excepción del elemento Defensina humana con uso de codones en cítricos (SEQ. ID. No. 8) el cual se sustituye por Cecropina con uso de codones en cítricos (SEQ. ID. No. 10) .

• Unidad de expresión CsPP16-Sarcotoxina que contiene todos los elementos indicados para la unidad de expresión CsPP16-Defensina, con excepción del elemento Defensina humana con uso de codones en cítricos (SEQ. ID. No. 8) el cual se sustituye por Sarcotoxina con uso de codones en cítricos (SEQ. ID. No. íi). i • Unidad de expresión CsPP16-lndolicidina que contiene todos los elementos indicados para la unidad de expresión CsPP16-Defensina, con excepción del elemento Defensina humana con uso de codones en cítricos (SEQ. ID. No. 8) el cual se sustituye por Indolicidina con uso de codones en cítricos (SEQ. ID. No. 12). ! I En una de las modalidades de la invención, el promotor 35S corto (SEQ. ID. No. 2) o largo (SEQ. ID: No. 7) del virus del mosaico de la coliflor que se encuentra en las unidades de expresión de la invención CsPP16- CsPP16- (SEQ. ID.

No. 13). ! Las unidades de expresión mencionadas fueron posteriormente sintetizadas por la compañía' Genscript, secuenciadas para verificar que no se insertaron mutaciones en el proceso de ensamblaje y clonadas en el vector con resistencia a antibiótico beta-lactámico. Los plásmidos obtenidos fueron transformados por electroporación en las bacterias Agrobacterium iumefaciens y Agrobacterium rhizogenes, seleccionando las bacterias transformantes con el antibiótico Carbenicilina a 100 µ§/?t)?, concentración final. i El primer método de transformación con las construcciones anteriormente descritas, comprende por ejemplo la transformación genética de tallos y brotes de cítricos, los cuales se regeneran in vitro hasta obtener una plántula genéticamente modificada, la cual es injertada en un portainjerto o patrón, por ejemplo de naranja agria de las variedades macrophylla o volkameriana. El patrón puede provenir de una plántula de al menos un centímetro, proveniente de la germinación por ejemplo de una semilla dej naranja agria, o bien el patrón es una planta joven de cítricos, a la cual se le injerta lateralmente la yema i genéticamente modificada para su crecimiento. I El segundo método de transformación con las construcciones anteriormente descritas, comprende promover la generación de pequeñas áreas genéticamente transformadas de plantas adultas, seari sanas o enfermas con la bacteria que produce HLB. Este consiste en exponer el tejido vascular de tallos o ramas localizadas entre tejidos consumidores y productores (fotosintéticos). Esto se realiza por raspado hasta observar tejido verde fotosintético, donde sobre éste se coloca un algodón humedecido con la solución de Agrobacterium pretratada con acetosiringona y diluida en amortiguador con inductores de crecimiento vegetal (auxinas y citocininas). La planta o rama tratada se coloca en una bolsa para mantener en elevada humedad el parche con la bacteria Agrobacterium tumefaciens hasta por tres días, retirando él apósito después del tratamiento indicado. Las plantas son expuestas a los tratamientos de dos días hasta un mes, obteniéndose en todos los casos la expresión de los antimicrobianos en los tejidos vasculares y acumulados en los tejidos consumidores, que son los sitios de infección de la bacteria. j Conforme a la presente invención, posterior a la transformación de las plantas enfermas, se mohitorea la presencia del microorganismo causante de la enfermedad, por ejemplo, la bacteria causante de HLB, la cual disminuye debido a los tratamientos de expresión de los antimicrobianos aplicados solos o en combinaciones. Las plantas enfermas que fueron tratadas mediante la invención recupéraron su fotosíntesis, indicando que los tejidos vasculares ya no estaban bloqueados y que las plantas fueron capaces de florear y llevar a cabo un adecuado llenado de fruto. Por su parte, las plantas con tratamiento con Defensina florecieron, mostrándose en la figura 21A dos limones obtenidos, de 101 y 84 gramos,ilos cuales fueron partidos en su eje transversal, mostrando que el mesocarpo es simétrico. Esta apariencia jes normal en frutos sanos, en contraste a los infectados, los cuales contienen mesocarpo (gajos) asimétricos (figura 21B). j Los resultados obtenidos en la transformación de plantas enfermas de 1.20 m de altura mediante la presente invención y su evaluación hasta 210 días, muestran una disminución sustancial en los síntomas de i I la enfermedad HLB así como la recuperación de las condiciones fisiológicas normales de laj planta (crecimiento, producción de brotes, aumento de fotosíntesis, floración y llenado de frutos) (Figura 17).

Por otra parte, la transformación genética de árboles jóvenes de 1.20 m, certificados en su sanidad, provenientes del vivero certificado Emiliano Zapata, los cuales fueron expuestos a psílidos infectados con la bacteria Candidatus Liberibacter en campo en Tecomán Colima, bajo condiciones de bioseguridad (figura 22), obtuvieron nula o baja cantidad de bacteria, en contraste con los árboles control que fueron transformados con Agrobacterium con plásmidos sin genes codificantes para los antimicrobianos arriba citados. Los árboles descritos fueron expuestos a psílidos infectados con la bacteria Candidatus Liberibacter y fue evaluada la presencia de la bacteria después de 60 días. Dicha evaluación consistió en colectar 2 hojas fotosintéticas maduras y 2 hojas jóvenes, denominadas brotes. Se aisló DNA total de la vena central y se estimó la cantidad de bacteria mediante PCR en tiempo real del gen 16S de Candidatus Liberibacter, empleando sondas fluorescentes. Los valores obtenidos fueron normalizados con el gen endógeno ¡de limón COX (figura 23) Los resultados obtenidos muestran que en los tratamientos con lisozima, defensina y una combinación de ambos (Lis y Def), la cantidad de bacteria se reduce o no es detectable, en contraste con las plantas control que no expresan a los antimicrobianos. I i Por otra parte, el segundo método que comprende la transformación de explantes y su regeneración vía cultivo de tejidos conforme a la presente invención, demuestra que las plantas son capaces de regenerarse i y son vigorosas. En estos experimentos, se obtuvieron plantas injertadas vigorosas expresando los antimicrobianos anteriormente mencionados, de los cuales se seleccionaron diez transformantes independientes para futuros ensayos en campo bajo condiciones de bioseguridad. i A continuación se describen a manera de ejemplos dos construcciones utilizadas que incluyen las dos secuencias fusionadas que se sintetizaron así como ejemplos del procedimiento mediante al cual se obtienen plantas genéticamente transformadas resistentes a HLB. Enseguida se describen también a manera de ejemplos cómo se determinó el desempeño de las construcciones como vectores para la transferencia de los genes de fusión diseñados. 1 Los siguientes ejemplos se incluyen con el único fin de ilustrar la invención, sin que esto implique limitaciones a su alcance, así que los procedimientos y materiales pueden tener variantes detectables para ! cualquier persona versada en el campo técnico, que queden dentro del ámbito y el espíritu de la invención. i ¡ Ejemplo 1. Obtención de unidades de expresión CsPP16 conteniendo el promotor 35S del virus del i mosaico de la coliflor. i I Para la obtención de dichas unidades de expresión las secuencias indicadas en la tabla 4 se sintetizaron y ensamblaron en el orden indicado, fueron secuenciadas para verificar que no se insertaron mutaciones en í I el proceso de ensamblaje y finalmente se clonaron en el vector de la compañía Genscript que contiene resistencia al antibiótico carbenicilina. , i Los plásmidos recombinantes resultantes fueron transformados a células competentes de Agrobacterium tumefaciens y A. rhizogenes. Se empleó al antibiótico carbenicilina, que es la versión sintética de la ampicilina y es más estable. Se extrajo DNA plasmídico de las bacterias resistentes y se verificó la presencia del plásmido recombinante en gel de agarosa. ¡ Para verificar la presencia del gen de interés con actividad antimicrobiana insertado en el vector o bien en la planta transformada mediante éste, se utilizaron oligonucleótidos específicos para su amplificación mediante PCR, utilizándose por ejemplo para el caso del gen de lisozima, los oligonucleótidos delantero 3'-AGGTTTTTCGAAAGATGCGAACTTGCTAGAA-5' (SEQ. ID. No. 14) y reverso 3 -AA ACACCGCA ACCTT G A ACATATTGTCTG C-5 ' (SEQ. ID. No. 15), y para el caso de defensina los oligonucleótidos delantero 3'- ATGAGAGTTCTTTATU I C I 1 1 I CAGCTTC-5' (SEQ. ID. No. 16) y reverso 3'- AL I I C I I C I I GCAGCATCTTGTACCTGGAA-5' (SEQ. ID. No. 17). , Ejemplo 2. Obtención de unidades de expresión CsPP16 conteniendo el promotor vascular AT5G59880.

Para la obtención de dichas unidades de expresión, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor versión corta (SEQ. ID. No. 2) o larga (SEQ. ID. No. 7) indicados en las unidades de expresión de la tabla X, fueron sustituidos por el promotor vascular AT5G59880 (SEQ. ID. No. 13). Al igual que en el ejemplo 1, las secuencias resultantes se sintetizaron y ensamblaron en el orden indicado, fueron secuenciadas para verificar que no se insertaron mutaciones en el proceso de ensamblaje y finalmente se clonaron en el vector de la compañía Genscript que contiene resistencia al antibiótico carbenicilina. ! Al igual que en el ejemplo 1, los plásmidos recombinantes resultantes fueron transformados! a células competentes de Agrobacterium tumefaciens y A. rhizogenes, empleándose al antibiótico carbenicilina, que es la versión sintética de la ampicilina y es más estable. Se extrajo DNA plasmídico de las! bacterias resistentes y se verificó la presencia del plásmido recombinante en gel de agarosa.

Para verificar la presencia del gen de interés con actividad antimicrobiana insertado en el vector o bien en la planta transformada mediante éste, se utilizaron oligonucleótidos específicos para su amplificación mediante PCR, utilizándose por ejemplo para el caso del gen de lisozima, los oligonucleótidos delantero 3'-AG GTTTTTCG A AAG ATG CG AACTTG CTAG AA-5 ' (SEQ. ID. No. 14) y reverjso 3'-AA ACACCG CAACCTTG AACATATTGTCTG C-5 ' (SEQ. ID. No. 15), y para el caso de defensina los oligonucleótidos delantero 3'- ATG AGAGTTCTTTATL I I C I 1 1 I CAGCTTC-5' (SEQ. ID. No. 16) y reverso 3'- I ACTTCTTCTTGCAGCATCTTGTACCTGGAA-5' (SEQ. ID. No. 17).

Tabla 4 Tabla 4 (continuación) Ejemplo 3. Expresión transitoria de las construcciones de la invención en plantas de limón mexicano infectadas con HLB, utilizando Agrobacterium.

Se creció Agrobacterium en medio LB a 30°C en agitación constante hasta alcanzar una D.O. de 0.4 (600 nm). A las células se agregó acetosiringona a una concentración final de 140 micromolar, incubando por dos horas adicionales con el inductor. Las bacterias fueron cosechadas por centrifugación y resuspendidas en medio de transformación (figura 7). ! El método de inoculación de las plantas adultas comprendió remover la corteza lignificada con; una lija, exponiendo el tejido verde fotosintético. Sobre éste se colocó un algodón prehumedecido con la solución de bacteria recombinante conteniendo algunos de los vectores de expresión descritos en los ejemplos 1 y/o 2, resuspendida en medio de transformación. El algodón se fijó temporalmente alrededor del tejido fotosintético descubierto con plástico y la planta se cubrió con una bolsa de plástico manteniéndose con alta humedad por dos días. Al término de la incubación, se retiró la bolsa y el apósito de algodón. Las I plantas continuaron regándose para mantener un estatus hídrico adecuado que favoreciera la transferencia i del T-DNA a la zona tratada. ' i Materiales de cítricos creados empleando patrones de limón volkameriano injertados en limón mexicano y/o limón persa, fueron utilizados en los ensayos. Las plantas mostraron síntomas asociados a1 HLB y su i carga bacteriana de Candidatus Liberibacter fue confirmada por PCR en tiempo real. i Se realizó el diseño experimental que se muestra en la tabla 5. i Tabla 5. Diseño experimental empleado para transformar árboles maduros de limón.

No. de No. de Tratamiento plantas inoculaciones Plantas enfermas con Lisozima 5 4 Plantas enfermas con Defensina 5 4 Plantas enfermas con Lisozima y Defensina 5 4 Plantas enfermas con transgen control 5 4 (GUS como gen reportero) Plantas enfermas con inoculación de agua 5 4 Plantas sanas 5 4 Plantas sanas con agua 1 4 Se midió la capacidad fotosintética de las plantas con un equipo IRGA a irradiación constante, haciendo diez mediciones por planta.

Las plantas fueron inoculadas al raspar el tejido leñoso de los tallos con un bisturí, donde un algodón conteniendo la solución bacteriana fue depositado sobre la región descubierta. El algodón se cubrió con plástico y la planta completa se cubrió con una bolsa grande de plástico para mantener elevada humedad y i favorecer la generación de tejido transformado (figura 8). Las plantas fueron regadas solamente con agua para evitar enmascarar los síntomas de HLB. A los sesenta y ciento veinte días posteriores a la inoculación se realizó el análisis de las plantas. ' Después de 60 días de la inoculación se procedió al análisis de las plantas. Se analizó el efecto de la expresión de lisozima, defensina y su combinación, además de controles sanos, enfermos y un control que consistió en emplear al gen reportero GUS, indicador del evento de transformación genética. i La inoculación de las plantas con estos tratamientos supone la integración del T-DNA conteniendo al gen de i interés en el tejido expuesto. Generalmente, las especies avirulentas de Agrobacterium producen un pequeño tumor en la zona aplicada, evidencia de la transformación.

Las plantas tratadas fueron analizadas por la presencia de tejido transformado, encontrando pequeñas zonas tumorales como las que se muestran en la figura 9.

I Ejemplo 4. Medición de fotosíntesis y de áreas foliares de las plantas tratadas conforme a la presente invención. | .

Se tomaron diez mediciones de cada planta tratada, las cuales se registraron y promediaron en programa Excel, siendo las unidades µ???^ C02/cm2.s en la figura 10 se muestra la gráfica de los valores obtenidos. Las plantas enfermas control tuvieron un valor de fijación de C02 inferior al de los tratamientos. Cabe señalar el valor obtenido en las plantas enfermas tratadas con GUS, que mostraron franca heterótrofía. Las i plantas tratadas con las construcciones de la invención que incluyen péptidos antimicrobianos poseen mayor capacidad fotosintética, lo cual puede atribuirse a una mejora en el estatus fisiológico de la planta después de dos meses de la inoculación. A este tiempo (60 días), la fotosíntesis resultante después del tratamiento con defensina fue inferior que el obtenido con lisozima, sin embargo posteriormente a los 210 días ambos tratamientos mostraron valores de fotosíntesis similares a los de las plantas sanas.

De manera paralela se cuantificó el número de brotes nuevos en estas plantas así como su tamaño. Como puede observarse en la figura 11, las plantas control GUS (enfermas sin tratamiento antirhicrobiano) mostraron el menor número de brotes nuevos, siendo los tratamientos con CsPP16-defensina y defensina/lisozima los que presentaron un mayor número de éstos. Los tratamientos comprendieron aplicar a la bacteria transformada con el vector conteniendo CsPP16-defensina, un segundo tratamiento fue i CsPP16-lisozima y un tercer tratamiento se realizó con una mezcla de bacterias conteniendo CsPP16- i defensina y CsPP16-lisozima. De manera consistente, observamos que los tratamientos cop defensina ! tienen mayor número de brotes, los cuales pueden deberse a que este gen podría actuar más rápidamente en el control de la bacteria Candidatus Liberíbacter. Después de 210 días, el número de brotes en los tratamientos fueron estadísticamente similares.

Asimismo en la figura 12 se observa graficado el tramaño de los brotes nuevos, siendo los tratamientos con Cmppl6-defensina y Cmpl6-lisozima los que presentaron un mayor tamaño. Como se ha descrito, las diferencias observadas a los 60 días ya no se observan en los tratamientos a medida que transcurre más tiempo en los mismos. Cabe señalar que en este periodo, las plantas no fueron fertilizadas con el objeto de evidenciar los síntomas de HLB, los cuales son más marcados cuando las plantas tienen estrés nutricional. En la figura 12 se muestra el aspecto de un brote obtenido en el tratamiento lisozima/defensina acorde con la invención, que aparece sin síntomas con áreas foliares similares a las plantas sanas. ¦ Después de 60 días de la inoculación, los brotes nuevos no presentaron ningún síntoma asociado al HLB, en comparación con los brotes preexistentes a éstos, los cuales a pesar de la inoculación los síntomas característicos de HLB permanecieron. Esto nos indicó que posiblemente debido a la acumulación excesiva de callosa en el floema, el libre tránsito de las proteínas a través de éste es bloqueado impidiendo llegar í hasta estos tejidos, lo que concuerda con los análisis de fotosíntesis previamente mostrados, donde la heterotrofia en estos tejidos es evidente. Los brotes nuevos al no presentar ningún síntoma visible de la enfermedad, hicieron suponer que es debido a los tratamientos con los antimicrobianos conforme a la invención; en la figura 13 se muestra el aspecto de las plantas tratadas conforme a la invención después de 100 días de tratamiento. Se muestra la comparación de las plantas control y aquellas tratadas con los antimicrobianos, donde se observa una clara mejoría de los síntomas en los brotes de las plantas tratadas. Se llevó a cabo la medición de áreas foliares antes y después de 60 días de tratamiento en brotes nuevos de cada tratamiento, analizando 10 hojas por cada planta. Se promediaron las áreas foliares de cada planta y se analizaron por medio de la gráfica que se muestra en la figura 14, donde se observa un incremento en el área foliar de las plantas con el tratamiento del antimicrobiano similar a las áreas foliares de la planta sana, contrario a lo que sucede con las plantas control donde se observa una disminución en las áreas foliares, posiblemente al avance de la enfermedad. Además en las plantas inoculadas con Agrobacteríum, se observó en el tronco de éstas el desarrollo de pequeños tumores en la zona de inoculación, lo que indicó la presencia de zonas hiperproductoras de los antimicrobianos tal y como se muestran en la figura Í.5.

! I Ejemplo 5. Medición del contenido de antimicrobianos en las plantas transformadas. I Se obtuvieron muestras de plantas consistentes en hojas prexistentes y hojas nuevas. Las' plantas se procesaron de acuerdo a los procedimientos de detección establecidos por el Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria de SAGARPA, México. ¡ I I Brevemente, se disectó la vena central de la hoja y se cortó en pequeñas piezas con la ayuda de unía navaja desechable. El tejido fue pesado (100 mg) y procesado de dos formas, una de ellas para la obtención de DNA total empleando un kit comercial de purificación, y la otra para el tratamiento con Etidio MoVio Azida (EMA) y posterior purificación de DNA, el cual permite discriminar si el DNA usado como templado estuvo i presente en bacterias vivas o muertas. ] En la figura 16 se muestran los resultados obtenidos de este análisis. Como se puede observar, la cantidad i de bacteria viva disminuyó en los tratamientos, aunque no se eliminó completamente. Se debe señalar que este ensayo de expresión transitoria expresa en regiones discretas de la planta al antimicrobiano empleado y no se puede controlar la cantidad producida. Se observa en la gráfica el tamaño total de la barra como indicativo de la detección total de la bacteria y con color azul la cantidad de bacterias muertas,! mientras que con rojo se observa la cantidad de bacterias vivas. De manera general, los tratamientos tienen hasta un i sexto de la carga presente en las plantas enfermas control. Este resultado es muy promisorio si consideramos que estas plantas son quimeras productoras de antimicrobianos; utilizando métodos de transformación genética para obtener plantas completamente transformadas en todos los tejidos se logra una resistencia a la enfermedad cercana al 100%. i La gráfica de la figura 17 nos muestra la relación de carga bacteriana viva/ muerta después de 60 días de tratamiento, donde podemos observar que la cantidad de bacterias vivas en las plantas que han recibido el I tratamiento con el antimicrobiano es hasta 4 veces menor que las plantas control, donde la cantidad de i bacterias tanto muertas como vivas supera en mucho a las plantas con tratamiento. j ; Ejemplo 6. Prueba de expresión estable en plantas de limón mexicano infectado con HLB.

La expresión estable de lisozima en limón mexicano, se logra transformando explantes de limón] y una vez que éstos se han regenerado se injertan en patrones de limón, lo que permite la obtención de plantas t maduras transgénicas expresando la proteína de interés en un tiempo corto. , La germinación in vitro de semillas de limón mexicano se llevó cabo en tubos de ensaye estériles conteniendo medio de germinación como se muestra en la figura 18. En la composición de dichb medio se encuentran elementos minerales, agua, hormonas, sustancias orgánicas, vitaminas y sacarosa qué propician la germinación de las semillas de limón. Las semillas previamente fueron esterilizadas con una solución de cloro al 30% por media hora, seguido de tres lavados con agua estéril. La siembra de las semillas se realizó en condiciones estériles. Una vez sembradas las semillas, se incubaron a temperatura ambiente en oscuridad por aproximadamente 2 a 3 semanas. Una vez finalizado este tiempo se observará él brote del cotiledón, y se incubó nuevamente 1 semana a temperatura ambiente, con fotoperíodo 16 horas luz y 8 horas en oscuridad, esto para permitir que la actividad fotosintética de la planta se active.

I Las plantas obtenidas de esta manera, fueron utilizadas después para obtener explantes, a los cuajes se les transformó por medio de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes que contienen la construcción CsPP16-Lisozima. ¡ Para la transformación de explantes de limón con A. tumefaciens y A. rhizogenes, primero estas bacterias se crecieron en medio LB a 30°C en agitación hasta alcanzar una D.O. de 0.4 (600 nm). A las célujas se les agregó acetosiringona a una concentración final de 140 micromolar, incubando por dos horas adicionales con el inductor. Las bacterias fueron cosechadas por centrifugación y resuspendidas en medio de transformación. Los tallos de los limones germinados in vitro, se cortaron a una longitud aproximada de 1 I cm, con navaja previamente sumergida en medio de transformación en condiciones estériles. Con ayuda de papel absorbente estéril, se retiró el exceso de líquido a los explantes ya cortados. Los explantes se transfirieron en medio de cocultivo (MC), donde se incubaron a temperatura ambiente por 1-2 días, en condiciones de oscuridad. Pasado este tiempo, se volvieron a transferir los explantes a medio de regeneración (SRM), incubándose a temperatura ambiente en oscuridad por 4 semanas. Seguido a esto, los explantes se incubaron por otras 4 a 6 semanas a temperatura ambiente con fotoperíodo 16 horas luz y 8 horas en oscuridad, hasta su completa regeneración. Los explantes se cambiaron a nuevo medio SRM cada 4 semanas o en caso de alguna contaminación. Las figuras 7, 8 y 19 muestran el proceso de transformación y regeneración de los explantes de limón mexicano. ¡ Para la propagación de explantes transformados en diversos patrones de limón mexicano estos se injertaron en patrones de limón volkameriano, citrange troyer o rugoso Schaub. j Los injertos en los patrones antes mencionados, se realizaron haciendo un corte en forma de "†" a 15 cm aproximadamente de la base del patrón, y cuidadosamente dentro de este corte, se colocó íntegramente el explante transformado. Se aseguró el injerto con parafilm. Se regó la planta únicamente con agua y se cubrió el injerto con una bolsa de plástico para mantener una humedad relativa alta y permitir la regeneración. Sesenta días posteriores a la implantación del injerto, se analizó la expresión de jisozima en hojas de la planta por PCR punto final y qRT- PCR utilizando por ejemplo, los oligonucleótidos descritos en los ejemplos 1 y 2. ! La composición de los medios de cultivo utilizados para transformación de limón mexicano fueron: medio LB (950 mL de agua destilada, 10 g de triptona, 5 gramos de extracto de levadura, 10 g de NaCI, con pH 7 ajustado con NaOH IN, esta solución se ajusta a un volumen final de 1 litro con agua desionizada y se esteriliza); medio para germinar semillas de limón (1 litro de medio MS donde se disuelven 30 g de sacarosa y 2 g de gel rite); medio de cocultivo MC (1 litro de medio MS donde se disuelven 2 mg de iridol-3-ácido acético,l mg de 2-¡sopentil-adenina, 2 mg de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 8 g de agar; el pH a 5.2 se ajusta con NaOH IN y se esteriliza); medio de regeneración SRM (1 litro de medio MS donde se! disuelven i i mg de 6-benzilaminopurina, 10 g de agar; el pH a 5.2 se ajusta con NaOH 1N y se esteriliza; agregar una vez que el medio esta tibio los antibióticos 250 mg/L de Vancomicina y 500 mg/L de Cefatoxima).

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Claims (14)

Reivindicaciones. 1 I

1. Un método para obtener plantas rutáceas o solanáceas transgénicas resistentes a la infección por microorganismos que se restringen al floema, que comprende inducir la expresión de una proteína quimérica ó de fusión que comprende: i a) Una proteína Cm PP16 j i b) Un péptido linker c) un péptido antibacteriano ó una enzima hidrolítica antibacteriana

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 donde la infección ocasiona HLB en cítricos ó bien ZC en una solanácea.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 donde la inducción de la expresión ocurre al introducir en la planta en un vector recombinante que codifica para dicha proteína de fusión mediante métodos de transformación transgénica y donde la proteína de fusión se transporta por el floema a lo largo del tejido vascular, alcanzando las zonas donde se establecen dichas bacterias y donde el antibacteriano ejerce su acción contra la infección.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3 donde el vector recombinante es un plásmitío.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3 ó 4 donde el método transgénico utilizando se realiza mediante Agrobacterium sp o bien por transferencia directa. j

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5 en donde la bacteria que ocasiona HLB es al menos una del grupo que consiste de: Candidatus Liberobacter, Ca. L. asiaticus, Ca.L. africanus y/o Ca. L. americanus. ! 7. Un vector recombinante caracterizado porque expresa a la proteína de fusión CmPP16-Lisózima y que comprende las secuencias nucleotídicas ligadas de manera contigua: Borde izquierdo de A. tumefaciens: LB , Seq. Id. No. 1, Promotor 35S versión corta del virus del mosaico de la coliflor: Seq1. Id. No. 2, Proteína 16K del floema de Cucúrbita máxima: Seq. Id. No. 3, Polilinker flexible: Seq. Id. No. 4, Lisozima: Seq. Id. No. 5, Terminador NOS y Borde izquierdo de T-DNA de A. tumefaciens: Seq. Id. No. 6. 2. El vector recombinante de la reivindicación 7 donde la secuencia SEQ ID 2 es un promotor que está ligado operativamente a las secuencias contiguas SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 4 y SEQ. ID. NO: 5, y que conlleva a la expresión en plantas de una proteína de fusión CmPP16-Lisozima. j 3. Un vector recombinante caracterizado porque expresa a la proteína de fusión CmPP16-defensina y que comprende las secuencias nucleotídicas ligadas de manera contigua: Para la unidad de lexpresión = 2134 bp: Borde derecho del T-DNA de A. tumefaciens (RB): Sed. Id. No: 9, Promotor 35S largo del Virus del mosaico de la coliflor: Sed. Id. No: 10, Gen que codifica para 16K ortóloga en cítricos: Sed. Id. No: 3, i I 36 ! Polilinker flexible: Seq. Id. No. 4, Defensina humana con uso de codones en cítricos: Seq. Id. No. 11, Terminador NOS y borde derecho del T-DNA de A. tumefaciens: Sed. Id. No:12. i 4. El vector recombinante de la reivindicación 9 donde la secuencia SEQ ID 10 es un promotor, que está ligado operativamente a las secuencias contiguas SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 4 y SEQ. ID. NO: 11, y que conlleva a la expresión en plantas de una proteína de fusión CmPP16-defens¡na. 5. Un vector recombinante caracterizado porque expresa al menos una proteína de fusión seleccionada del grupo que consiste de: CmPP16-péptido mieloide antimicrobial, CmPP16-Beta-defensina-l, CmPP16-Polifemusina-l, CmPP16-Taquiplesina, CmPP16-Protegrina-l, CmPP16-Magainina, ¡ CmPP16- Indolicidina; CmPP16-Cecropina, CmPP16-Sarcotoxina IA, CmPP16-Pirrocoricina y CmPP16-Defensinas. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5 donde el método de transformación transgénica comprende: a) construir el vector de DNA de expresión de conformidad con la reivindicación 7, 8 9 u 11, y conjugarlo a una cepa de Agrobacteríum sp, I b) inocular a una plata de cítrico susceptible a ser infectada por agentes bacterianos que ocasionan HLB con dicha cepa de Agrobacterium sp, que posee al vector de expresión ¡ c) verificar la adquisición del vector así como su expresión y verificar la resistencia adquirida.

7. Una planta transgénica resistente a infección por CaL. caracterizada porque tiene incorporado en su genoma un transgene que codifica para para una proteína de fusión que puede ser: CsPP16 fusionado a un péptido antibacteriano ó CsPP16 fusionado a una enzima hidrolítica antibacteriana. 1

8. Una planta transgénica resistente a infección por Cal. caracterizada porque tiene incorporado en su genoma un transgene que codifica para para una proteína de fusión que puede ser: CsPP16÷lisozima ó CsPP16-defensina. '

9. Una planta transgénica resistente a infección por Cal. de conformidad con la reivindicación 14 caracterizada porque el transgene CmPP16-lisozima se expresa después de la transferencia ! del vector recombinante que comprende las siguientes secuencias nucleotídicas ligadas de manera contigua: ! a. Borde izquierdo de A. tumefaciens: LB , Seq. Id. No. 1, b. Promotor 35S versión corta del virus del mosaico de la coliflor: Seq. Id. No. 2, j c. Proteína 16K del floema de Cucúrbita máxima: Seq. Id. No. 3, ! i d. Polilinker flexible: Seq. Id. No. 4, j e. Lisozima: Seq. Id. No. 5, Terminador NOS y ¡ f. Borde izquierdo de T-DNA de A. tumefaciens: Seq. Id. No. 6. ' I i I i I i ! f 37

10. Una planta transgénica resistente a infección por Ca.L. de conformidad con la reivindicación 14 caracterizada porque el transgene CmPP16- defensina se expresa después de la transferencia del vector recombinante que comprende las siguientes secuencias nucleotídícas ligadas de manera contigua: a. Borde derecho del T-DNA de A. tumefaciens (RB): Sed. Id. No: 9, b. Promotor 35S largo del Virus del mosaico de la coliflor: Sed. Id. No: 10, c. Gen que codifica para 16K ortóloga en cítricos: Sed. Id. No: 3, d. Polilinker flexible: Seq. Id. No. 4, e. Defensina humana con uso de codones en cítricos: Seq. Id. No. 11, f. Terminador NOS y borde derecho del T-DNA de A. tumefaciens: Sed. Id. No:12. ! i

11. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 13, 14, 15 ó 16 caracterizada además porque se obtiene por el método descrito en la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 12. j

12. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque pertenece a la especie que se selecciona del grupo que consiste de: limón mexicano, naranjos (Citrus sinensis), mandarinas {Citrus reticulata) y tángelos {Citrus reticulata x Citrus paradisi). [

13. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque pertenece a la especie que se selecciona del grupo que consiste de: limones {Citrus limón), toronjas I {Citrus paradisi), Citrus limonia, Citrus limettioides. j

14. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque i pertenece a la especie que se selecciona del grupo que consiste de: Aeglopsis chevaliéri Swingle, Atalantia missionis Oliver, Balsamocitrus dawei Stapf., Calodendrum capensis Thunb, Catharanthus roseus (L.) Citroncirus webberi, Citrus amblycarpa Ochse, Citrus aurantiifolia Swingle, Citrus aurantium L, Citrus depressa Hayata, Citrus grandis (L.) Osbeck, Citrus hassaku Hort. ex Tanaka, Citrus hystrix DC, i Citrus ichangensis Swingle, Citrus jambhiri Lushington, Citrus junos Sieb. ex Tanaka, Citrus kabuchi Hort. ex Tanaka, Citrus limón (L.) Burm., Citrus x limonia Osbeck, Citrus x nobilis Lour. "Ortanique", Citrus i máxima (pomelo/shaddock), Citrus x nobilis Lour., Citrus oto Hort. ex Tanaka, Citrus x paradisi Macfad., j Citrus reticulata Blanco, Citrus sinensis (L.) Osbeck, Citrus sunki Hort. ex Tanaka, Citrus unshiu (Mack.) Marc, Clausena indica Oliver, Clausena lansium (Lour.) Skeels, Cuscuta australis R. Br. (Convolvulaceae, Cuscutaceae), Fortunella spp., Limonia acidissima L, Microcitrus australasica (F.J. Muell.) Swingle, Murraya koenigii (L.), Murraya paniculata (L.) Jack, Poncirus trifoliata (L.) Raf., Swlnglea glutinosa (Blanco) Merr., Toddalia lanceolata Lam, Triphasia trifolio (Burm. f.) P. Wilson. i