MX2007014833A

MX2007014833A - Algodon trangenico insecticida ce43-67b que expresa cry1ab.

Info

Publication number: MX2007014833A
Application number: MX2007014833A
Authority: MX
Inventors: Patricia Jane Cayley; David Vincent Negrotto; Jason Barnett
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2005-06-02
Filing date: 2006-05-15
Publication date: 2008-02-15
Also published as: WO2006128573A2; AU2006254493A1; AU2006254493B2; AR053501A1; CN101184847B; EP1917359A2; ZA200708596B; US20090217423A1; US7834254B2; US20110020828A1; US9131651B2; WO2006128573A3; BRPI0611504A2; CN101184847A; CR9525A

Abstract

La presente solicitud se refiere a una planta de algodon transgenica resistente a los insectos. En particular, se refiere a un evento especifico, denominado CE43-67B. La solicitud se refiere, ademas, a polinucleotidos que son caracteristicos del evento CE43-67B, a plantas que comprenden los polinucleotidos, y a metodos para detectar el evento CE43-67B.

Description

ALGODÓN TRANSGENICO INSECTICIDA CE43-67B QUE EXPRESA CRYlAB CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a, inter alia , polinucleótidos y métodos de uso de los mismos y en particular a plantas de algodón que comprenden dichos polinucleótidos. En forma específica, la invención se refiere a un evento del algodón denominado CE43-67B que comprende un gen CrylAb. La invención se refiere, además, a métodos para identificar eventos específicos del algodón que contienen un gen capaz de conferir resistencia a los insectos en dichas plantas de algodón. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plagas de las plantas son un factor principal en la pérdida de cultivos agrícolas importantes a nivel mundial. Aproximadamente se pierden anualmente $8000 millones en los Estados Unidos debido a infestaciones en las plantas causadas por plagas no mamíferas, incluyendo insectos. Además de las pérdidas en los cultivos agrícolas, las plagas de insectos también son una carga para los productores de hortalizas y frutas, para los productores de flores ornamentales y para los jardineros domésticos. Las plagas de insectos se controlan, principalmente, mediante aplicaciones intensivas de plaguicidas químicos, que son activos a través de la inhibición del crecimiento de los insectos, la prevención de Ref 186935 la reproducción o alimentación de los insectos, o producen la muerte. El buen control de los plagas de insectos puede lograrse, entonces, aunque estos productos químicos en ocasiones pueden afectar, también, a otros insectos beneficiosos. Otro problema que surge del amplio uso de los plaguicidas químicos es la aparición de variedades de insectos resistentes. Este hecho se ha alivianado parcialmente mediante las diferentes prácticas de manejo de la resistencia, aunque existe una creciente necesidad de conseguir agentes alternativos para el control de las plagas. Los agentes biológicos para el control de las plagas, tales como las cepas de Bacillus thuringiensis que expresan toxinas plaguicidas del tipo de las 5-endotoxinas, también se han aplicado a plantas de cultivo con resultados satisfactorios, ofreciendo una alternativa o complemento a los plaguicidas químicos. Los genes que codifican algunas de estas 6-endotoxinas se han aislado, y su expresión en los huéspedes heterólogos ha demostrado proporcionar otra herramienta para el control de los plagas de insectos importantes para la economía. En particular, la expresión de la toxina insecticida CrylAc de Bacillus thuringiensis en plantas transgénicas, ha proporcionado una protección eficiente contra los plagas de insectos seleccionados y las plantas transgénicas que expresan esta toxina se han comercializado, permitiendo a los granjeros reducir las aplicaciones de agentes químicos para el control de los insectos. CrylAc es una de una extensa familia de toxinas insecticidas producidas por las diferentes cepas de Bacillus thuringi ensis . Cada toxina en la familia tiene un espectro único de actividad insecticida. La familia del algodón, género Gossypium, miembro de las Malváceas, está formada por 39 especies, de las cuales Gossypium hirsu tum es la especie cultivada más comúnmente. También se cultivan otras tres especies: G . arboreurn, G. barbadense, y G. herbaceum . Estas especies cultivadas se cultivan principalmente por las fibras de las semillas que se convierten en productos textiles. El algodón es apropiado como fibra de aplicación textil debido a que las fibras secas maduras se tuercen de tal manera que permite hilar fibras fuertes y delgadas. Otros productos, tales como el aceite de semilla de algodón, forraje y borra de algodón son subproductos de la producción de fibra. El daño a los cultivos de algodón producido por los plagas de insectos en todo el mundo produce una pérdida significativa de producción cada año. El efectivo control de estas plagas para minimizar las pérdidas de producción es de gran importancia económica. Algunos ejemplos de los plagas de insectos del algodón incluyen Gusano soldado (Spodoptera exigua) , Picudo del algodón (Anthono us granáis granáis) , Gusano medidor del repollo (Trichopl usia ni ) , Chinche de plantas nublada (Neurocolpus nubilus) , Afidio del algodón (Aphis gossypu) , Gusano elotero (Heliocoverpa zea), Cortadores pequeños (Fel tia subterránea, Peri?roma saucia, Agrotis ípsilon) , Piral del maíz (Ostrinia nubilalis) , Oruga militar tardía (Spo?optera frugiperda) , gusano rosa del capullo ( Pectinophera gossypiella) , Ácaros de las semillas (Frankliniella spp.), Saltamontes de la soya (Pseudoplusia inclu?ens) , chinches hediondas (Nezara viri?ula, Acrosternum hilare, Euschistus servus) , Pulgón de la col (Lygus lineolaris) , Gusano cogollero (Heliothis virescens) y Moscas blancas (Trialeuro?es abutilonea, Bemisia tabaci ) . La transformación y regeneración de las plantas de algodón actualmente es un procedimiento bien establecido, normalmente basado en la transferencia basada en Agrobacteri um tumefaciens de ADN foráneo en las partes de la planta de algodón y la regeneración de dichas partes de la planta en cultivo de tejidos en plantas de algodón transgénicas totalmente fértiles. Existe un requerimiento de generar una nueva planta de algodón que sea resistente a los insectos de modo que se reduzca la pérdida de producción a través del daño a los cultivos de algodón producido por los plagas de insectos. Una planta de algodón resistente a los insectos podría reducir la necesidad de aplicar plaguicidas químicos, lo que puede resultar perjudicial para otros insectos beneficiosos y el medio ambiente. En particular, se desea proporcionar una planta resistente a los insectos alternativa a las plantas transgénicas que comprende el gen CrylAc de Bacillus thuringi ens i e . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona, inter alia, un evento específico del algodón (denominado de aquí en adelante "CE43-67B") y métodos para su identificación. Este evento específico se ha seleccionado en base a, inter alia, su desempeño agronómico, su eficacia y sus características moleculares. Se considera que las características de este evento son muy superiores a transformantes similares basados en, inter alia, el sitio de integración del transgen durante el proceso de transformación. "Evento CE43-67B" en el contexto de esta solicitud se refiere a la planta de algodón transgénica insecticida original descrita aquí y cualquier material de planta derivado de ésta, incluyendo las semillas. "Insecticida" como se usa aquí se refiere a cualquier efecto inhibidor sobre un insecto, incluyendo, sin carácter limitativo, reducción de la alimentación, retraso del crecimiento, reducción de la fecundidad, parálisis o muerte. "Fecundidad" comprende todos los aspectos relacionados con la reproducción tales como la capacidad reproductiva, la frecuencia reproductiva y el número de crías. También se incluye en esta invención cualquier material de planta derivado del evento CE43-67B, incluyendo las semillas. El evento CE43-67B exhibe un nuevo genotipo que comprende por lo menos un cásete de expresión. El c sete comprende un promotor apropiado para expresión en plantas ligado en forma funcional a un gen que codifica una toxina insecticida CrylAb, útil en el control de un amplio espectro de plagas de insectos lepidópteros, y una señal de poliadenilación apropiada. Los promotores apropiados pueden aislarse de, inter alia, las plantas. Se han aislado y caracterizado numerosos promotores vegetales, incluyendo promotores constitutivos, intercambiables y/o específicos de los tejidos. Los promotores apropiados pueden seleccionarse del siguiente grupo no limitativo: CaMV35S, FMV35S, Ubiquitina, Act2 , NOS, OCS, virus del rizo de las hojas de Cestrum, Patatina, E9 , interruptor alcA/alcR, interruptor GST, interruptor RMS, oleosina, Gelvina, pequeña sub-unidad de bifosfato de ribulosa, carboxilasa-oxigenasa, actina 7, promotor MR7 (maíz), Gos 9 (arroz), promotores GOS2 , MasOcs (o super promotor), promotor RolD (Agrobacteriam rhizogenes) , promotor SuperMAS, y promotor Suc2 (Arabidopsis) . En una modalidad de la presente invención, el promotor es el promotor de Actina, ACT2 , de Arabidopsis thaliana . También pueden incorporarse elementos adicionales como secuencias potenciadoras en el cásete de expresión para impulsar los niveles de expresión génica, por ejemplo potenciadores de transcripción o traducción, tales como activador de traducción del virus del grabado de tabaco (TEV) , potenciador de CaMV35S, y potenciador de FMV35S. De manera alternativa puede ser aconsejable incluir una secuencia de selección, por ejemplo, para dirigir el transporte de la toxina CrylAb a un compartimiento celular particular. Por ejemplo, si se desea proporcionar la proteína fuera de la célula, entonces puede ligarse una secuencia de selección extracelular al polinucleótido que codifica la proteína CrylAb. Otros ejemplos de selección incluyen la selección a un organelo o compartimiento específico intracelular, por ejemplo al retículo endoplasmático usando una secuencia de retención "KDEL" . Se han aislado y caracterizado numerosas seriales de poliadenilación. Algunos ejemplos de seriales de poliadenilación apropiadas funcionales en las plantas incluyen la del gen de la nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens, del gen del inhibidor de proteasa II y del gen de alfa-tubulina (EP-A 652,286). En una modalidad de la presente invención, la señal de poliadenilación es la del gen nos de Agrobacteri um tumefaciens . El polinucleótido que codifica la proteína CrylAb puede optimizarse en sus codones o alterarse de otro modo para potenciar, por ejemplo, la traducción una vez que se incorpora en el material de planta. Dicha optimización de codones puede usarse además para alterar la estructura secundaria prevista de la transcripción de ARN producida en cualquier célula transformada, o para destruir elementos de inestabilidad de ARN crípticos presentes en la transcripción no alterada, aumentando de este modo la estabilidad y/o la variabilidad de la transcripción en las células transformadas (Abier and Green (1996) Plant Molecular Biology (32) pp. 63-78) . La optimización del codón puede emplearse además para alterar una secuencia codificadora de ADN heterólogo de modo tal que se asemeje mucho más a la secuencia de codificación de un gen del huésped. Por ejemplo, un gen bacteriano puede optimizarse en sus codones para aumentar la relación de bases citocina y guanina a bases adenina y timina de modo tal que se asemeje más aún al gen de la planta (por ejemplo, algodón o maíz) , y aún codificar la misma proteína. Dicha optimización de codones puede realizarse de acuerdo con las tablas de use de codones estándar. En un precursor para el evento CE43-67B, se encuentra un segundo cásete que comprende un gen que, cuando se expresa, puede usarse como marcador seleccionable. Se han caracterizado numerosos marcadores seleccionables, incluyendo algunos que confieren tolerancia a los antibióticos y otros que confieren tolerancia a los herbicidas. Algunos ejemplos de genes marcadores seleccionables apropiados incluyen aquellos que confieren tolerancia a la higromicina, canamicina o gentamicina. Otros marcadores seleccionables apropiados incluyen genes que confieren resistencia a los herbicidas tales como herbicidas basados en glifosato o resistencia a las toxinas tales como eutipina. Otras formas de selección también se encuentran disponibles tales como los sistemas de selección basados en hormonas tales como el sistema de Multi Auto Transformation (MAT) de Hiroyrasu Ebinuma y otros (1997) PNAS Vol. 94 pp, 2117- 2121; sistemas de selección visual que usan la proteína de fluorescencia verde conocida, (13-glucoronidasa; y cualquier otro sistema de selección tal como mañosa isomerasa (Positech™) , xilosa isomerasa y 2-desoxiglucosa (2-DOG) . En una modalidad de la presente invención, el gen marcador seleccionable es aquel que confiere tolerancia a la higromicina. Este segundo cásete de expresión es útil para seleccionar transformantes durante y después de la transformación de la planta. En forma opcional, puede agregarse del precursor del evento CF43-67B luego de la transformación para dejar solo el evento CE43-67B. El evento CE43-67B per se no comprende un cásete marcador seleccionable. Además, los casetes de expresión adicionales están incluidos en forma opcional en el evento CE43-67B. Por ejemplo éstos pueden proporcionar genes que codifiquen distintas toxinas insecticidas tales como VIP3A. De manera alternativa, pueden proporcionar otros beneficios deseables tales como resistencia a los herbicidas. Los casetes de expresión pueden introducirse en la planta en el mismo o en diferentes plásmidos. Si los casetes de expresión están presentes en el mismo plásmido y se introducen en la planta a través de un método de transformación basado en Agrobacteri um, pueden estar presentes dentro de las mismas o de diferentes regiones de ADN T. En una modalidad de la presente invención, se encuentran dos casetes de expresión en regiones de ADN T diferentes dentro de plásmidos diferentes. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención se proporciona un polinucleótido que comprende una primera región que comprende la secuencia presentada como SEC ID NO: 1 y una región adicional que comprende la secuencia presentada como SEC ID NO: 2. En una modalidad adicional dicho polinucleótido comprende una región que puede amplificarse a través de una reacción de amplificación cuya reacción usa los iniciadores presentados como SEC ID NO: 5 y 6 o SEC ID NO: 11 y 12. Incluso en otra modalidad adicional dicho polinucleótido comprende aún otra región que codifica un gen CrylAb de Bacillus thuringi ensis . Incluso en otra modalidad adicional dicho polinucleótido comprende una región que proporciona el promotor de actina de Arabi?opsis funcionalmente ligado a dicho gen CrylAb. En un aspecto adicional de la invención se proporciona un polinucleótido que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO : 3. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 25 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende la secuencia presentada como SEC ID NO: 3. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 35 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 246 hasta 305 de la SEC ID NO: 1. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 40 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 246 hasta 305 de la SEC ID NO: 1. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 246 hasta 305 de la SEC ID NO: 1. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende la secuencia presentada como nucleótidos 246 hasta 305 de la SEC ID NO: 1. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO: 1, dicho polinucleótido contiene la unión de nucleótidos entre los nucleótidos 275 y 276 de la SEC ID NO: 1. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende la secuencia presentada como SEC ID NO: 1. Se proporciona, además, una secuencia que es el complemento de una secuencia descrita con anterioridad. En un aspecto adicional de la invención se proporciona un polinucleótido que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 25 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende la secuencia presentada como SEC ID NO: 4. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 35 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 104 hasta 163 de la SEC ID NO: 2. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 40 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 104 hasta 163 de la SEC ID NO: 2. Se proporciona, de manera adicional, un polinucleótido que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 104 hasta 163 de la SEC ID NO: 2. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende la secuencia presentada como nucleótidos 104 hasta 163 de la SEC ID NO: 2. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende por lo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO: 2, dicho polinucleótido contiene la unión de nucleótidos entre los nucleótidos 133 y 134 o SEC ID NO: 2. Se proporciona, además, un polinucleótido que comprende la secuencia presentada como SEC ID NO: 2. Se proporciona, además, una secuencia que es el complemento de una secuencia descrita con anterioridad. En una modalidad adicional se proporciona una planta de algodón que comprende un polinucleótido descrito con anterioridad. Incluso en otra modalidad adicional se proporciona una semilla de algodón que comprende el polinucleótido como se describió con anterioridad. En una modalidad adicional, dicha planta es una planta de algodón insecticida que es un precursor para el evento CE43-67B, el evento CE43-67B per se, o una planta derivada de ésta que aún comprende un polinucleótido como se describió con anterioridad. En una modalidad adicional dicha planta comprende un segundo cásete de expresión. En una modalidad dicho segundo cásete de expresión codifica una toxina insecticida VIP3A. En otra modalidad, dicho segundo cásete de expresión codifica una proteína que proporciona resistencia a un herbicida que comprende glifosato ácido o una de sus sales aceptables desde el punto de vista agrícola. Un experto en la técnica está familiarizado con los métodos de transformación de plantas. En particular, se han caracterizado dos técnicas principales en un amplio intervalo de especies de plantas: transformación por Agro£>acteriuj7? y transformación por transferencia directa de ADN. La transformación mediada por Agrobacterium es un método utilizado comúnmente para la transformación de plantas dicotiledóneas. El ADN foráneo que debe introducirse en la planta se clona en un vector binario entre las secuencias de consenso del borde izquierdo y derecho. Esta es la región de ADN T. El vector binario se transfirió a una célula de Agrobacteri um, que posteriormente se usa para infectar el tejido de la planta. La región de ADN T del vector que comprende el ADN foráneo se inserta en el genoma de la planta. El cásete con el gen marcador y el cásete con el gen del rasgo pueden estar presentes en la misma región de ADN T, diferentes regiones de ADN T en el mismo vector, o incluso diferentes regiones de ADN T en diferentes vectores. En una modalidad de la presente invención, los casetes están presentes en diferentes regiones de ADN T en diferentes vectores .

De manera alternativa, puede usarse transferencia directa de ADN para introducir el ADN directamente en la célula de planta. Un método apropiado de transferencia directa puede ser el bombardeo de células de plantas con un vector que comprende el ADN para inserción usando una pistola de partículas (transformación biolística mediada por partículas); otro método establecido, "whis ers", incluye el recubrimiento del ADN sobre fibras de carburo de silicio sobre las cuales se implantan las células. Otros métodos para transformar células de plantas incluyen transformación de protoplastos (en forma opcional en presencia de polietilenglicoles); sonicación de tejidos de plantas, células o protoplastos en un medio que comprende el polinucleótido o vector; microinserción del polinucleótido o vector en el material de planta (en forma opcional empleando la técnica "whiskers" con carburo de silicio), electroporación y similares. Luego de la transformación, las plantas transgénicas se regeneran del tejido de planta transformado, y se selecciona la progenie que posee el ADN foráneo usando un marcador apropiado tal como de resistencia a la higromicina. El experto en la técnica está familiarizado con la composición de los medios de regeneración apropiados. El marcador seleccionable puede segregarse de los eventos transgénicos por métodos de producción de plantas convencionales, produciendo, de este modo, por ejemplo, el evento CE43-67B. Una planta de la invención, como se describe aquí, tiene un efecto insecticida sobre los insectos de una o más especies del grupo que comprende Heliothis sp. y Helicoverpa sp. que pueden infestarla. "Infestar" como se usa aquí se refiere a un ataque, colonización, alimentación o daño de cualquier forma por uno o más insectos. De este modo, por ejemplo, la planta de la presente invención proporcionará un mecanismo de autodefensa contra la infestación generada por insectos tales como Helicoverpa zea (gusano del algodón) . Como resultado, se requiere un número reducido de aspersiones de insecticida durante el cultivo de dicha planta cuando se compara con una planta de algodón no transgénica de la misma variedad y la pérdida de rendimiento por causa de los plagas de insectos se mantiene en un nivel mínimo. La presente invención no se limita al evento CE43-67B en sí mismo, aunque se extiende en forma adicional para incluir cualquier material de planta derivado de asta, incluyendo las semillas en la medida que contengan por lo menos uno de los polinucleótidos de la presente invención. La presente invención incluye, sin carácter limitativo, plantas que derivan de una cruza con el evento CE43-67B o uno de sus derivados por cultivo tradicional u otros métodos. La invención incluye, además, material de planta derivado del evento CE43-67B que puede comprender secuencias de polinucleótidos adicionales, modificadas, menos de ellas cuando se compara con el CE43-67B o exhibir otras características fenotípicas. Por ejemplo, puede desearse transformar el material de planta derivado del evento CE43-67B para generar un nuevo evento que posee un rasgo adicional, tal como un segundo gen de resistencia a los insectos. Este proceso se conoce como apilamiento. El segundo gen de resistencia a los insectos puede codificar, por ejemplo lectinas insecticidas, inhibidores de proteasas insecticidas y proteínas insecticidas derivadas de las especies de Bacill us thuringiensis , Xenorhab?us nematophil us, o Photorab?us l uminescens . En un aspecto, el segundo gen de resistencia a los insectos codifica un gen insecticida de Bacillus thuringiensis . Con preferencia, el segundo gen de resistencia a los insectos codifica un gen VIP de Bacillus thuringiensis , cuyo gen VIP produce una toxina con un modo de acci6n diferente o sitio de unión en los intestinos del insecto para CrylAb para el control de diferentes especies de insectos. El gen VIP puede ser, por ejemplo, VIP3A. La presente invención proporciona además material de planta que deriva del evento CE43-67B que posee un rasgo adicional tal como resistencia a los herbicidas, resistencia a los nematodos o resistencia a los hongos. En una modalidad, dicho rasgo adicional es la resistencia a los herbicidas. El rasgo de resistencia a los herbicidas puede proporcionarse, por ejemplo, por una enzima de degradación de herbicidas, o una enzima resistente específica de un sitio blanco. En una modalidad adicional, dicho rasgo de resistencia a los herbicidas proporciona resistencia a un herbicida que comprende glifosato ácido o una de sus sales aceptables desde el punto de vista agrícola. En una modalidad adicional aún, dicho rasgo de resistencia a los herbicidas se proporciona a través de un gen que codifica la EPSP sintasa o uno de sus mutantes. La presente invención proporciona, además, un método para controlar insectos que comprende proporcionar el evento CE43-67B o material de planta que deriva del evento CE43-67B en un lugar (locus) en el cual se alimentan los insectos. La invención incluso proporciona, además, un método de controlar insectos que comprende proporcionar el evento CE43-67B o material de planta que deriva del evento CE43-67B en un locus en el cual se alimentan los insectos, y aplicar otros productos agroquímicos a dicho material de planta tales como herbicidas, fungicidas y otros compuestos insecticidas incluyendo otras proteínas insecticidas. Algunos ejemplos de posibles compuestos insecticidas incluyen lectinas insecticidas, inhibidores de proteasa insecticidas y proteínas insecticidas que derivan de especies de Bacillus thuringiensis, Xenorhab?us nematophil us , o Photorab?us l uminescens . Algunos ejemplos de posibles productos químicos incluyen piretroides, carbamatos, imidacloprid, organoclorados y macromoléculas tales como espinosad, abamectina o emamectina. La presente invención proporciona, además, un método para detectar material de planta que deriva del evento CE43-67B, dicho método comprende: (a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico del material de planta que desea evaluarse; (b) obtener un par de iniciadores que sean apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia seleccionada del grupo formado por: (i) una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3 y su complemento y (ii) una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4 y su complemento; (c) agregar dicho par de iniciadores a dicha muestra y los medios para realizar una reacción de amplificación; (d) realizar una reacción de amplificación; y (e) visualizar la secuencia amplificada de este modo. Existen muchos métodos de amplificación que pueden usarse de acuerdo con los métodos de la invención. El principio subyacente, una técnica conocida para aquellos expertos en el arte, es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) . El producto de amplificación de una reacción de PCR puede visualizarse coloreando con bromuro de etidio y excitación con luz UV, normalmente luego de la separación por tamaños usando electroforesis con gel de agarosa. En una modalidad particular de la invención pueden usarse variaciones de los principios de PCR tales como TaqManm. Dichas técnicas incluyen la rotulación de por lo menos uno de los iniciadores involucrados en el proceso de amplificación con un tinte fluorescente. Cuando no se une, el iniciador adopta una conformación tal que no puede detectarse ninguna fluorescencia. Sin embargo, cuando el iniciador se une a una parte de ADN, la conformación cambia y puede detectarse fluorescencia. De este modo, el proceso de amplificación puede monitorearse en tiempo real, y la intensidad de fluorescencia corresponde directamente al nivel de amplificación. El análisis TaqManTm puede ser útil por ejemplo, para detectar la presencia del evento CE43-67B en un ámbito de algodón de tipo silvestre, o para detectar la presencia perjudicial de CE43-67B en otro germoplasma. Otras modalidades de la presente invención incluyen, sin carácter limitativo, PCR RACE. Una modalidad adicional de la presente invención incluye el uso de PCR por múltiplex para distinguir entre material de planta con CE43-67B homocigoto y material de planta CE43-67B heterocigoto. Resulta conocido para los expertos en la técnica como prueba de cigocidad, e incluye el uso de tres iniciadores de PCR que se unen en forma específica a las partes del genoma del algodón y/o ADN insertado. La presencia o ausencia de cada uno de los dos productos de amplificación de tamaños particulares indica si la muestra experimental es homocigoto o heterocigoto para CE43-67B. Los iniciadores apropiados para usar en dicha prueba de cigocidad se presentan como SEC ID Nos 5, 6 y 8. Los iniciadores apropiados alternativos para usar en dicha prueba de cigocidad se presentan como SEC ID Nos 10, 11 y 12. Las pruebas de cigocidad también pueden diseñarse usando iniciadores marcados con sondas fluorescentes diferentes de modo tal que el color de la fluorescencia de los productos de amplificación indique si la muestra experimental es hemicigota u homocigota para CE43-67B. La presente invención proporciona, además, un método para detectar una planta que contiene el polinucleótido presentado como SEC ID NO: 1, dicho método comprende: (a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; (b) obtener un par de iniciadores que sean apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3 y su complemento; (c) agregar dicho par de iniciadores a dicha muestra y los medios para realizar una reacción de amplificación; (d) realizar una reacción de amplificación; y (e) visualizar la secuencia amplificada de este modo. La presente invención proporciona, además, un método como el que se describió con anterioridad en el cual dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3 y su complemento incluso en otra modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 25 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3 y su complemento. Incluso en otra modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende la secuencia presentada como SEC ID NO: 3 y su complemento. La presente invención inclusive proporciona, además, un método como el que se describió con anterioridad en el cual la secuencia que debe amplificarse a través de dicha reacción de amplificación comprende una secuencia que contiene la unión de nucleótidos de la inserción de cásete transgen-secuencia genómica (g-g) provista como nucleótidos 275/276 de la SEC ID NO : 1. El experto en la técnica apreciará que esta unión puede usarse para caracterizar y de este modo identificar el evento y así se encuentra dentro del ámbito del experto en la técnica diseñar y producir secuencias de iniciadores de oligonucleótidos que resulten apropiadas para usar en una reacción de amplificación para amplificar la secuencia que comprende la unión mencionada con anterioridad. El experto en la técnica también apreciará que las secuencias de iniciadores apropiados para usar en una reacción de amplificación pueden diseñarse en base a la secuencia genómica que es 5' es decir en dirección 5' del nucleótido número 1 de la SEC ID NO: 1 y la inserción o secuencia genómica que esta 3', es decir en dirección 3', del nucleótido número 545 de la SEC ID NO: 1. La presente invención proporciona, además, un método para detectar una planta que contiene el polinucleótido presentado como SEC ID NO: 1 dicho método comprende: (a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; (b) obtener un par de iniciadores que sean apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 35 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 246 hasta 305 de la SEC ID NO: 1 y su complemento, (c) agregar dicho par de iniciadores a dicha muestra y los medios para realizar una reacción de amplificación; (d) realizar una reacción de amplificación; y (e) visualizar la secuencia amplificada de este modo. En una modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 40 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 246 hasta 305 de la SEC ID NO: 1. En una modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 246 hasta 305 de la SEC ID NO: 1. En una modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende la secuencia presentada como nucleótidos 246 hasta 305 de la SEC ID NO: 1. Incluso en otra modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO: 1 dicha secuencia contiene la unión de nucleótidos entre los nucleótidos 275 y 276 de la SEC ID NO: 1. Los iniciadores a los que se hace referencia con anterioridad son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar las secuencias mencionadas con anterioridad y sus secuencias complementarias . La presente invención incluso proporciona, además, una secuencia que es el producto de la amplificación del método descrito con anterioridad. La presente invención incluso proporciona, además, una secuencia que es el complemento de una secuencia descrita con anterioridad. La presente invención incluso proporciona, además, un método como se mencionó con anterioridad en el cual el producto amplificado de este modo comprende una secuencia como se describió con anterioridad. La presente invención incluso proporciona, además, un método como el que se describió con anterioridad en el cual dicho par de iniciadores comprende un iniciador sentido que comprende una secuencia que cuando se lee en la dirección 5'- 43' es idéntica a una región de la secuencia presentada como nucleótidos 1 a 275 de la SEC ID NO: 1 y el iniciador inverso comprende una secuencia que cuando se lee en la dirección 5 ' -^43 ' es idéntica a una región del complemento inverso de la secuencia presentada como nucleótidos 276 hasta 545 de la SEC ID NO: 1. El experto en la técnica reconocerá que puede crearse un número de iniciadores apropiados para usar en los métodos de la invención en base a las secuencias provistas aquí y sus secuencias complementarias. Además de esto, como se mencionó con anterioridad, dichas secuencias de iniciadores pueden basarse en la secuencia 5' y 3' (en dirección 5 ' y en dirección 3') de las secuencias presentadas co o SEC ID NO: 1 y se encuentra dentro de la capacidad de una persona experimentada en el arte identificar dicha secuencia 5 ' y 3 ' . En una modalidad particular de la invención dicho par de iniciadores comprende las secuencias presentadas como SEC ID NO: 5 y 6. En una modalidad adicional de la invención dicho par de iniciadores comprende las secuencias presentadas como SEC ID NO: 9 y 10. En una modalidad adicional de la invención dicho par de iniciadores comprende las secuencias presentadas como SEC ID NO: 11 y 12. La presente invención proporciona, además, un método para detectar una planta que contiene el polinucleótido presentado como SEC ID NO: 2 dicho método comprende: (a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; (b) obtener un par de iniciadores que sean apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4 y su complemento, (c) agregar dicho par de iniciadores a dicha muestra y los medios para realizar una reacción de amplificación; (d) realizar una reacción de amplificación; y (e) visualizar la secuencia amplificada de este modo. La presente invención proporciona, además, un método como el que se describió con anterioridad en el cual dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4 y su complemento. Incluso en otra modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 25 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4 y su complemento. Incluso en otra modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende la secuencia presentada como SEC ID NO: 4 y su complemento. La presente invención incluso proporciona, además, un método como el que se describió con anterioridad en el cual la secuencia que debe amplificarse a través de dicha reacción de amplificación comprende una secuencia que contiene la unión de nucleótidos de la secuencia genómica-inserción del cásete transgénico (t-a) provista como nucleótidos 133/134 de la SEC ID NO: 2. El experto en la técnica apreciara que esta unión puede usarse para caracterizar y de este modo identificar el evento y así se encuentra dentro del ámbito de dicha persona experimentada diseñar y producir secuencias de iniciadores de oligonucleótidos que resulten apropiadas para usar en una reacción de amplificación para amplificar la secuencia que comprende la unión mencionada con anterioridad. El experto en la técnica también apreciara que las secuencias de iniciadores apropiados para usar en una reacción de amplificación pueden diseñarse en base a la inserción o secuencia genómica que esta 5', es decir en dirección 5', del nucleótido número 1 de la SEC ID NO: 2 y la secuencia genómica que esta 3', es decir en dirección 3', de la secuencia genómica número de nucleótido 1198 de la SEC ID NO: 2. La presente invención proporciona, además, un método para detectar una planta que contiene el polinucleótido presentado como SEC ID NO: 2 dicho método comprende: (a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; (b) obtener un par de iniciadores que sean apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 35 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 104 hasta 163 de la SEC ID NO: 2 y su complemento, (c) agregar dicho par de iniciadores a dicha muestra y los medios para realizar una reacción de amplificación; (d) realizar una reacción de amplificación; y (e) visualizar la secuencia amplificada de este modo. En una modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 40 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 104 hasta 163 de la SEC ID NO: 2. En una modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 104 hasta 163 de la SEC ID NO: 2. En una modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende la secuencia presentada como nucleótidos 104 hasta 163 de la SEC ID NO: 2. Incluso en otra modalidad adicional dichos iniciadores son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO: 2 dicha secuencia contiene la unión de nucleótidos entre los nucleótidos 133 y 134 de la SEC ID NO: 2. Los iniciadores a los que se hace referencia con anterioridad son apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar las secuencias mencionadas con anterioridad y sus secuencias complementarias . La presente invención incluso proporciona, además, una secuencia que es el producto de la amplificación del método descrito con anterioridad. La invención proporciona, además, una secuencia que es el complemento de una secuencia descrita con anterioridad.

La presente invención incluso proporciona, además, un método como se mencionó con anterioridad en el cual el producto amplificado de este modo comprende una secuencia como se describió con anterioridad. La presente invención incluso proporciona, además, un método como el que se describió con anterioridad en el cual dicho par de iniciadores comprende un iniciador sentido que comprende una secuencia que cuando se lee en la dirección 5'->3' es idéntica a una región de la secuencia presentada como nucleótidos 1 a 133 de la SEC ID NO: 2 y un iniciador inverso que comprende una secuencia que cuando se lee en la dirección 5 '->3' es idéntica a una región del complemento inverso de la secuencia presentada como nucleótidos 134 hasta 1198 de la SEC ID NO: 2. El experto en la técnica reconocerá que puede crearse un número de iniciadores apropiados para usar en los métodos de la invención en base a las secuencias provistas aquí y sus secuencias complementarias. Además de esto, como se mencionó con anterioridad, dichas secuencias de iniciadores pueden basarse en la secuencia 5' y 3' (en dirección 5 ' y en dirección 3') de las secuencias presentadas como SEC ID NO: 2 y se encuentra dentro de la capacidad de una persona experimentada en el arte identificar dicha secuencia 5' y 3 ' . La presente invención incluso proporciona, además, un método para detectar material de planta que deriva del evento CE43-67B, dicho método comprende: (a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; (b) obtener una sonda que sea capaz de hibridarse a una secuencia seleccionada del grupo formado por una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3 y una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4; (c) agregar por lo menos una de las sondas del paso (b) a dicha muestra en condiciones que permitan que dicha sonda se hibride con un ácido nucleico complementario dentro de dicha muestra; (d) eliminar sustancialmente la sonda no hibridada mediante. lavado; y (e) detectar la sonda hibridada de este modo para identificar si la muestra es del evento CE43-67B. La presente invención proporciona, además, un método para detectar una planta que contiene el polinucleótido presentado como SEC ID NO: 1 dicho método comprende (a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; (b) obtener una sonda que sea capaz de hibridarse a una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3; (c) agregar la sonda a dicha muestra en condiciones que permitan que dicha sonda se hibride con un ácido nucleico complementario dentro de dicha muestra; (d) eliminar sustancialmente la sonda no hibridada mediante lavado; y (e) detectar la sonda hibridada de este modo para identificar si la muestra contiene dicho polinucleótido . La presente invención proporciona, además, un método para detectar una planta que contiene el polinucleótido presentado como SEC ID NO: 2, dicho método comprende (a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; (b) obtener una sonda que sea capaz de hibridarse a una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4; (c) agregar la sonda a dicha muestra en condiciones que permitan que dicha sonda se hibride con un ácido nucleico complementario dentro de dicha muestra; (d) eliminar sustancialmente la sonda no hibridada mediante lavado; y (e) detectar la sonda hibridada de este modo para identificar si la muestra contiene dicho polinucleótido . En una modalidad particular de los métodos descritos con anterioridad dicha sonda comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos. Incluso en otra modalidad adicional de dicho método, dicha sonda comprende por lo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO: 1, dicha sonda que contiene la unión de nucleótidos entren nucleótidos 275 y 276 de la SEC ID NO: 1 o por lo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO: 2, dicha sonda contiene la unión de nucleótidos entre los nucleótidos 133 y 134 de la SEC ID NO: 2. Incluso en otra modalidad adicional de la invención, dicha sonda puede comprender un fragmento de un polinucleótido relevante descrito dentro de esta memoria descriptiva. En particular, dicha sonda puede comprender una secuencia de polinucleótidos que es capaz de hibridarse con una secuencia que caracteriza el evento descrito en la presente solicitud. Incluso en otra modalidad adicional de dicho método, dicho lavado se lleva a cabo en condiciones de alta severidad. Dicha sonda puede generarse y marcarse usando técnicas conocidas para el experto en la técnica. La sonda puede ser, por ejemplo, un producto de PCR o fragmento de digestión por restricción. En una modalidad adicional, la sonda como se describe aquí puede marcarse con un marcador fluorescente, radiactivo, enzimático u otro apropiado para permitir que se detecte la hibridación. Incluso en otra modalidad adicional de la presente invención se proporciona un método de hibridar una sonda al ácido nucleico complementario dentro de la muestra en condiciones rigurosas y detectar si la sonda se ha hibridado. Las condiciones de hibridación de alta severidad son conocidas para aquellas personas con experiencia en el arte y comprenden, por ejemplo: hibridación a una temperatura de aproximadamente 65°C en una solución que contiene 6 x SSC, 0.01% SDS y 0.25% de leche descremada en polvo, seguido de enjuague a la misma temperatura en una solución que contiene 0.2 x SSC y 0.1% SDS. El experto en la técnica puede seleccionar, en forma alternativa las siguientes condiciones de hibridación, a saber, hibridación a una temperatura de entre 60°C y 65°C en solución salina regulada en pH con citrato de potencia 0.3 que contiene 0.1% SDS seguido de enjuague a la misma temperatura con solución salina regulada en pH con citrato de potencia 0.3 que contiene 0.1% SDS. El experto en la técnica puede seleccionar, en forma adicional condiciones de hibridación igualmente conocidas como condiciones de "alta severidad" . Las técnicas apropiadas para detectar material de planta que deriva del evento descrito aquí en base al principio de hibridación incluyen, sin carácter limitativo Transferencias Southern, Transferencias Northern e hibridación en el sitio. El experto en la técnica está familiarizado con estas técnicas. Normalmente, incluyen incubar una sonda con una muestra, lavar para eliminar la sonda no adherida, y detectar si la sonda se ha hibridado. Dicho método de detección depende del tipo de marcador adherido a la sonda - por ejemplo, una sonda marcada en forma radiactiva puede detectarse por exposición a y desarrollo de una película de rayos x. De manera alternativa, una sonda marcada enzimáticamente puede detectarse por conversión de un sustrato para producir un cambio de color.

Incluso en un aspecto adicional se proporciona un método para identificar una planta que comprende el evento CE43-67B, dicho método comprende (a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; (b) digerir dicho ADN mediante una enzima de restricción; (c) separar los fragmentos de ADN digeridos y transferir los fragmentos separados de este modo a una membrana; (d) sondear los fragmentos unidos de este modo con una sonda, diseñada como se describió con anterioridad, cuya sonda se ha marcado para permitir su visualización; (e) eliminar la sonda sustancialmente no hibridada; y (f) la sonda hibridada de este modo en la cual el mencionado evento puede caracterizarse por dicha sonda que se hibrida a fragmentos que tienen un tamaño particular. En un aspecto adicional se proporciona un evento del algodón que es capaz de identificarse a través de un método de acuerdo con la invención. En una modalidad particular dicho método es el que está de acuerdo con el párrafo que antecede. La presente descripción incluye, además, un método para detectar una planta que contiene una proteína capaz de ser codificada por un polinucleótido presentado como SEC ID NO: 7, dicho método comprende: (a) preparar un extracto de proteína de la planta que desea evaluarse; (b) proporcionar un anticuerpo que es capaz de unirse a una proteína CrylAb de Bacillus thuringiensis; (c) agregar dicho anticuerpo a dicho extracto en condiciones que permitan que dicho anticuerpo se una a dicha proteína dentro de dicho extracto; y (d) detectar el anticuerpo unido de este modo para identificar si el extracto contiene dicha proteína. La presente descripción incluye, además, un método para detectar una planta que comprende un gen CrylAb de Bacillus thuringiensis, dicho método comprende: (a) preparar un extracto de proteína de la planta que desea evaluarse; (b) proporcionar un anticuerpo que es capaz de unirse a una proteína CrylAb de Bacillus thuringiensis ; (c) agregar dicho anticuerpo a dicho extracto o dicho extracto a dicho anticuerpo en condiciones que permitan que dicho anticuerpo se una a dicha proteína CrylAb dentro de dicho extracto; y (d) detectar el anticuerpo unido de este modo para identificar si el extracto contiene dicha proteína CrylAb. Este método es útil para distinguir entre plantas que expresan CrylAb, tales como plantas que comprenden CE43-67B, y plantas que no expresan CrylAb. Los métodos apropiados para detectar material de planta que deriva del evento descrito aquí cuyos métodos se basan en dicha unión al anticuerpo incluyen, sin carácter limitativo, Western blots, Ensayos Inmunoabsorbentes Ligados a Enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) y espectrometría de masa SELDI . El experto en la técnica está familiarizado con estas y otras técnicas inmunológicas adicionales. Los pasos típicos incluyen incubar una muestra con un anticuerpo que se une a la mencionada proteína, lavar para eliminar el anticuerpo no unido, y detectar si el anticuerpo se ha unido. Muchos métodos de detección se basan en reacciones enzimáticas - por ejemplo el anticuerpo puede marcarse con una enzima tal como peroxidasa de rábano, y luego de la aplicación de un sustrato apropiado, detectarse un cambio en el color. Los anticuerpos apropiados pueden ser monoclonales o policlonales. La presente descripción incluye, además, un método para detectar material de planta que se deriva de un evento descrito aquí, dicho método comprende obtener una muestra para análisis; realizar un extracto de proteína a partir de la dicha muestra; proporcionar una tira para ensayo o tira reactiva diseñada para detectar la presencia de dicha proteína presente dentro de la muestra; incubar la tira para ensayo o tira reactiva con la muestra; y detectar si dicha proteína está presente. Este método puede ser un método de detección basado en anticuerpos para los eventos mencionados aquí y usa tiras para ensayo o tiras reactivas. Los pasos típicos incluyen incubar una tira para ensayo o tira reactiva con una muestra y observar la presencia o ausencia de bandas de color sobre la tira para ensayo o tira reactiva. Las bandas de color son indicativas de la presencia de una proteína en la muestra. Dichas pruebas por tiras para ensayo o tiras reactivas usualmente son específicas para las proteínas, y pueden usarse para una evaluación rápida de las muestras en el campo . En una modalidad, el método inmunológico o tira reactiva utiliza un anticuerpo o anticuerpos, o su/sus fragmento/fragmentos, específicos para el gen CrylAb de Bacillus thuringiensis codificado por la SEC ID NO: 7. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, sin carácter limitativo, Fab, Fab modificado, diFab, Fab', F(ab')2 o fragmento de FV, monómero de inmunoglobulina de cadena liviana o de cadena pesada, FV (scFV) de cadena única o nanocuerpo. El anticuerpo o su fragmento pueden ser monoclonal o policlonal. En una modalidad particular, el anticuerpo es un anticuerpo secretado por las líneas celulares seleccionadas del grupo formado por DSM ACC2723 y DSM ACC2724 (ambas depositadas el 12 de Mayo de 2005 en Deutsche Sarnmlung von Mikroorganismen y Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemania) o un anticuerpo que es capaz de inhibir la unión del CrylAb de un anticuerpo secretado por líneas celulares seleccionadas del grupo formado por DSM ACC2723 y DSM ACC2724. Se destaca que se conocen bien en el arte métodos para producir anticuerpos monoclonales y policlonales y sus fragmentos .

Las tiras para ensayo o tiras reactivas apropiadas y materiales para su uso se describen en la solicitud PCT WO 02/27322 y son, por ejemplo, tiras inmunológicas de flujo lateral que comprenden una membrana de detección de acetato de celulosa, celulosa, nitrocelulosa o nylon, en un soporte plástico. Dicha tira inmunológica puede producirse usando membranas y filtros a través de los cuales pasa un líquido por acción capilar. La proteína presente en la muestra reacciona con los anticuerpos contenidos en la tira inmunológica a medida que recorre la longitud de la tira y se captura en la línea que se torna visible. Los medios de detección apropiados son, por ejemplo, oro coloidal y perlas de látex coloreadas. En una modalidad particular, se rocía una línea de anticuerpo anti-CrylAb específico, como se describió con anterioridad, sobre una tira para ensayo, que está realizada en forma apropiada con nitrocelulosa con un soporte plástico. Se rocía una línea de control con reactivo de anticuerpo anti-ratón en paralelo sobre la primera línea de anticuerpo. Se flanquea la membrana en la parte superior con una almohadilla absorbente y en la parte inferior con una almohadilla que contiene el anticuerpo anti-CrylAb marcado con oro coloidal seco. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-CrylAb marcado con oro coloidal es diferente del primer anticuerpo rociado como línea de prueba. En una modalidad particular, el anticuerpo anti-CrylAb marcado con oro coloidal es el anticuerpo secretado por la línea celular DSM ACC2723 y el anticuerpo rociado en la línea de prueba es el anticuerpo secretado por la línea celular DSM ACC2724. Una almohadilla de aplicación de la muestra flanquea la almohadilla de oro coloidal. En el uso, la almohadilla de aplicación de la muestra se coloca en una muestra de tejido extraído o se aplica esta muestra a la almohadilla de otro modo, por ejemplo, con el uso de una pipeta. Cualquier proteína CrylAb incluida dentro de la muestra asciende por la tira y se une al anticuerpo anti-CrylAb marcado con oro coloidal. A medida que continúa el ascenso por la tira, la proteína también se une al anticuerpo anti-CrylAb en la línea de prueba. El exceso de conjugado de oro se captura en la línea de control con reactivo. En una prueba positiva, es decir, si CrylAb está presente en la muestra, aparece una doble línea roja: la línea inferior indica la presencia de CrylAb mientras que la línea superior es la línea de control que señala un dispositivo que funciona en forma apropiada. Incluso en un aspecto adicional de la invención se proporciona un kit de partes que comprende un par de iniciadores como se describió con anterioridad e instrucciones para realizar el método como se describió con anterioridad y medios para realizar una reacción de amplificación y en forma opcional medios para preparar la muestra que desea evaluarse. Incluso en otra modalidad adicional se proporciona un kit de partes que comprende un anticuerpo como se describió con anterioridad e instrucciones para realizar el método como se describió con anterioridad y medios para realizar el método como se describió con anterioridad y en forma opcional medios para preparar la muestra que desea evaluarse. Incluso en otra modalidad adicional de la presente invención, dicho kit de partes puede comprender tecnología de detección por amplificación de ADN tal como PCR o TaqManTm. Incluso en otra modalidad adicional de la presente invención, dicho kit de partes puede comprender tecnología de detección por hibridación de sonda tal como Southern blots, Northern blots o Hibridación in-si tu . En otra modalidad de la presente invención, dicho kit de partes puede comprender tecnología de detección por unión al anticuerpo tal como Transferencias Western, ELISA, espectrometría de masa SELDI, tiras para ensayo o tiras reactivas . En una modalidad adicional de la presente invención, dicho kit de partes puede comprender cualquier combinación de las técnicas de detección antes mencionadas . Incluso en otra modalidad adicional, dicho kit de partes puede comprender en forma de instrucciones uno o más de los métodos descritos con anterioridad. Incluso en un aspecto adicional se proporciona una planta o semilla de acuerdo con la invención que se usa en un método de mejoramiento. Por ejemplo, las plantas pueden usarse para transferir el rasgo que proporciona resistencia a los insectos en una planta del mismo género pero que tiene un germoplasma de fondo diferente. Dicho mejoramiento en un diferente germoplasma puede desearse si la planta se debe cultivar en condiciones en las cuales es favorable un germoplasma alternativo. Los métodos para mejoramiento que pueden usarse para transferir el rasgo en un germoplasma de fondo diferente son conocidos en el arte. Incluso en un aspecto adicional se proporciona el uso de una planta o semilla de acuerdo con la invención para generar material de explantos para usar en un método de transformación de dicho explanto con un rasgo genético adicional. Una vez provisto con los eventos que pueden identificarse a través de los métodos para la presente invención se encuentra dentro de la capacidad del experto en la técnica generar dicho material de explantos y usarlo en procedimientos de transformación adicionales. En forma adicional, una vez provista con los eventos que pueden identificarse a través de los métodos de la presente invención se encuentra dentro de la capacidad del experto en la técnica usar dichos eventos en métodos de cultivo como se describe aquí. De acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de uno o más de los polinucleótidos de la invención como se describió con anterioridad para detectar el evento CE43-67B. En una modalidad, dichos polinucleótidos pueden usarse en un método para detectar el evento CE43-67B como se describió con anterioridad. EJEMPLOS La invención resultará obvia además a partir de los siguientes ejemplos no limitativos en conjunción con los listados de secuencias asociados como se describe a continuación : SEC ID NO 1: evento CE43-67B: Secuencia genómica - Inserto SEC ID NO 2: evento CE43-67B: Inserto - Secuencia genómica SEC ID NO 3: evento CE43-67B: Secuencia genómica -Intersección de inserto SEC ID NO 4: evento CE43-67B: Inserto Intersección de secuencia genómica SEC ID Nos 5 - 6: evento CE43-67B: Iniciadores SEC ID NO 7: evento CE43-67B: secuencia del gen CrylAb SEC ID Nos 8 - 19: evento CE43-67B: Iniciadores Ejemplo 1: Clonación y Transformación 1 . 1 Clonación ?el vector Se usaron técnicas de clonación génica estándar de digestión por restricción y ligación de fragmentos de vectores de laboratorio para construir los vectores de transformación, pNOVI 914 y pNOV4641. El vector pNOVI 914 incluyó un cásete marcador seleccionable que comprende un promotor de Ubiquitina (UBQ3), el intrón UBQ3 , una secuencia génica que codifica una proteína que confiere resistencia a la higromicina, y a una secuencia de poliadenilación nos. El vector pNOV4641 incluyó el cásete de expresión del gen blanco, cuyo cásete comprendió un promotor de Actina (ACT2), el intrón ACT2 , una secuencia que codifica el gen CrylAb que tuvo los codones optimizados para expresión en el maíz, y una secuencia de poliadenilación nos. Los vectores se transformaron en cepa GV3 101 de Agrobacteri um tumefaciens usando técnicas estándar de transformación de Agrobacteri um, y las células transformadas seleccionadas a través de resistencia a los antibióticos. 1 .2 Transformación ?e las plantas Se produjo el evento CE43-67B por transformación mediada por Agrobacterium de Gossypiurn hirsutism L . cv Coker 312. Las semillas de Coker 312 se cosecharon en el invernadero. Se cortaron peciolos blandos de plantas de 3 a 5 semanas de edad, y se esterilizaron por inmersión en etanol 70%. Luego se sumergieron los peciolos en una solución de Clorox 5% + 2 ml/l de Tween 20 durante 20 minutos. Se lavaron los peciolos 3 veces en ddH20. Se cortaron los extremos de los peciolos, y se transfirieron los peciolos a medio precultivo de peciolos (4.3 g/1 de sales de MS, vitaminas B5 (100 mg/l de mio-Inositol, 1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de HCl de piroxidina, 10 mg/l de tiamina HCl) , 30 g/1 de glucosa, 2.4 g/1 de fitogel, pH 7.0) y se dejaron precultivar a la luz a 30°C durante 3 días. Se desarrollaron cultivos de 2 ml de Agrobacteri um que contenían las construcciones pNOV 1914 y pNOV4641 hasta la mañana siguiente en antibióticos apropiados y luego se diluyeron con medio MMSl líquido (4.3 g/1 de sales MS, vitaminas B5 (100 mg/l de mio-inositol, 1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de HCl de piroxidina, 10 mg/l de HCl de tiamina), 0.05 mg/l de 2.4-D, 0.1 m/l de quinetina, 30 g/1 de glucosa, pH 6.5) hasta una DO660 de entre 0.1 y 0.2. Se cortaron los extremos de los peciolos y se colocaron en 10 a 20 ml de solución bacteriana en una plato de petri estéril. Una vez en la solución, se cortaron los peciolos en sentido longitudinal y luego se cortaron en secciones de 2 cm. Luego de que los explantos de peciolos se remojaron en la solución bacteriana durante 5 hasta 10 minutos, se transfirieron a placas de co-cultivo (la misma receta que el líquido MMS 1 con la incorporación de 2.4 g/1 de Phytagel) superpuesto con papeles filtro estériles, y se dejaron co-cultivar a 24°C durante 48 a 72 horas en baja intensidad de luz. Se transfirieron explantos de co-cultivo a medio MMS 1 (receta como para el medio líquido MMS 1, en forma adicional con 2.4 g/1 de fitogel) que contiene 500 mg/l de cefotaxima y 10 mg/l de higromicina, y se incubaron a 30°C bajo un ciclo de luz de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Se transfirieron los explantos a medio fresco luego de 2 semanas, y cada 4 hasta 6 semanas a partir de entonces hasta que se formó el callo. Una vez que los callos fueron del tamaño de una arveja de jardín, se retiraron de los explantos y se transfirieron a medio MMS 1 fresco que contenía 500 mg/l de cefotaxima y 10 mg/l de higromicina, y se mantuvieron en cultivo de tejido subcultivando cada 4 semanas según corresponda. Se separaron completamente 1.5 g de tejido de callo y se colocaron en un matraz Erlenmeyer de 50 ml que contenía 10 ml de medio líquido MMS2 (4.3 g/1 de sales MS, vitaminas B5 (100 mg/l de mio-inositol , 1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de HCl de piroxidina, 10 mg/l de HCl de tiamina), 1.9 g/1 de KN03, 30 g/1 de glucosa, pH 6.5). El callo suspendido se agitó a 100 rpm a la luz a 30°C durante dos semanas. Las células en el medio de suspensión se enjuagaron 3 veces en medio MMS2 líquido, se re-suspendieron y se colocaron en placas sobre medio MMS2 sólido (receta de acuerdo con medio MMS2 líquido, en forma adicional con 2.4 g/1 de fitogel). Una vez colocado en placas, se retiró el exceso de medio MMS2 líquido, y se incubaron las placas a 30°C a la luz. Se chequearon las placas para evaluar el desarrollo embrionario somático cada semana. Los embriones somáticos se formaron dentro de 1 a 2 meses. Este paso de suspensión líquida pudo repetirse múltiples veces hasta que se formó un callo embriogénico o embriones somáticos . Los embriones somáticos se transfirieron a medio de GE (terminación embrionaria) (2.65 g/1 de sales MS modificación No. 4 (Duchefa) , 1.9 g/1 de KN0 , vitaminas B5 (como anteriormente) , 30 g/1 de glucosa, 1 g/1 de glutamina y 0.5 g/1 de asparagina, pH 6.5), y sub-cultivado para medio de GE fresco cada 3 a 4 semanas . Una vez que los embriones somáticos se tornaron verdes y tenían más de 2 cm de longitud, se colocaron en placas con las raíces hacia abajo en medio GE. En todas las etapas de la regeneración, se evitó que los plantines en crecimiento alcanzaran las tapas o los laterales de sus contenedores para evitar la caída de hojas. Los embriones germinados con 1 a 2 hojas reales se transfirieron a medio de GE en recipientes de Greiner de 175 ml . Los plantines fuertes con hojas reales se transfirieron a jardineras con turba estéril expandida con dH20 en 175 ml de Greiners y se transfirieron a turba en macetas de 7.62 centímetros. Se aclimataron las plantas en un propagador para plantas a alta humedad en una cabina de cultivo en condiciones de 14 horas de luz de día a 30°C y 10 horas de oscuridad a 20°C. Una vez que se observó el crecimiento de raíces a través de orificios de drenaje de la maceta, se transfirieron a macetas más grandes que contenían 50% de John Innes No . 3 y 50% de turba suplementada con Osmocote, y se colocaron en el invernadero. 1 . 3 iáentif icación y selección ?e productos transgénicos Se evaluaron las plantas transgénicas putativas por PCR para determinar la presencia del gen CrylAb. Se identificaron y se seleccionaron los eventos positivos usando bioensayos para determinar la actividad insecticida. La caracterización molecular de las líneas insecticidas se llevó a cabo por análisis de Southern Blot. Las semillas Ti de varios eventos se observaron en un ensayo en campo para determinar la resistencia de los insectos y la calidad agronómica. El evento CE43-67B se eligió en base a caracterización molecular, niveles de expresión de proteínas según la identificación por ELISA, actividad insecticida contra Heliothis virescens y Spodoptera Ii ttoralis y rendimiento en campo. El cásete marcador seleccionable de higromicina se segregó usando cultivo de plantas convencional para producir el evento CE43-67B. 1 . 4 Verificación de la secuencia ?e CE43-67B Se aisló ADN genómico del evento CE43-67B. Este se uso en la secuenciación o las uniones del sitio de inserción de ADN con el ADN del algodón genómico en el evento CE43-67B (SEC ID Nos: 1 y 2), usando técnicas estándar de secuenciación de ADN. Ejemplo 2: Detección específica del evento CE43-67B mediante PCR 2.1 Extracción de ADN Se extrajo ADN de tejido de la hoja usando el Sistema de ADN Wizard™ Magnetic 96 (Promega, #FF3760) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con un paso adicional al comienzo del protocolo: luego del molido del material de la hoja, se agregó a cada cavidad 0.9 ml de Regulador de pH de Extracción de Algodón (Trix 0.2M pH 8.0, EDTA 50 mM, NaCl 0.25M, 0.1% v/v de 2-mercaptoetanol , 2.5% p/v de polivinilpirrolidona), el tejido de la planta se re-suspendió y la placa se centrifugó a 4.000 rpm (2755 g) durante 10 minutos. Luego de aspirar y descartar el sobrenadante, se agregaron 300 µl de Regulador de pH de Lisis A (Promega) y se siguió el protocolo del fabricante desde este punto. Este procedimiento generó aproximadamente 85 µl de ADN gnómico purificado a una concentración de aproximadamente 10 ng/ul . 2.2 Reacciones PCR específicas del evento Se configuraron reacciones de PCR de 25 µl PCR usando una mezcla de reacción estándar que comprende: 1 x Jumpstart RED TaqPCR (Sigma, #P-1 107) 0.5 uM de iniciador 1 (SEC ID NO: 9) 0.5 uM de iniciador 2 (SEC ID NO: 10) 10 ng de ADN genómico ddH20 Las reacciones de PCR se calentaron en ciclador térmico a 94°C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos como sigue: 94 °C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 50 segundos. La reacción se completó calentando a 72°C durante 5 minutos. Se corrieron reacciones de PCR sobre un gel de agarosa, y se visualizaron las bandas de ADN bajo luz uv luego de colorear con bromuro de etidio. Se obtuvo una banda de 760 pb. De manera alternativa, se realizaron reacciones de PCR de 25 µl usando una mezcla de reacción estándar que comprende : lx Jumpstart RED TaqPCR (Sigma, #P-1107) 0.5 µM de iniciador 1 (SEC ID NO: 11) 0.5 µM de iniciador 2 (SEC ID NO: 12) ADN genómico extenso ddH20 Las reacciones de PCR se calentaron en ciclador térmico a 94°C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos como sigue: 94 °C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos. La reacción se completó calentando a 72°C durante 5 minutos. Se corrieron reacciones de PCR sobre un gel de agarosa, y se visualizaron las bandas de ADN bajo luz uv luego de colorear con bromuro de etidio. Se obtuvo una banda de un tamaño de 267 pb. Ejemplo 3: Detección de CE43-67B mediante Prueba de Cigocidad por PCR múltiplex 3 . 1 Extracción de ADN genómico Se extrajo ADN genómico de CE43-67B como se describió en el Ejemplo 2.1. 3.2 PCR Múl tiplex 1 Se diseñaron iniciadores de PCR para usar en una prueba de cigocidad de PCR por múltiplex. Se fijó una reacción de PCR de 20 µl para cada muestra que deseaba evaluarse de la siguiente manera: lx Ju pStart ReadyMix REDTaq PCR (Sigma P-1107) 0.5 µM de iniciador 1 (SEC ID NO: 5) 0.5 µM de iniciador 2 (SEC ID NO: 6) 0.5 µM de iniciador 3 (SEC ID NO: 8) 10 ng de ADN genómico ddH20. Las reacciones de PCR se calentaron en ciclador térmico a 94°C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos como sigue: 94°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos, 72°C durante 45 segundos. La reacción se completó calentando a 72 °C durante 5 minutos. Se corrieron las reacciones de PCR sobre un gel de agarosa, y se visualizaron las bandas de ADN bajo luz UV luego de colorear con bromuro de etidio. La presencia de 2 bandas (561 pb y aproximadamente 1000 bp) indicó que la muestra era de una planta heterocigoto CE43-67B; 1 banda de 561 pb de tamaño indicó que la muestra era de una planta homocigota CE43-67b; y 1 banda de aproximadamente 1000 pb de tamaño India) que la muestra era de una planta de algodón homocigota de tipo silvestre. 3.3 PCR Múl tiplex 11 Se diseñaron iniciadores de PCR para usar en una prueba de cigocidad de PCR múltiplex. Se diseñó una reacción de PCR de 20 µl para cada muestra que deseaba evaluarse de la siguiente manera: lx JumpStart ReadyMix REDTaq PCR (Sigma P-1107) 0.5 µM de iniciador 1 (SEC ID NO: 11) 0.5 µM de iniciador 2 (SEC ID NO: 12) 0.5 µM de iniciador 3 (SEC ID NO: 13) 10 ng de ADN genómico ddH20. Las reacciones de PCR se calentaron en ciclador térmico a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos como sigue: 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 45 segundos. La reacción se completó calentando a 72°C durante 5 minutos. Se corrieron reacciones de PCR sobre gel de agarosa, y se visualizaron las bandas de ADN bajo luz UV luego de colorear con bromuro de etidio. La presencia de 2 bandas (267 pb y aproximadamente 1000 bp) indicó que la muestra era de una planta CE43-67B heterocigota; 1 banda de 267 pb de tamaño indicó que la muestra era de una planta homocigota CE43-67B; y 1 banda de aproximadamente 1000 pb de tamaño indicó que la muestra era de una planta de algodón homocigota de tipo silvestre. Ejemplo 4: Detección de CE43-67B mediante Southern Blot 4 . 1 Extracción del ADN para usar en Southern Blot Aproximadamente 2 a 3 g de peso fresco de tejido de hojas jóvenes congeladas se molió en un mortero congelado hasta obtener un polvo fino y se agregó a 15 ml de regulador de pH de extracción de núcleos helado (glucosa 0.35 M, Tris-HCl 0.1M pH 8, Na2EDTA 50 mM, 2% de Polivinilpirrolidona-10, 0.1% de ácido ascórbico, 0.2% de B-mercaptoetanol) en un tubo rotulado. La muestra se incubó sobre hielo durante 15-20 minutos. El tubo se mezcló suavemente y se centrifugó a 2700 g durante 20 minutos a 4°C. Se descartó el sobrenadante y se agregó 8 ml de regulador de pH de Lisis de los núcleos (sorbitol 0.14 M, Tris-Cl 0.22 M pH 8, NaCl 0.8 M, Na2EDTA 0.22 M, CTAB 0.8% p/v, 1% de Sarkosyl, 1% de Polivinilpirrolidona-10, 0.1% de acido ascórbico, 0.2% de B-mercaptoetanol, 5 pg/ml de proteinasa K) . Luego de mezclar, se incubaron los tubos a 65°C durante 30 minutos. Se agregaron 10 ml de cloroformo, y se mezcló el tubo suavemente por inversión hasta que se forme una emulsión de centrifugado a 4600 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se retiró la capa acuosa en un nuevo tubo que contenía 10 µl de RNasa A (10 mg de Sigma R4642), y se incubó el tubo durante 30 minutos a 37°C. Se repitieron una vez los pasos de cloroformo y centrifugado. Se retiró la fase acuosa en un nuevo tubo que contiene 10 ml propan-2-ol. Luego de aproximadamente 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, se observó un precipitado gelatinoso en el medio del tubo. El tubo se mezcló suavemente para precipitar el AD?. El AD? se devanó usando una anilla estéril en un tubo falcon que contenía etanol 70%. El AD? se secó al aire para eliminar el etanol y se resuspendió en 200-400 µl de TE. 4 . 2 Método al terna tivo para extracción del ADN Se muelen 2-3 hojas de algodón jóvenes (aproximadamente 1 g en peso descongelado) hasta obtener una pasta en un mortero a temperatura ambiente, con 2 ml de Regulador de pH de molienda (?aOAc 100 mM pH 4.8, EDTA 50 mM pH 8.0, ?aCl 500 mM, 2% de PVP (PM 10.000), 1.4% de SDS) y un poco de arena. El tejido molido se transfirió a un tubo falcon de 15 ml, y los remanentes en el mortero se enjuagan con 1 ml de regulador de pH de molienda en el tubo. La muestra se incubó a 65°C durante 15 minutos, agitando ocasionalmente. Se agregaron 4 ml de acetato de amonio 10 M, y la muestra se mezcló bien y se incubó a 65°C durante 10 minutos para precipitar las proteínas. Las muestras se centrifugaron a temperatura ambiente a 4600 rpm durante 10 minutos. La fase acuosa se transfirió a un tubo fresco de 15 ml. Se agregaron 0.6 volúmenes de isopropanol frío y la muestra se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Luego de mezclar invirtiendo lentamente el tubo varias veces, el ADN se hizo correr y se disolvió en 500 µl de TE. Se agregaron 10 µl de RNAsa de 10 mg/ml y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego de la extracción con 500 µl de fenol : cloroformo : alcohol isoamílico (25:24:1), la muestra se mezcló suavemente y se centrifugó a 13000 rpm durante 5 min. Se transfirió el sobrenadante a un tubo fresco usando una pipeta fina de Pasteur y se extrajo nuevamente con cloroformo ¡alcohol isoamílico (24:1) como se indicó anteriormente. El sobrenadante se transfirió a tubos limpios, se agregó y se mezcló 1/10 de volumen de NaOAc 3M (pH 4.8), y luego se agregó un volumen de isopropanol frío. La muestra puede incubarse a temperatura ambiente durante hasta 30 minutos para precipitar el ADN. El ADN se devanó para retirarlo y se suspendió nuevamente en etanol 70%. El ADN se secó al aire para eliminar el etanol y se volvió a suspender en 200 µl de agua. 4 . 3 Digestión áe la enzima ?e restricción Se cuantificó el ADN usando un espectrofotómetro y corriendo sobre un gel . Se prepararon digestiones de enzima apropiadas usando 5 µg de ADN por digestión en un volumen total de 40 µl . Se usaron digestiones que incluyeron Ncol . Mscl , Hin?lll /Kpni y Nhel /Asci para detectar el número de copias y la integridad de la inserción. Se incubaron las digestiones durante 6 horas a la temperatura apropiada para cada enzima. 4 . 4 Electroforesis en gel Se agregó colorante de carga azul de bromofenol a cada muestra obtenida en 4.3 anterior, y se cargó cada muestra en un gel de TBE agarosa al 0.8%. El gel se corrió a 50 voltios hasta la mañana siguiente. Luego del ciclo, se lavó el gel en HCl 0.25 M durante 10 minutos para depurar el ADN, se incubó en solución desnaturalizante (NaOH 0.5 M, NaCl 1.5 M) con suave agitación durante 30 minutos, se enjuagó con agua destilada y luego se incubó en solución neutralizante (Tris 0.5 M, NaCl 1.5 M) durante 30 minutos. Se preparó una Southern Blot de la siguiente manera: Se colocó una placa de vidrio sobre una bandeja que contenía 20X SSC y una tira de papel 3M se colocó sobre la placa de vidrio tal que ambos extremos se sumergieron en la solución 20X de SSC (para actuar como mecha) . Se colocó un trozo de papel 3M del mismo tamaño que el gel sobre la mecha, y se colocó el gel sobre éste. Se colocaron tiras de nescofilm alrededor de los bordes del gel para formar un sello. Se colocó una membrana Hybond en la parte superior del gel, seguido de dos trozos adicionales de papel 3M. Durante todo el montaje de la transferencia, se tuvo cuidado de asegurar que no quedaran atrapadas burbujas de aire entre la membrana, el gel y el papel 3M. Se colocó una pila de 5 cm-10 cm de toallas de papel absorbente en la parte superior del papel 3M y se mantuvo en su lugar con un peso. El ADN se dejó transferir a la membrana Hybond hasta la mañana siguiente. Luego de transferir la Southern Blot se desmontó la pila y el ADN se adhirió a la membrana a través de entrecruzamiento con rayos UV. 4.5 Hibriáación Se preparó una sonda de ADN apropiada por digestión con Hin?lll /Kpnl por restricción del plásmido binario pNOV4641 y purificación del fragmento resultante. Se hirvieron 25 ng de sonda de ADN en 45 µl de TE durante 5 minutos, se colocó sobre hielo durante 5 minutos, luego se transfirió a un tubo Rediprime II (Amersham Pharmacia Biotech, #RPN1633). Luego del agregado de 5 µl de dCTP marcado con 32P al tubo Rediprime, la sonda se incubó a 37°C durante 1 hora. La sonda se purificó por centrifugación a través de una columna microspin G-50 (Amersham Pharmacia Biotech, #27-5330-01) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para eliminar los dNTPs no incorporados. Se midió la actividad de la sonda en forma aproximada comparando la cantidad de componente radiactivo restante en la columna con la cantidad del tubo con la muestra, con una relación de por lo menos 50:50 como aceptable. La membrana Hybond se pre-hibridó humectando con 40 ml de regulador de pH Rapid-Hib (Amersham-Pharmacia) pre-entibiado, a 65°C durante 30 minutos. Se hirvi6 la sonda rotulada durante 5 minutos, y se colocó sobre hielo durante 5 minutos . Se agregó una cantidad apropiada de sonda (1 millón de recuentos por cada 1 ml de Regulador de pH de pre-hibridación) al Regulador de pH de pre-hibridación y la hibridación ocurrió a 65°C hasta la mañana siguiente. Al día siguiente, se descartó el Regulador de pH de hibridación, y luego de un enjuague con 50 ml de solución de 2xSSC/l% SDS la membrana se lavó en 150 ml de solución de 2xSSC/l% SDS a 65°C durante 30-45 minutos. Este proceso se repiti6 dos veces con solución 0.1xSSC/l% SDS. Se expuso la membrana a una pantalla fosforescente o película de rayos X para detectar donde se había unido la sonda.

Ejemplo 5: Detección de CE43-67B mediante ELISA 5.1 Extracción de las proteínas Se cosechó tejido de algodón para análisis y se congelo a -70°C. El tejido congelado se molió hasta obtener un polvo fino y se peso en un tubo de polietileno marcado. Se agregó Regulador de pH de extracción (Tris lOOmM, Borato de Sodio 100 mM, MgCl2 5 mM, 0.05% de Tween 20, 0.2% de Ascorbato de Sodio, Agua, pH 7.8, AEBSF 1 mM, Leupeptina 0.001 mM) a la muestra en una relación de 2:1 (volumen de Regulador de pH de extracción:peso de muestra fresca) para tejido congelado o 30:1 (volumen de Regulador de pH de extracción:peso de muestra anhidra) para tejido liofilizado. La muestra se pasó por vortex y se homogeneizó usando un Brinkman PT 10/35 Polytron equipado con un generador reductor de espuma PT 10835, hasta que se licuó la mezcla. Se centrifugaron los extractos a 10.000 x g durante 15 minutos. El sobrenadante del extracto de proteínas se almacenó a 2-8°C. 5.2 Protocolo para ELISA El procedimiento de ELISA utilizó técnicas estándar de la siguiente manera. Se enjuagó una placa de 96 cavidades en etanol durante 2 horas, y se secó al aire. Se recubrió la placa con 50 µl de anticuerpo anti-CrylAb de cabra por cavidad y se incubó hasta la mariana siguiente a 2-8°C. Luego de lavar tres veces con solución de lavado lx ELISA (Tris 100 mM, 0.5% de Tween-20, NaCl 75 mM, pH 8.5), se secó brevemente la placa golpeando boca abajo sobre una toalla de papel. Se agregaron 150 µl de solución de bloqueo (NaP04 10 mM, NaCl 140 M, 1% de BSA, 0.02% de Azida de sodio, se tituló hasta un pH 7.4 con NaH2P04 y Na2HP04) a cada cavidad seguido de incubación a temperatura ambiente durante 45 minutos. Se lavó la placa 3 veces como se describió con anterioridad. Se aplicaron estándares de CrylAb y muestras de extractos de proteínas a las cavidades apropiados de la placa por triplicado, volumen total de 50 µl por cavidad. Se incubó la placa a 2-8°C durante 1 hora 30 minutos, seguido de temperatura ambiente durante 30 minutos adicionales. Se lavó la placa tres veces con solución de lavado para ELISA, y luego se incubó a 35-39 °C durante 1 hora con 50 µl de anticuerpo anti-CrylAb de conejo por cavidad. Se lavó la placa tres veces con solución de lavado para ELISA, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos con 50 µl de anticuerpo anti-conejo de burro conjugado con fosfatasa alcalina por cavidad. Luego de tres lavados adicionales con solución de lavado para ELISA, se agregó 50 µl de solución de sustrato de fosfatasa por cavidad y se incubó la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con el agregado de 50 µl de NaOH 3M por cavidad. Se midió la absorbancia de la solución en cada cavidad a 405 nm usando un lector de placa de múltiples cavidades Ceres 900C y se analizaron los resultados usando el software KC3 Curve (Bio-Tek Instruments Inc.). Se calculó la concentración de CrylAb en las muestras por referencia a los estándares de proteína CrylAb. Ejemplo 6: Detección de CE43-67B mediante Tira reactiva 6.1 Extracción ?e las proteínas Se colocó un trozo de tejido de hoja de aproximadamente 0.2 cm2 en un tubo que contenía regulador de pH de extracción. Se usó un agitador de plástico para extraer las proteínas del tejido, cortando y macerando el tejido. 6.2 Prueba por Tiras Reactivas Se colocó una tira para ensayo en el tubo y se incubó durante 5 a 10 minutos para desarrollar el resultado. La tira para ensayo comprendió una primera banda a la cual se adhirió el anticuerpo anti-CrylAb, y una segunda banda a la cual se unió el anticuerpo de control. Luego de la incubación, una doble línea roja en la ventana de resultado de la tira para ensayo indicó la presencia de CrylAb. La línea inferior indicó la presencia de proteína CrylAb mientras que la línea superior fue un control que indicaba que el ensayo funcionaba correctamente . Ejemplo 7: Detección de CE43-67B a través de la Prueba de Cigocidad de parámetros TaqMan 7. 1 Extracción ?e ADN genómico Se extrajo ADN genómico de CE43-67B como se describió en el Ejemplo 2.1. 7. 2 PCR Taqman ?e Parámetros Se diseñaron los iniciadores de PCR para usar en una prueba de cigocidad de parámetros TaqMan. Se diseñó una reacción de PCR de 20 µl para cada muestra que deseaba evaluarse de la siguiente manera: lx Jumpstart ReadyMix REDTaq PCR (Sigma P-l107) 0.5 pM de mezcla de iniciador 1 (concentraciones equimolares de las SEC ID Nos: 14, 15 y 16) 0.5 pM de mezcla de iniciador 2 (concentraciones equimolares de las SEC ID Nos: 17, 18 y 19) 10 ng de ADN genómico ddH20. Las reacciones de PCR se calentaron en ciclador térmico a 95°C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos como sigue: 95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 minuto. 7.3 Análisis Se leyeron los valores de fluorescencia en el ABl 7900HT, y se corrió el análisis de parámetros elevando el programa de Discriminación Alélica en el software SDS provisto. La detección de fluorescencia FAM indicó que la muestra era de una planta homocigota CE43-67b. La detección de fluorescencia TET indicaba que la muestra era de una planta de algodón homocigota de tipo silvestre. La detección de fluorescencia FAM y TET indicaba que la muestra era de una planta CE43-67B heterocigota. Ejemplo 8: Eficacia insecticida de CE43-67B. 8. 1 Ensayo ?e Campo I - Diseño Se diseñaron pruebas en campo en 6 ubicaciones en los Estados Unidos para evaluar la resistencia a los insectos de CE43-67B. En cada ubicación, se plantaron pruebas por duplicado en un diseño en bloque completo aleatorizado, donde cada una comprendía 4 copias. Cada prueba consistió en un terreno que comprendió hileras de 1.2 x 12 metros (4 x 40 pies) , plantadas a razón de 3 plantas por cada 30 cm (pie) . En cada ubicación, se infestó en forma artificial una prueba con larvas de Heliothis virescens (gusano del tabaco) , y la otra con larvas de Helicoverpa zea (gusano del algodón) , cuando las plantas se encontraban en cuadratura activa. Posteriormente se evaluaron las pruebas para determinar el porcentaje de daño a cápsulas y botones florales. Las infestaciones artificiales se llevaron a cabo rociando los huevos en una solución de goma xántica sobre las plantas de manera que las larvas recién nacidas se incubaron directamente sobre las plantas . Se diseñaron las infestaciones para dar aproximadamente 3 huevos por planta. 8.2 Ensayo ?e Campo I - resul ta?os Los datos presentados en la tabla que sigue son el promedio de todas las determinaciones tomadas durante los ensayos: los puntajes de daño múltiple a botón floral y daño a cápsula se promediaron para dar un puntaje promedio del daño a los cuerpos fructíferos, y se promediaron los datos de las 6 ubicaciones juntas.

Los datos muestran claramente que CE43 - 67B mostró una excelente resistencia tanto a Heliothis virescens como a Helicoverpa zea cuando se compara con el control no transgénico denominado Coker312 . 8. 3 Ensayo ?e Campo II - ?iseño Se infestaron artificialmente plantas CE43-67B con huevos de gusano del tabaco (Heliothis virescens) , que se obtuvieron del Southern Insect Management Laboratory en Stoneville, MS 24 hasta 36 horas antes de la infestación artificial . Se mezclaron los huevos en una solución de goma xántica y se rociaron sobre el área terminal de las plantas de algodón utilizando ?n aspersor de mochila convencional con C02. Se rociaron los huevos a través de una boquilla plana 8006 a aproximadamente 68.9 kPa (10 psi) . La prueba se llevó a cabo en 2 ubicaciones, Syngenta's Southern Regional Technical Centre en Leland, MS y Vero Beach Research Centre en Vero Beach, FL. En ambos lugares, no replicados, se utilizaron para la infestación bloques sólidos de aproximadamente 2240 plantas de CE43-67B, como también bloques más pequeños de aproximadamente 224 plantas de Coker 312 no transgénico. Si se consideraba que las poblaciones de enemigos naturales eran lo suficientemente altas para interferir con la infestación, se rociaba el área del estudio con acetato (Orthene®) a razón de 0.23 kilogramo (0.5 libra) de ia/A 24 hasta 48 horas antes de la infestación programada. El bloque de algodón no transgénico Coker 312 se usó para estimar la efectividad de la técnica de infestación y para determinar la aptitud en campo de la cepa de gusano del tabaco utilizada en los estudios. En cada ubicación, se realizaron cuatro infestaciones artificiales para algodón CE43-67B y Coker 312 con un cuarto de las plantas disponibles infestadas cada vez. Las infestaciones se llevaron a cabo entre la aparición del botón floral medio y la floración temprana. Se estimó la incubación de huevos recolectando varias hojas que contenían huevos de plantas Coker 312 colocándolas en cápsulas de Petri. Se realizó el recuento de las hojas recolectadas y dos a tres días después, se determinó la eclosión exitosa de las larvas. Se llevaron a cabo las determinaciones 7 días después de la infestación. Se evaluó la mitad de todas las plantas infestadas en la ubicación de Leland, MS, mientras que se evaluaron tres cuartos de todas las plantas infestadas en la ubicación de Vero Beach, FL. En cada caso, la evaluación involucró una búsqueda de plantas completes de larvas sobrevivientes. Los puntajes de daños a botones florales también se tomaron del ensayo de Leland. Donde se encontraron larvas sobrevivientes en plantas CE43-67B, se marcaron las estructuras de los frutos que contenían las larvas. Cuatro a 7 días después, estas estructuras frutales, más todas las estructuras adyacentes se evaluaron minuciosamente otra vez para evaluar si las larvas aún estaban vivas. No se realizaron evaluaciones similares en los terrenos de Coker 312 porque en esta etapa muchas de las larvas que se encontraban en estas plantas comenzaron a buscar sitios para cría en el suelo. 8. 4 Ensayo ?e Campo II- resul ta?os La tabla que sigue es un resumen de los datos recolectados .

Estimado en base al número de huevos aplicados y el índice de incubación observado ND = no determinado Las larvas sobrevivientes en las plantas CE43-67B 7 días después de la infestación en ambas ubicaciones fueron muy pocas, oscilando desde la primera hasta la tercera crisálida. Las estructuras frutales que contenían larvas vivas 7 días después de la infestación se marcaron y se evaluaron nuevamente 4 hasta 7 días después. En la segunda evaluación, no pudieron recuperarse larvas vivas en las estructuras frutales marcadas, o las circundantes. En forma adicional, las estructuras frutales marcadas permanecieron en las plantas y se desarrollaron normalmente. Esto sugiere fuertemente que aún quedaban unas pocas larvas vivas en las plantas CE43-67B 7 días después de la infestación que no sobrevivieron a la segunda evaluación. Los niveles de daño a botones florales observados en las plantas CE43-67B fueron extremadamente bajos en comparación con el control no transgénico Coker 312, confirmando que las larvas del gusano del tabaco eran vigorosas y capaces de establecer una infestación robusta. Los datos de este ensayo de infestación artificial mostraron que CE43-67B tiene una excelente resistencia al gusano del tabaco cuando se compara con el control no transgénico denominado Coker 312. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. - Un polinucleótido caracterizado porque comprende una primera región que comprende la secuencia presentada como SEC ID NO: 1 y una región adicional que comprende la secuencia presentada como SEC ID NO: 2.
2.- Un polinucleótido caracterizado porque comprende: a) por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3; b) por lo menos 35 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 246 hasta 305 de la SEC ID NO: 1; o c) por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 1, dicho polinucleótido que abarca los nucleótidos 275 y 276 de la SEC ID NO: 1.
3.- Un polinucleótido caracterizado porque comprende : a) por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4; b) por lo menos 35 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como nucleótidos 103 a 164 de la SEC ID NO: 2; o c) por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 2, dicho polinucleótido que abarca los nucleótidos 133 y 134 de la SEC ID NO: 2.
4.- Una planta de algodón caracterizada porque comprende un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5.- Semilla de la planta de algodón de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. - Un método para detectar una planta que contiene el polinucleótido presentado como SEC ID NO: 1, caracterizado porque comprende: a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; b) obtener un par de iniciadores que sean apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3 y su complemento; c) agregar el par de iniciadores a la muestra y los medios para realizar una reacción de amplificación; d) realizar una reacción de amplificación; y e) visualizar la secuencia amplificada de este modo .
7. - Un método para detectar una planta que contiene el polinucleótido presentado como SEC ID NO: 2, caracterizado porque comprende: a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; b) obtener un par de iniciadores que sean apropiados para usar en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4 y su complemento; c) agregar el par de iniciadores a la muestra y los medios para realizar una reacción de amplificación; d) realizar una reacción de amplificación; y e) visualizar la secuencia amplificada de este modo.
8. - Un método de conformidad con la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque la secuencia comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos.
9. - Un método para detectar una planta que contiene el polinucleótido presentado como SEC ID NO: 1 y/o el polinucleótido presentado como SEC ID NO: 2, caracterizado porque comprende : a) preparar una muestra que contiene el ADN genómico de la planta que desea evaluarse; b) obtener una sonda que sea capaz de hibridarse a una secuencia seleccionada del grupo formado por una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 3 y una secuencia que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada como SEC ID NO: 4; c) agregar por lo menos una de las sondas del paso (b) a la muestra en condiciones que permitan que la sonda se hibride con un ácido nucleico complementario dentro de la muestra; d) eliminar sustancialmente la sonda no hibridada; y e) detectar la sonda hibridada de este modo para identificar si la muestra contiene el polinucleótido.
10.- Un método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la secuencia comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos.
11.- Un método de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque la sonda sustancialmente no hibridada se elimina mediante el enjuague de la sonda en condiciones de alta severidad.
12.- Un kit de partes caracterizado porque comprende un par de iniciadores de conformidad con la reivindicación 6 o 7, instrucciones para realizar el método de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, medios para realizar una reacción de amplificación, y en forma opcional medios para preparar la muestra que desea evaluarse.
13.- Un anticuerpo anti-CrylAb caracterizado porque se secreta por la línea celular DSM ACC2723 o DSM ACC2724.
14.- Una tira reactiva caracterizada porque comprende a) una línea de prueba de anticuerpo anti-CrylAb específico; b) una línea de control con reactivo de anticuerpo anti-ratón; c) una almohadilla que contiene anticuerpo anti- CrylAb seco marcado con oro coloidal; y d) una almohadilla de aplicación de la muestra, donde el anticuerpo anti-CrylAb y el anticuerpo anti-CrylAb seco marcado con oro coloidal se seleccionan en forma independiente del grupo formado por un anticuerpo secretado por la línea celular DSM ACC2723 y un anticuerpo secretado por la línea celular DSM ACC2724.