BR112015027022B1 - Vetor recombinante, célula hospedeira, método para obter uma planta, método para tratar uma planta, gene quimérico, proteína que atua como transportador e composição para tratar uma planta - Google Patents

Abstract

VETOR RECOMBINANTE; CÉLULA HOSPEDEIRA; MÉTODO PARA OBTER UMA PLANTA; MÉTODO PARA TRATAR UMA PLANTA; GENE QUIMÉRICO; PROTEÍNA QUE ATUA COMO TRANSPORTADOR; COMPOSIÇÃO PARA TRATAR UMA PLANTA E USO DE GENE QUIMÉRICO. A presente invenção refere-se à geração de plantas transgênicas resistentes a infecções causadas por microrganismos restritos ao floema e compreende a indução da expressão de uma proteína de fusão ou quimérica, que compreende uma proteína floema Citrus aurantifolia (CsPP16), uma proteína ligante e uma proteína com atividade antimicrobiana; por exemplo, com atividade antibacteriana ou enzima hidrolítica antibacteriana. A porção da proteína de fusão correspondente à proteína CsPP16 pode exercer a sua função de movimento simplasmático, o que ocorre por meio do plasmodesmo da planta para atingir os tubos de peneira de floema, ao passo que a porção antimicrobiana pode atuar para eliminar o microrganismo que se assenta no floema. A invenção permite controlar a doença que causa o amarelamento de citros ou Huanglongbing (HLB) e também aplicar ao tratamento de outras doenças causadas por bactérias e outros microrganismos que se assentam no tecido vascular de plantas mais altas. A invenção inclui os vetores moleculares projetados que transportam e expressam uma proteína de fusão e as plantas transgênicas obtidas (...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo de aplicação de técnicas de biologia molecular para gerar plantas resistentes a microrganismos fitopatogênicos que residem no tecido vascular das plantas através da expressão de proteínas com atividade antimicrobiana fundida de maneira traduzida a proteínas com capacidade para movimento supracelular e sistêmico. Em uma de suas modalidades, a invenção se refere a métodos para controlar a bactéria que causa amarelamento ou Huanglongbing (HLB) de citrus por expressão constitutiva e proteínas antimicrobianas vasculares específicas de tecido fundidas às proteínas com capacidade para movimento simplástico para tecidos distantes através do tecido vascular.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Huanglongbing (“dragão amarelo” em Chinês) é uma doença de citrus que se tornou muito importante no México. É também conhecida pelas iniciais HLB e pela palavra em inglês Greening (Esverdeamento) ou ExGreening (Ex-Esverdeamento). A doença é bastante destrutiva devido ao fato de que causa perdas totais na produção de citrus.

[0003] Os sintomas de HLB incluem, porém sem restrição, amarelamento da folha, produção reduzida de frutas e, praticamente, a ausência sementes (Figura 1). Ademais e coincidentemente, com a vasta maioria de doenças nas plantas de interesse agrícola, não há tratamento eficaz para HLB. Por essa razão, o diagnóstico antecipado é crucial e um tratamento é essencial para reverter a doença. Verifica-se que a doença se espalhou rapidamente ao redor do mundo desde a sua detecção na Ásia Oriental; agora foi detectada na Flórida e no México. Além disso, é considerada com a principal ameaça à produção de citrus mundialmente (www.senasica.sagarpa.gob.mx).

[0004] A doença HLB foi relatada primeiramente na China em 1929, a qual se espalhou rapidamente e foi detectada na África do Sul em 1947; também tem sido um grave problema na produção de citrus de Taiwan desde 1951. Assim, tem se dispersado principalmente em regiões de crescimento de citrus tanto tropicais quanto subtropicais, incluindo a Flórida, nos E.U.A., desde 1998. No caso do México, foi relatada em diversas regiões de produção do país desde 2009, de Sinaloa a Campeche. É provável que a doença já esteja presente em outras regiões de produção de citrus no México, priorizando o controle da mesma.

[0005] No México, há 23 estados de produção de citrus, sendo que em 13 desses, a bactéria de HLB e o vetor de inseto que transmite a doença já foram detectados. Esse problema fitossanitário é crucial visto que a citrus é cultivada em 549.000 hectares com uma produção de sete milhões de toneladas anualmente, em com valor de 10,206 bilhões de pesos mexicanos (SENASICA, 2011) .

[0006] Dentre as citrus que são susceptíveis à infecção por HLB, os sintomas mais graves ocorrem na lima mexicana, laranja (Citrus sinensis), laranja mandarina (Citrus reticulata) e em toronjas (Citrus reticulata x Citrus paradisi), ao passo que os sintomas menos graves estão presente em limas (Citrus limon) e em tangerinas (Citrus paradisi), Citrus limonia, Citrus limettioides (McClean & Schwarz, citadas em EPPO quarantine pest, 1990) . No entanto, mundialmente, a lista de plantas infectadas é maior, em que as espécies susceptíveis são listadas abaixo (Halbert and Manjunath, 2004): Aeglopsis chevalieri Swingle, Atalantia missionis Oliver, Balsamocitrus dawei Stapf. , Calodendrum capensis Thunb, Catharanthus roseus (L.) G. Don X Citroncirus webberi J. Ingram & H.E. Moore, Citrus amblycarpa Ochse, Citrus aurantiifolia (Christm.) Swingle, Citrus aurantium L., Citrus depressa Hayata, Citrus grandis (L.) Osbeck, Citrus hassaku Hort. ex Tanaka, Citrus hystrix DC., Citrus ichangensis Swingle, Citrus -ambhiri Lushington, Citrus -unos Sieb. ex Tanaka, Citrus kabuchi Hort. ex Tanaka, Citrus limon (L.) Burm., Citrus x limonia Osbeck, Citrus x nobilis Lour. "Ortanique", Citrus maxima (pomelo/shaddock), Citrus x nobilis Lour., Citrus oto Hort. ex Tanaka, Citrus x paradisi Macfad., Citrus reticulata Blanco, Citrus sinensis (L.) Osbeck, Citrus sunki Hort. ex Tanaka, Citrus unshiu (Mack.) Marc, Clausena indica Oliver, Clausena lansium (Lour.) Skeels, Cuscuta australis R. Br. (Convolvulaceae, Cuscutaceae), Fortunella spp., Limonia acidissima L., Microcitrus australasica (F.J. Muell.) Swingle, Murraya koenigii (L.), Murraya paniculata (L.) Jack, Poncirus trifoliata (L.) Raf., Swinglea glutinosa (Blanco) Merr., Toddalia lanceolata Lam, and Triphasia trifolia (Burin. f.) P. Wilson.

[0007] De igual modo, os não hospedeiros incluem Citrus indica Tanaka, Citrus iirnetta Risso, e Citrus macroptera Montrons (Gomez, 2008).

[0008] Reconheceu-se que a etiologia da doença é bacteriana (Liberibacter); no entanto, há várias cepas relacionadas (tabela 1). Constatou-se que HLB é transmitida por insetos do grupo psilídeo (Hemíptero), que inclui outros vetores importantes tais como, por exemplo, os vetores de cecidomia branca e afídeos. Semelhante às doenças originadas de vetores, uma dentre as estratégias usadas para controlar essa doença é precisamente o controle dos vetores associados às mesmas. Embora os mecanismos pelos quais psilídeo transmite a doença não sejam precisamente conhecidos, fica claro que esses insetos têm capacidade para transmitir de maneira eficiente a mesma. Ademais, os psilídeos transmitem patógenos semelhantemente aos afídeos, portanto, pode-se esperar que os detalhes de transmissão de bactéria sejam semelhantes a outros patógenos restritos ao floema. Os mesmos também têm capacidade para transmitir o vírus, o que torna o controle desses vetores ainda mais necessários.

[0009] Um dentre os vetores da bactéria Candidatus Liberibacter spp que causa HLB é Diaphorina citri Kuwayama (Hemíptero: Psilídeos); esse inseto tem um período embriônico situado em uma faixa a partir de 9,7 dias em 15 °C a 3,5 dias em 28 °C; os ovos são colocados na extremidades das ramos delicados da planta, sobre e entre folhas não maduras dobradas, que aparecem frequentemente em grandes números no mesmo galho; o posicionamento de ovos é condicional em relação à presença de ramos delicados, em que a fêmea põe até 800 ovos ao longo de sua vida, as ninfas são sedentárias e se assentam nos galhos e pecíolos não maduros, o que forma colônias com um número variável de indivíduos. As ninfas excretam uma substância céria branca através de filamentos depositados nas folhas, ao passo que adultos têm pouca habilidade para manterem longos voos, porém podem ser transportados por longas distâncias por correntes de ar.

Restrita a tubo peneirado, sem paredes de célula, com 99% c Citrus, Crotolaria de homologia em Fitoplasma Brasil Desconhecida -uncea DNA com o fitoplasma (16Sr IX) de vassoura- de-bruxa em ervilha Fitoplasmad Citrus China Desconhecida Referências: *Strategic Planning for the Florida Citrus Industry: Addressing Citrus Greening; a Bové et al., 1974; Garnier e Bové, 1983; Jagoueix et al., 1994, 1997; Garnier et al., 2000, Duan et al., 2008; b Gudmestad e Secor, 2007; Hansen et al., 2008; Lin et al., 2009; c Teixeira et al., 2008; Wulffet et al., 2009; d Chen et al., 2009

[0010] A duração do ciclo biológico do inseto (ovo a adulto) varia de 14,1 a 49,3 dias em 28 °C e 15 °C respectivamente, em que as temperaturas de 25 °C a 28 °C são as mais adequadas para o desenvolvimento dos mesmos uma vez que o psilídeo não se desenvolve em temperaturas de 33 °C e em 10 °C. O inseto tem um pico de população no fim da primavera e no início do verão (coincidente com o período de brotamento de citrus).

[0011] A presença do psilídeo não implica na infecção da mesma com a bactéria, embora, no caso do México, ambos os elementos estejam presentes.

[0012] Determinou-se que a HLB é causada por um grupo de bactérias que formam um clado coerente, denominado geralmente de Candádatus Láberábacter, Candádatus Láberábacter asáatácus, Candádatus Láberábacter africanus, e de Candádatus Láberábacter amerácanus. O México relatou que a Candádatus Láberábacter asáatácus é a bactéria transmitida pelo psilídeo Dáaphorána cátrá e está presente na família das Rutáceas; no entanto, não há relatórios da presença de Candádatus Láberábacter psyllaurous cujas plantas hospedeiras são a Solanaceae. O Brasil e a China relataram um fitoplasma associado à HLB também restrito ao sistema vascular de plantas infectadas.

[0013] Até a presente data, não foi possível cultivar esses grupos bacterianos, o que impediu a caracterização adicional desses patógenos. Embora a relação taxonômica de Candádatus Láberábacter spp. com outros grupos não estejam completamente clara, as sequências de DNA disponíveis indicam que é uma alfaproteobacteria. As informações disponíveis sugerem que está relacionada a rizobactérias, tais como, Bradyrízobíurn, e mais distantes com Agrobacteríum. Esses grupos bacterianos têm uma parede de célula composta de peptidoglicano e, assim, os mesmos podem ser susceptíveis a destruir enzimas, tais como, lisozima.

[0014] As bactérias Candídatus Líberíbacter (CaL) são restritas ao floema de seus hospedeiros; há uma grande variedade de patógenos vegetais, que também se acumulam no floema, ou que são restritos ao tecido, a partir de vírus(tais como, geminivírus e luteovírus) a bactérias (por exemplo, principalmente fitoplasmas). O caso de fungos foi pouco estudado, porém é possível que muitos endófitos colonizem o floema. O conhecimento da função desse tecido é essencial para desenvolver estratégias para esses patógenos.

[0015] Significativamente, bactérias gram- negativas são susceptíveis a lisozima em alta pressão hidrostática (por exemplo, um tampão com 10 mM de fosfato de sódio (Marsschalk et al., 2001)), uma condição costada no floema da planta. Os sintomas da infecção das mesmas são, às vezes, confundidos, por deficiências nutricionais, porém, à medida que a infecção progride, a assimetria nas manchas cloróticas presentes na doença das manchas simétricas em ambos os lados das nervuras centrais, que são produzidas precisamente por deficiência (Figura 1).

[0016] Particularmente, o acúmulo no floema desses patógenos aparentam causar a maioria dos sintomas causados. A análise ultraestrutural de tecido infectado mostrou que o fluxo livre de floema é bloqueado por depósitos massivos de calose (beta 1-3 glucanase) em placas de peneira. Os órgãos vegetais, que são interconectados através de feixes vasculares bloqueados desenvolvem clorose; isso certamente irá causar uma menor taxa de crescimento das plantas infectadas. O acúmulo de calose pode ser uma resposta não controlada à presença desses bactérias no floema, o que também sugere um tratamento contra a doença (isto é, induzir a expressão de glucanase no floema, por exemplo).

[0017] O movimento de solutos no floema se deve à diferença de pressão entre os tecidos-fonte e tecidos-consumidores, que são interconectados, devido ao fato de que esses solutos, especialmente, sacarose ou outros açúcares e aminoácidos são consumidos rapidamente, o que resulta na entrada de água nas células por osmose, e diluição subsequente do soluto; também há uma acúmulo maior de fiação de carbono de soluto na fonte de tecido. A interconexão entre ambos os tecidos permite o movimento de solutos entre esses tecidos. O floema também é um conduto através do qual sinais químicos são transportados entre órgãos distantes envolvidos na comunicação dos mesmos, em que a dita comunicação é necessária para coordenar tanto o crescimento quanto o desenvolvimento de plantas vasculares em resposta a um programa genético e a estímulos internos.

[0018] O transporte no floema é alterado em plantas infectada com Candádatus Láberábacter; particularmente, o transporte simplástico que ocorre através de através de canais citoplasmáticos ou de plasmodesmo. A infecção por Candádatus Láberábacter causa um acúmulo excessivo de amido nas folhas; isso é simplástico através do floema, tais como, sxd em milho (Provencher et al., 1999). O mutante sxd tem um defeito na mobilização simplástica de açúcares, o que faz com que açúcares de amido polimerizem em amido, o que produz o sintoma assimétrico difuso por salpico, por exemplo, constatado em citrus com HLB.

[0019] Para entender a doença HLB é também importante descrever as funções e estruturas dos tecidos de condução de plantas mais altas cuja especialização conferiu às mesmas vantagens evolucionárias, em que esse tecido é formado a partir do xilema (condutor unidirecional de água e minerais) e do floema, que translada fotoassimilados, minerais, proteínas e ácidos nucleicos e que consiste essencialmente em dois tipos de célula, tanto a célula de acompanhamento (CA) quanto o elemento de peneira (EC), que pode ser um tubo de peneira (TC) , são interconectados por um plasmodesmo modificado. O tecido vascular em angiospermas difere das células de câmbio, que se submetem a uma divisão assimétrica longitudinal (Esau, 1953) para soltar, durante amadurecimento, o núcleo e produzir o tubo de peneira. A Figura 2 esboça o tecido vascular de plantas superiores e a ontogênese de um tubo de peneira, e a relação do mesmo à célula de acompanhamento. A Figura 3 mostra a presença da bactérias em tubos de peneira (TC), em que as mesmas estabelecem e se assentam, ao passo que a Figura 4 mostra a estrutura de plasmodesma (PD), que é a conexão simplástica entre o tubo de peneira e a célula de acompanhamento, em que o micrográfico mostra a aparição da mesma quando é obstruída por material fibrilares e amorfos devido à infecção. A identificação bioquímica desses depósitos de material fibrilar sugere que os mesmos sejam 1-3 beta glucan (calose) e uma proteína de "cura" denominada de PP2, em que ambas as moléculas são sintetizadas e depositadas no plasmodesmo como uma reação de hipersensibilidade.

[0020] Os plasmodesmos são canais que atravessam a membrana e a parede celular; não são passivos, porém especializados e atuam como amortecedores para facilitar e regular a comunicação e o transporte de água, nutrientes, metabólitos, e macromoléculas entre as células vegetais; contêm uma forma do retículo endoplasmático capturado, o que interconecta todas as células vegetais, com exceção das células de proteção. O plasmodesmo aparenta permitir o movimento de moléculas até 4,98 x 10~23(30 kD) de ambos os tipos de célula; em contrapartida, o plasmodesmo que interconecta células mesofílicas têm um limite de exclusão de cerca de 1,66 x 10“24(1 kD) .

[0021] Os mecanismos para o transporte de macromoléculas através do plasmodesma são complexos. O modelo descrito por Haywood et.al., 2004, considera a presença de moléculas estruturais e de facilitação de translocação, em que uma proteína que reconhece a natureza simétrica das moléculas fora um complexo, que é reconhecido por uma proteína ancorada ao início do plasmodesma; deve haver vários complexos para reconhecer as famílias que são tão variadas nas sequências das mesmas, e com capacidade para atravessar essa barreira simplástica; moléculas do tipo acompanhamento desdobram proteínas e iniciam a translocação das mesmas ao tubo de peneira. O controle de sistema é exercido pelo núcleo, o que transcreve RNAs de codificação para proteínas de natureza supracelular; as moléculas são dobradas após atravessarem o plasmodesma e são, por sua vez, reconhecidas por outras moléculas que irão indicar, supostamente, às mesmas o tecido-alvo. Foi constatado um grande número de proteínas que pode volutear através do plasmodesmo, aumentando o limite de exclusão das mesmas, em que algumas dessas proteínas têm a habilidade de ligar o RNA não especificamente, ao passo que, em outros casos, a função das mesmas na comunicação a longa distância no fenômeno de indução floral foi demonstrada; há também um antecedente da capacidade de o RNA para atravessar um heteroenxerto e para atingir tecidos distantes, tais como, meristemas vegetativos e florais, conforme relatados para abóbora por Ruiz Medrano and colleagues (1999) .

[0022] Devido às restrições especiais de plasmodesma, há um limite de exclusão molecular conforme mencionado acima, no entanto, a presença de proteínas de maior peso molecular a partir de até 4,15 x 10~22 e de RNAs sugere que o transporte é altamente seletivo e regulado por mecanismos ainda não conhecidos claramente na entrada de plasmodesma. A natureza dos sinais químicos envolvidos é amplamente desconhecida, porém foram constatadas várias moléculas no floema, que podem fornecer tais sinais; dentre as mesmas se encontram os fito-hormônios e outras moléculas de baixo peso molecular, lipídeos, proteínas, e uma alta diversidade de espécies de RNA.

[0023] No presente, abordagens experimentais estão sendo desenvolvidas para tratar HLB, incluindo a aplicação de pesticidas para controlar o vetor. No entanto, a toxicidade e atividade residual dos mesmos limitam sua aplicação, ao passo que o uso de antibióticos que tentam alcançar uma distribuição simétrica dentro do floema tem a limitação de que a sua aplicação precisa ser necessariamente contínua, o que implica uma investimento considerável para essa estratégia.

[0024] A fim de controlar a HLB, o uso de tetraciclina foi relatado, o que interfere com a síntese de proteína em bactéria, ou de penicilina, que inibe a síntese de peptidoglicano, um componente estrutural da parede de célula bacteriana. Embora o resultado tenha sido uma redução marcada em sintomas, o uso de tetraciclina bacteriostática foi descartado devido à fitotoxicidade produzida pelo menos; além disso, o uso de antibióticos em plantas e animais para consumo humano não é recomendado

[0025] Recentemente, tanto a sequência de genoma de Candidatus Liberibacter asiaticus quanto a de Candidatus Liberibacter ZC, uma bactéria relacionada proximamente que causa a doença conhecida como Zebra da Batata-Feita (Zebra-Chip) em batatas, foi obtida; têm uma alta semelhança entre si (Hartung et al., 2011; Lin et al., 2011) . No entanto, a comparação das sequências disponíveis de ambos os patógenos sugere reorganizações divergentes nos genomas das mesmas; em que o ganho e a perda de material genético contribuiu às diferenças de genoma. De todo modo, as informações disponíveis indicam claramente que a Candidatus Liberibacter formou um clado compactado com um “modo de vida” adaptado ao floema de plantas, incluindo, por exemplo, uma capacidade limitada para sintetizar determinados aminoácidos e ácidos nucleicos. A comparação ao genoma de uma rizobactéria, Sinorizobium melitoti mostra que, embora ambas as bactérias sejam claramente relacionadas, a Candádatus Láberábacter tem um genoma menor com um teor de A/T muito maior e uma capacidade potencial limitada para reparar o DNA deduzido a partir da ausência de domínios de exonuclease na DNA polimerase do mesmo e a partir da presença e um único gene para DNA ligase a 10 genes de S. meáááotá (Hartung et al., 2011) .

[0026] Os estudos indicam a suscetibilidade de C. Láberábacter ZC para antibióticos betalactâmicos, o que mostra que a parede de célula da mesma é semelhante àquela da outra bactéria que tem peptidoglicano, portanto, suscetível à enzima lisozima. Ademais, a C. Láberábacter asáatácus mostra claramente uma parede de célula típica de bactérias gram-negativas, que também mostram que o tratamento com antibióticos betalactâmicos é possível, uma estratégia que está sendo realizada experimentalmente na Universidade da Flórida e na USDA para controlar essa bactéria (Bové, 2006).

[0027] Outra estratégia que foi considerada é a indução da expressão de genes envolvidos em resistência sistêmica adquirida ou resposta de patógeno. No entanto, a partir de um ponto de vista comercial, isso não é desejável visto que as plantas irão reduzir, em geral, a produtividade em situações de estresse. As estratégias paralelas consideraram o silenciamento de genes-chave no vetor de inseto. A interferência de RNA (RNAi) para controlar psilídeos é expressa na planta introduzindo-se a mesma ao vetor durante a alimentação da planta, arrefecendo bruscamente os genes essenciais no inseto e, desse modo, causando um declínio de população.

[0028] Várias estratégias foram propostas para o controle de bactérias que vivem no domínio simplástico e, especificamente, do agente casual de HLB. Diversos laboratórios, principalmente, nos Estados Unidos, propuseram diferentes estratégias para controlar a bactéria Candidatus Liberibacter. Por exemplo, a transformação genética de citrus foi realizada de maneira bem sucedida por meio de técnicas e biolística mediadas por Agrobacterium tumefaciens. A Tabela 2 descreve a expressão de diferentes genes de interesse agronômico, por exemplo, em espécies de citrus. TABELA 2. EXPRESSÃO DE DIFERENTES GENES DE INTERESSE AGRONÔMICO EM ESPÉCIE DE CITRUS*

[0029] Até a presente data, o uso de peptídeos microbicidas, a indução da resposta imune inata e o uso de interferência de RNA contra psilídeos foram usados com resultados limitados.

[0030] Os exemplos de peptídeos microbicidas são o peptídeo mieloide microbicida, a Beta-defensina-1, a Polifemusina-1, a Tachiplesina, a protegrina-1, Magainina, indolicidina (de origem animal); Cecropinas, Sarcotoxina IA, Pirrocoricina (origem de inseto) e Defensinas de origem vegetal e animal. A expressão dessas moléculas foram avaliadas, porém os resultados não produziram os efeitos de controle desejados.

[0031] No presente, há inúmeros protocolos para a transformação genética de plantas com propósitos de controle de doença.

[0032] Por exemplo, a patente US6455759 se refere à produção de múltiplas proteínas em uma planta transgênica, incluindo o construto de DNA que expressa duas proteínas de fusão ligadas por um ligante e que são clivadas por enzimas na planta, em que ambas permanecem proteínas livres.

[0033] A patente US7196057 se refere à produção de proteínas de fusão para proteger plantas a partir de insetos patogênicos, em que uma parte dessas proteínas é tóxica ao inseto e a outra parte dos mesmos transloca toxina através das tripas do inseto, mencionado apenas a possibilidade de obter plantas transgênicas que expressam os vetores dessas proteínas de fusão sem mostrar evidência do desempenho dos mesmos.

[0034] O pedido de patente WO2009/064255 se refere ao uso de um âncora de sinal que localiza uma proteína de fusão ao apoplasto de elementos vasculares na planta, que pode ser útil para modificar proteínas excretoras em relação à parede de célula e/ou apoplasto de células vegetais e para produzir proteínas excretoras em células vegetais transgênicas como biorreatores.

[0035] O pedido de patente WO99/28484 se refere a um método para aprimorar resistência ou tolerância em uma planta e nos descendentes da mesma a um patógeno, que consiste em expressar uma proteína de fusão que compreende um primeiro domínio com atividade antipatogênica, um ligante, e um segundo domínio com atividade antipatogênica; o mesmo também descreve os construtos de expressão, a expressão em E. coli, a introdução do mesmo em Agrobacteríum sp para mediar a transformação de plantas e o desempenho das mesmas contra nematódeos patogênicos.

[0036] Apesar disso, é essencial ter métodos e/ou estratégias de controle eficientes para tratar doenças vegetais causadas por microrganismos que invadem o floema por meio do simplasma, um vez que antes da presente invenção não havia controle eficaz e/ou procedimentos de combate.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO.

[0037] A presente invenção revela métodos eficiente para o tratamento de doenças causadas por microrganismos patogênicos que invadem o floema de plantas. Especificamente, a invenção revela a modificação genética de citrus explantes transformados com Agrobacteríum tumefacíens que contêm o gene com CsPP16 de citrus, que é homólogo ao gene com CmPP16 testado em abóbora (Xoconostle- Cazares et al., 1999). Esse gene com CsPP16 foi fundido de maneira traduzida aos peptídeos microbicidas selecionados a partir do grupo que compreende alfa defensina humana, lisozima humana, indolisina, magainina, cecropina, sarcotoxina, lisozima, e misturas das mesmas. Para esse propósito, foi usada uma articulação que permite que as proteínas de CsPP16 e peptídeos microbicidas flexionem independentemente. De acordo com a presente invenção, as proteínas usadas no controle de bactérias patogênicas no floema são fundidas à terminação amino com a articulação e a proteína CsPP16 de movimento supracelular.

[0038] Todos os construtos genéticos, conforme descrito no presente documento, contêm o promotor 35S de vírus de mosaico de couve-flor CaMV 35S como promotor 1 e sequência NOS como a sequência terminadora. Adicionalmente, outro conjunto de construtos que contêm o promotor 59880 de expressão específico de floema de Arabídopsís thalíana (Ruiz-Medrano et al., 2011) que conduz a expressão dos peptídeos microbicidas mencionados acima, desse modo, permitindo a expressão apenas no tecido vascular, em que a bactéria fitopatogênica está presente. Todos os construtos descritos no presente documento contêm as bordas esquerda e direita do T-DNA de Agrobacteríum em cada extremidade e carecem de marcadores selecionáveis (Figura 24).

[0039] O primeiro método de transformação com os construtos descritos acima compreende, por exemplo, a transformação genética de caules e ramos de citrus, que são regenerados in vitro para obter uma plântula geneticamente modificada, que é enxertada em um talo da raiz ou padrão; por exemplo, de laranja-da-terra de Citrus macrophylla ou variedades de Citrus volkameríana. O padrão pode partir de uma plântula de um centímetro, por exemplo, a partir da germinação de uma semente de laranja-da-terra, ou um padrão de uma planta citrus não madura, que é enxertada lateralmente em um broto cujo crescimento foi modificado geneticamente.

[0040] O segundo método de transformação com os construtos descritos acima compreende promover a geração de áreas pequenas geneticamente modificadas de plantas adultas, tanto saudáveis como doente com a bactéria que causa HLB. Isso consiste em expor o tecido vascular de caules ou galhos localizados entre tecidos consumidores e produtores (fotossintético). Isso é feito mediante raspagem até que seja observado um tecido fotossintético verde, em que é colocado um chumaço umidificado com solução de Agrobacteríum pré-tratada com acetossiringona e diluída em um tampão com indutores de crescimento de planta (auxinas e citocininas). A planta ou galho pré-tratado é colocada em uma bolsa para manter a alta umidade da Agrobacteríum tumefacíens ressecada até três dias, removendo a peliculização após o tratamento indicado. As plantas são expostas a tratamentos de dois duas até um período de um mês, obtendo-se e, em todos os casos, a expressão dos microbicidas nos tecidos vasculares e acumulados nos tecidos consumidores, que são os locais de infecção bacteriana.

[0041] De acordo com a presente invenção, após a transformação de plantas doentes, a próxima etapa é monitorar a presença da bactéria que causa HLB, que diminui devido a tratamentos de expressão dos microbicidas aplicados somente ou em combinação. As plantas doentes que forma tratadas pela invenção recuperaram a fotossíntese, o que indica que os tecidos vasculares não mais foram bloqueados, e que as plantas puderam florescer e preencher a fruta. Enquanto isso, as plantas tratadas com Defensina florescerem conforme visto na Figura 21(A) que exibe duas limas de 101 e 84 g, que foram fatiadas no eixo geométrico transverso das mesmas, o que mostra um mesocarpo simétrico. Essa é a aparência normal das frutas saudáveis, em comparação àquelas infectadas, que mostram seções ou mesocarpo assimétrico (Figura 21(B)).

[0042] Os resultados obtidos na transformação de plantas doentes de 1,20 m pela presente invenção e a avaliação dos mesmas até 210 dias mostram uma redução substancial dos sintomas de HLB e a recuperação de condições fisiológicas normais da planta (crescimento, produção de ramos, fotossíntese crescente, floração e preenchimento em fruta) (Figura 17).

[0043] Ademais, a transformação genética de árvores não maduras de 1,20 m com um certificado de controle de saneamento, que provem do viveiro certificado Emiliano Zapata, e expostas a psilídeos infectados no campo com Candidatus Liberibacter em Tecoman Colima, México, sob quantidade nula ou baixa de bactérias em contrapartida às árvores de controle transformadas com Agrobacteríum com plasmídeos sem genes que codifica para os microbicidas mencionados acima. As árvores descritas acima foram expostas a psilídeos infectados com Candídatus Líberíbacter, e a presença da bactéria foi avaliada após 60 dias. Essa avaliação consistiu em coletar duas folhas fotossintéticas maduras e duas folhas não maduras, denominadas de broto. O DNA total da veia central foi isolado, e o número de bactérias foi estimado por PCR em tempo real do gene 16S Candídatus Líberíbacter com o uso de sondas fluorescentes. Os valores obtidos foram normalizados com o gene endógeno de COX da lima (Figura 23). Os resultados obtidos mostram que nos tratamentos com lisozima, defensina e uma combinação de das duas (Lis e Def) , o número de bactérias é reduzido ou não detectável, em contrapartida às plantas de controle que não expressam microbicidas.

[0044] Ademais, o segundo método que compreende a transformação de explantes e a regeneração dos mesmos por meio de cultura de tecido, de acordo com a presente invenção, mostra que as plantas puderam se regenerar e ser vigorosas. Nesses experimentos, as plantas enxertadas vigorosas foram obtidas expressando-se os microbicidas acima, dos quais dez transformantes independentes foram selecionados para teste em campo adicional sob condições de biossegurança. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0045] A Figura 1 mostra os sintomas característicos de HLB nas árvores (esquerda superior) e nas folhas (direita superior) e sintomas de HLB em folhas e em frutas (fundos). Pode-se observar frutas deformadas com sementes absorvidas e feixes vasculares marrons (a partir de Strategic Planning for the Flórida Citrus Industry, Addressing Citrus, 2010) .

[0046] A Figura 2 mostra o tecido vascular de plantas mais altas, que retratam (esquerda) o corte transversal de um feixe vascular; (A) a ontogênese de um elemento de peneira; (B) a divisão de célula cambial longitudinal; e (C) o crescimento assimétrico; (D) a fragmentação de núcleo e (E) o desaparecimento do mesmo; (F) o acúmulo de corpos mucilaginoso e (G) e perfuração da placa furada com peneira em um tubo funcional. (G) O elemento de peneira maduro (direita) mostra poros abertos na placa furada com peneira, delimitado por calose, e proteína P dispersa no citoplasma periférico com ER e plastídeos.

[0047] A Figura 3 mostra um micrográfico eletrônico que retrata a presença de Candidatus liberibacter sp restrito ao floema vascular de uma árvore citrus (A partir do Strategic Planning for the Flórida Citrus Industry, Addressing Citrus, 2010) . A célula de acompanhamento (CA), plasmodesma (PD), e o tubo de peneira (TC) são observados.

[0048] A Figura 4 mostra a localização e a estrutura de um plasmodesma. (Superior) O local de parede em que cada poro ou desmotúbulo atravessado por um plasmodesma, em que a parede é frequentemente mais espessa; atravessado devido ao retículo endoplasmático próximo à parede e associado ao plasmodesma em ambas as células. (esquerda inferior) A representação de um tubo de peneira (roxa) e uma célula de acompanhamento (rosa) também pode ser observada, e (direita inferior) um micrográfico de transmissão de um plasmodesma ramificado presente entre a célula de acompanhamento (CA) e o tubo ou elemento de peneira (EC) . Verifica-se que o retículo endoplasmático (ER) que atravessa o plasmodesma.

[0049] A Figura 5 mostra a evidência da capacidade de movimento da proteína CmPP16 (Xoconostle- Cazares et al., 1999) . Verifica-se que (a) a proteína foi microinjetada em células mesofílicas de folhas de Nicotiana benthamíana pôde se mover de célula a célula; (d e g) quando a proteína foi complexada com RNA, a mesma mediou o movimento de RNA para células vizinhas. O sentido de RNA de CmPP16 e o RNA2 de RCNMV são mostrados como controles, que não se translocam para fora das próprias célula. O movimento da proteína rotulada com outra molécula fluorescente (TRITC) para outra células é mostrado em (e) e (h) .

[0050] A Figura 6 mostra que a CmPP16 é sintetizada na célula de acompanhamento e percorre ao tubo de peneira para coincidir com a localização de Candidatus Liberibacter. (Esquerda) mostra uma imagem de microscópio confocal de uma hibridização in situ, que detecta o RNA que codifica a proteína CmPP16 localizada no feixe vascular (verde); e (direita) a imunolocalização de proteína em roxo. Os anticorpos policlonais foram suados e direcionados contra a proteína CmPP16 e foram revelados com fosfatase alcalina cromogênica, que produz a cor roxa (Xoconostle- Cazares et al., 1999).

[0051] A Figura 7 mostra a transformação de plantas citrus maduras, particularmente, a transformação de caules com A. tumefacíens. Inicialmente (esquerda), a cultura ín vítro é crescida de maneira aeróbica na bactéria que contém o gene que codifica as proteínas antimicrobianas. Separadamente (centro), a cortiça das árvores a ser transformada é removida para expor o tecido vascular. O diagrama (direita) mostra que (1) a célula reconhece os sinais de planta, que compostos de baixo peso molecular; (2) esses compostos são reconhecidos pela bactéria por meio de um sistema de fosforrelê de dois componentes; (3) a síntese de T-DNA presente no plasmídeo binário é induzida, resultando em uma único filamento de T- DNA, que forma proteínas complexas; (5) genes de virulência adicional são ativados para ajudar a mobilizar (6) o T-DNA na planta célula. Nesse processo, uma cópia do T-DNA é inserida estavelmente no genoma das células vegetais.

[0052] A Figura 8 mostra o procedimento de transformação da presente invenção por rizogenes A. tumefaciens e A. de células maduras a partir de plantas maduras de lima mexicana. Na estufa (esquerda superior) a cortiça de caule a ser infectado é removida (direita superior), e o chumaço é umidificado com a solução que contém A. tumefacíens ou A. rhízogenes. Subsequentemente (esquerda central), o chumaço é colocado no caule, que (direita central) é embalado em um plástico flexível e segurado com fita. As plantas (esquerda inferior) são transferidas às bolsas plásticas para manter alta umidade relativa, o que favorece a transformação genética das mesmas. Após a transformação (direita inferior), a capacidade fotossintética das plantas é avaliada como uma indicação de que os feixes vasculares das mesmas são permeáveis.

[0053] A Figura 9 mostra o desenvolvimento de áreas fotossintéticas sobressalentes pequenas na forma de caloses nas plantas inoculadas, de acordo com a presente invenção (esquerda). No painel direito, os tumores foram delineados para localizar visualmente os mesmos.

[0054] A Figura 10 mostra a fotossíntese de estimação de plantas tratada de acordo com a presente invenção. A fotossíntese foi medida a 500 micromoles de intensidade de luz. Os valores de fotossíntese correspondem a micromoles fixos de CO2 por cm"1 x sec’1. O controle corresponde ao valor médio de cinco plantas infectadas inoculadas com água. A barra de GUS corresponde à planta infectada com o gene GUS (que codifica a betaglucuronidase) . A barra de DEF corresponde à transformação com o gene que codifica a defensina fundido com CsPP16, barra de LIS, lisozima-CsPP16 e LYD-CsPP16, a combinação de ambos os microbicidas. As plantas de lima saudável são usadas como controle. Conforme mostrado, após o tratamento, as plantas de lima infectadas e transformadas com microbicidas aumentam a capacidade fotossintética das mesmas.

[0055] A Figura 11 mostra o número de novos ramos em plantas tratadas de acordo com a presente invenção. O gráfico indica o tamanho de novos ramos em plantas tratadas, em que as plantas com ramos maiores foram aqueles que recebem os tratamentos com microbicidas de acordo com a invenção. Os tratamentos foram: GUS (plantas que expressam uma proteína-repórter sem capacidade microbicida); DEF/LIS (plantas que expressam defensina humana fundida com CsPP16 e lisozima fundido com CsPP16; ambos os genes são expressos a partir do promotor 35S de CaMV e são flanqueados pelas bordas esquerda e direita de T-DNA) .

[0056] A Figura 12 A tabela superior mostra o tamanho dos novos ramos nas plantas após o tratamento indicado. O gráfico inferior mostra o comprimento médio de novos ramos. As plantas com ramos maiores foram aquelas que recebem os tratamentos com microbicidas de acordo com a presente invenção. (esquerda inferior) mostra a aparência de novos ramos sem sintomas em plantas tratadas com microbicidas. Os tratamentos foram: GUS (plantas que expressam uma proteína-repórter sem capacidade microbicida); DEF/LIS (plantas que expressam defensina humana fundida com CsPP16 e lisozima fundido com CsPP16; ambos os genes são expressos a partir do promotor 35S de CaMV e são flanqueados pelas bordas esquerda e direita de T-DNA) .

[0057] A Figura 13 mostra a aparência das plantas tratadas após 100 dias de tratamento.

[0058] A Figura 14 mostra a comparação das áreas de folha de plantas antes e após o tratamento com microbicidas de acordo com a presente invenção.

[0059] A Figura 15 mostra o desenvolvimento de pequenos hiperprodutores de tumores de microbicidas nos caules das plantas produzidas pela transformação genética de acordo com a presente invenção.

[0060] A Figura 16; mostra a quantificação da bactériaor bactéria Candidatus Liberibacter a 60 dias em plantas tratadas com microbicidas de acordo com a presente invenção. Os dados são unidades arbitrárias calculadas por PCR em tempo real.

[0061] A Figura 17 mostra (A) a detecção de Candidatus Liberibacter em plantas adultas infectadas com HLB por PCR quantitativa. A carga bacteriana foi medida por PCR em tempo real; os dados foram normalizados por gene endógeno de citrus COX. O valor mais alto foi atribuído ao valor arbitrário de 1 (plantas não tratadas) . O asterisco amarelo mostra o valor obtido em plantas saudáveis. Os asteriscos vermelhos mostram as plantas que, estando inicialmente doentes, diminuíram a carga bacteriana comparável às plantas saudáveis. (B) Diagrama simplificado da avaliação em 210 dias de tratamento, em que mais que um terço das plantas são saudáveis, embora os dois terços restantes tenham diminuído em 99% do teor bacteriano.

[0062] A Figura 18 mostra a cultura in vitro de sementes de lima mexicana. Pode-se observar o(esquerda) dia 1, (centro) 3a semana incubado à temperatura ambiente no escuro e (direita) 5a semana incubada a temperatura ambiente na presença de luz.

[0063] A Figura 19 mostra o processo de regeneração de explantes transformados com A. rhízogenes e A. tumefaciens de acordo com a presente invenção. Pode-se observar (esquerda superior) explantes em meio de cocultura, (direita superior) explantes em meio de regeneração (SRM) por 30 dias em condições de escuridão e (fundo) explantes em meio de regeneração (SRM) por 60 dias em conduções de pouca escuridão.

[0064] A Figura 20 mostra o desenvolvimento e a regeneração de um enxerto (esquerda) em 15 dias (centro) e 60 dias (direita) após a geração de enxertos em diferentes padrões.

[0065] A Figura 21 mostra limas obtidas de plantas doentes com HLB e submetidas ao tratamento com microbicida de defensina de acordo com a presente invenção. Pode-se observar (A) a aparência de limas que expressam defensina (verifique que o peso das mesmas, 101 e 84 g, é comparado ao peso de uma lima comercial de um peso médio de 90 g); (B) uma lima saudável (esquerda); uma lima infectada com segmentos irregulares e frutas menores (centro) e uma lima que expressa CsPP16-defensina (direita), em que a simetria do mesocarpo é comparável àquela de frutas saudáveis.

[0066] A Figura 22 mostra a aparência do ensaio de 120 plantas saudáveis transformadas com CsPP16- lisozima, CsPP16-defensina, e uma combinação das mesmas. Foi realizado em microtúneis cobertos com uma malha antiafídeo em Tecoman, Colima, México, área endêmica de HLB (topo). Os dois painéis esquerdos contêm 160 plantas tratadas com o microbicida e expostas a psilídeo infectados com bactéria Candídatus Láberábacter, CsPP16-defensina, CsPP16-indolisina, CsPP16-magainina, CsPP16-cecropina, CsPP16-sarcotoxina, CsPP16-lisozima e combinações pares das mesmas. Mostra (fundo) o interior de um túnel.

[0067] A Figura 23 mostra a quantificação da bactéria Candídatus Láberábacter em árvores de lima mexicana não maduras que expressam CsPP16-defensina, CsPP16-lisozima e ambas em 60 dias após a exposição a psilídeos infectados. OS tratamentos microbicidas de acordo com a presente invenção (esquerda) mostram uma menor quantidade de bactéria e foram comparados ao controle negativo. Em contrapartida, as plantas de controle sem microbicidas (direita) mostra, em geral, uma quantidade maior de bactéria. Na defensina, foi detectada, a baixos níveis, a bactéria em apenas uma planta, ao passo que no tratamento com lisozima, foram detectadas duas plantas, também em baixos níveis. Em combinação, pode-se verificar a detecção de Candidatus Liberibacter em duas plantas. Esses plantas se correlacionam a baixos níveis de microbicida.

[0068] A Figura 24 mostra as unidades de expressão de proteína com atividade antimicrobiana, de acordo com a presente invenção, com capacidade para expressar as ditas proteínas em floema. Pode-se verificar a (topo) a unidade de expressão que contém o promotor AT5G59880 e (fundo) a unidade de expressão que contém o promotor 35S de CaMV.

[0069] A Figura 25 mostra a diminuição de bactéria CLa associada à doença HLB, que foi detectada por EMA-PCR em tempo real.

[0070] A Figura 26 mostra a análise toxicológica precisa em camundongos BALB/c com suco de lima a partir de frutas das plantas tratadas de acordo com a presente invenção.

[0071] A Figura 27 mostra a aparência de árvores de lima mexicana adultas sob confinamento em 3 meses de tratamento antimicrobiano de acordo com a presente invenção.

[0072] A Figura 28 mostra a aparêncil das plantas crescidas em microtúneis após 12 meses (lima mexicana) e 6 meses de tratamento (Lima-da-pérsia, laranja, toranja, e mandarina).

[0073] A Figura 29 mostra a aparência das plantas crescidas sob contenção biológica.

[0074] A Figura 30 mostra as plantas de lima tratadas de acordo com a presente invenção.

[0075] A Figura 31 mostra o teor de bactéria (esquerda) em 3 meses de tratamento em ramos e folhas maduras de plantas infectadas tratadas, de acordo com a presente invenção e a fotossíntese inicial e final (direita) de plantas tratadas com defensina (tratamento 1), lisozima (tratamento 2) e uma mistura de defensina e lisozima (tratamento 3).

[0076] A Figura 32 mostra a área de folha de (A) laranja, (B) toranja, (C) Lima-da-pérsia e (D) plantas de mandarina tratadas de acordo com a presente invenção. Pode-se verificar a área de folha em plantas maduras (barra esquerda de cada grupo) e em plantas não maduras (barra direita de cada grupo).

[0077] A Figura 33 mostra os parâmetros bromatológicos obtidos para suco de lima a partir de frutas das árvores tratadas com defensina, lisozima e uma mistura das mesmas, além de limas a partir de árvores de controle.

[0078] A Figura 34 mostra a imunodetecção de defensina no tecido vascular de uma lima modificada geneticamente.

[0079] A Figura 35mostraumensaiopoPCRePode-se observar o (X) xilema, (C) o câmbio, e o (F) floema (células de acompanhamento e tubos de peneira). ponto terminal da detecção de genes que codificam microbicidas nas plantas tratadas com Agrobacteríum tumefaciens transformadas com os construtos mencionados acima. Pode-se observar a fragmento de 402 bp, que corresponde ao gene que codifica para lisozima humana.

[0080] A Figura 36 mostra (A) a aparência de pólen das plantas tratadas com defensina (RR09) e das plantas de controle não tratadas; (B) a área média de pólen não tratada (barra esquerda) e com tratamento antimicrobiano (lisozima) (barra direita).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0081] A presente invenção se refere a métodos eficientes para o tratamento de doenças causadas por microrganismos patogênicos que invadem o floema de plantas, particularmente, a métodos para a geração de plantas transgênicas, incluindo citrus, resistentes à infecção bacteriana pelo clado de Candidatus Líberobacter (Ca.L.) que causa a doença HLB; esses bactérias são localizadas em de maneira restrita no floema; portanto, os protocolos em que os antibióticos são usados não foram bem sucedidos.

[0082] Até que a presente invenção, a solução para essa doença não foi tratada por métodos de modificação genética pelos quais as plantas geradas adquirem um construto genético, que é constatado e expresso estavelmente.

[0083] Considera-se que o método mais eficaz para o gerenciamento a longo prazo de doenças associadas à Líberíbactería depende da aquisição de resistência nas plantas hospedeiras, assim, a presente invenção baseia-se na aquisição de resistência em plantas que usam modificação genética. Portanto, a invenção compreende um método de transformação genética, que é adequado para espécie de citrus e é direcionado para transferir um mecanismo de defesa para eliminar ou combater a infecção causada por pelo menos um micro-organismo patogênico que invade o floema das plantas; por exemplo, uma bactéria do grupo que compreende Candidatus Liberobacter, Candidatus Liberobacter asiaticus, Candidatus Liberobacter africanus, e/ou Candidatus Liberobacter americanus, desse modo, controlando as doenças associadas a essas infecções, tais como, HLB e Zebra da Batata-Feita (Zebra-Chip) (ZC). O sucesso do método da presente invenção baseia-se no uso de um mecanismo usado por plantas para translocar moléculas com atividade antimicrobiana por meio do tecido vascular.

[0084] A presente invenção baseia-se, por exemplo, o fato de que a parede de célula da Candidatus Liberibacter spp. é composta de peptidoglicano, então, supõe-se que as bactérias são suscetíveis a serem destruídas por enzimas, tais como, lisozima. Além disso, a presente invenção se refere a uma estratégia para controlar a infeção com o uso a necessidade de Candidatus liberibacter spp. se assentar no floema da planta.

[0085] O método da presente invenção compreende alcançar a expressão de um gene quimérico que codifica uma proteína de fusão que tem uma dupla função: atuar como um transportador no interior do tecido vascular da planta e realizar atividade antimicrobiana; por exemplo, destruir a parede de célula de bactéria patogênica que invade o floema das plantas, por exemplo, Candidatus Liberibacter spp.

[0086] Durante o desenvolvimento da presente invenção, foi conduzido um protocolo de transformação com o qual foi possível obter uma eficiência de transformação razoável e integração bem sucedida e estável do transgene quimérico proposto no presente documento, conforme confirmado pelos dados experimentais mostrados abaixo, que também mostram que a proteção contra a infeção por HLB pelo método da presente invenção também se deve, de maneira bem sucedida, à transferência, à expressão e à funcionalidade do gene transferido.

[0087] A presente equipe de pesquisa caracterizou detalhadamente uma proteína que liga RNA independente da sequência do mesmo; a mesma foi denominado de CmPP16, em que essa proteína não apenas se associa a diferentes RNAs in vitro, porém também tem capacidade para transportar os mesmos a partir de uma célula a outra por meio do plasmodesmo (Xoconostle-Cazares et al., 1999). Portanto, a CmPP16 é funcionalmente semelhante às proteínas de movimento de vírus de RNA embora, conforme já foi implicado, sua função em plantas saudáveis seja desconhecida. Esse trabalho pioneiro demonstrou a presença de um sistema endógeno da planta saudável para translocar proteínas e ácidos nucleicos, um sistema que é usado por vírus para mover sistematicamente. Os homólogos da proteína CmPP16 foram constatados em diferentes espécies de planta, porém a conservação dos mesmos não é tão alta quanto. As presente investigações também indicam que a CmPP16 fundida a proteínas maiores não perde sua capacidade de transporte intracelular por meio de plasmodesmo. Uma evidência da capacidade de movimento da proteína CmPP16 são os resultados mostrados na Figura 5, em que as imagens de um microscópio confocal mostram que quando a proteína CmPP16 é microinjetada em células mesofílicas de Nícotáana benthamáana, as folhas podem se mover de célula a célula; e quando a CmPP16 foi complexada com RNA, também mediou o movimento de RNA para células vizinhas. A Figura 6 mostra a localização de CmPP16 no floema.

[0088] Em relação a patógenos que circulam através do floema e raramente deixam o mesmo durante o processo infeccioso, uma limitação no tratamento de doenças causadas por esses patógenos é a incapacidade de agentes químicos (por exemplo, antibióticos) para atingir os elementos de peneira que abrigam o patógeno. Com base em nesse precedente, para o desenvolvimento da presente invenção considerou-se que a proteína CsPP16 funciona como um veículo para transportar proteínas nos elementos de peneira, que normalmente não são acessíveis. Portanto, sugere-se que a proteína com atividade antimicrobiana fundida à CsPP16 pode acessar o floema e, particularmente, o elemento de peneira, em que o peptídeo exerce a sua atividade antibacteriana e/ou microbicida. Para alcançar sucesso nessa abordagem estratégica da presente invenção, foi necessário projetar o vetor de expressão das proteínas de fusão CsPP16-peptídeo descritas no presente documento e realizar uma transformação estratégia.

[0089] A presente invenção propõe o uso de um gene que codifica a proteína CsPP16 fundida a uma proteína com atividade antimicrobiana, por exemplo, com atividade antibacteriana; nesse caso, por exemplo, lisozima humana. A expressão de tal proteína de fusão deve ser direcionada por um promotor específico de floema, por exemplo, caracterizado anteriormente. O dito promotor regula a expressão de uma proteína que é exigia para manter a alta condutividade do floema, por exemplo, o fator 3 de despolimerização de actina (ADF3), embora outros fatores que alcançam o mesmo efeito possam ser usados na presente invenção.

[0090] Com base na literatura, foram selecionadas proteínas com atividade antimicrobiana em outros sistemas, aquelas com atividade antimicrobiana em plantas. Convém verificar que foram usadas a lisozima humana e defensina humana para impedir que os recombinantes gerem problemas imunes em humanos, visto que as frutas citrus destinam-se a consumo humano.

[0091] De acordo com a presente invenção, as sequências de proteína antibiótica foram obtidas a partir do banco de dados GenBank (NCBI), e a sequência de aminoácido foi convertida em uma sequência-base com o uso dos códons mais comuns em citrus. As informações exigidas para mudar o uso de códons se encontram na tabela 3.

[0092] A fim de fornecer os elementos essenciais para poder realizar a invenção, a lista de códons usados comumente para citrus disponíveis no banco de dados http://www.kazusa.or.jp/códon/ é apresentada abaixo. Indian citrus ringspot vírus [gbvrl]: 12 Citrus idaeovirus [gbvrl]: 1 Citrus sinensis x Poncirus trifoliata Citrus tatter leaf vírus [gbvrl]: 3 [gbpln]: 3 Cytoplasmic citrus leprosis vírus Citrus natsudaidai [gbpln]: 1 [gbvrl]: 18 Citrus leaf blotch virus [gbvrl]: 3 Citrus leaf rugose vírus [gbvrl]: 4 mitochondrion Citrus junos [gbpln]: 1 Citrus 17 variegation vírus [gbvrl]: Citrus junos [gbpln]: 7 Citrus maxima [gbpln]: 8 Citrus 1 sinensis x Citrus reticulata [gbpln]: Citrus x paradisi [gbpln] : 28 Citrus aurantiifolia [gbpln]: 1 Citrus kinokuni [gbpln]: 1 Citrus latipes [gbpln]: 1 Citrus cv. Shiranuhi [gbpln]: 12 Citrus hystrix [gbpln]: 1 Citrus unshiu [gbpln]: 64 Microcitrus sp. citruspark01 [gbpln] : 1 Mitochondrion Citrus jambhiri [gbpln]: 1 Citrus hybrid cultivar [gbpln]: 1 Citrus jambhiri [gbpln]: 15 Citrus yellow mosaic vírus [gbvrl]: 6 Citrus psorosis vírus [gbvrl]: 9 Citrus limon [gbpln]: 11 Citrus cv. Sainumphung [gbpln]: 5 Chloroplast Citrus sinensis [gbpln]: 89 Citrus iyo [gbpln]: 2 Citrus sinensis [gbpln]: 116 Citrus reticulata [gbpln] : 3 Citrus macrophylla [gbpln]: 2 Citrus clementina [gbpln] : 4 Citrus 4 sudden death-associated vírus [gbvrl]: Citrus ringspot vírus [gbvrl]: 1 Citrus Clementina x Citrus Citrus tristeza vírus [gbvrl]: 476 reticulata [gbpln]: 4

[0093] Para o projeto dos construtos usados na presente invenção, após obter a sequência dos genes sintéticos, os mesmos foram adicionados com sequências regulatórias, por exemplo, o promotor 35S do vírus de mosaico de couve-flor e terminador NOS. No entanto, outras sequências regulatórias que funcionam da mesma maneira podem ser usadas para os propósitos da presente invenção. TABELA 3. USO DE CÓDONS COMUNS EM CITRUS SINENSIS X CITRUS RETICULATE

Observação: Durante a codificação de GC 43,22% 1a letra GC 51,98% 2a letra GC 34,75% 3a letra GC 42,94%

[0094] Todos os construtos genéticos descritos no presente documento contêm como promotor 1 o promotor d35S dos vírus de mosaico de couve-flor CaMV 355 e a sequência NOS como sequência terminadora. Adicionalmente, outro conjunto de construtos contêm o promotor 59880 de expressão específico de floema de Arabídopsás thaláana para conduzir a expressão dos peptídeos microbicidas mencionada acima, desse modo, permitindo a expressão apenas no tecido vascular em que o organismo fitopatogênico, por exemplo, é constatado. Todos os construtos descritos no presente documento contêm, em suas extremidades, as bordas esquerda e direita do T-DNA de Agrobacteríum e carecem de marcadores de seleção.

[0095] O objectivo principal da presente invenção é fornecer métodos para obter plantas transgênicas ou geneticamente modificadas que expressam uma proteína de fusão pela qual as mesmas adquirem a resistência contra infecções do micro-organismo que afeta o floema das plantas e que gera doenças, tal como, a bactéria que causa HLB. Um dos métodos da invenção compreende as seguintes etapas:

[0096] 1) Conjugar a uma cepa de Agrobacteríum um vetor de expressão de DNA da proteína CsPP16 fundida a uma molécula antibacteriana,

[0097] 2) Inocular uma planta suscetível a infecção por agentes microbianos que causam doenças, por exemplo, agentes bacterianos que causam HLB ou doenças causadas por microrganismos que afeta o floema das plantas, com a dita cepa de Agrobacteríum que têm o vetor de expressão.

[0098] 3) Verificar a aquisição do vetor e a expressão do mesmo, a estabilidade do mesmo nas plantas transformadas e nos descendentes do mesmo e verificar a resistência adquirida.

[0099] Em uma modalidade, o método acima compreende, na etapa 2), a inoculação das plantas infectadas anteriormente com o agente microbicida que causa a doença, com os vetores descritos no presente documento.

[0100] De acordo com a presente invenção, é fornecida a construção de vetor de expressão que deve ter basicamente o gene que codifica CsPP16 ligado ao gene que codifica para uma proteína microbicida com especificidade para remover microrganismos que afetam o floema das plantas, por exemplo, bactéria localizadas no floema das plantas, particularmente, bactéria, tal como, Candídatus Líberíbacter, Candídatus Líberíbacter asíatícus, Candídatus Líberíbacter afrícanus, e/ou Candídatus Líberíbacter amerícanus que causam infeção por HLB em espécies de citrus. Nas modalidades da invenção também há aqueles vetores de expressão que facilitam a expressão de uma proteína de fusão selecionada a partir do grupo que compreende CsPP16-peptídeo com atividade antimicrobiana, CsPP16-peptídeo mieloide microbicida, CsPP16-lisozima, CsPP16-Beta-defensina-1, CsPP16-Polifemusina-1, CsPP16- tachiplesina, CsPP16-Protegrina-1, CsPP16-Magainina, CsPP16-Indolicidina, CsPP16-Cecropina, CsPP16-Sarcotoxina IA, CsPP16-Pirrocoricina e CsPP16-Defensinas, e uma mistura das mesmas.

[0101] Oura modalidade da invenção é a possibilidade de gerar uma condição resistente à “Zebra da Batata-Feita (Zebra-Chip)" (ZC) que ocorre nas batatas por Candídatus Líberíbacter solanacearum.

[0102] Ainda, outras modalidades da invenção são as construções de vetores de expressão mostradas na Figura 24; as mesmas são caracterizadas por terem as seguintes sequências:

[0103] • unidade de expressão de CsPP16- Lisozima, que contém a borda esquerda de T-DNA de A. tumefacíens (SEQ. ID. No. 1), a versão curta do promotor 35S do vírus de mosaico de couve-flor (SEQ. ID. No. 2), o gene que codifica a proteína 16K do floema de Citrus aurantifolia, ortólogo em citrus ou proteína CsPP16 (SEQ. ID. No. 3), um poli-ligante flexível(SEQ. ID. No. 4), lisozima humana com uso de códon em citrus (SEQ. ID. No. 5) e o terminador NOS e a borda direita de T-DNA de A. tumefaciens (SEQ. ID. No. 6).

[0104] • unidade de expressão de CsPP16- Defensina, que contém a borda esquerda de T-DNA de A. tumefaciens (SEQ. ID. No. 1), o promotor 35S amplo do vírus de mosaico de couve-flor (SEQ. ID. No. 7), o gene que codifica a proteína 16K do floema de Citrus aurantifolia, ortólogo em citrus ou a proteína CsPP16 (SEQ. ID. No. 3), um poli-ligante flexível (SEQ. ID. No. 4), defensina humana com uso de códons em citrus (SEQ. ID. No. 8), o terminador NOS e a borda direita de T-DNA de A. tumefaciens (SEQ. ID. No. 6).

[0105] Além disso, e para propósitos da presente invenção, as unidades de expressão a seguir também são compreendidas:

[0106] • unidade de expressão de CsPP16- Magainina que contém todos os elementos indicados para a unidade de expressão de CsPP16-Defensina, com exceção da Defensina humana com uso de códon em citrus (SEQ. ID. No. 8), que é substituído por Magainina com uso de códon em citrus (SEQ. ID. No. 9).

[0107] • unidade de expressão de CsPP16- Cicropina que contém todos os elementos indicados para a unidade de expressão de CsPP16-Defensina, com exceção da Defensina humana com uso de códon em citrus (SEQ. ID. No. 8), que é substituída por Cecropina com uso de códon em citrus (SEQ. ID. No. 10).

[0108] • unidade de expressão de CsPP16- Sarcotoxina que contém todos os elementos indicados para a unidade de expressão de CsPP16-Defensina, com exceção da Defensina humana com uso de códon em citrus (SEQ. ID. No. 8), que é substituída por Sarcotoxina com uso de códon em citrus (SEQ. ID. No. 11).

[0109] • unidade de expressão de CsPP16- Indolicidina que contém todos os elementos indicados para a unidade de expressão de CsPP16-Defensina, com exceção da Defensina humana com uso de códon em citrus (SEQ. ID. No. 8), que é substituída por Indolicidina com uso de códon em citrus (SEQ. ID. No. 12).

[0110] Em uma das modalidades da invenção, o promotor 35S curto (SEQ. ID. No. 2) ou promotor amplo(SEQ. ID. No. 7) do vírus de mosaico de couve-flor constatado nas unidades de expressão da invenção CsPP16-lisozima, CsPP16- Defensina, CsPP16-Magainina, CsPP16-Cecropina, CsPP16- Sarcotoxina e CsPP16-Indolicidina mencionadas acima, pode ser substituído pelo promotor AT5G59880 vascular (SEQ. ID. No. 13).

[0111] As unidades de expressão mencionadas acima foram sintetizadas posteriormente por GenScript USA Inc., sequenciadas para verificar que nenhuma mutação foi inserida no processo de montagem e clonadas no vetor com resistência para antibiótico betalactâmico. Os plasmídeos obtidos foram transformados por eletroporação na bactéria Agrobacteríum tumefaciens e Agrobacteríum rizogenes, selecionado a bactéria em transformação com a carbenicilina antibiótica em uma concentração final de 100 μ/ml.

[0112] O primeiro método de transformação com os construtos descritos acima compreende, por exemplo, a transformação genética de caules e ramos de citrus, que são regenerados in vitro para obter uma plântula geneticamente modificada, que é enxertada em um talo da raiz ou padrão, tal como, laranja-da-terra e variedades de volkameria ou macrofila. O padrão pode partir de uma plântula de 1 cm, a partir da germinação de uma semente de laranja-da-terra, ou o padrão é uma planta citrus não madura, à qual a explosão de aroma geneticamente modificada é enxertada lateralmente para o crescimento da mesma.

[0113] O segundo método de transformação com os construtos descritos acima compreende promover a geração de pequenas áreas modificadas geneticamente de plantas adultas, saudáveis ou doentes com a bactéria que produz HLB. Isso envolve expor o tecido vascular de caules ou galhos localizados entre tecidos consumidores e produtores (fotossintético). Isso é feito mediante raspagem até que seja constatado o tecido fotossintético verde e mediante a colocação do mesmo em um chumaço umidificado em um tampão com uma solução de Agrobacteríum pré-tratada com acetossiringona e diluído em um tampão com indutores de crescimento de planta (auxinas e citocininas). A planta ou galho pré-tratada é colocada em uma bolsa para manter em alta umidade o ressecamento com Agrobacteríum tumefacíens até três dias, removendo a peliculização após o tratamento indicado. As plantas são expostas ao tratamento de dois dias até um mês, obtendo-se, em todos os casos, a expressão do microbicida nos tecidos vasculares e acumulados em tecidos consumidores, que são os locais de infecção da bactéria.

[0114] De acordo com a presente invenção, após a transformação de plantas doentes, a presença do organismo que causa a doença é monitorada; por exemplo, a bactéria que causa HLB, que diminui devido aos tratamentos de expressão microbicida aplicada somente ou em combinações. As plantas doentes que foram tratadas pela invenção recuperaram sua fotossíntese, o que indica que os tecidos vasculares não mais foram bloqueados e que as plantas puderam florir e conduzir um preenchimento apropriado da fruta. Enquanto isso, as plantas tratadas com Defensina florescerem; a Figura 21A mostra duas limas obtidas, 101 e 84 g, que foram cortadas no eixo geométrico transversal, que mostra um mesocarpo simétrico. Essa aparência é normal em frutas saudáveis, em comparação àquelas infectadas, que contêm um mesocarpo assimétrico (segmentos) (Figura 21B).

[0115] Os resultados na transformação de plantas doentes de 1,20 m de altura pela presente invenção e a avaliação das mesmas até 210 dias mostram uma diminuição substancial nos sintomas de HLB e a recuperação de condições fisiológicas normais da planta (crescimento, produção de ramos, fotossíntese crescente, floração, e preenchimento de fruta) (Figura 17).

[0116] Ademais, a transformação genética de árvores não maduras de 1,20 m com um certificado de controle de saneamento e do viveiro certificado Emiliano Zapata, foram expostas a psilídeos infectados no campo com Candidatus Liberibacter em Tecoman Colima, México, sob quantidade nula ou baixa de bactérias em contrapartida às árvores de controle transformadas com Agrobacteríum com plasmídeos sem genes que codifica para os microbicidas mencionados acima. As árvores descritas acima foram expostas a psilídeos infectados com Candídatus Líberíbacter, e a presença da bactéria foi avaliada após 60 dias. Essa avaliação consistiu em coletar 2 folhas fotossintéticas maduras e 2 folhas não maduras, denominadas de broto. O DNA total da veia central foi isolado, e o número de bactérias foi estimado por PCR em tempo real do gene 16S de Candídatus Líberíbacter com o uso de sondas fluorescentes. Os valores obtidos foram normalizados com o gene endógeno de lima de COX (Figura 23). Os resultados mostram que no tratamento com lisozima, defensina e uma combinação das mesmas (Lis e Def), o número de bactérias é reduzido ou não detectável, em contrapartida às plantas de controle que não expressam os microbicidas.

[0117] Ademais, o segundo método que compreende a transformação de explantes e a regeneração dos mesmos por meio de cultura de tecido, de acordo com a presente invenção, mostra que as plantas puderam se regenerar e ser vigorosas. Nesses experimentos, as plantas enxertadas vigorosas foram obtidas expressando-se os microbicidas mencionados acima, dos quais dez transformantes independentes foram selecionados para teste em campo adicional sob condições de biossegurança.

[0118] Abaixo, como exemplos, são descritos dois construtos usados que incluem as sequências fundidas, que foram sintetizadas, e exemplos do procedimento para obter plantas geneticamente modificada resistentes à HLB. Além disso, inclui-se uma descrição que usa exemplos para determinar o desempenho dos construtos como vetores para a transferência dos genes de fusão projetados.

[0119] Os exemplos a seguir são incluídos para o propósito de apenas ilustra a invenção, sem implicar limitação no escopo da mesma. Portanto, os procedimentos e materiais podem ter variantes, detectáveis por uma pessoa versada no campo da técnica, que estão dentro do escopo e do espírito da invenção.

[0120] Exemplo 1. Obtenção de unidades de expressão de CsPP16 que contêm o promotor 35S do virus de mosaico de couve-flor. A fim de obter tais unidades de expressão das sequências indicadas na tabela 4, as mesmas foram sintetizadas e montadas na ordem listada; foram sequenciadas para verificar que não houve mutação inserida no processo de montagem e, por fim, clonadas no vetor de Genscript, que contém a resistência a antibiótico de carbenicilina.

[0121] Os plasmídeos recombinantes resultantes foram transformados em células competentes de Agrobacteríum tumefaciens e A. rízogenes. Foi usado antibiótico de carbenicilina, que é a versão sintética de ampicilina e é mais estável. O DNA de plasmídeo foi extraído da bactéria resistente, e a presença do plasmídeo recombinante foi verificada em gel de agarose.

[0122] A fim de verificar a presença do gene de interesse com atividade antimicrobiana inserido no vetor ou na planta transformada pelo mesmo, iniciadores de oligonucleotídeo específicos foram usados para amplificação por PCR; por exemplo, no caso de lisozima, o oligonucleotídeo direto 3’-AGGTTTTTCGAAAGATGCGAACTTGCTAGAA- 5' (SEQ. ID. No. 14), e o reverso 3'- AAACACCGCAACCTTGAACATATTGTCTGC-5' (SEQ. ID. No. 15); e, no caso de defensina, o oligonucleotídeo direto 3’- ATGAGAGTTCTTTATCTTCTTTTCAGCTTC-5' (SEQ. ID. No. 16) e o reverso 3'- ACTTCTTCTTGCAGCATCTTGTACCTGGAA-5' (SEQ. ID. No. 17) .

[0123] Exemplo 2. Obtenção de unidades de expressão de CsPP16 que contêm o promotor AT5G59880 vascular. Para obter tais unidades de expressão, o promotor 35S do vírus de mosaico de couve-flor, a versão curta (SEQ. ID. No. 2) ou a versão ampla (SEQ. ID. No. 7), indicados nas unidades de expressão da tabela 4 foi substituído pelo promotor AT5G59880 vascular (SEQ. ID. No. 13). Conforme no exemplo 1, as sequências resultantes foram sintetizadas e montadas na ordem listadas, foram sequenciadas para verificar que não houve mutação inserida no processo de montagem e, por fim, clonadas no vetor da empresa Genscript, que contém resistência a antibiótico de carbenicilina.

[0124] Conforme no exemplo 1, os plasmídeos recombinantes resultantes foram transformados em células competentes de Agrobacteríum tumefaciens e A. rizogenes. Foi usado o antibiótico de carbenicilina, que é a versão sintética de ampicilina e é mais estável. O DNA de plasmídeo foi extraído da bactéria resistente, e a presença do plasmídeo recombinante foi verificada em gel de agarose. TABELA 4

[0125] A fim de verificar a presença do gene de interesse com atividade antimicrobiana inserido no vetor ou na planta transformada pelo mesmo, iniciadores de oligonucleotídeo específicos foram usados para amplificação por PCR; por exemplo, no caso de lisozima, o oligonucleotídeo direto 3’-AGGTTTTTCGAAAGATGCGAACTTGCTAGAA- 5' (SEQ. ID. No. 14), e o reverso 3'- AAACACCGCAACCTTGAACATATTGTCTGC-5' (SEQ. ID. No. 15); e, no caso de defensina, o oligonucleotídeo direto 3’- ATGAGAGTTCTTTATCTTCTTTTCAGCTTC-5' (SEQ. ID. No. 16) e o reverso 3'- ACTTCTTCTTGCAGCATCTTGTACCTGGAA-5' (SEQ. ID. No. 17) .

[0126] Exemplo 3. Expressão transiente dos construtos da invenção em plantas de lima mexicana infectadas com HLB, que usa de Agrobacterium. A Agrobacteríum foi cultivada em um meio de LB a 30 °C sob constante agitação para atingir um O.D. de 0,4 (600 nm). A Acetosiringona foi adicionada às células a uma concentração final de 140 micromolares, incubando-se por duas horas adicionais com o indutor. As bactérias foram colhidas por centrifugação e suspensas novamente em um meio de transformação (Figura 7).

[0127] O método de inoculação de plantas adultas incluiu remover a cortiça lignificada com lixa, expondo o tecido fotossintético verde. Um chumaço pré- umidificado com a bactéria recombinante que contém alguns dentre os vetores de expressão descrito nos exemplos 1 e/ou 2 foi colocado no tecido e suspenso novamente no meio de transformação. O chumaço foi fixado temporariamente ao redor do tecido fotossintético descoberto com plástico e a planta foi coberta com uma bolsa plástica e mantida em alta umidade por dois dias. Após a incubação, a bolsa e o chumaço foram removidos. As plantas continuaram a ser regadas para manter um teor de água adequado que contribui para a transferência de T-DNA para a área tratada.

[0128] Os materiais de citrus criados com o uso de patronos de lima volkameriana enxertada em lima mexicana e/ou Lima-da-pérsia foram usados nos ensaios. As plantas mostraram sintomas associados à HLB, e a carga bacteriana das mesmas de Candidatus Liberibacter foi confirmada por PCR em tempo real. O projeto experimental realizado é mostrado na tabela 5. TABELA 5. PROJETO EXPERIMENTAL USADO PARA TRANSFORMAR ÁRVORES DE LIMA MADURAS.

[0129] A capacidade fotossintética das plantas foi medida com o uso de um sistema IRGA em radiação constante, tomando dez medições por planta.

[0130] As plantas foram inoculadas mediante raspagem do tecido de caule lenhoso com um bisturi, em que um chumaço que contém a solução bacteriana foi depositado na região exposta. O chumaço foi coberto com plástico, e toda a planta foi coberta com uma bolsa plástica grande para manter alta umidade e para contribuir para a geração de tecido transformado (Figura 8). As plantas foram irrigadas com água apenas para evitar o disfarce dos sintomas de HLB. A análise das plantas foi realizada em 60 e em 120 dias após a inoculação.

[0131] A análise das plantas foi realizada em 60 dias após a inoculação. Foi analisado o efeito da expressão de lisozima, de defensina e a combinação das mesmas, mais controles saudáveis, controles doentes e um controle que consistiu em usar o gene-repórter GUS, um indicador do evento de transformação de gene.

[0132] A inoculação das plantas com esses tratamentos implica a integração do T-DNA que contém o gene de interesse no tecido exposto. Em geral, as espécies de Agrobacteríum não virulentas produzem um pequeno tumor na área aplicada, evidência da transformação. As plantas tratadas foram analisadas para a presença de tecido transformado, o que constatou pequenas áreas de tumor, conforme mostrado na Figura 9.

[0133] Exemplo 4. Medição de fotossíntese e área de folha de plantas tratadas de acordo com a presente invenção. Foram tomadas dez medições de cada planta que foram registradas e mediadas com o software Excel; em que as umidades de μmol CO2/cm2.s-1. A Figura 10 mostra o gráfico dos valores obtidos. O valor de fixação de CO2 de plantas doentes foi menor que aqueles dos tratamentos. Verifica-se que o valor obtido nas plantas doentes tratados com GUS mostrou uma heterotrofia franca. As plantas tratadas com os construtos da invenção que incluem peptídeos microbicidas têm maior capacidade fotossintética, que pode ser atribuída a um aprimoramento no estado fisiológico da planta dois meses após a inoculação. Nesse período (60 dias), a fotossíntese resultante após o tratamento de defensina foi menor que aquela obtida com lisozima. No entanto, em 210 dias ambos os tratamentos mostraram valores de fotossíntese semelhantes àqueles de plantas saudáveis.

[0134] Ao mesmo tempo, o número de novos ramos nessas plantas e o tamanho das mesmas foi quantificado. Conforme mostrado na Figura 11, as plantas de controle de GUS (doentes sem tratamento antimicrobiano) mostraram menos ramos novos, em que os tratamentos com CsPP16-defensina e com defensina/lisozima mostraram um maior número. Os tratamentos compreenderam aplicar à bactéria transformadas com o vetor que contém CsPP16-defensina um segundo tratamento com CsPP16-lisozima, e um terceiro tratamento com uma mistura de bactéria que contém CsPP16-defensina e CsPP16-lisozima. Observou-se consistentemente que os tratamentos com defensina produzem um maior número de ramos, que pode ser devido ao fato de que esse gene atuou mais rapidamente no controle da bactéria Candidatus Liberibacter. Após 210 dias, o número de ramos nos tratamentos foi estatisticamente semelhante.

[0135] Além disso, a Figura 12 mostra em um gráfico o tamanho dos novos ramos; e, que os tratamentos com CsPP16-defensina e CsPP16-lisozima mostraram um tamanho maior. Conforme descrito, as diferenças em 60 dias não mais foram observadas à medida que o tempo decorreu nos tratamentos. Verifica-se que, durante esse período, as plantas não eram fertilizadas para evidenciar sintomas de HLB, que são mais evidentes quando as plantas sofrem estresse nutricional. A Figura 12 mostra a aparência de um ramo obtido com o tratamento lisozima/defensina de acordo com a invenção; o ramo aparente não ter sintomas e tem áreas de folha semelhantes às plantas saudáveis.

[0136] Após 60 dias de inoculação, os novos ramos não mostraram sintoma adicional associado à HLB, em comparação aos ramos pré-existentes, em que, apesar da inoculação, os sintomas característicos de HLB permanecerem. Concluiu-se que isso foi uma indicação possivelmente devido ao acúmulo excessivo de calose no floema, o movimento livre de proteínas é bloqueado através desse elemento, o que impede que o mesmo atinja aqueles tecidos. Isso é consistente com a análise de fotossíntese mostrada anteriormente, em que a heterotrofia nesses tecidos está evidente. Os novos ramos não apresentam qualquer sintoma visível da doença, portanto, conclui-se que se deve aos tratamentos com microbicidas de acordo com a invenção; a Figura 13 mostra a aparência de plantas tratadas de acordo com a invenção após 100 dias de tratamento. Também mostra a comparação de plantas de controle e aquelas tratadas com microbicidas, em que um aprimoramento evidente em sintomas nos ramos das plantas tratadas foi observado.

[0137] A medição de áreas de folha foi conduzida antes e após 60 dias de tratamento nos novos ramos de cada tratamento, analisando 10 folhas por cada planta. As áreas de folha de cada planta foram mediadas e analisadas pelo gráfico mostrado na Figura 14, em que pode- se observar um aumento na área de folha das plantas com o tratamento antimicrobiano semelhante às áreas de folha da planta saudável, contrário ao que acontece com as plantas de controle em que observa-se uma diminuição nas áreas de folha, possivelmente, devido à progressão da doença. Além disso, em plantas inoculadas com Agrobacteríum, observou-se no caule o desenvolvimento de pequenos tumores na área de inoculação, p que indicou a presença de zonas hiperprodutoras das microbicidas, conforme mostrado na Figura 15.

[0138] Exemplo 5. Mediação de teor de microbicida nas plantas transformadas. Obtiveram-se as amostras de planta que consistem em folhas pré-existentes e novas. As plantas foram processadas, de acordo com procedimentos de teste, estabelecidos pelo Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria de SAGARPA, México.

[0139] Brevemente, a veia central da folha foi dissecada em pequenas seções com o auxílio de uma navalha descartável. O tecido foi pesado (100 mg) e processado de duas maneiras, uma para obter um DNA total com o uso de um kit de purificação comercial, e o outro para o tratamento com azida de monoetídio (MEA) e purificação subsequente de DNA, para discriminar se o DNA usado como modelo esteve presente em bactérias vivas ou mortas.

[0140] A Figura 16 mostra os resultados dessa análise. Conforme pode ser visto, o número de bactéria viva diminuiu no tratamento, embora não tenha sido destruída completamente. Deve-se verificar que esse ensaio de expressão transiente expressa, em regiões distintas da planta, o microbicida usado, e a quantidade produzida não pode ser controlada. O gráfico mostra o tamanho total da barra como indicação da detecção bacteriana total, e na cor azul, o número de bactérias mortas, ao passo que a cor vermelha mostra o número de bactérias vivas. Em geral, o tratamento tem até um sexto da carga nas plantas de controle doentes. Esse resultado é muito promissor considerando que essas plantas são produtoras de quimeras de microbicidas; com o uso de métodos de gene transformação para obter plantas, plantas completamente transformadas em todos os tecidos, é possível alcançar uma resistência à doença próxima a 100%.

[0141] O gráfico na Figura 17 mostra a relação de carga bacteriana viva/morta após 60 dias de tratamento, em que pode-se observar que o número de bactérias vivas nas plantas que foram tratadas com o microbicida é até 4 vezes inferior às plantas de controle, em que o número tanto de bactérias mortas quanto de bactérias vivas é muito maior que as plantas tratadas.

[0142] Exemplo 6. Teste de expressão estável em plantas de lima mexicana infectada com HLB. A expressão estável de lisozima em lima mexicana é realizada transformando-se explantes de lima e, uma vez regenerados; os mesmo são enxertados em padrões de lima, o que permite obter plantas maduras transgênicas que expressam a proteína de interesse em um curto tempo.

[0143] A germinação in vitro de sementes de lima mexicana foi conduzida em tubos de ensaio que contêm meio de germinação estéril, conforme mostrado na Figura 18. Na composição do meio, há elementos minerais, água, hormônios, substâncias orgânicas, vitaminas, e sacarose, que promovem a germinação das sementes de lima. As sementes foram esterilizadas anteriormente com uma solução com cloro a 30% por meia hora, seguido por três lavagens com água estéril. A semeadura das sementes foi realizada sob condições estéreis. Uma vez plantadas, as sementes foram incubadas à temperatura ambiente no escuro por aproximadamente 2 a 3 semanas. Após esse período, o ramo do cotilédone foi observado e novamente incubado por 1 semana à temperatura ambiente sob um período de exposição à luz (16 horas de luz e 8 horas de escuridão); isso para permitir a ativação da atividade fotossintética da planta.

[0144] As plantas então obtidas foram usadas, em seguida, para obter explantes, que são transformados por Agrobacteríum tumefaciens e Agrobacteríum rízogenes que contém o construto CsPP16-lisozima.

[0145] Para a transformação de explantes de lima com A. tumefaciens e com A. rízogenes, essas bactérias são cultivadas primeiramente em um meio de LB a 30 °C sob agitação para atingir um O.D. de 0,4 (600 nm) . Às células foi adicionada acetossiringona em uma concentração final de 140 micromolares e incubadas por duas horas adicionais com o indutor. As bactérias foram colhidas por centrifugação e suspensas novamente no meio de transformação. Os caules das limas germinadas in vitro foram cortados a um comprimento aproximado de 1 cm com uma faca imersa anteriormente no meio de transformação sob condições estéreis. O excesso de fluido dos explantes cortados foi removido com o uso de um papel absorvente estéril. Os explantes foram transferidos para um meio de cocultivação (CM), em que foram incubados à temperatura ambiente por 1 a 2 dias no escuro. Após esse período, os explantes foram transferidos novamente a um meio de regeneração (SRM) e incubados à temperatura ambiente no escuro por 4 semanas. Subsequentemente, os explantes foram incubados por mais 4 a 6 semanas à temperatura ambiente sob período de exposição à luz (16 horas de luz e 8 horas de escuridão) até a regeneração completa. Os explantes foram mudados para um SRM fresco a cada 4 semanas ou no caso de contaminação. As Figuras 7, 8 e 19 mostram o processo de transformação e de regeneração de explantes de lima mexicana.

[0146] Para propagar os explantes transformados em diferentes padrões de lima mexicana, os mesmos foram enxertados em padrões de lima volkameriana, citrange troyer ou Schaub áspero.

[0147] Os enxertos, nos padrões acima, estavam fazendo um corte na forma de "V" em 15 cm a partir da base do padrão e, cuidadosamente, colocando dentro desse corte os explante transformado em sua totalidade. O enxerto foi fixado com parafilm. A planta foi regada com água apenas, e o enxerto foi coberto com uma bolsa plástica para manter uma umidade relativa e para permitir a regeneração. Sessenta dias após a implantação de enxerto, a expressão de lisozima foi analisada por ponto terminal de PCR e qRT-PCR com o uso de oligonucleotídeos, tais como, aqueles descritos nos exemplos 1 e 2.

[0148] A composição dos meios de cultura usados para a transformação de lima mexicana foi: Um meio de LB (950 ml de água destilada; 10 g de triptona; 5 g de estrato de levedura; 10 g de NaCl com pH 7 ajustado com NaOH a 1 N (essa solução é ajustada a um volume final de 1 litro com água deionizada e esterilizada);,meio para germinar sementes de lima (1 litro de meio MS, em que 30 g de sacarose e 2 g de gelrite são dissolvidos); meio de cocultura MC (1 litro de meio MS, em que 2 mg de ácido indol-3-acético, 1 mg de 2-isopentil-adenina, 2 mg de ácido 1,4-diclorofenoxiacético e 8 g de agar são dissolvidos; o pH em 5,2 é ajustado com NaOH a 1 N e esterilizado) ; meio de regeneração SRM (1 litro meio MS em que 3 mg de 6- benzilaminopurina e 10 g de agar são dissolvidos; o pH a 5,2 é ajustado com NaOH a 1 N e esterilizado; uma vez que o meio está morno, 250 mg/L de vancomicina e 500 mg/L de antibióticos de cefotaxima foram adicionados).

[0149] Exemplo 7. Transmissão antimicrobiana através de enxerto. As transformações genéticas de citrus Lima-da-pérsia e lima mexicana foram realizadas padrões de talo da raiz de C. volkameríana e C. macrophylla laranjada-terra. Nesses ensaios, os talos da raiz microbicidas que contêm defensina, lisozima e uma mistura dos mesmos foram transformados, cada um dos mesmos fundidos de maneira traduzida com a proteína CsPP16, que é a proteína de proteína sistêmica de citrus 16KDa. A transformação foi realizada expondo-se o tecido de caule a um abrasivo, e o tecido foi colocado subsequentemente em contato com uma solução de A. tumefacíens ou A. rízogenes, que contém os construtos genéticos descritos (Figura 8). As plantas usadas forma enxertadas em ramos infectados de HLB que apresentaram os sintomas característicos da doença.

[0150] As plantas foram analisadas em busca da presença da proteína em enxertos e das características agronômicas das mesmas, tais como, altura da planta, fotossíntese, área de folha e quantificação da bactéria.

[0151] As plantas tratadas anteriormente foram monitoradas por um ano, o que constata que novos ramos e frutas foram produzidos com uma quantidade reduzida da bactéria em relação às contagens iniciais. As folhas antigas e novas foram monitoradas; o que constata a concentração mais alta nas folhas antigas e não nos ramos novos. Deve-se verificar que o sintoma de mosqueamento difuso não desapareceu das folhas maduras. Esse fato é interpretado como uma incapacidade para mobilizar o polímero de amido de folha gerado por esse sintoma de mosqueamento. A Figura 25 mostra o comportamento em um ano da análise de plantas doentes com HLB e que foram transformadas nos talos da raiz das mesmas de volkameriana e macrofila, e galhos do enxerto com os construtos descritos.

[0152] As amostras das folhas com os sintomas, tais como, folhas sistêmicas assintomáticas foram coletadas, o DNA das mesmas extraído, e a presença de gene endógeno de CLa e de COX foi quantificada por técnicas de PCR em tempo real. Uma variante desse método gene endógeno COX para detectar bactérias vivas no tecido analisado foi conduzir a técnica de EMA PCR. De maneira interessante, mostra-se que as bactérias vivas diminuíram em torno de 70% e são confinadas em tecidos antigos. Em contrapartida, tecidos não maduros mostram valores muito baixos ou abaixo do limite de detecção da técnica. A Figura 25 mostra o comportamento da presença de bactéria vivas nas plantas de controle, situadas em uma faixa entre 100 e 87% da bactéria CLa.

[0153] A fotossíntese foi comparável entre plantas saudáveis e aquelas de folhas não maduras. Verifica-se que as plantas puderam produzir fruta esférica com simetria radial, característica de plantas com um tecido vascular saudável (Figura 21).

[0154] Essas evidências permite afirmar que o uso de padrões geneticamente transformados com proteínas de resistência à bactéria que causa HLB ou outras presentes nos tecidos vasculares de plantas.

[0155] As frutas produzidas por plantas infectadas tratadas com microbicidas de acordo com a presente invenção mostraram uma qualidade comercial e foram usados para conduzir teste de toxicidade.

[0156] As frutas obtidas a partir das plantas tratadas de acordo com a presente invenção mostraram a simetria característica de frutas saudáveis (Figura 21), o que mostra um corte transversal de uma lima doente com HLB, o que apresenta lóculos assimétricos, ao passo que uma fruta de uma planta doente que foi tratada com microbicidas de acordo com a presente invenção mostra uma simetria comprável à fruta de uma planta saudável.

[0157] Exemplo 8. Teste de Toxicidade Aguda em Camundongos. 10 camundongos BALB-c por tratamento foram alimentados com dieta normal e em vez de água comum, foi dada aos mesmos água de lima com 2% de suco das frutas das plantas tratadas de acordo com a presente invenção (Defensina RR09 e lisozima RR18). Os camundongos foram pesados no início do experimento. Após 30 dias do experimento, os mesmos foram pesados novamente e uma a amostra de sangue periférico foi obtida por punção da veia da cauda.

[0158] Conforme pode ser visto na Figura 26, não houve mortalidade animal nos tratamentos realizados (lisozima e defensina, e no grupo de controle) . De modo semelhante, os camundongos mostraram pesos estatisticamente semelhantes entre tratamentos no final do teste.

[0159] O sangue coletado dos camundongos foanalisado por microbiometria hematológica. Durante a comparação dos valores obtidos quanto do grupo de controle quanto dos tratamentos, os mesmos estavam situados nas faixadas propostas como valores normais (tabela 6) . Conforme pode ser visto, a biometria hematológica de camundongos tratados foi semelhante àquela de camundongos no grupo de controle, obtendo-se valores situados na faixa relatada como normal para camundongos BALB-c de 10 a 14 semanas. Verifica-se que, no fim do teste de toxicidade aguda, obteve-se 100% de sobrevivência tanto em animais tratados quanto em animais de controle. TABELA 6. LIMA COM HLB. BIOMETRIA HEMATOLÓGICA.

[0160] Exemplo 9. Transgenes não são detectados no pólen das plantas tratadas. O pólen e as flores de plantas tratadas com microbicidas de acordo com a presente invenção foram coletadas, para as quais o DNA total foi extraído do pólen e flores coletadas de plantas tratadas e de controle. O gene endógeno foi amplificados, não o microbicida de codificação, o que demonstra que as plantas produzem pólen e flores selvagens. Essa evidência experimental mostra que o transgene não pode ser disperso descuidadamente em uma planta receptora potencial; de modo semelhante, o transgene não estará presente na fruta, o que permite obter uma fruta não modificada geneticamente, portanto, não sujeito, por exemplo, à lei de Organismos Modificados Geneticamente (GMO) atual lei mexicana de governo de biossegurança.

EXEMPLO 10. TESTES EM OUTROS CITRUS.

[0161] a) Transformação genética de Lima-da- pérsia, laranja Valência, Toranja e mandarina enxertada em volkamerikana. Além dos testes em lima mexicana com espinhos, foi realizada a indução da expressão de microbicidas de acordo com a presente invenção em Lima-da- pérsia, laranja Valência, toranja, e mandarina, em que todas foram enxertadas tanto em Citrus macrophylla e C. volkameríana (tabela 7) . 100 plantas para cada variedade foram tratadas, dentre as quais 25 foram tradas com lisozima, 25 com defensina e 25 com uma mistura das mesmas. As 25 restantes foram usadas como controles do experimento e foram inoculadas com água. TABELA 7

[0162] Árvores com um ano de idade com tamanho médio de 1,5 m e certificado de segurança do Viveiro Francisco Villa em Tamaulipas, México, foram inoculadas conforme descrito acima para lima mexicana. As plantas estavam em uma câmara de alta umidade por 3 dias e, em seguida, transplantadas em microtúneis preparados com uma malha antiafídeo.

[0163] As malhas foram removidas para permitir a entrada de psilídeos infectados com CLa, à medida que a área de contenção biológica está localizada em uma região endêmica de HLB em Tecoman, Colima, México. A presença de psilídeos infectados foi monitorada e a possível infecção de tratamento e de plantas de controle nas cultivares referidas. Após o 8 meses de plantio, não houve sintomas tanto detecção positiva de bactérias observados durante o uso de métodos moleculares para a detecção de CLa em plantas tratadas, porém não nas plantas de controle, que foram infectadas e mostraram sintomas associadas à presença de HLB.

[0164] Em combinação com as quantificações das bactérias, o crescimento e capacidade fotossintética das mesmas foram monitorados, em que não houve diferenças significativas constadas entre plantas de tratamento e de controle. Um ano após os tratamentos, os níveis de bactéria são muito baixos ou abaixo dos limites de detecção da técnica usada (PCR em tempo real com sondas Taqman).

[0165] b) Transformação genética de árvores de lima mexicana produtivas enxertadas em Citrus volkameriana. 24 árvores de 3 anos de idade produtivas foram selecionadas na zone endêmica de HLB em Tecoman, Colima, México, e a presença da bactéria que causa HLB foi quantificada as mesmas, produzindo altos títulos em amostras de folha sintomáticas com mosqueamentos difusos. As plantas foram submetidas a tratamento de indução de expressão microbicida, conforme descrito acima, com uma distribuição mostrada na tabela 8. TABELA 8

[0166] As árvores de três anos após o plantio tiveram um tamanho médio de 3 m. As plantas foram contidas biologicamente em túneis emoldurados com alumínio e malha antiafídeo. Duas entradas ao acesso restrito de propriedades e estufas têm portas trancadas.

[0167] As árvores foram marcadas colocando-se uma tira com a cor do tratamento (tabela 8) e um rótulo de alumínio com o número de árvore no tronco das mesmas.

[0168] Conforme visto na Figura 27, árvores adultas de lima mexicana sob confinamento em 3 meses geraram ramificações; em que algumas dentre as primeiras folhas mostraram sintomas. No entanto, a extensão dos sintomas foi confinada àquela área. Além disso, foi observado que os novos falhos não têm sintomas da doença 4 meses após o tratamento de acordo com a presente invenção. A avaliação em 9 meses após o tratamento mostra árvores simétricas com ramos e floração normal. Os novos ramos têm menos sintomas, tais como, mosqueamento difuso ou falta do mesmo. A taxa fotossintética é alta, o que indica uma boa condição fisiológica.

[0169] A aparência das plantas cultivadas em microtúneis após 12 meses (lima mexicana) e 6 meses tratamento (Lima-da-pérsia, laranja, toranja e mandarina) de acordo com a presente invenção, mostrou um crescimento, e a aparição de ramificações sem sintomas de HLB (Figura 28) .

[0170] Ademais, as plantas cultivada sobcontenções biológicas, produzem ramos isentos de CLa durante o recebimento do tratamento antimicrobiano de acordo com a presente invenção (Figura 29).

[0171] A medição de parâmetros fotossintéticos mostrou que as plantas tratadas, de acordo com a presente invenção, têm valores de fotossíntese semelhantes às plantas de viveiro cultivadas na ausência do psilídeo. Além disso, as plantas tratadas produzem flores e preenchimento de fruta de qualidade comercial (Figura 30).

[0172] A aparência das plantas tratadas com microbicidas em cinco meses de contato com o psilídeo é normal, não mostram sintomas de HLB em folhas pré- existentes e novos ramos. Em contrapartida, as plantas de controle sem tratamento antimicrobiano mostram, no mesmo lote, s presença de sintomas em suas folhas e têm, em média, menos ramificações. A Figura 28 (painel à direita inferior) mostra os sintomas de uma planta não tratada, que apresenta os sintomas característicos da doença.

[0173] A Figura 21 mostra diferenças significativas entre as frutas de uma lima saudável, que apresenta carpeis com simetria radial (painel esquerdo), ao passo que a fruta produzida por uma árvore doente mostra um desenvolvimento assimétrico dos carpeis e a aparição de dois cromossomos acrocêntricos (painel central). Como um resultado do tratamento de árvores de lima inicialmente doente e subsequentemente tratadas de acordo com a presente invenção, as frutas obtidas são semelhantes àquelas de uma árvore saudável (painel direito).

[0174] Ademais, o teor bacteriano em três meses foi estimado, o que mostra que a bactérias estão presentes tanto em folhas maduras quanto em ramos novos. Em contrapartida, embora a bactéria seja detectada em folhas maduras existentes a partir do início do tratamento, novas folhas reduziram significativamente em número. Em relação à fotossíntese, plantas de controle não tratadas mostram uma fotossíntese em contrapartida aos três tratamentos testados (tratamento 1: defensina, tratamento 2: lisozima e tratamento 3: mistura de defensina com lisozima) (Figura 31) .

[0175] Em relação à lima-da-pérsia, mandarina, toranja e laranjeiras, as plantas foram avaliadas por seus parâmetros agronômicos, o que não constata diferenças significativas seis meses após serem tratados em relação à área de folha das mesmas. No entanto, o teor de CLa é diferente nas plantas de controle, que já mostram a presença de características bacterianas e de sintomas de HLB (Figura 32).

[0176] Exemplo 11. Análise Bromatológica de suco de lima. As limas derivam de árvores tratadas com defensina, lisozima e uma mistura das mesmas, além de limas de árvores de controle, foi coletada. O suco foi extraído com o uso de um espremedor de suco e indicado para determinar parâmetros bromatológicos de acordo com as normas mexicanas e da FDA para sucos. Os resultados são mostrados na Figura 33.

[0177] Conforme observado, as concentrações de cálcio, ferro, teor de energia, cinza, carboidratos disponíveis, sódio, vitamina C (ácido ascórbico) e umidificação são semelhantes dentre os sucos de frutos submetidos ao tratamento da invenção e o suco de controle, o que demonstra equivalência substancial dentre os mesmos.

[0178] Exemplo 12. Imunodetecção de defensina proteina em lima transgênica e evidência para a presença de transgenes. As plantas de lima geneticamente modificadas que expressam a defensina antimicrobiana ou a lisozima de acordo com a presente invenção foram processadas para inclusão em parafina e realizam testes de imunodetecção. Seções semifinas foram realizadas, parafinizadas e hidratadas para incubar subsequentemente as mesmas com anticorpos anti-humanos-beta-defensina. O primeiro anticorpo gerado em bode foi imunodetectado com anticorpo anti-coelho de bode acoplado à fosfatase alcalina e desenvolvido com BCIP e NBT, que gera uma cor azul-violeta, o que indica a presença da proteína imunodetectada. Conforme mostrado na Figura 34, a defensina foi localizada no floema da planta infectada.

[0179] Além disso, e por PCR de ponto terminal, nas plantas transformadas de acordo com a presente invenção, foram detectados os genes que codificam os microbicidas descrito acima (Figura 35), o que constitui uma evidência molecular da presença dos ditos transgenes nas plantas modificadas geneticamente por meio de cultura de tecido. O uso de técnicas de PCR, os locais de inserção no genoma de citrus GM foram identificados.

[0180] Exemplo 13. Morfologia do pólen obtido das plantas tratadas. O pólen das plantas tratadas de acordo com a presente invenção, que foi fotografado e medido para avaliar a equivalência substancial, foi coletado. A Figura 36 (painel A) mostra imagens representativas do pólen, e pode-se verificar que suas características morfológicas são semelhantes às plantas de controle.

[0181] A área média de pólen foi obtida, e não há diferenças estatisticamente significativas dentre as mesmas (Figura 36, painel B) . Os resultados não mostram alterações na área ou na morfologia do pólen obtida a partir das plantas de tratamento.

[0182] Conforme pode ser visto a partir do supracitado, de acordo com a presente invenção, é possível obter plantas modificadas geneticamente que expressam proteínas com atividade antimicrobiana, tais como, o citrus testado, que tem a capacidade para se protegerem de infeção causada por Candidatus Liberibacter asiaticus; por exemplo, lima mexicana, Lima-da-pérsia, laranja, mandarina e toranj a.

[0183] Além disso, a presente invenção permite obter talos da raiz (padrões) de citrus geneticamente modificado que expressam proteínas antimicrobianas. Os padrões testados experimentalmente são Citrus volkameriana e Citrus macrophylla, que são resistentes a vírus da tristeza do citrus. Os talos da raiz geneticamente modificados podem mobilizar microbicidas por meio do tecido vascular aos enxertos de plantas suscetíveis à infecção, tais como, lima mexicana, Lima-da-pérsia, laranja, mandarina e toranja, conforme demonstrado experimentalmente fornecendo, assim, proteção aos enxertos. Os talos da raiz têm a vantagem de produzir frutas convencionais sem a presença de genes que codificam microbicidas, e as frutas não são sujeitas, por exemplo, à lei mexicana do uso com biossegurança de organismos geneticamente modificados. Isso também implica uma grande segurança no consumo e na produção.

[0184] De acordo com a presente invenção, para plantas saudáveis produzidas em viveiros certificados, a expressão transiente de microbicidas é realizada por meio de inoculação de Agrobacteríum tumefaciens que contém no T- DNA dos mesmos as unidades de expressão de microbicidas. Essa inoculação pode ser realizada em plantas saudáveis como um método preventivo. No momento do plantio de áreas endêmicas, tais como, HLB, as plantas não serão infectadas ou irão mostrar níveis muito baixos da bactéria permitindo, assim, a geração de frutas convencionais, que não serão sujeitas, por exemplo, à lei mexicana de uso de segurança de organismos geneticamente modificados. Além disso, o produto pode ser usado em novos plantios ou pode substituir plantas doentes.

[0185] Para árvores produtivas doentes com HLB, a expressão transiente de microbicidas é realizada de acordo com s presente invenção por meio da inoculação de Agrobacteríum tumefaciens que contém as unidades de expressão antimicrobianas em seu T-DNA. Essa inoculação pode ser realizada em plantas saudáveis como um método preventivo. No momento do plantio de áreas endêmicas, tais como, HLB, as plantas não serão infectadas ou irão mostrar níveis muito baixos da bactéria permitindo, assim, a geração de frutas convencionais, que não serão sujeitas, por exemplo, à lei mexicana de uso de segurança de organismos geneticamente modificados. Além disso, o produto pode ser usado em novos plantios ou pode substituir plantas doentes. REFERÊNCIAS. - Bové J.M. (2006) . Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old diease of citrus. Journal of Plant Pathology, 88 (1), 7 a 37. - Cervera, M., et.al. 1998. Genetic transformation and regeneration of mature tissue of woody fruit plants bypassing the juvenile stage. Transgenic Res. 7, 51 a 59. - Cervera, M., et.al. 2004. Genetic transformation of mature citrus plants. Methods Mol. Biol. 286, 177 a 187. - Corbesier L., et.al. 2007. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science 316: 1030 a 1033. - Hartung J.S., et.al. 2011. Comparison of the 'Ca. Liberibacter asiaticus' genome adapted for an intracellular lifestyle with other members of the Rhizobiales. PLoS One. 6(8):e23289. - Koh E.J., et.al. 2011. Callose deposition in the phloem plasmodesmata and inhibition of phloem transport in citrus leaves infected with “Candidatus Liberibacter asiaticus”. Protoplasma PMID: 21874517. - Lin H., et.al. 2011. The complete genome sequence of 'Candidatus Liberibacter solanacearum', the bacterium associated with potato zebra chip disease. PLoS One 6: e19135. - Lin M.K., Belanger H., Lee Y.J., Varkonyi-Gasic E., Taoka K., Miura E., Xoconostle-Cazares B., Gendler K., Jorgensen R.A., Phinney B., Lough T.J., Lucas W.J. 2007. FLOWERING LOCUS T protein may act as the long-distance florigenic signal in the cucurbits. Plant Cell 19: 1488 a 1506. - Lough T.J., et.al. 2006. Integrative plant biology: role of phloem long-distance macromolecular trafficking. Annu Rev Plant Biol 57:203 a 232. - Masschalck B., et.al. 2001. Inactivation of gram-negative bacteria by lysozyme, denatured lysozyme, and lysozyme-derived peptides under high hydrostatic pressure. Appl Environ Microbiol. 67:339 a 344. - Provencher L.M., et.al. 2001. Sucrose export defective1 encodes a novel protein implicated in chloroplast-to-nucleus signaling. Plant Cell 13:1127 a 1141. - Ruiz-Medrano R., Xoconostle-Cazares B., Ham B.K., Li G., Lucas W.J. 2011. Vascular expression in Arabidopsis is predicted by the frequency of CT/GA-rich repeats in gene promoters. Plant J 67:130 a 144. - Ruiz-Medrano R., Xoconostle-Cazares B., Kragler F. 2004. The plasmodesmatal transport pathway for homeotic proteins, silencing signals and viruses. Curr Opin Plant Biol 7: 641 a 650. - Ruiz-Medrano R., Xoconostle-Cazares B., Lucas W.J. 2001. The phloem as a conduit for inter-organ communication. Curr Opin Plant Biol. 4:202 a 209. - Strategic Planning for the Florida Citrus Industry: Addressing Citrus Greening. 2010. Committee on the Strategic Planning for the Florida Citrus Industry: Addressing Citrus Greening Disease (Huanglongbing); National Research Council of the National Academies USA. ISBN 978-0-309-15207-5. resistance and alarm signals in the phloem. Mol Plant Pathol 5:495 a 504. R., Wang H.L., Monzer J., Yoo B.C., McFarland K.C., Franceschi V.R., Lucas W.J. 1999. Plant paralog to viral movement protein that potentiates transport of mRNA into the phloem. Science. 283:94 a 98.

Claims (12)

1. Vetor recombinante caracterizado por compreender uma unidade de expressão que expressa uma proteína de fusão que atua como um transportador no interior do tecido vascular de uma planta e tem uma atividade antimicrobiana, em que a unidade de expressão compreende um gene que codifica a proteína CsPP16 ligada aum gene que codifica para uma proteína com atividade antimicrobiana, em que ambos os genes são ligados através de um ligante flexível, em que o referido gene que codifica a proteína CsPP16 tem a sequência de SEQ. ID No. 3, o referido ligante flexível tem a sequência de SEQ. ID. No. 4, e o referido gene que codifica para uma proteína com atividade antimicrobiana, tem a sequência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ. ID. No. 5 e SEQ. ID. No. 8.

2. Célula hospedeira de Agrobacterium caracterizada por compreender o vetor recombinante conforme definido na reivindicação 1, em que a referia célula é capaz de transferir material genético a uma planta.

3. Método para obter uma planta, ou partes da mesma, resistente a infecções causadas por microrganismos que são restritos ao floema caracterizado por compreender as etapas de: a) Conjugar a uma célula hospedeira com capacidade para transferir material genético a uma planta o vetor recombinante, conforme definido na reivindicação 1; b) Inocular uma planta suscetível a infecções causadas por microrganismos que são restritos ao floema com a célula hospedeira obtida na etapa a), e c) Verificar a aquisição do vetor e a expressão do mesmo, a estabilidade do mesmo nas plantas transformadas e nos descendentes das mesmas e verificar a resistência adquirida.

4. Método para tratar uma planta, ou partes da mesma, infectada por microrganismos que são restritos ao floema, caracterizado por compreender as etapas de: a) Inocular a planta infectada com uma célula hospedeira com capacidade para transferir material genético a uma planta, em que tal célula hospedeira foi conjugada anteriormente com o vetor recombinante conforme definido na reivindicação 1; e b) Verificar na planta infectada a aquisição do vetor e a expressão do mesmo, a estabilidade do mesmo nas plantas transformadas infectadas e nos descendentes do mesmo e verificar a resistência adquirida à infecção.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado por na etapa a) a célula hospedeira com capacidade para transferir material genético a uma planta ser Agrobacterium.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a Agrobacterium ser selecionada a partir do grupo que compreende Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes.

7. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado por a planta ser selecionada a partir do grupo que compreende limões (Citrus limon), laranjas (Citrus sinensis), laranjas mandarinas (Citrus reticulata), toranjas (Citrus reticulata x Citrus paradisi), tangerinas (Citrus paradisi), Citrus limonia, Citrus limettioides, Aeglopsis, chevalieri Swingle, Atalantia missionis Oliver, Balsamocitrus dawei Stapf., Calodendrum capensis Thunb, Catharanthus roseus (L.) Citroncirus webberi, Citrus amblycarpa Ochse, Citrus aurantiifolia Swingle, Citrus aurantium L., Citrus depressa Hayata, Citrus grandis (L.) Osbeck, Citrus hassaku Hort. ex Tanaka, Citrus hystrix DC., Citrus ichangensis Swingle, Citrus jambhiri Lushington, Citrus junos Sieb. ex Tanaka, Citrus kabuchi Hort. ex Tanaka, Citrus limon (L.) Burm., Citrus x limonia Osbeck, Citrus x nobilis Lour. “Ortanique”, Citrus maxima (pomelo/shaddock), Citrus x nobilis Lour., Citrus oto Hort. ex Tanaka, Citrus x paradisi Macfad., Citrus reticulata Blanco, Citrus sinensis (L.) Osbeck, Citrus sunki Hort. ex Tanaka, Citrus unshiu (Mack.) Marc, Clausena indica Oliver, Clausena lansium (Lour.) Skeels, Cuscuta australis R. Br. (Convolvulaceae, Cuscutaceae), Fortunella spp., Limonia acidissima L., Microcitrus australasica (F.J. Muell.) Swingle, Murraya koenigii (L.), Murraya paniculata (L.) Jack, Poncirus trifoliata (L.) Raf., Swinglea glutinosa (Blanco) Merr., Toddalia lanceolata Lam, Triphasia trifolia (Burm. f.) P. Wilson, Citrus indica Tanaka, Citrus limetta Risso and Citrus macroptera Montrons.

8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o microrganismo infeccioso ser selecionado a partir do grupo que compreende Candidatus Liberobacter asiaticus, Candidatus Liberobacter africanus, Candidatus Liberobacter americanus e Candidatus Liberibacter solanacearum.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o microrganismo infeccioso provocar na planta uma doença selecionada a partir do grupo que compreende doença da batata frita Zebrada (Zebra chip) e doença Huanglongbing.

10. Gene quimérico caracterizado por codificar uma proteína de fusão que atua como um transportador no interior do tecido vascular da planta e ter uma atividade antimicrobiana, compreendendo o gene que codifia a proteína CsPP16 ligada a um gene que codifica para uma proteína com atividade antimicrobiana, em que ambos os genes são ligados através de um ligante flexível, em que o referido gene que odifica a proteína CsPP16 tem a sequência de SEQ. ID. No. 3, o ligante flexível tem a sequência de SEQ. ID. No. 4, e o gene que codifica a proteína com atividade antimicrobiana tem uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ. ID. No. 5 e SEQ. ID. No. 8.

11. Proteína que atua como um transportador no interior do tecido vascular da planta e tem uma atividade antimicrobiana caracterizada por a referida proteína ser codificada pelo gene quimérico, conforme definido na reivindicação 10.

12. Composição para tratar uma planta, ou partes da mesma, infectada por microrganismos que são restritos ao floema, caracterizada por compreender a célula hospedeira, conforme definido na reivindicação 2, em um veículo compatível agronomicamente.

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