CN107418965B - 一种表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株及其制备方法 - Google Patents

一种表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株的方法，步骤如下：(1)制备中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液；(2)制备含有重组质粒pRF‑AETH的根癌农杆菌；(3)制备根癌农杆菌菌液；(4)将中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液与根癌农杆菌菌液混合，共培养；(5)选择性培养，鉴定，获得稳定表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis。本发明还提供了一种中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株。本发明方法可以获得稳定表达egfp基因的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株。该转化菌株不仅可以为中国被毛孢Hirsutella sinensis功能基因的分子生物学研究提供方便，而且可以监测中国被毛孢Hirsutella sinensis在寄主昆虫体内的生长与繁殖、发育与分化的过程,为阐明中国被毛孢Hirsutella sinensis与寄主的相互作用提供直接证据，应用前景优良。

Description

一种表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis 转化菌株及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株及其制备方法。
背景技术
冬虫夏草是一种在特定生态环境下,由虫生真菌-中国被毛孢Hirsutellasinensis寄生于鳞翅目蝙蝠蛾幼虫所形成的具有很好保健与药用功效的复合物(Zhang YJ et al.,2012；Paterson R R.,2008)。因其具有奇特的保健与药用功效,市场需求激增,自然资源采集疯狂,致使资源已濒临枯竭。因此，人工培养冬虫夏草已成为人们寻求补充野生冬虫夏草渐逐断源的重要途径(Holliday J et al.,2008)。但是，由于真菌进入蝙蝠蛾幼虫体内最后形成冬虫夏草的机制目前尚不清楚，导致人工培养难度大。
因此，研究中国被毛孢Hirsutella sinensis在蝠蛾体内生长与繁殖、发育与分化过程极为重要，不仅具有重要的理论意义,而且更具有实际应用价值，这将为人工培育冬虫夏草提供重要的科学依据。
eGFP是一种增强型绿色荧光蛋白，这种蛋白分子量小、在生物体内可以表达稳定、而且无毒、通常不影响生物自身的生长与繁殖、发育与分化，它可以作为生物标记，用于研究目标生物体的生长发育状况。如果能够制备得到表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis，将会使得中国被毛孢Hirsutella sinensis在蝠蛾体内生长与繁殖、发育与分化过程的研究极为方便、有效。
但是，中国被毛孢Hirsutella sinensis是一种很特别的虫生真菌，迄今为止，尚未见含EGFP荧光标记的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化子。
因此，建立高效中国被毛孢Hirsutella sinensis遗传转化方法，获得稳定表达绿色荧光蛋白的标记菌株,对于推动中国被毛孢Hirsutella sinensis侵染过程的生物学研究及其分子生物学研究具有重要的应用价值，也可以为冬虫夏草的人工栽培提供科学依据。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供了一种制备表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株的方法以及该方法制备得到的转化菌株。
本发明制备表达绿色荧光蛋白中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株的方法，步骤如下：
(1)制备中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液；
(2)制备根癌农杆菌感受态，转化重组质粒pRF-AETH，获得含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌；
(3)取含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌，制备根癌农杆菌菌液；
(4)将步骤(1)制备的中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液与步骤(3)制备的根癌农杆菌菌液混合，共培养；
(5)选择性培养，获得稳定表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutellasinensis。
步骤(1)中，所述的中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液中孢子浓度为104～105个/mL。
步骤(2)中，所述含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO：M 2016223的根癌农杆菌AGL-1/pRF-AETH Agrobacteriumtumefaciens AGL-1/Prf-AETH。
本发明涉及的根癌农杆菌AGL-1/pRF-AETH，于2016年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为：CCTCC M 2016223。
步骤(3)中，制备得到的根癌农杆菌菌液的OD600为0.6～0.7。
步骤(4)中，中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液与步骤(3)制备的根癌农杆菌菌液混合后，共培养的方法是：将混合后的菌液涂布到共培养平板上培养，其中，共培养平板为铺有微孔滤膜的IM培养基，共培养条件为15～20℃避光培养2～4d。优选地，所述的根癌农杆菌菌液或IM共培养的平板中含有乙酰丁香酮，所述乙酰丁香酮的终浓度为200～400μM(如果乙酰丁香酮加在根癌农杆菌菌液中，终浓度是指混合菌液中的浓度；如果乙酰丁香酮加在IM共培养的平板中，终浓度是指培养基中的浓度)。
本发明IM培养基的配方：5mM Glucose、0.6mM CaCl2、9μM FeSO4、0.5％甘油(w/v)、40mM MES(2-吗啉乙磺酸)(pH 5.3)、4mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、2.5mM NaCl、10mM K2HPO4和10mM KH2PO4(pH4.8)、200μM乙酰丁香酮和15g/L琼脂，其余为水。
步骤(5)中，选择性培养是将步骤(4)共培养后的微孔滤膜取下，反向铺到含抗生素的PDA培养基中，15～18℃培养3～4周。其中，所述的抗生素是终浓度为200～350μg/mL的头孢霉素和终浓度为200～250μg/mL的潮霉素B。
本发明PDA培养基与抗生素形成的选择培养基的配方(1L)：马铃薯200g、葡萄糖50g、蛋白胨10g、酵母粉1g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、琼脂10g、潮霉素B 200～250mg和头孢霉素200～350mg，加水补充至1L，pH 7.0。
本发明还提供了前述方法制备得到的表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株。
本发明还提供了一种中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO：M 2016222的中国被毛 孢H.sinensis AETH-T55。
本发明涉及的中国被毛孢Hirsutella sinensisAETH-T55，于2016年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为：CCTCC M2016222。
发明人曾经尝试采用现有已知质粒pRFHUE-eGFP转化中国被毛孢Hirsutellasinensis，但是却未能获得成功。
为了克服该难题，发明人通过对质粒的改进，制备得到了重组质粒pRF-AETH，并进一步制备得到了包含该质粒的根癌农杆菌，才成功转化了中国被毛孢Hirsutellasinensis，获得了绿色荧光强、遗传稳定的阳性转化子。
本发明方法的优点和积极效果：
(1)本发明建立了一种适用于中国被毛孢Hirsutella sinensis的遗传转化体系，筛选并获得携带有强绿色荧光标记的转化菌株；
(2)所用的材料简单，只需收集中国被毛孢Hirsutella sinensis的芽生孢子即可，无需制备原生质体和分生孢子。
(3)筛选获得的强绿色荧光标记转化菌株为人工培养冬虫夏草提供重要的科学依据。
(4)本发明获得的转化菌株不仅为中国被毛孢Hirsutella sinensis功能基因的分子生物学研究提供方便，而且为深入了解中国被毛孢Hirsutella sinensis在寄主昆虫体内的生长与繁殖、发育与分化的过程进行监测，为阐明中国被毛孢Hirsutella sinensis与寄主的相互作用提供直接证据。
本发明方法可以有效构建表达荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis，而且获得了一株绿色荧光极强烈、荧光特性稳定的菌株H.sinensis AETH-T55，可以用于监测中国被毛孢Hirsutella sinensis在寄主昆虫体内的生长与繁殖、发育与分化的过程，为阐明中国被毛孢Hirsutella sinensis与寄主的相互作用提供直接证据，为冬虫夏草的人工栽培提供支持，而且制备工艺简单，应用前景优良。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1中国被毛孢Hirsutella sinensis在产孢培养基中产生的芽生孢子形态特征；
图2中国被毛孢转化菌株H.sinensis AETH-T55在可见光和蓝光激发下 的形态；
图3随机挑选的6株转化子提取基因组DNA，PCR扩增基因组中的egfp/hph/kan/18SrRNA四个基因的电泳结果；
图4中国被毛孢转化菌株H.sinensis AETH-T55T-DNA插入位点的右翼序列扩增结果。
具体实施方式
本发明实施例中涉及的材料和试剂分别为：
微孔滤膜：直径100mm,孔径0.45μm,上海市新亚净化器件厂生产；
乙酰丁香酮(AS):Sigma-Aldrich生产；
潮霉素B(Hyg B)：50mg/mL,Roche生产；
头孢霉素(Cef):剃希爱(上海)化成工业发展有限公司生产；
PCR试剂：PCR buffer、dNTP、rTaq Polymerase购买于TAKARA公司；
质粒pRFHUE-eGFP，来自西班牙Dr.L.González-Candelas，按照文章A.Crespo-Sempere etal.,“Development of a green fluorescent tagged strain ofAspergillus carbonarius tomonitor fungal colonization in grapes”,International Journal of Food Microbiology 148(2011)135–140的方法制备；
根癌农杆菌AGL-1：购买于北京华越洋生物科技有限公司；
中国被毛孢Hirsutella sinensis，来自成都图径生物科技有限公司。
实施例1本发明制备中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株的方法以及获得到的菌株
一、制备方法
(1)制备中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液
将中国被毛孢Hirsutella sinensis的菌丝用分散头打散后接入产孢液体培养基，18℃，130r/min培养14d后用一层尼龙膜(150目)过滤菌丝收集得到芽生孢子，IM培养基重悬三次后血球计数板计数，浓度调整在104～105个/mL备用。芽生孢子的形态结构见附图1。
(2)制备含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌
挑取根癌农杆菌AGL-1单菌落，接种于5ml LB(含Rif 20μg/mL)液体培养基中，28℃，200r/min震荡培养15h。
将2mL过夜培养的菌液加到50mL含同样抗生素的LB培养基中，28℃，200r/min振荡3.5h，至OD600≈0.6～0.7；吸取菌液于50mL预冷的离心管中，冰浴10min；4℃，5000r/min离心10min，弃上清液；缓慢加入10mL预冷的100mM CaCl2溶液，使农杆菌细胞轻轻悬浮，冰浴30min；4℃，5000r/min离心10min，弃上清液，置于冰上加入2mL预冷的含15％甘油的100mMCaCl2溶液，充分悬浮细胞；按每管200μL分装于无菌离心管中， 于-80℃保存。
取1μg载体pRF-AETH(重组质粒pRF-AETH)加入感受态细胞中，冰浴30min；放入液氮中速冻5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min，冰上静置5min；加入800μL LB液体培养基，28℃，180r/min振荡培养4h；5000r/min离心1min，去部分上清，留100μL菌液涂布于含有50μg/ml Kan和20μg/ml Rif的LB平板上，28℃培养箱中倒置培养，2天左右转化菌落可见。
挑选单克隆菌液PCR验证，经验证含有目标载体的农杆菌加25％甘油保存于-80℃。所述LB固体培养基配方(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g、加水补充至1L，pH 7.0；所述LB液体培养基不加琼脂即可。
取含有目标载体的根癌农杆菌，命名为根癌农杆菌AGL-1/pRF-AETH，并于2016年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M2016223。
(3)制备根癌农杆菌菌液
根癌农杆菌AGL-1/pRF-AETH划线接种，28℃培养2d，用无菌的枪头挑取单克隆接种至10mL液体LB培养基中于28℃，200r/min培养15h。
过夜培养的农杆菌分别离心、弃上清，等体积的IM培养基重悬两次，然后调节农杆菌浓度至OD600≈0.15～0.2，加入AS至终浓度为200μM。28℃，200r/min继续培养6h后至OD600≈0.6～0.7，用于根癌农杆菌和中国被毛孢Hirsutella sinensis的共培养转化。IM培养基配方：10mM Glucose、0.6mM CaCl2、9μM FeSO4、50％甘油(v/v)、40mM MES(2-吗啉乙磺酸)(pH 5.3)、4mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、2.5mM NaCl、10mM K2HPO4和10mM KH2PO4(pH4.8)。
(4)共培养
采用固相共培养的方式，即将100μL根癌农杆菌菌液与100μL准备好的中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子混合后涂布到铺有微孔滤膜的IM平板上，18℃正置避光共培养2～4d；
IM培养基的配方：5mM Glucose、0.6mM CaCl2、9μM FeSO4、0.5％甘油(w/v)、40mMMES(2-吗啉乙磺酸)(pH 5.3)、4mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、2.5mM NaCl、10mM K2HPO4和10mMKH2PO4(pH4.8)、200μM乙酰丁香酮和15g/L琼脂；
PDA培养基(筛选固体培养基配方)(1L)：马铃薯200g、葡糖糖50g、蛋白胨10g、酵母粉1g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、琼脂10g、潮霉素B 200～250mg和头孢霉素200～350mg，加水补充至1L，pH 7.0。
(5)选择性培养
将微孔滤膜分别倒置贴附于筛选平板上，15～18℃培养3～4周，可以观察到单个疑似转化子出现。
筛选平板是含终浓度为200～350μg/mL的头孢霉素、终浓度为200～250μg/mL的潮霉素B的PDA培养基。
二、鉴定
(1)转化子镜检观察和分离纯化
将疑似转化子挑取置于无菌水中，用枪头打散后取部分菌丝镜检观察发现其中100余株有绿色荧光。
而且，通过对不同共培养时间得到转化子的统计发现共培养2～3d获得较少的转化子，3～4d可以获得较多的转化子。这表明适当延长共培时间有益于提高中国被毛孢Hirsutella sinensis的转化效率。
实验结果说明，本发明方法可以获得稳定表达egfp基因的中国被毛孢Hirsutellasinensis。
通过进一步的分离纯化得到了一株绿色荧光强烈，而且荧光特性稳定的菌株，命名为H.sinensis AETH-T55。此绿色荧光转化子在可见光和蓝光(488nm)激发下的镜检结果见图2。同时，于2016年4月25日将中国被毛孢Hirsutella sinensisH.sinensis AETH-T55保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2016222。
(2)转化子的分子鉴定
从上面得到的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化子中随机挑选6株(H.sinensis AETH-T1、AETH-T2、AETH-T3、AETH-T20、AETH-T27、AETH-T36)进行扩大培养，收集菌丝分别采用改良的CTAB法提取基因组DNA作为模板(浓度稀释至300μg/mL左右)分别扩增egfp/hph/kan/18S rRNA四个基因，引物序列见表1：
表1 扩增egfp/hph/kan/18S rRNA四个基因的引物序列
Figure BDA0000997381810000061
扩增体系为10×PCR buffer 2.5μL，dNTP mixture(2.5μM)2.0μL，Primer-F(10μM)0.75μL，Primer-R(10μM)0.75μL，DNA模板1μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，补加无菌双蒸水至25μL。扩增条件：egfp/hph：95℃，5min；(95℃，30s；62℃，30s；72℃，1min)，
30个循环；72℃，10min。kan/18S基因：95℃，2min；54℃，2min；72℃，3min；再进行(95℃，30s；54℃，30s；72℃，2min)，30个循环；72℃，10min。扩增结果如图3所示，egfp/hph/18S rRNA三个基因均扩增出了对应大小的目的片段，kan基因未扩增出片段，说明扩增的结果没有受到农杆菌中表达载体的干扰，检测的6个转化子均为阳性转化子。
实验结果说明，本发明方法获得的表达egfp基因的中国被毛孢Hirsutellasinensis，其本身的功效不会被导入的基因影响。
(3)中国被毛孢Hirsutella sinensis转化子H.sinensis AETH-T55T-DNA插入位点的侧翼分析
为了了解中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株H.sinensis AETH-T55T-DNA插入位点的突变与性状改变之间的联系，有必要对T-DNA插入位点的侧翼序列进行分析，确定转化目的基因在中国被毛孢Hirsutella sinensis染色体上插入的位置。我们提取了它的基因组DNA，然后以其为模板进行三轮TAIL-PCR反应，扩增的引物序列和反应程序分别见表2和表3。
表2 TAIL-PCR扩增引物序列
Figure BDA0000997381810000071
表3 TAIL-PCR扩增程序
Figure BDA0000997381810000072
扩增体系为10×PCR buffer 2.5μL，dNTP mixture(2.5μM)2.0μL，RB-F(10μM)1.0μL，AD-R(100μM)1.5μL，DNA模板1μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，补加无菌双蒸水至25μL。第一轮TAIL-PCR反应产物(RB-1和AD-1/AD-2/AD-3)稀释1,000倍后作为第二轮TAIL-PCR反应(RB-2和 AD-1/AD-2/AD-3)的模板；同样将第二轮TAIL-PCR反应产物稀释1,000倍后为第三轮TAIL-PCR反应(RB-3和AD-1/AD-2/AD-3)的模板。将第三轮将第三轮反应产物送测序，测序结果见附图4。
实验结果说明，本发明方法制备的中国被毛孢菌株H.sinensis AETH-T55的确含有目的基因—绿色荧光蛋白基因，其可以有效、稳定高表达外源的绿色荧光蛋白，而且中国被毛孢Hirsutella sinensis自身的基因的表达不会被影响。
综上，本发明方法提供了可以高效制备得到表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis的技术，而且筛选得到了一株绿色荧光强烈、荧光特性稳定的菌株H.sinensis AETH-T55。该菌株可以用于监测中国被毛孢Hirsutella sinensis在寄主昆虫体内的生长与繁殖、发育与分化的过程，为阐明中国被毛孢Hirsutella sinensis与寄主的相互作用提供直接证据，为冬虫夏草的人工栽培提供支持，而且其制备工艺简单，应用前景优良。
Figure IDA0000997381910000011
Figure IDA0000997381910000021

Claims (10)

1. 一种制备表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢 Hirsutella sinensis转化菌株的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）制备中国被毛孢 Hirsutella sinensis芽生孢子的悬浮液；
（2）制备根癌农杆菌感受态，转化重组质粒pRF-AETH，获得含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌；其中，重组质粒pRF-AETH是将质粒pRFHUE-eGFP中的启动子pGpdA替换为虫生真菌启动子pAT、并将启动子Trpc替换为虫生真菌启动子pTrpc得到的质粒，虫生真菌启动子pAT、pTrpc的序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
（3）取步骤（2）制得的含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌，制备根癌农杆菌菌液；
（4）将步骤（1）制备的中国被毛孢 Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液与步骤（3）制备的根癌农杆菌菌液混合，共培养；
（5）选择性培养，鉴定，获得表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢 Hirsutella sinensis。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的中国被毛孢 Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液中孢子的浓度为104 ~ 105个/mL。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO：M 2016223的根癌农杆菌AGL-1/pRF-AETH。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，制备得到的根癌农杆菌菌液的OD600为0.6 ~ 0.7。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，中国被毛孢 Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液与步骤（3）制备的根癌农杆菌菌液混合后，共培养的方法是：将混合后的菌液涂布到共培养平板上培养，其中，共培养平板为铺有微孔滤膜的IM培养基，共培养条件为15~20℃避光培养2~4 d。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的根癌农杆菌菌液或IM共培养的平板中含有乙酰丁香酮，所述乙酰丁香酮的终浓度为200~400 µM。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，选择性培养是将步骤（4）共培养后的微孔滤膜取下，反向铺到含抗生素的PDA培养基中，15~18 ℃培养3~4周。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的抗生素是终浓度为200 ~ 350 µg/mL的头孢霉素和终浓度为200 ~ 250 µg/mL的潮霉素B。
9. 权利要求1~8任意一项所述方法制备得到的表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢 Hirsutella sinensis转化菌株。
10. 一种中国被毛孢 Hirsutella sinensis转化菌株，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO：M 2016222的中国被毛孢H.sinensis AETH-T55。
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