CN108359629A - 类球红细菌重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及类球红细菌重组菌及其构建方法与应用，将敲除rshI基因的重组菌进行sdhB基因敲除，以亚碲酸钾和卡那霉素作为单交换筛选标记，与原有方法下类球红细菌进行sdhB基因敲除相比，双菌结合转移效率显著提高，转化率达90％以上，比对照组提高了50‑100倍，显著提高了类球红细菌基因无痕敲除的筛选效率；rshI的基因敲除菌株，不用插入筛选标记，无缝定点敲除rshI基因，不影响其上游和下游基因的转录水平，保证类球红细菌正常生长。此外，通过一种类球红细菌高效基因无痕敲除方法等分子生物学手段对电子传递链进行修饰，通过发酵条件优化，提高辅酶Q10的产量。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是类球红细菌重组菌及其构建方法与应用。
背景技术
类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是一种革兰氏阴性菌，属于紫色非梳细菌中的ɑ变形菌。目前，对类球红细菌进行遗传改造，主要采用接合转移法。对于类球红细菌通过化学转化法和电击转化法无法转移质粒，也鲜有报道。目前，对类球红细菌实施接合转移获得阳性转化子的效率普遍较低，所以需要对类球红细菌接合转移效率进行研究，以提高遗传操作效率。有报道称，在大肠杆菌中敲除了编码降解外源DNA的I型限制性内切酶的hsdR基因，获得了高转化效率以及其他功能与野生菌株仍保持一致的突变菌株。
接合转移是细菌间一种常见的遗传物质传递的现象。本发明使用的是双亲接合转移系统，在双亲结合转移系统中，将提供质粒的宿主称为供体株，而接受质粒的宿主称为受体株。接合转移发生的前提是供体细胞需要携带有可转移的质粒，该质粒不仅需要有可在受体细胞中进行自我复制的复制原，还应该具备可进行转移的转移原，以及可以受转移蛋白特异性识别的位点。另外供体细胞还需要有一套帮助质粒转移的转移蛋白，这些转移蛋白的基因可以由供体细胞的染色体携带。最常用的双亲接合的供体宿主是大肠杆菌，在该细菌的染色体上整合了RP4型质粒的全套转移蛋白，可以有效驱动质粒的转移。
类球红细菌为常见的辅酶Q10合成的天然优势菌株，目前辅酶Q10的高产菌株也大多来源于这种菌株。辅酶Q10是细胞中的天然抗氧化剂，可以促进ATP的合成、清除自由基从而保护细胞膜及蛋白质免于氧化损伤，因此广泛的应用于化妆品、医药及保健品行业，在美国辅酶Q10作为保健品被制成软胶囊供人们直接口服使用。
目前辅酶Q10的生产方法主要有三种，包括动植物提取法、化学合成法以及微生物发酵法。其中，微生物发酵法是利用辅酶Q10生产菌株进行微生物发酵，然后经过分离、提取与纯化获得辅酶Q10的一种现代化方法。该方法综合了生物提取法和化学合成法的优点，且原料来源广泛，廉价易得，可以在有限的空间内进行大规模的高密度发酵，生产效率高，环境污染小。
细胞呼吸链是类球红细菌进行氧化呼吸、传递电子、获得能量的元件，对菌体生长、胞内产物积累有着非常重要的影响。辅酶Q10作为细胞呼吸链上的重要电子传递体，其合成受细胞呼吸链的活性调控。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种类球红细菌重组菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述类球红细菌重组菌的构建方法，为类球红细菌高效基因无痕敲除方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述类球红细菌重组菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种类球红细菌重组菌，为类球红细菌重组菌S324，是由类球红细菌基因组中敲除限制性核酸内切酶编码基因rshI而得到的。
优选的，上述类球红细菌重组菌(S324)，所述限制性核酸内切酶编码基因rshI具有序列表<400>7所示序列。
优选的，上述类球红细菌重组菌(S324)，通过连接有rshI-LR 片段的敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rshI-LR)敲除rshI基因获得，所述载体中rshI左右臂(rshI-LR)长度为1517bp，所述基因具有序列表<400>3所示序列，其中，
优选的，上述类球红细菌重组菌(S324)，类球红细菌中rshI左臂761bp基因rshI-L，所述基因具有序列表<400>1所示序列；类球红细菌中rshI右臂756bp基因rshI-R，所述基因具有序列表<400>2 所示序列。
上述类球红细菌重组菌(S324)的构建方法，将敲除载体 pLH339(pK18mobsacB::rshI-LR)化转入大肠杆菌S17-1，特异性无缝敲除限制性核酸内切酶编码基因rshI，获得的限制性核酸内切酶基因功能缺失的工程菌株，具体步骤如下：
(1)从-80℃保藏的大肠杆菌S17-1甘油管中，挑菌液划线至LB 固体平板上，于37℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰；
(2)挑取单菌落接种于4mL新鲜LB液体培养基中，37℃、200 r/min摇床培养12h；
(3)按1％(v/v)的接种量，将培养好的菌液转接于装有50mL 新鲜LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、200r/min培养至 OD660为0.5-0.6，收集菌液于离心管中，冰浴10min；
(4)4℃、4000r/min离心5min，尽量除尽上清；
(5)向离心管中加入5mL预冷的SSCS溶液，轻轻充分悬浮菌体；
(6)吸取100μL菌液分装至预冷的1.5mL EP管中；
(7)吸取4ul构建好的敲除载体，加入到100μL的大肠杆菌 S17-1的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；
(8)42℃水浴锅中热激处理90s(严格控制时间，以免影响转化效率)；
(9)立即置于冰上冰浴5min；
(10)于超净工作台中，加入900μL新鲜LB液体培养基，混匀，37℃，200r/min摇床培养45min；
(11)将培养后的菌液吸取100μL涂布于含有卡那霉素的LB 平板上(Kanar，100μg/mL)。于37℃恒温培养箱中，培养至转化子长出，获得的敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rshI-LR)；
(12)将已获得的敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rshI-LR)化转入大肠杆菌S17-1，与类球红细菌共培养，使pLH339发生接合转移：
(a)将构建好的敲除载体化转入大肠杆菌S17-1的感受态细胞中，吸取100μL复苏后的菌液涂布于添加有卡那霉素的LB固体平板上(Kana，100μg/mL)，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h；
(b)将类球红细菌2.4.1菌株从甘油管中三区划线于NH1固体平板上，于32℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰；
(c)将类球红细菌2.4.1和大肠杆菌S17-1分别挑取单克隆接种于NH1液体培养基和LB液体培养基(LB液体培养基中添加100 μg/mL的卡那霉素)中，类球红细菌于32℃、200r/min控温摇床中培养24h左右(对数期前期用于接合转移较好)，大肠杆菌S17-1 于37℃、200r/min摇床中培养8-12h；
(d)各取1mL菌液于1.5mL EP管中，8000r/min离心3min 后，弃去上清；
(e)用1mL的0.9％生理盐水洗涤菌体沉淀一次；
(f)分别加入适量新鲜NH1液体培养基重悬菌体沉淀(OD600在0.8-1.2之间)；
(g)按不同的比例将两种菌液混合(总体积为400μL较好)，用枪头吸取混合菌液缓慢的点于平板中无菌滤膜中央，于超净工作台中将菌液吹干；
(h)菌液吹干后将平板正置于32℃恒温培养箱中培养24h；
(13)将共培养获得的菌苔，涂布于筛选平板，筛选获得rshI 敲除菌株：
(A)用400μL无菌水将平板上的菌苔洗下，涂布于添加有卡那霉素和亚碲酸钾(Kana浓度为25μg/mL，K2TeO3浓度为150μ g/mL)的NH1固体平板上，于32℃恒温培养箱中静置培养，至平板上有黑色转化子长出；
(B)挑取转化子接种于添加有卡那霉素的NH1液体培养基中，于32℃、200r/min控温摇床中培养24h；
(C)将试管中的菌液在添加有卡那霉素的NH1固体平板上 (Kanar，25μg/mL)划线进行分离纯化，于32℃恒温培养箱中静置培养至单菌落清晰；
(D)挑取单克隆接种于添加有卡那霉素的NH1液体培养基 (Kanar，25μg/mL)中，于32℃、200r/min控温摇床中培养24h；
(E)提取基因组DNA作为模板进行PCR扩增。利用表3中的引物rshI-L-F/rshI-P4和rshI-P1/rshI-R-R验证单交换菌株是否正确，同源重组单交换原理图如图4；
(F)挑取验证正确单交换菌株的单克隆接种于NH1液体培养基中(不添加任何抗生素)，于32℃、200r/min控温摇床中培养24h；
(G)按1％的接种量进行转接，筛选双交换菌株，同时将菌液稀释至合适的浓度(一般为10-2-10-5之间为宜)，吸取100μL稀释后的菌液均匀的涂布于添加有100g/L蔗糖的SMM固体平板上，于32℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰；
(H)转接后的菌液于32℃、200r/min控温摇床中培养24h左右，并重复上步实验操作；
(I)挑取在添加有100g/L蔗糖的SMM固体平板上长出的单菌落，接种于NH1液体培养基中于32℃、200r/min控温摇床中培养 24h；
(J)提取基因组DNA进行PCR扩增，利用表3中的引物rshI-P1和rshI-P4验证双交换菌株是否正确，同源重组双交换原理图如图4，其中引物P1位于rshI-L上游106bp，引物P4位于rshI-R 下游186bp。以待检测菌株的基因组为模板，如果没有发生同源重组，则用引物P1、P4扩增出来的片段大小为2635bp；如果发生了同源重组，则片段大小为1849bp，如图5。
限制性核酸内切酶编码基因rshI功能缺失与双菌接合转移效率的关联。
所述单交换筛选标记为亚碲酸钾和卡那霉素，所述浓度分别为 150μg/mL、25μg/mL。
所述双菌接合转移，所述双菌为大肠杆菌(Escherichia coli) S17-1和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1。
所述载体为pLH339(pK18mobsacB::rshI-LR)。
所述载体pLH339(pK18mobsacB::rshI-LR)转入宿主菌，所用宿主菌为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1。
一种类球红细菌重组菌，为类球红细菌重组菌S372，是在权利要求1所述类球红细菌重组菌S324的基础上敲除琥珀酸脱氢酶编码基因sdhB而得到的。
优选的，上述类球红细菌重组菌(S372)，所述琥珀酸脱氢酶编码基因sdhB具有序列表<400>8所示序列。
优选的，上述类球红细菌重组菌(S372)，通过连接有sdhB-LR 片段的敲除载体pLH357(pK18mobsacB::sdhB-LR)敲除sdhB基因获得，所述载体中sdhB左右臂(sdh B-LR)长度为1528bp，所述基因具有序列表<400>6所示序列，其中，
类球红细菌中sdhB左臂766bp基因sdhB-L，所述基因具有序列表<400>4所示序列；类球红细菌中sdhB右臂762bp基因sdhB-R，所述基因具有序列表<400>5所示序列。
上述类球红细菌重组菌(S372)的构建方法，将敲除载体 pLH357(pK18mobsacB::sdhB-LR)化转入大肠杆菌S17-1，特异性无缝敲除琥珀酸脱氢酶编码基因sdhB，获得的琥珀酸脱氢酶基因功能缺失的工程菌株，具体步骤如下：
(1)从-80℃保藏的大肠杆菌S17-1甘油管中，挑菌液划线至LB 固体平板上，于37℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰；
(2)挑取单菌落接种于4mL新鲜LB液体培养基中，37℃、 200r/min摇床培养12h；
(3)按1％的接种量，将培养好的菌液转接于装有50mL新鲜LB 液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、200r/min培养至OD660为 0.5-0.6，收集菌液于离心管中，冰浴10min；
(4)4℃、4000r/min离心5min，尽量除尽上清；
(5)向离心管中加入5mL预冷的SSCS溶液，轻轻充分悬浮菌体；
(6)吸取100μL菌液分装至预冷的1.5mL EP管中；
(7)吸取4ul构建好的敲除载体，加入到100μL的大肠杆菌 S17-1的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；
(8)42℃水浴锅中热激处理90s(严格控制时间，以免影响转化效率)；
(9)立即置于冰上冰浴5min；
(10)于超净工作台中，加入900μL新鲜LB液体培养基，混匀，37℃，200r/min摇床培养45min；
(11)将培养后的菌液吸取100μL涂布于含有卡那霉素的LB 平板上(Kanar，100μg/mL)。于37℃恒温培养箱中，培养至转化子长出；
(12)将已获得的敲除载体pLH357(pK18mobsacB::sdhB-LR)化转入大肠杆菌S17-1，与类球红细菌共培养，使其发生结合转移：
(a)将构建好的敲除载体化转入大肠杆菌S17-1的感受态细胞中，吸取100μL复苏后的菌液涂布于添加有卡那霉素的LB固体平板上(Kana，100μg/mL)，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h左右。
(b)将类球红细菌S324从甘油管中三区划线于NH1固体平板上，于32℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰；
(c)将类球红细菌和大肠杆菌S17-1分别挑取单克隆接种于 NH1液体培养基和LB液体培养基(LB液体培养基中添加100μg/mL 的卡那霉素)中，类球红细菌于32℃、200r/min控温摇床中培养24 h左右(对数期前期用于接合转移较好)，大肠杆菌S17-1于37℃、 200r/min摇床中培养8-12h；
(d)各取1mL菌液于1.5mL EP管中，8000r/min离心3min 后，弃去上清；
(e)用1mL的0.9％生理盐水洗涤菌体沉淀一次；
(f)分别加入适量新鲜NH1液体培养基重悬菌体沉淀(OD600在0.8-1.2之间)；
(g)按不同的比例将两种菌液混合(总体积为400μL较好)，用枪头吸取混合菌液缓慢的点于平板中无菌滤膜中央，于超净工作台中将菌液吹干；
(h)菌液吹干后将平板正置于32℃恒温培养箱中培养24h；
(13)将共培养获得的菌苔，涂布于筛选平板，筛选sdhB敲除菌株：
(A)用400μL无菌水将平板上的菌苔洗下，涂布于添加有卡那霉素和亚碲酸钾(Kana浓度为25μg/mL，K2TeO3浓度为150μ g/mL)的NH1固体平板上，于32℃恒温培养箱中静置培养，至平板上有黑色转化子长出；
(B)挑取黑色转化子接种于添加有卡那霉素的NH1液体培养基中，于32℃、200r/min控温摇床中培养24h；
(C)将试管中的菌液在添加有卡那霉素的NH1固体平板上(Kanar，25μg/mL)划线进行分离纯化，于32℃恒温培养箱中静置培养至单菌落清晰；
(D)挑取单克隆接种于添加有卡那霉素的NH1液体培养基 (Kanar，25μg/mL)中，于32℃、200r/min控温摇床中培养24h；
(E)提取基因组DNA作为模板进行PCR扩增，利用表4中的引物sdhB-L-F/sdhB-P4和sdhB-P1/sdhB-R-R验证单交换菌株是否正确，同源重组单交换原理图如图4；
(F)挑取验证正确单交换菌株的单克隆接种于NH1液体培养基中(不添加任何抗生素)，于32℃、200r/min控温摇床中培养24h；
(G)按1％的接种量进行转接，筛选双交换菌株，同时将菌液稀释至合适的浓度(一般为10-2-10-5之间为宜)，吸取100μL稀释后的菌液均匀的涂布于添加有10％sucrose的SMM固体平板上，于 32℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰；
(H)转接后的菌液于32℃、200r/min控温摇床中培养24h，并重复上步实验操作；
(I)挑取在添加有100g/L蔗糖的SMM固体平板上长出的单菌落，接种于NH1液体培养基中于32℃、200r/min控温摇床中培养 24h；
(J)提取基因组DNA进行PCR扩增，利用表4中的引物 sdhB-P1和sdhB-P4验证双交换菌株是否正确，同源重组双交换原理图如图4，其中引物P1位于sdhB-L上游113bp，引物P4位于sdhB-R 下游4bp。以待检测菌株的基因组为模板，如果没有发生同源重组，则用引物P1、P2扩增出来的片段大小为2443bp；如果发生了同源重组，则片段大小为1685bp，如图8。
所述单交换筛选标记为亚碲酸钾和卡那霉素，所述浓度分别为 150μg/mL、25μg/mL。
所述双菌接合转移，所述双菌为大肠杆菌(Escherichia coli) S17-1和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)S324。
所述载体为pLH357(pK18mobsacB::sdh B-LR)。
所述载体pLH357(pK18mobsacB::sdh B-LR)转入宿主菌，所用宿主菌为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
上述构建方法中：
所用NH1培养基：8g酵母提取物，3g葡萄糖，2g/L NaCl， 1.3g KH2PO4，0.125gMgSO4，1mg盐酸硫胺素，15μg生物素，1 mg烟酸，加去离子水定容至1L，调节pH至7.2。
所用单交换筛选培养基：8g酵母提取物，3g葡萄糖，2g/L NaCl， 1.3g KH2PO4，0.125g MgSO4，1mg盐酸硫胺素，15μg生物素，1 mg烟酸，25mg卡那霉素，150mg亚碲酸钾，加去离子水定容至1L，调节pH至7.2。
所用SMM+10％sucrose(100g/L蔗糖加入SMM)：20mL CB母液， 1mL生长因子母液，4g DL-苹果酸，3.5g磷酸氢二钾，2g氢氧化钾，0.5g硫酸铵，0.5g氯化钠，l00g蔗糖，加去离子水定容至 1L，调节pH至6.9。
生长因子母液：在100mL去离子水中加入4mg生物素,200mg烟酸，100mg盐酸硫胺素，定容至200mL，过滤除菌(配制时可用HCl 溶液助溶)。
CB母液：在500mL的去离子水中加入l0g氨三乙酸和8g KOH，待全部溶解(可用NaOH溶液助溶)后依次加入14.6g无水硫酸镁， 1.7g CaCl2·2H2O，50mL M44母液，用NaOH调节pH至7.0。
M44母液：800mL去离子水中加2g EDTA，11g ZnSO4·7H2O，5g FeSO4·7H2O，1.5gMnSO4·H2O，0.4g CuSO4·5H2O，0.12g H3BO3， 0.37g CoCl4·6H2O定容至I L。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
上述类球红细菌重组菌S324在提高类球红细菌基因无痕敲除过程中筛选效率方面的应用。
上述类球红细菌重组菌S372在提高辅酶Q10合成量方面的应用。
本发明的有益效果是：
利用同源重组技术将类球红细菌中的限制性核酸内切酶编码基因进行无缝敲除，获得rshI基因敲除的重组菌，利用类球红细菌能耐受高浓度亚碲酸钾，大肠杆菌S17-1不耐高浓度亚碲酸钾，用亚碲酸钾代替萘啶酮酸作为单交换筛选标记。本发明将敲除rshI基因的重组菌进行sdhB基因敲除，以亚碲酸钾和卡那霉素作为单交换筛选标记，与原有方法下类球红细菌2.4.1进行sdhB基因敲除相比，双菌结合转移效率显著提高，转化率达90％以上，比对照组提高了 50-100倍，显著提高了类球红细菌基因无痕敲除的筛选效率。
rshI的基因敲除菌株，不用插入筛选标记，无缝定点敲除rshI 基因，不影响其上游和下游基因的转录水平，保证类球红细菌正常生长。此外，通过一种类球红细菌高效基因无痕敲除方法等分子生物学手段对电子传递链进行修饰，通过发酵条件优化，提高辅酶Q10的产量。可见：
1、本发明利用同源重组技术获得rshI的基因敲除菌株，不用插入筛选标记，无缝定点敲除rshI基因，不影响其上游和下游基因的转录水平，保证类球红细菌正常的生长。
2、本发明将敲除rshI基因的工程菌为宿主菌，继续敲除琥珀酸脱氢酶编码基因sdhB，以亚碲酸钾和卡那霉素作为单交换筛选标记，与原有方法下野生型类球红细菌进行sdhB基因敲除相比，双菌接合转移效率显著提高，本发明显著提高了类球红细菌基因无痕敲除的筛选效率。
3.本发明通过敲除琥珀酸脱氢酶编码基因sdhB获得辅酶Q10高产菌株，降低成本，易于形成规模化工业生产。
附图说明
图1为本发明载体pLH146(pK18mobsacB)的图谱；
图2为本发明敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rshⅠ-LR)的构建图谱；
图3为本发明构建敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rshI-LR)的PCR验证图，M：DNAMarker；1：阴性对照；2：以rshI-LR片段为模板的阳性对照，扩增获得rshI-LR片段，大小为1517bp；3、4：片段成功连接到载体上的菌株，扩增获得rshI-LR片段，大小为 1517bp，与阳性对照相同；
图4为本发明敲除菌株筛选的同源重组原理图；
图5为本发明rshI基因敲除菌株PCR验证图，M：DNA Marker； 1：阴性对照；2：野生型；3-4：发生同源重组的菌株；
图6为本发明敲除载体pLH357(pK18mobsacB::sdhB-LR)的构建图谱；
图7为本发明构建敲除载体pLH357(pK18mobsacB::sdhB-LR)的 PCR验证图，M：DNAMarker；1：阴性对照；2：以sdhB-LR片段为模板的阳性对照，扩增获得sdhB-LR片段，大小为1528bp；3、4：片段成功连接到载体上的菌株，扩增获得sdhB-LR片段，大小为 1528bp，与阳性对照相同；
图8为本发明sdhB基因敲除菌株PCR验证图，M：DNA Marker； 1：阴性对照；2：野生型；3、4、5：没有发生同源重组的菌株；6、 7：发生同源重组的菌株；
图9是辅酶Q10合成情况对比。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
本发明利用同源重组技术将类球红细菌中的限制性核酸内切酶编码基因(restriction endonuclease，rshⅠ)和琥珀酸脱氢酶编码基因(succinate dehydrogenasecatalytic subunit,sdh B)进行无缝敲除，获得限制性核酸内切酶和琥珀酸脱氢酶基因功能缺失的工程菌株，本发明的内容包括：构建所述rshⅠ，sdhB敲除载体的方法，构建rshⅠ，sdhB基因敲除菌株的方法。所述载体为 pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1),载体中包括sacB基因。
本发明所述的rshⅠ-L来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1，其核苷酸序列如序列1所示；rshⅠ-R来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1，其核苷酸序列如序列2所示。所述的rshⅠ-LR是rshⅠ-L、rshⅠ-R连接在一起的序列，是以rshⅠ-L、rshⅠ-R为模板通过重叠PCR技术扩增得到的，其核苷酸序列如序列3所示。所述的敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rsh Ⅰ-LR)是将rshⅠ-LR片段插入到初始载体pK18mobsacB，构建了敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rshⅠ-LR)，并将它化转入大肠杆菌 S17-1，然后和类球红细菌共培养，使其发生接合转移，得到rshⅠ基因敲除菌株。
本发明所述的sdhB-L来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1，其核苷酸序列如序列4所示；sdhB-R来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1，其核苷酸序列如序列5所示。所述的sdhB-LR是sdhB-L、sdhB-R连接在一起的序列，是以sdhB-L、sdhB-R为模板通过重叠PCR技术扩增得到的，其核苷酸序列如序列6所示。所述的敲除载体pLH357 (pK18mobsacB::sdhB-LR)是将sdhB-LR片段插入到初始载体 pK18mobsacB，构建了敲除载体pLH357(pK18mobsacB::sdhB-LR)，并将它化转入大肠杆菌S17-1，然后分别和类球红细菌和上述rshⅠ基因敲除菌株共培养，使其发生结合转移，得到sdhB基因敲除菌株。
本发明所述的sdhB基因敲除菌株经发酵培养后，取不同培养时间的发酵液进行辅酶Q10产量的检测。
pK18mobsacB载体大小为5719bp，如图1所示，其上包含卡纳霉素的抗性标记，以及一个sacB基因作为双向筛选的标记，sacB 编码蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解和合成高分子量的果聚糖。高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用，可造成细胞死亡。也就是说，sacB基因使得细菌获得蔗糖敏感的特性。该载体不可以在类球红细菌中游离存在，只能整合至染色体上才能使载体上的元件发挥作用。因此，在本研究中，首先通过将目的基因的同源臂构建至载体的多克隆位点上，然后通过接合转移将载体导入类球红细菌中，利用卡纳霉素作为抗性标记筛选单交换菌株，最后在以蔗糖为唯一碳源的平板上利用sacB基因的作用机理筛选双交换菌株，从而实现基因打靶的目的。本研究已发现在10％或10％以上的蔗糖存在下，sacB 基因的表达可以导致类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1 死亡。
本发明具体操作步骤如下：
一、敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rshⅠ-LR)的构建
1、以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的基因组为模板，利用表1中的引物rshⅠ-L-F和rshⅠ-L-R通过PCR扩增得到rshⅠ -L，以rshⅠ-R-F和rshⅠ-R-R为引物通过PCR扩增得到rshⅠ-R。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer(含Mg2+)10μl，dNTP(2mM) 2μl，上游引物rshⅠ-L-F和下游引物rshⅠ-L-R(10μM)各0.4 μl，模板0.2μl，KOD Fx DNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer(含Mg2+)10μl，dNTP(2mM) 2μl，上游引物rshⅠ-R-F和下游引物rshⅠ-R-R(10μM)各0.4 μl，模板0.2μl，KOD Fx DNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。
PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火30s， 68℃延伸1min，反应35个循环，68℃再延伸10min。
PCR结束后获得完整的目的片段核苷酸序列，其序列见序列1、序列2。
2、以rshⅠ-L、rshⅠ-R为模板，利用表2中的引物进行重叠 PCR扩增获得rshⅠ-LR。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer(含Mg2+)10μl，dNTP(2mM) 2μl，引物rshⅠ-L-F和rshⅠ-R-R(10μM)各0.4μl，模板rsh Ⅰ-L和rshⅠ-R各0.2μl，KOD Fx DNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。
PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火30s， 68℃延伸1min50s，反应35个循环，68℃再延伸10min。
PCR结束后获得完整的目的片段核苷酸序列，其序列见序列3。
表1所用引物序列
将已获得的DNA片段rshⅠ-LR用PstI和Sph I进行双酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pK18mobsacB进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有卡那霉素(100μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，获得敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rsh Ⅰ-LR)，验证图如图3。
LB培养基：
胰蛋白胨：10.0g，酵母浸出物：5.0g，NaCl：10.0g，去离子水溶解后，定容至1.0L，pH调至7.0-7.2，固体培养基加1.5％的琼脂粉。121℃灭菌20min。
二、敲除载体pLH357(pK18mobsacB::sdhB-LR)的构建
1、以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的基因组为模板，利用表2中的引物sdhB-L-F和sdhB-L-R通过PCR扩增得到sdhB-L，以sdhB-R-F和sdhB-R-R为引物通过PCR扩增得到sdhB-R。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer(含Mg2+)10μl，dNTP(2mM) 2μl，上游引物sdhB-L-F和下游引物sdhB-L-R(10μM)各0.4μl，模板0.2μl，KOD Fx DNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20 μl。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer(含Mg2+)10μl，dNTP(2mM) 2μl，上游引物sdhB-R-F和下游引物sdhB-R-R(10μM)各0.4μl，模板0.2μl，KOD Fx DNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20 μl。
PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火30s， 68℃延伸1min，反应35个循环，68℃再延伸10min。
PCR结束后获得完整的目的片段核苷酸序列，其序列见序列4、序列5。
2、以sdhB-L、sdhB-R为模板，利用表2中的引物进行重叠PCR 扩增获得sdhB-LR。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer(含Mg2+)10μl，dNTP(2mM) 2μl，引物sdhB-L-F和sdhB-R-R(10μM)各0.4μl，模板sdhB-L 和sdhB-R各0.2μl，KOD Fx DNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。
PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火30s， 68℃延伸1min50s，反应35个循环，68℃再延伸10min。
PCR结束后获得完整的目的片段核苷酸序列，其序列见序列6。
表2所用引物序列
将已获得的DNA片段sdhB-LR用BamH I和Pst I进行双酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pK18mobsacB进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有卡那霉素(100μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，获得敲除载体pLH357 (pK18mobsacB::sdhB-LR)，验证图如图7。
三、rshⅠ基因敲除菌株的构建
将上述已获得的敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rshⅠ-LR)化转入大肠杆菌S17-1，具体方法为：
(1)从-80℃保藏的大肠杆菌S17-1甘油管中，挑菌液划线至 LB固体平板上，于37℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰。
(2)挑取单菌落接种于4mL新鲜LB液体培养基中，37℃、 200r/min摇床培养12h左右。
(3)按1％的接种量，将培养好的菌液转接于装有50mL新鲜 LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、200r/min培养至OD660为0.5-0.6，收集菌液于离心管中，冰浴10min。
(4)4℃、4000r/min离心5min，尽量除尽上清。
(5)向离心管中加入5mL预冷的SSCS溶液，轻轻充分悬浮菌体。
(6)吸取100μL菌液分装至预冷的1.5mL EP管中
(7)吸取4ul构建好的敲除载体，加入到100μL的大肠杆菌 S17-1的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。
(8)42℃水浴锅中热激处理90s(严格控制时间，以免影响转化效率)。
(9)立即置于冰上冰浴5min。
(10)于超净工作台中，加入900μL新鲜LB液体培养基，混匀，37℃，200r/min摇床培养45min。
(11)将培养后的菌液吸取100μL涂布于含有卡那霉素的LB 平板上(Kanar，100μg/mL)。于37℃恒温培养箱中，培养至转化子长出。
将上述已获得的敲除载体pLH339(pK18mobsacB::rshⅠ-LR)化转入大肠杆菌S17-1，和类球红细菌共培养，使其发生结合转移，具体方法为：
(1)将构建好的敲除载体化转入大肠杆菌S17-1的感受态细胞中，吸取100μL复苏后的菌液涂布于添加有卡那霉素的LB固体平板上(Kanar，100μg/mL)，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h 左右。
(2)将类球红细菌基因敲除的出发菌株从甘油管中三区划线于 NH1固体平板上，于32℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰。
(3)将类球红细菌和大肠杆菌S17-1分别挑取单克隆接种于 NH1液体培养基和LB液体培养基(LB液体培养基中添加100μg/mL 的卡那霉素)中，类球红细菌于32℃、200r/min控温摇床中培养24 h左右(对数期前期用于接合转移较好)，大肠杆菌S17-1于37℃、 200r/min摇床中培养8-12h。
(4)各取1mL菌液于1.5mL EP管中，8000r/min离心3min 后，弃去上清。
(5)用1mL的0.9％生理盐水洗涤菌体沉淀一次。
(6)分别加入适量新鲜NH1液体培养基重悬菌体沉淀(OD600在0.8-1.2之间)。
(7)按不同的比例将两种菌液混合(总体积为400μL较好)，用枪头吸取混合菌液缓慢的点于平板中无菌滤膜中央，于超净工作台中将菌液吹干。
(8)菌液吹干后将平板正置于32℃恒温培养箱中培养24h。
(9)用400μL无菌水将平板上的菌苔洗下，涂布于添加有卡那霉素和亚碲酸钾(Kana浓度为25μg/mL，K2TeO3浓度为150μ g/mL)的NH1固体平板上，于32℃恒温培养箱中静置培养，至平板上有黑色转化子长出。
四、sdhB基因敲除菌株的构建
将上述已获得的敲除载体pLH357(pK18mobsacB::sdhB-LR)化转入大肠杆菌S17-1，具体方法为：
(1)从-80℃保藏的大肠杆菌S17-1甘油管中，挑菌液划线至LB 固体平板上，于37℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰。
(2)挑取单菌落接种于4mL新鲜LB液体培养基中，37℃、 200r/min摇床培养12h左右。
(3)按1％的接种量，将培养好的菌液转接于装有50mL新鲜 LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、200r/min培养至OD660为0.5-0.6，收集菌液于离心管中，冰浴10min。
(4)4℃、4000r/min离心5min，尽量除尽上清。
(5)向离心管中加入5mL预冷的SSCS溶液，轻轻充分悬浮菌体。
(6)吸取100μL菌液分装至预冷的1.5mL EP管中
(7)吸取4ul构建好的敲除载体，加入到100μL的大肠杆菌 S17-1的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。
(8)42℃水浴锅中热激处理90s(严格控制时间，以免影响转化效率)。
(9)立即置于冰上冰浴5min。
(10)于超净工作台中，加入900μL新鲜LB液体培养基，混匀，37℃，200r/min摇床培养45min。
(11)将培养后的菌液吸取100μL涂布于含有卡那霉素的LB 平板上(Kanar，100μg/mL)。于37℃恒温培养箱中，培养至转化子长出。
将上述已获得的敲除载体pLH357(pK18mobsacB::sdhB-LR)化转入大肠杆菌S17-1，和类球红细菌共培养，使其发生结合转移，具体方法为：
(1)将构建好的敲除载体化转入大肠杆菌S17-1的感受态细胞中，吸取100μL复苏后的菌液涂布于添加有卡那霉素的LB固体平板上(Kanar，100μg/mL)，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h 左右。
(2)将类球红细菌基因敲除的出发菌株从甘油管中三区划线于 NH1固体平板上，于32℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰。
(3)将类球红细菌和大肠杆菌S17-1分别挑取单克隆接种于 NH1液体培养基和LB液体培养基(LB液体培养基中添加100μg/mL 的卡那霉素)中，类球红细菌于32℃、200r/min控温摇床中培养24 h左右(对数期前期用于接合转移较好)，大肠杆菌S17-1于37℃、 200r/min摇床中培养8-12h。
(4)各取1mL菌液于1.5mL EP管中，8000r/min离心3min 后，弃去上清。
(5)用1mL的0.9％生理盐水洗涤菌体沉淀一次。
(6)分别加入适量新鲜NH1液体培养基重悬菌体沉淀(OD600在0.8-1.2之间)。
(7)按不同的比例将两种菌液混合(总体积为400μL较好)，用枪头吸取混合菌液缓慢的点于平板中无菌滤膜中央，于超净工作台中将菌液吹干。
(8)菌液吹干后将平板正置于32℃恒温培养箱中培养24h。
五、rshⅠ敲除菌株的筛选，具体方法如下：
(1)用400μL无菌水将平板上的菌苔洗下，涂布于添加有卡那霉素和亚碲酸钾(Kana浓度为25μg/mL，K2TeO3浓度为150μ g/mL)的NH1固体平板上，于32℃恒温培养箱中静置培养，至平板上有黑色转化子长出。
(2)挑取黑色转化子接种于添加有卡那霉素的NH1液体培养基中，于32℃、200r/min控温摇床中培养24h左右。
(3)将试管中的菌液在添加有卡那霉素的NH1固体平板上 (Kanar，25μg/mL)划线进行分离纯化，于32℃恒温培养箱中静置培养至单菌落清晰。
(4)挑取单克隆接种于添加有卡那霉素的NH1液体培养基(Kanar，25μg/mL)中，于32℃、200r/min控温摇床中培养24 h左右。
(5)提取基因组DNA作为模板进行PCR扩增。利用表3中的引物rshⅠ-L-F/rshⅠ-P4和rshⅠ-P1/rshⅠ-R-R验证单交换菌株是否正确，同源重组单交换原理图如图4。
(6)挑取验证正确单交换菌株的单克隆接种于NH1液体培养基中(不添加任何抗生素)，于32℃、200r/min控温摇床中培养24h 左右。
(7)按1％的接种量进行转接，筛选双交换菌株，同时将菌液稀释至合适的浓度(一般为10-2-10-5之间为宜)，吸取100μL稀释后的菌液均匀的涂布于添加有10％sucrose的SMM固体平板上，于 32℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰。
(8)转接后的菌液于32℃、200r/min控温摇床中培养24h左右，并重复上步实验操作。
(9)挑取在添加有10％sucrose的SMM固体平板上长出的单菌落，接种于NH1液体培养基中于32℃、200r/min控温摇床中培养24h左右。
(10)提取基因组DNA进行PCR扩增，利用表3中的引物rsh Ⅰ-P1和rshⅠ-P4验证双交换菌株是否正确，同源重组双交换原理图如图4，其中引物P1位于rshⅠ-L上游106bp，引物P4位于rsh Ⅰ-R下游186bp。以待检测菌株的基因组为模板，如果没有发生同源重组，则用引物P1、P4扩增出来的片段大小为2635bp；如果发生了同源重组，则片段大小为1849bp，如图5。
PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2μl，dNTP(10mM)0.4μl，引物P1、P2(10μM)各0.4μl，模板1μl，Taq DNA聚合酶(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号PER 001-1)0.4μl，加无菌水至终体积为20μl。
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s， 72℃延伸2min50s，反应35个循环，72℃后延伸10min。
表3所用引物序列
六、sdhB敲除菌株的筛选，具体方法如下：
(1)用400μL无菌水将平板上的菌苔洗下，涂布于添加有卡那霉素和亚碲酸钾(Kana浓度为25μg/mL，K2TeO3浓度为150μ g/mL)的NH1固体平板上，于32℃恒温培养箱中静置培养，至平板上有黑色转化子长出。
(2)挑取黑色转化子接种于添加有卡那霉素的NH1液体培养基中，于32℃、200r/min控温摇床中培养24h左右。
(3)将试管中的菌液在添加有卡那霉素的NH1固体平板上 (Kanar，25μg/mL)划线进行分离纯化，于32℃恒温培养箱中静置培养至单菌落清晰。
(4)挑取单克隆接种于添加有卡那霉素的NH1液体培养基 (Kanar，25μg/mL)中，于32℃、200r/min控温摇床中培养24 h左右。
(5)提取基因组DNA作为模板进行PCR扩增。利用表4中的引物sdhB-L-F/sdhB-P4和sdhB-P1/sdhB-R-R验证单交换菌株是否正确，同源重组单交换原理图如图4。
(6)挑取验证正确单交换菌株的单克隆接种于NH1液体培养基中(不添加任何抗生素)，于32℃、200r/min控温摇床中培养24h 左右。
(7)按1％的接种量进行转接，筛选双交换菌株，同时将菌液稀释至合适的浓度(一般为10-2-10-5之间为宜)，吸取100μL稀释后的菌液均匀的涂布于添加有10％sucrose的SMM固体平板上，于 32℃恒温培养箱中培养至单菌落清晰。
(8)转接后的菌液于32℃、200r/min控温摇床中培养24h左右，并重复上步实验操作。
(9)挑取在添加有10％sucrose的SMM固体平板上长出的单菌落，接种于NH1液体培养基中于32℃、200r/min控温摇床中培养24h左右。
(10)提取基因组DNA进行PCR扩增，利用表4中的引物 sdhB-P1和sdhB-P4验证双交换菌株是否正确，同源重组双交换原理图如图4，其中引物P1位于sdhB-L上游113bp，引物P4位于sdhB-R 下游4bp。以待检测菌株的基因组为模板，如果没有发生同源重组，则用引物P1、P2扩增出来的片段大小为2443bp；如果发生了同源重组，则片段大小为1685bp，如图8。
PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2μl，dNTP(10mM)0.4μl，引物P1、P2(10μM)各0.4μl，模板1μl，Taq DNA聚合酶(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号PER 001-1)0.4μl，加无菌水至终体积为20μl。
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s， 72℃延伸2min50s，反应35个循环，72℃后延伸10min。
表4所用引物序列
七、sdhB基因敲除菌株的辅酶Q10的检测
sdhB基因敲除菌株在5L发酵罐中进行两步发酵
所用发酵培养基：蔗糖50g/L，酪蛋白胨10g/L，酵母提取物 3.5g/L，K2HPO4 2g/L，NaCl 1.5g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L。发酵条件： 3L发酵液，接种量8％，32℃，pH7.2，用5MNaOH溶液调节pH。每 12h取一次发酵液。发酵开始时设置搅拌转速为400r/min，在通气量为1vvm的条件下发酵至48h(该点进入稳定期)，然后将转速调至200r/min、通气量降低为0.5vvm继续培养至发酵周期结束 (96h)，生长曲线如图9。
辅酶Q10的检测
(1)发酵液预处理：取1mL发酵培养液加入10mL离心管中， 4000r/min离心10min，弃去上清。
(2)辅酶Q10提取：向离心管中加入4mL提取液(乙酸乙酯：乙醇＝5:3，体积比)，在漩涡震荡仪上充分震荡混匀，暗室中抽提1h，期间每隔15min摇匀一次。
(3)4000r/min、4℃离心10min，上层有机相经0.45μm的有机系滤头过滤，取25μL进行HPLC分析。每组实验由三个平行实验构成，数据结果以平均值SD表示。
(4)HPLC检测条件：色谱柱为C18反相柱(5μm×4.6mm× 250mm,Thermo,ODS-2HYPERSIL,USA)，流动相为甲醇：异丙醇＝3： 1(v:v)，柱温箱为40℃，柱流速1mL/min，紫外检测器，检测波长275nm。
(5)辅酶Q10标准曲线的建立：称取10mg的辅酶Q10标品溶于 10mL的无水乙醇，配制成1mg/mL的母液，然后分别稀释至浓度为 500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL和lμg/mL。通过HPLC 分析建立辅酶Q10浓度与峰面积之间的关系曲线。
通过两步发酵法，可以有效提高辅酶Q10的产量。该策略最终使得sdhB基因敲除菌株的辅酶Q10产量较野生型提高了29.14％，单位菌体辅酶Q10的含量提高了20％左右。
上述参照具体实施方式对该类球红细菌重组菌及其构建方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 类球红细菌重组菌及其构建方法与应用
<150> 2017110379681
<151> 2017-10-31
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 761
<212> DNA
<213> rshI左臂(Rhodobacter sphaeroides)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(761)
<400> 1
gccattgagt tgaccggtga gcgctaggtg gatcgcttcg aggagggtgg attttccaca 60
ctcgttgttt ccgacaatga cgttcagttt gtcattgaag gtgacgtttg cctgcttaag 120
gcagcggtag tttctgataa ccgcgcgttg gatgaacaaa ctcgtgactc ccttcgccgt 180
gtacactgct atgaggcaca gcttaagcaa agtctacaag ggcgggtgcg gctcaatcaa 240
gtctagccga ccagaagaag ctggatagtg aattcttggg tcggtcgacc ttcgaccggg 300
tccatccgtg gctgaagcgg ccagactcaa tgccgtgttt caaatcgcag gtagcttgac 360
ggaggcgaag agcagtaagc ctgacagcat ctgcgatcgt gttcaggtgc tttgctgcgg 420
caccgcctga acggcggctt cggaaagtgc tgccacgcag catgaaacga ccccgaccgg 480
cggctatggg ccgggtgcgc tatcttgccg cgctcggcca cctagcagcg gaagtccggt 540
tcctgcgcat cgccgccctc cgagcgcagg gcggcgaaag accgcagaca gcccctagct 600
gccggtcgta cgggacgcgt caagacgcta ggcgccttcg cagagtgcgg aaagcggtat 660
aagaggttgc ggcatcgcag ccgcaggcgg gacgtgcgtt tgtggcacaa ggcagccagc 720
ctcgttgtct atttgttgcg cttggggcga cgacaatctt g 761
<210> 2
<211> 756
<212> DNA
<213> rshI右臂(Rhodobacter sphaeroides)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(756)
<400> 2
tgtcttcggc tcggcggaag tgacggccgc ctgggcttct gccgaaacgt tctcgggttc 60
aggatcagcc atttaccaca cgtaattgga cacgcgccgc ttcgatctcg tgctgcttgc 120
gcttctttgc gccgctcttt cggtcgcgcc gcgaggacgg cgctgccact ccgaagtgct 180
ccgccgcttc cgacatctcc atgtagagca acgagggctc tcccaaatcg attgcacgcg 240
caggccgctc cggggcgacg cccagtgctc ggactatctc ggaggcgacc gcgcgggcga 300
ggggcggcgg cacggagttg ccgacttgcc ttccgccatg ccacttagtg gcgtggagcc 360
tgaaccaatc ggggaacccg tgaagccgcg ccatctcgcg cacggtgatg cagcggttgt 420
actcgtagtg gatcggccga ggactggtga aggccccccg ggcaccgtca gtgcctgccc 480
tcagagtgtt gcaaaggccg cccggtgcca gcttgtagaa gcggctgatc ggctcaaccg 540
ccccttgcgg ggtctcttgg aagcgccggc gagaaatttc cgaatgggcc gtgcgcgcgc 600
tggatgtcat ccatgtcggc gtccagttcc ggggatagcc gtaatgccag gcatcgttgt 660
tcaggcagcg caattcggcc gcgtaggtag acggctcgcc catggcagag gtccgaacag 720
cgtcgctctc cacgagcgag gcgaaccgat ctgcat 756
<210> 3
<211> 1517
<212> DNA
<213> rshI左右臂(Rhodobacter sphaeroides)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1517)
<400> 3
gccattgagt tgaccggtga gcgctaggtg gatcgcttcg aggagggtgg attttccaca 60
ctcgttgttt ccgacaatga cgttcagttt gtcattgaag gtgacgtttg cctgcttaag 120
gcagcggtag tttctgataa ccgcgcgttg gatgaacaaa ctcgtgactc ccttcgccgt 180
gtacactgct atgaggcaca gcttaagcaa agtctacaag ggcgggtgcg gctcaatcaa 240
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tcctgcgcat cgccgccctc cgagcgcagg gcggcgaaag accgcagaca gcccctagct 600
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aagaggttgc ggcatcgcag ccgcaggcgg gacgtgcgtt tgtggcacaa ggcagccagc 720
ctcgttgtct atttgttgcg cttggggcga cgacaatctt gtgtcttcgg ctcggcggaa 780
gtgacggccg cctgggcttc tgccgaaacg ttctcgggtt caggatcagc catttaccac 840
acgtaattgg acacgcgccg cttcgatctc gtgctgcttg cgcttctttg cgccgctctt 900
tcggtcgcgc cgcgaggacg gcgctgccac tccgaagtgc tccgccgctt ccgacatctc 960
catgtagagc aacgagggct ctcccaaatc gattgcacgc gcaggccgct ccggggcgac 1020
gcccagtgct cggactatct cggaggcgac cgcgcgggcg aggggcggcg gcacggagtt 1080
gccgacttgc cttccgccat gccacttagt ggcgtggagc ctgaaccaat cggggaaccc 1140
gtgaagccgc gccatctcgc gcacggtgat gcagcggttg tactcgtagt ggatcggccg 1200
aggactggtg aaggcccccc gggcaccgtc agtgcctgcc ctcagagtgt tgcaaaggcc 1260
gcccggtgcc agcttgtaga agcggctgat cggctcaacc gccccttgcg gggtctcttg 1320
gaagcgccgg cgagaaattt ccgaatgggc cgtgcgcgcg ctggatgtca tccatgtcgg 1380
cgtccagttc cggggatagc cgtaatgcca ggcatcgttg ttcaggcagc gcaattcggc 1440
cgcgtaggta gacggctcgc ccatggcaga ggtccgaaca gcgtcgctct ccacgagcga 1500
ggcgaaccga tctgcat 1517
<210> 4
<211> 766
<212> DNA
<213> sdhB左臂(Rhodobacter sphaeroides)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(766)
<400> 4
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<210> 6
<211> 1528
<212> DNA
<213> sdhB左右臂(Rhodobacter sphaeroides)
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<400> 6
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<220>
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ctgaacccgg ccaaggccat cgccgaaatc aaaaagatga tggtcgaacg cgtcatctga 780
Claims (10)
1.一种类球红细菌重组菌，其特征在于：为类球红细菌重组菌S324，是由类球红细菌基因组中敲除限制性核酸内切酶编码基因rshI而得到的。
2.根据权利要求1所述的类球红细菌重组菌S324，其特征在于：所述限制性核酸内切酶编码基因rshI具有序列表<400>7所示序列。
3.根据权利要求1所述的类球红细菌重组菌S324，其特征在于：通过连接有rshI-LR片段的敲除载体pLH339敲除rshI基因获得，所述载体中rshI左右臂长度为1517bp，所述基因具有序列表<400>3所示序列，其中，
类球红细菌中rshI左臂761bp基因rshI-L，所述基因具有序列表<400>1所示序列；类球红细菌中rshI右臂756bp基因rshI-R，所述基因具有序列表<400>2所示序列。
4.权利要求1所述类球红细菌重组菌S324的构建方法，其特征在于：将敲除载体pLH339化转入大肠杆菌S17-1，特异性无缝敲除限制性核酸内切酶编码基因rshI，获得的限制性核酸内切酶基因功能缺失的工程菌株。
5.权利要求1所述类球红细菌重组菌S324在提高类球红细菌基因无痕敲除过程中筛选效率方面的应用。
6.一种类球红细菌重组菌，其特征在于：为类球红细菌重组菌S372，是在权利要求1所述类球红细菌重组菌S324的基础上敲除琥珀酸脱氢酶编码基因sdhB而得到的。
7.根据权利要求6所述的类球红细菌重组菌S372，其特征在于：所述琥珀酸脱氢酶编码基因sdhB具有序列表<400>8所示序列。
8.根据权利要求6所述的类球红细菌重组菌S372，其特征在于：通过连接有sdhB-LR片段的敲除载体pLH357敲除sdhB基因获得，所述载体中sdhB左右臂长度为1528bp，所述基因具有序列表<400>6所示序列，其中，
类球红细菌中sdhB左臂766bp基因sdhB-L，所述基因具有序列表<400>4所示序列；类球红细菌中sdhB右臂762bp基因sdhB-R，所述基因具有序列表<400>5所示序列。
9.权利要求6所述类球红细菌重组菌S372的构建方法，其特征在于：将敲除载体pLH357化转入大肠杆菌S17-1，特异性无缝敲除琥珀酸脱氢酶编码基因sdhB，获得的琥珀酸脱氢酶基因功能缺失的工程菌株。
10.权利要求6所述类球红细菌重组菌S372在提高辅酶Q10合成量方面的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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