CN115181753A - 类球红细菌接合转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种类红球细菌接合转化方法，其包括以下步骤：(1)培养基因缺陷型大肠杆菌SD1149‑001；(2)转化靶标质粒进入所述基因缺陷型大肠杆菌SD1149‑001，得到含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149‑001；(3)培养通过步骤(2)得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149‑001至OD600为0.3～0.7；(4)培养类球红细菌至OD660为1.8～2.0；(5)将步骤(3)得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149‑001和步骤(4)得到的类球红细菌混合，进一步培养；(6)得到含有靶标质粒的类红球细菌。使用本发明的接合转化方法，避免了再次涂布分离大肠杆菌和类球红细菌，并且提高了接合转化效率，使得获得的类球红细菌单克隆菌株相比于其他条件提高至少3倍。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地，涉及一种类红球菌接合转化方法。
背景技术
类球红细菌是一种工业相关宿主，用于生产各种分子，如氢、营养食品和商业化学品。然而，它对质粒的化学转化效率较低，尤其是那些大于10kb的质粒。因此，接合是一种有吸引力的替代方法，它依赖于跨细菌物种通过形成桥来转移遗传物质的能力。通常，使用包含整合在染色体中的必要转移基因(例如S17-1)的“供体”大肠杆菌菌株进行接合。但是，接合转化仍然面临着一些问题，例如，需要将大肠杆菌以及类球红细菌混合后涂布至硝化纤维薄膜，并在经过培养之后重新收集菌体。由于此步骤在人工操作的环境下只能一次处理一个样品，对实验通量(单位时间内可进行的实验样本数)有实质限制。而类球红细菌作为一种工业相关发酵菌种，需要能够批量地进行接合。与此同时，接合转化仍然存在转化效率较低的问题。
因此，目前需求一种能够提高类球红细菌接合转化方法的通量，以及接合转化效率的方法，使之能够运用于工业化生产。
发明内容
为了解决上述问题，第一方面，本发明提供了一种类红球细菌接合转化方法，其包括以下步骤：
(1)培养基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001；
(2)转化靶标质粒进入所述基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001，得到含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001；
(3)培养通过步骤(2)得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001至OD600为0.3～0.7；
(4)培养类球红细菌至OD660为1.8～2.0；
(5)将步骤(3)得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001和步骤(4)得到的类球红细菌混合，进一步培养；
(6)得到含有靶标质粒的类红球细菌。
使用本发明的接合转化方法，提高了接合转化效率，使得获得类球红细菌单克隆菌株相比于其他条件提高至少3倍。
如本文所述“基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001”为ATCC编号为47005的大肠杆菌进行hemA基因敲除的改造而获得。
所述基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001是hemA基因敲除的大肠杆菌。
在一些具体的实施方案中，步骤(1)包括制备基因缺陷型大肠杆菌SD1149-00的感受态细胞。
在一些具有的实施方案中，将制备好的感受态细胞分装至单管或者8连管或者24孔板或者96孔板或者384孔板中。
在一些具体的实施方案中，将制备好的感受态细胞分装至96孔板中。
在一些具体的实施方案中，步骤(3)包括将通过步骤(2)得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001接种至单管或者8连管或者24孔板或者96孔板或者384孔板中进行培养。进一步地，进行隔夜培养。
在一些具体的实施方案中，步骤(3)包括将通过步骤(2)得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001接种至96孔板中进行培养。进一步地，进行隔夜培养。
在一些具体的实施方案中，步骤(3)中，在37℃下培养通过步骤(2)得到的经转化的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001至OD600为0.3～0.7。
在一些具体的实施方案中，步骤(4)包括：避光培养类球红细菌二至三天；再接种至培养基进行隔夜培养；然后于光照条件下培养类球红细菌至OD660为1.8～2.0。
进一步地，避光培养类球红细菌是在固体培养基中进行。
进一步地，接种至培养基进行隔夜培养是在液体培养基中进行。
所述进一步培养包括于光照环境下放置30℃培养24小时，然后再于32℃，避光条件下培养五天。
在一些具体的实施方案中，步骤(5)中，将步骤(3)得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001和步骤(4)得到的类球红细菌混合是在单管或者8连管或者24孔板或者96孔板或者384孔板中进行。
在一些具体的实施方案中，步骤(5)中，将步骤(3)得到的经转化的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001和步骤(4)得到的类球红细菌混合是在96孔板中进行。
在一些具体的实施方案中，将进行混合所得混合液涂布至不含五胺基酮戊酸的平板上，无需再次涂布分离大肠杆菌和类球红细菌。
在一些具体的实施方案中，在单管或者8连管或者24孔板或者96孔板或者384孔板中进行混合而无需使用硝化纤维薄膜。
使用单管或者8连管或者24孔板或者96孔板或者384孔板避免了混合后涂布至硝化纤维薄膜，并在经过培养之后重新收集菌体，消除了通量的限制。
第二方面，本发明提供了一种按照如上述方法制备的类红球细菌。
第三方面，本发明提了如上所述的类红球细菌用于发酵工程的用途。
使用本发明的接合转化方法，提高了接合转化效率，使得获得的类球红细菌单克隆菌株相比于其他条件提高至少3倍。另外，通过在培养中使用单管或者8连管或者24孔板或者96孔板或者384孔板，无需再次涂布分离大肠杆菌和类球红细菌并避免了混合后涂布至硝化纤维薄膜，并在经过培养之后重新收集菌体，消除了通量的限制。
附图说明
图1为14个工业用类球红细菌的接合转化(横坐标稀释倍数，纵坐标工业用菌种)。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001感受态的制备
1.将基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001(hemA基因敲除)在含有五胺基酮戊酸的LB培养基平板上进行隔夜培养；
2.挑选单克隆至4ml含有五胺基酮戊酸的LB液体培养基进行培养；
3.将菌液培养至吸光度OD600为0.2-0.4；
4.在低温(4℃)下离心五分钟，除去上清液；
5.利用氯化钙清洗细胞，而后放置冰上30分钟；
6.在低温(4℃)下离心五分钟，除去上清液；
7.利用氯化钙加甘油的溶液清洗细胞，而后放置冰上60分钟；
8.将上述制备的SD1149-001感受态细胞分装至96孔板，每孔含100μL。
实施例2、靶标质粒转化感受态细胞并培养
1、加5μL目标质粒(>500ng)至100μL的感受态细胞；
2、将上述感受态细胞以42℃热激，置于冰上两分钟；
3、在低温(4℃)下离心五分钟，除去上清液；
4、将细胞重新悬浮在50μL的LB液体培养基；
5、取4μL悬浮菌液，涂布至含有五胺基酮戊酸以及适当抗生素的LB培养基平板上，进行隔夜培养；
6、将含有五胺基酮戊酸以及适当抗生素的SOB液体培养基装至96孔板中，每孔500μL，取适当大肠杆菌并接种至其中，进行隔夜培养；
7、将含有五胺基酮戊酸以及适当抗生素的SOB液体培养基装至96孔板中，每孔450μL，取50μL经隔夜培养的大肠杆菌菌液进行接种。于37℃培养至吸光度OD600为0.3～0.7。
实施例3、类球红细菌的培养以及接合转化培养
1、将类球红细菌于固体培养基上避光培养三天；
2、将已在固体培养基上避光培养三天的类球红细菌接种至50ml液体培养基。并于光照的环境下隔夜培养；
3、取10ml经隔夜培养的类球红细菌，接种至50ml液体培养基中，于光照条件下在30℃培养至吸光度OD660为1.8～2.0；
4、将实施例2中培养至目标吸光度的大肠杆菌于室温下离心五分钟，除去上清液，重新将大肠杆菌细胞悬浮在500μL LB液态培养基中；5、重复上述离心步骤，重新将大肠杆菌细胞悬浮在适量LB液态培养基中，使其吸光度OD600＝1.0
6、取30ml培养至目标吸光度的类球红细菌于室温下离心两分钟，除去上清液，重新将类球红细菌细胞悬浮在2ml LB液态培养基中；
7、取一透光的96孔板，将100μL步骤5的菌液以及100μL步骤6的菌液混合；
8、将96孔板于室温下离心5分钟，于光照环境下放置30℃培养24小时；
9、将菌液经过适当稀释后涂布至固体培养基上，于32℃，避光条件下培养五天，得到含有靶标质粒的类红球细菌。
实施例4、质粒AP-250的类红球细菌的获得
用上述方法转化质粒AP-250
使用如实施例1～3所述的方法，制备靶标质粒的类红球细菌。实验结果(在不同的吸光度条件下进行转化所得的克隆数目)如表1所示，在使用相同涂布体积10μL的前提下，经由优化大肠杆菌以及工业用类球红细菌吸光度，得到最高1000颗单克隆菌株。经过优化后的条件(类球红细菌吸光度OD660＝1.94；大肠杆菌吸光度OD600＝0.42和0.62)与其他条件相比，克隆数目提高1.25至26.3倍。
表1
实施例5、质粒pBOTA00829的类红球细菌的获得
使用如实施例1～3所述的方法，制备靶标质粒的类红球细菌。实验结果(在不同的吸光度条件下进行转化所得的克隆数目)如表2所示，在使用相同涂布体积10μL的前提下，经由优化大肠杆菌以及工业用类球红细菌吸光度，得到最高1000颗单克隆菌株。经过优化后的条件(类球红细菌吸光度OD660＝1.94；大肠杆菌吸光度OD600＝0.36和0.54)与其他条件相比，克隆数目提高2至36.4倍。
表2
实施例6、14个工业用类球红细菌接合转化
使用如实施例1～3所述的方法，同时进行14个工业用类球红细菌接合转化(菌株SD4801、SD4802、SD4803、SD4804、SD4805、SD4806、SD4807、SD4808、SD4809、SD5017、SD5018、SD5019、SD5020、SD5021)、并成功获得单克隆菌株，如图1所示。
Claims (10)
1.一种类红球细菌接合转化方法，其包括以下步骤：
(1)培养基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001；
(2)转化靶标质粒进入所述基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001，得到含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001；
(3)培养通过步骤(2)得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001至OD600为0.3～0.7；
(4)培养类球红细菌至OD660为1.8～2.0；
(5)将步骤(3)得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001和步骤(4)得到的类球红细菌混合，进一步培养；
(6)得到含有靶标质粒的类红球细菌。
2.根据权利要求1所述的接合转化方法，其中，所述步骤(1)中包括制备基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001的感受态细胞。
3.根据权利要求2所述的接合转化方法，其中，将制备好的感受态细胞分装至单管、8连管、24孔板、96孔板或者384孔板中。
4.根据权利要求1所述的接合转化方法，其中，所述步骤(3)包括将通过步骤(2)得到的经转化的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001接种至单管、8连管、24孔板、96孔板或者384孔板中进行培养。
5.根据权利要求1所述的接合转化方法，其中，所述步骤(3)中培养通过步骤(2)得到的经转化的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001至OD600为0.42。
6.根据权利要求5所述的接合转化方法，其中，所述步骤(4)中培养类球红细菌至OD660为1.94。
7.根据权利要求1所述的接合转化方法，其中，所述步骤(5)中将步骤(3)得到的经转化的基因缺陷型大肠杆菌SD1149-001和步骤(4)得到的类球红细菌在单管、8连管、24孔板、96孔板或者384孔板中进行混合。
8.根据权利要求7所述的接合转化方法，其中，将进行混合所得的混合液涂布至不含五胺基酮戊酸的平板上，无需再次涂布分离大肠杆菌和类球红细菌。
9.根据权利要求7所述的接合转化方法，其中，所述步骤(5)中无需使用硝化纤维薄膜。
10.一种通过权利要求1～9所述的接合转化方法制备的类球红细菌。
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