CN105002129B - 高接合转移率的希瓦氏菌wp3菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高接合转移率希瓦氏菌WP3菌株及其构建方法和应用；所述构建方法包括以下步骤：对深海细菌希瓦氏菌WP3全基因组限制‑修饰系统相关基因进行预测；对预测到的三个限制酶基因分别设计基因敲除引物；以WP3ΔSW1为出发菌株，依次敲除所述的三个限制酶基因，相应获得限制酶基因缺失菌株，所述限制酶基因缺失菌株即为高结合转移率的菌株；相比于基因工程出发菌株WP3ΔSW1，本发明所得菌株结合转移效率明显提高，获得的单交换克隆子阳性率高，筛选单交换克隆子的工作量明显减少；在高结合转移率的菌株的基础上，通过同源重组至少可以一次性删除41kb的基因组DNA片段，有利于进一步的基因组改造。
Description
技术领域
本发明涉及一种高接合转移率希瓦氏菌WP3菌株及其构建方法和应用，具体是提升一株深海来源的希瓦氏菌Shewanella piezotolerans WP3的结合转移效率的方法，最终获得一株高结合转移效率的WP3菌株并在此基础上进行基因组大片段的删除。
背景技术
Shewanella属细菌广泛存在于自然环境，并且是深海中最为丰富的γ-变形菌，其最重要的特征是它们能以利用多种底物作碳源，具有十分出众的厌氧呼吸的能力，同时还具备低温下生长的能力，因此，Shewanella属细菌在生物修复、微生物燃料电池开发等方面具有潜在的应用价值。
目前，Shewanella菌的研究主要集中S.oneidensis MR-1和S.piezotolerans WP3这两株菌上，S.oneidensis MR-1分离自纽约Lake Oneida的沉积物，这株菌在前期已经建立了稳定的遗传操作系统，通过电转化或结合转移均能有效地实现该菌的遗传操作。S.piezotolerans WP3分离自自西太平洋深海沉积物(1914m)，前期尝试电转化对该菌进行遗传操作，但结果并不理想，之后虽然通过结合转移的方法获得了一系列基因敲除突变株，但是由于筛选单交换克隆子这一步骤的效率很低，导致基因敲除的难度较大，从而限制了该菌的遗传学及适应性的研究。因此，对WP3进行基因工程改造，提升其结合转移的效率，具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一株高接合转移深海细菌希瓦氏菌WP3菌株及其构建方法和应用，目的在于通过基因工程的方法获得一株高结合转移效率的WP3菌株，并在该菌株的基础上尝试基因组大片段的删除。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一株高结合转移效率的希瓦氏菌WP3菌株，所述菌株通过包括如下步骤的方法制得：以WP3ΔSW1为出发菌株，敲除所限制酶基因，相应获得高结合转移率的菌株。
优选地，所述菌株为Δsw1Δswp840、Δsw1Δswp840Δswp2190(WP3-3Δ)或Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)。
更优选地，所述菌株为Δsw1Δswp840Δswp2190(WP3-3Δ)或Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)。
特别优选地，所述菌株为Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)。
第二方面，本发明提供一种所述高结合转移效率的希瓦氏菌WP3菌株的构建方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一，对深海细菌希瓦氏菌WP3全基因组限制-修饰系统(R-M system)相关基因进行预测；
步骤二，对预测到的三个限制酶基因分别设计基因敲除引物；
步骤三，以WP3ΔSW1为出发菌株，依次敲除所述的三个限制酶基因，相应获得限制酶基因缺失菌株Δsw1Δswp840(1个限制酶基因缺失的菌株)、Δsw1Δswp840Δswp2190(WP3-3Δ)(2个限制酶基因缺失的菌株)、Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)(3个限制酶基因缺失的菌株)，所述限制酶基因缺失的菌株即为高结合转移率的菌株。
优选地，步骤二中，所述三个限制酶基因分别为swp9基因、swp840基因、swp2190基因。
优选地，步骤二中，所述基因敲除引物具体为：
所述swp0009基因的敲除引物：上游引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，下游引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
所述swp840基因的敲除引物对：上游引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
所述swp2190基因的敲除引物对：上游引物如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，下游引物如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。
优选地，步骤三中，所述敲除具体包括如下步骤：
(1)PCR扩增所述限制酶基因上下游同源臂，通过融合PCR获得大片段；
(2)连接所述大片段与自杀质粒得重组质粒，将所述重组质粒转化到供体菌E.coli WM3064；
(3)供体菌E.coli WM3064与受体菌WP3ΔSW1进行细菌结合转移实验；
(4)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、鉴定，即得1个限制酶基因缺失的菌株；
(5)以所述1个限制酶基因缺失的菌株为受体菌，重复步骤(1)至(4)，依次进行第2、3个限制酶基因的敲出，即可获得2个限制酶基因缺失的菌株、2个限制酶基因缺失的菌株。
优选地，步骤(2)中，所述自杀质粒为pRE112。
优选地，步骤(4)中，所述筛选具体指通过含氯霉素的抗性平板筛选。
优选地，步骤(4)中，所述鉴定具体指设计如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物进行PCR鉴定。
优选地，步骤三中，所述高结合转移率的菌株为Δsw1Δswp840Δswp2190(WP3-3Δ)(2个限制酶基因缺失的菌株)、Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)(3个限制酶基因缺失的菌株)。
更优选地，步骤三中，所述高结合转移率的菌株为Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)。
本发明按照上述操作流程分别敲除swp840、swp2190、swp9这3个基因，获得的突变株分别为Δsw1Δswp840、Δsw1Δswp840Δswp2190(WP3-3Δ)、Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)，且WP3-3Δ和WP3-4Δ遗传背景的鉴定结果符合预期(图1和图2)。
第三方面，本发明提供一种所述高结合转移效率的希瓦氏菌WP3菌株作为基因工程菌在基因组大片段删除方面的应用，特别是Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WT-4Δ)作为基因工程菌在基因组大片段删除方面的应用。
本发明所涉质粒、出发菌株已公开于该文献中：Chen,Y.,Wang,F.,Xu,J.,Mehmood,M.A.,and Xiao,X.(2011)Physiological and evolutionary studies of NAPsystems in Shewanella piezotolerans WP3.The ISME journal5:843-855。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、相比于基因工程出发菌株WP3ΔSW1，WT-4Δ的结合转移效率明显提高(104)，获得的单交换克隆子阳性率高，筛选单交换克隆子的工作量明显减少；
2、在WT-4Δ菌株的基础上，通过同源重组至少可以一次性删除41kb的基因组DNA片段，有利于进一步的基因组改造。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为限制酶缺失突变株遗传背景的PCR鉴定；
其中M为1 kb gene ruler marker；1、4、7、10、13为swp840基因的鉴定；2、5、8、11、14为swp2190基因的鉴定；3、6、9、12、15为swp2190基因的鉴定，WP3-WT与ΔSW1作阴性对照，3个基因对应的基因敲除质粒作阳性对照；
图2为限制酶缺失突变株中氯霉素抗性基因的PCR鉴定；
其中，M为1kb gene ruler marker，1和2为WP3-WT和WP3ΔSW1基因组，作DNA阴性对照，3为WT-3Δ基因组DNA，4为WT-4Δ基因组DNA，5为基因敲除质粒，作阳性对照；
图3为基因组大片段(swp5082-swp5126)敲除突变株的PCR鉴定；
其中，a:基因组大片段(swp5082-swp5126)敲除引物的鉴定，M为1kb gene rulermarker，1-4为双交换突变株，5为WP3-WT基因组DNA作阴性对照，6为基因组大片段敲除质粒作阳性对照；
b:氯霉素抗性基因(cat)引物的鉴定，M为1kb gene ruler marker，7-10为双交换突变株，11为WP3-WT基因组DNA作阴性对照，12为基因组大片段敲除质粒作阳性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1，WP3基因组中限制内切酶基因的预测
通过在线的REBASE数据库对Shewanella piezotolerans WP3基因组中的限制-修饰系统(R-M system)进行预测，预测到三个限制性内切酶基因和四个甲基化酶基因(表1)，这三个限制性内切酶基因分别编码两套Type II限制性内切酶和一套Type IV型限制性内切酶。
表1.WP3基因组中预测到的限制修饰系统
实施例2，WP3基因组中三个限制内切酶基因的敲除
甲基化酶通过对基因组DNA进行甲基化修饰，赋予基因组DNA抵御相关限制酶攻击的能力，因此在对WP3进行基因工程改造时，需要始终保持甲基化酶的活性，防止细菌基因组DNA因失去甲基化保护而遭受胞内残余限制酶消化的风险。在实验中，我们仅针对WP3的三个限制酶基因设计了相应的基因敲除引物(表2)。
通过PCR扩增分别获得三个限制酶基因的上下游侧翼序列，以swp840基因敲除载体的构建为例，利用融合PCR将swp840上下游侧翼序列融合成大片段DNA，大片段DNA经相应的限制酶处理后，通过T4DNA连接酶整合到自杀质粒pRE112相应的位点，获得的重组质粒随后转化至供体菌E.coli WM3064，PCR筛选阳性克隆子(Chen et al.,2011)。通过细菌基因的结合转移将WM3064菌株中的重组质粒转入WP3，由于pRE112质粒不能在WP3中自我复制，仅当该质粒通过同源重组整合到WP3基因组上后才能与基因组一起复制。而质粒的整合将赋予WP3对氯霉素的抗性，通过含氯霉素的抗性平板筛选，可以获得这些单交换克隆子，随后经松弛培养过夜后，涂布蔗糖板进行双交换克隆子的筛选，PCR鉴定不含氯霉素抗性基因且目的基因成功敲除的克隆子。按照这一流程分别敲除swp840、swp2190、swp9这3个基因，获得的突变株分别为Δsw1Δswp840、Δsw1Δswp840Δswp2190(WP3-3Δ)、Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)，且WP3-3Δ和WP3-4Δ遗传背景的鉴定结果符合预期(图1和图2)。
实施效果
对获得的这四个突变株分别进行结合转移效率统计，结果表明(表3)，与出发菌株WP3ΔSW1相比，WT-3Δ和WT-4Δ两个菌株的结合转移效率明显提高(104)，随机挑取氯霉素筛选板上的单交换克隆子进行菌落PCR鉴定，阳性率较高，说明自杀质粒成功整合到WP3基因组上。
在WT-4Δ菌株的基础上尝试进行基因组大片段的删除，选取基因组中一段长度为41kb的序列作为删除对象，采用如上所述的方法，首先获得了单交换克隆子，之后进行松弛培养及蔗糖板筛选，获得了一系列双交换克隆子，氯霉素抗性基因引物及目的基因特异引物(表2)的PCR鉴定结果表明，部分克隆子中的41kb序列被成功删除(图3)。
表2.基因敲除与氯霉素抗性基因鉴定相关引物
表3.限制酶敲除突变株的单交换克隆子统计
| 受体菌名称 | 受体菌量 | 供体菌量 | 结合子数目 | 阳性率(％) |
| Δsw1Δswp840 | 8.21×10<sup>7</sup> | 8.64×10<sup>8</sup> | 4 | 75(3/4) |
| Δsw1Δswp840Δswp9 | 9.04×10<sup>7</sup> | 8.64×10<sup>8</sup> | 0 | 0 |
| Δsw1Δswp840Δswp2190(WT-3Δ) | 6.45×10<sup>7</sup> | 8.64×10<sup>8</sup> | (2.67±0.46)×10<sup>4</sup> | 100(40/40) |
| Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WT-4Δ) | 6.45×10<sup>7</sup> | 8.64×10<sup>8</sup> | (2.51±0.30)×10<sup>4</sup> | 98(51/52) |
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (6)
1.一种高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans)WP3菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
以WP3ΔSW1为出发菌株，敲除限制内切酶基因，相应获得高接合转移率的菌株；
所述方法具体包括以下步骤：
步骤一，对深海细菌希瓦氏菌WP3全基因组限制-修饰系统相关基因进行预测；
步骤二，对预测到的三个限制内切酶基因分别设计基因敲除引物；
步骤三，以WP3ΔSW1为出发菌株，依次敲除所述的三个限制内切酶基因，相应获得限制内切酶基因缺失菌株Δsw1Δswp840、Δsw1Δswp840Δswp2190、Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9，所述限制内切酶基因缺失菌株即为高接合转移率的菌株；
其中，步骤二中，所述三个限制内切酶基因分别为swp0009基因、swp840基因、swp2190基因；
步骤二中，基因敲除引物中所述swp0009基因的敲除引物为：上游引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，下游引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
步骤二中，基因敲除引物中所述swp840基因的敲除引物为：上游引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
步骤二中，基因敲除中所述swp2190基因的敲除引物为：上游引物如SEQ ID No.9和SEQID No.10所示，下游引物如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。
2.根据权利要求1所述的高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)WP3菌株的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述敲除具体包括如下步骤：
(1)PCR扩增所述限制内切酶基因上下游同源臂，通过融合PCR获得大片段；
(2)连接所述大片段与自杀质粒得重组质粒，将所述重组质粒转化到供体菌E.coliWM3064；
(3)供体菌E.coli WM3064与受体菌WP3ΔSW1进行细菌接合转移实验；
(4)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、鉴定，即得1个限制内切酶基因缺失的菌株；
(5)以所述1个限制内切酶基因缺失的菌株为受体菌，重复步骤(1)至(4)，依次进行第2、3个限制内切酶基因的敲除，即可获得2个限制内切酶基因缺失的菌株、3个限制内切酶基因缺失的菌株。
3.根据权利要求2所述的高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)WP3菌株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述自杀质粒为pRE112。
4.根据权利要求2所述的高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)WP3菌株的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述筛选具体指通过含氯霉素的抗性平板筛选。
5.根据权利要求2所述的高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)WP3菌株的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述鉴定具体指设计如SEQID No.13和SEQ ID No.14所示的引物进行PCR鉴定。
6.一种如权利要求1所述的构建方法获得的高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans)WP3菌株作为基因工程菌在基因组大片段删除方面的应用。
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