CN106497955A - 一种利于构建长片段dna的穿梭载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利于构建长片段DNA的穿梭载体其制备方法和应用，所述的穿梭载体能在酿酒酵母和大肠杆菌中穿梭，其拥有酵母复制起始位点oriV和大肠杆菌复制起始位点ori2，且是低拷贝的复制起始位点，在酵母和大肠杆菌中都可以稳定复制，在酵母中的筛选标签是HIS3，在大肠杆菌中的筛选标签是氯霉素抗性。本发明所构建的酵母‑大肠杆菌穿梭载体（命名为pSynoYAC0）能够在酵母系统中组装成功，但是酵母中抽提的质粒质量很差，而大肠杆菌中抽提的质粒高，能够满足测序、酶切等进一步的实验需要。该载体在大肠杆菌中也能够复制，且是单拷贝，其复制过程中能够稳定存在，可获得符合要求的载体。

Description

一种利于构建长片段DNA的穿梭载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种利于构建长片段DNA的穿梭载体及其制备方法和应用。
背景技术
随着基础合成生物学的发展，对生命科学领域的研究需要在体外对复杂通路综合分析，构建新生物元件，重新设计自然生物系统。而现阶段体外组装技术主要有Gateway，In-fusion，Cold-fusion，T4 DNA polymerase-based Ligase Independent Cloning(LIC)，Golden Gate，Gibson Assembly等，目前使用最多的是Gibson Assembly技术，其适用范围广，操作简单、有效，强健、快速，一次能将4段目的片段组装到目标载体，与其他体外组装技术相比，具有更大的优势。而然，该技术最多能完成10kb左右的构建。而随着合成合成生物学的发展，需要对pathway、基因簇甚至于基因组等进行研究，这显然不能满足对其研究的需求。
但是，质粒和噬菌体所能携带的外源DNA片段的大小是很有限的。一般来说，Cosmid质粒所能携带的DNA片段不超过45kb。而现在发现的一些大基因，如人类的FaetorVlll基因(180kb)和Dystrophin基因(1800kb)都已远远超过上述载体的克隆容量。这些容量较小的克隆载体，在克隆真核基因组染色体时，遇到了巨大的挑战。
Hinnen等在上世纪70年代末就发现报道，酵母自身具有连接作用，能将片段连接起来。Gibson等在2008报道通过酵母体内组装技术完成592kb的质粒，Clyde A.HutchisonIII等经过近30年研究，成功研究出衣原体的最小基因组，运用酵母体内组织技术，组装完成并使其获得活性。
由于质粒达到一定量时，在复制拷贝过程中容易缺失、降解，导致无法将构建以质粒的形式存在。
酵母体内组装技术是基于重组臂序列，文献报道能实现25个片段的一次性组装到载体，将overlaps设计为80bp，获得全长526kb的质粒构建。用常规的基于重组的方法，如Gibson重组、In-Phusion重组等都无法进行构建。而酵母系统中，组装的片段都较大，需要低拷贝的质粒以保证其稳定性，但是由于酵母有较厚的细胞壁，所提质粒不能满足测序要求。因此，需要开发新的质粒来满足其应用需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种单拷贝、能够稳定复制且能够受阿拉伯糖诱导，提高拷贝数，从而获得更高浓度的利于构建长片段DNA的穿梭载体及其制备方法和应用。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种利于构建长片段DNA的穿梭载体，所述的穿梭载体能在酿酒酵母和大肠杆菌中穿梭，其拥有酵母复制起始位点oriV和大肠杆菌复制起始位点ori2，且是低拷贝的复制起始位点，在酵母和大肠杆菌中都可以稳定复制，在酵母中的筛选标签是HIS3，在大肠杆菌中的筛选标签是氯霉素抗性。
具体地，所述的穿梭载体的图谱见图1。
具体地，所述的穿梭载体的序列见SEQ ID NO.1，其中，n任选为a，c，g，or t。
具体地，所述的穿梭载体还包括tonB terminator、T7Te terminator、T7terminator、cat promoter、repE、incC、sopA、sopB、sopC、AmpR promoter、CEN/ARS、HIS3promoter、cos和loxP。
具体地，所述的穿梭载体为环状质粒。
具体地，所述的穿梭载体能够受阿拉伯糖诱导
本发明的另一个目的是提供一种所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体的制备方法，所述的穿梭载体通过基因合成方法合成多个片段，然后将所述的多个片段进行体外重组后，经自身环化制得。
优选地，每个所述的片段的长度为0.3～6kb，更优选为0.5～5kb。
具体地，通过基因合成方法合成所述的片段的具体方法为：
步骤(1)、将每条20pM/ul的引物各加2～10ul，混合后用100ul ddH2O稀释，第一轮PCR反应体系为：
第一轮PCR反应程序为：
步骤(2)、以第一轮PCR反应液为模板，进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增的反应体系为：
第二轮PCR扩增的反应程序为：
步骤(3)、采用琼脂糖凝胶电泳回收第二轮PCR扩增的产物，将PCR产物平连PUC57-Amp上，酶切位点是ECORV，挑选单克隆进行菌检测序，获得正确克隆后，再用首尾引物PCR扩增条带即得所述的片段。
上述，加ddH2O至50微升是指其他原料按用量添加后，加入ddH2O至总体积为50微升。扩增程序中的多个循环的循环次数按照实际需要进行选择。
具体地，所述的体外重组的具体方法为：按每个所述的片段100ng的用量将所述的多个片段与5～15ul的Gibson预混液混合，然后用ddH2O加至反应体系总体积20～30ul，然后在42～58℃反应0.5～3h，然后转入Epi300感受态，冰浴15～50min，38～48℃热激60～100s，冰浴1～5min，然后加500ul LB培养基在35～40℃恢复0.5～3h，涂于氯霉素抗性的LB固体培养基，过夜培养，挑选单克隆，选择阳性克隆送测即得所述的穿梭载体。
本发明中，Gibson预混液为购自NEB公司的货号：#E2611S的产品。
本发明的第三个目的是提供一种以所述的穿梭载体在酵母体内进行大片段组装的方法，包括如下步骤：
步骤(a)、将所述的穿梭载体进行酶切获得线性化质粒，合成多个片段；
步骤(b)、将所述的线性化质粒、所述的多个片段与异丙醇等体积沉淀，并加入占所述的线性化质粒、所述的多个片段与所述的异丙醇总体积的5％～20％的NaAc，于零下80℃～零下20℃沉淀30～360min，然后在0～40℃下，以12000～14000转/分钟的转速离心8～12min，丢弃上清液，然后经多次洗涤后，在生物安全柜吹8～12min后用水溶解得到混合液；
步骤(c)、将步骤(b)得到的混合液加入酵母电转感受态细胞中，冰上置25～35min，用电转仪电转，用YPD培养基在28～32℃下恢复30-360min；
步骤(d)、将经步骤(c)恢复后的菌液离心收集菌体，将所述的菌体经多次洗涤后用山梨醇混匀，然后在带有筛选的平板上涂匀，在28～32℃的恒温培养箱培养2～3d；
步骤(e)、在经步骤(d)培养后的平板上挑斑抽提质粒，挑选单克隆于his缺陷型培养基，用酵母试剂盒提取质粒，将获得的质粒进行PCR检测；
步骤(f)、将检测到有条带的质粒用Epi300感受态细胞转化到大肠杆菌中，获得单克隆进行菌检，获得阳性条带的菌液。
优选地，步骤(a)中，选择ASC I酶切位点或EcoR Ⅰ酶切位点进行酶切。
优选地，步骤(a)中，所述的线性化质粒和所述的片段之间的重组臂、所述的片段与所述的片段之间的重组臂为30～150bps。
优选地，步骤(b)中，所述的线性化质粒、每个所述的片段、所述的水的体积比为1：0.6～1.5：5～8。
优选地，步骤(b)中，采用质量百分比为60～80％的乙醇水溶液进行洗涤。
优选地，步骤(c)中，电转时用电转仪调整SC2真菌电转程序，用电转杯电转。
优选地，步骤(d)中，采用0.9～1.1moL/L的山梨醇进行洗涤。
由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明所构建的酵母-大肠杆菌穿梭载体(命名为pSynoYAC0)能够在酵母系统中组装成功，但是酵母中抽提的质粒质量很差，而大肠杆菌中抽提的质粒高，能够满足测序、酶切等进一步的实验需要。本发明的穿梭载体在大肠杆菌中也能够复制，且是单拷贝，其复制过程中能够稳定存在，获得符合要求的载体。本发明的穿梭载体为单拷贝、能够稳定复制且能够受阿拉伯糖诱导，提高拷贝数，从而获得更高浓度的质粒。
本发明在酵母平台组装时，能一次性完成多片段的组装和一次组装片段大于10kb以上的片段，且不需要聚合酶、连接酶等酶，更加经济快速，采用能够在酵母和大肠杆菌中穿梭的质粒，在酵母系统组装后，能够穿梭到大肠杆菌中去，获得高质量的质粒，大大减少了工作量，提高工作效率，降低生产成本。
附图说明
图1为质粒的图谱；
图2为实施例2的酵母菌液电泳图；
图3为实施例2的穿梭到大肠杆菌中的电泳图；
图4为实施例3的酵母菌液电泳图；
图5为实施例3的穿梭到大肠杆菌中的电泳图；
图6为实施例3的抽提出的质粒酶切后的电泳图；
图7为实施例3抽提出的质粒的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明中若无特别说明，原料均可市购获得，方法为本领域的常规方法。
实施例1：穿梭载体的制备：
一、将SEQ ID NO.13～16所示的4个片段序列分别采用基因合成方法，经两轮PCR扩增制得，具体为：
步骤(1)、将每条20pM/ul的引物各加5ul，混合后用100ul ddH2O稀释，第一轮PCR反应体系为：
高保真PCR酶 1ul
dNTPs 1ul
5X高保真PCRBuffer 10ul
首引物 1ul
尾引物 1ul
引物Mix 10ul
ddH2O TO 50ul
第一轮PCR反应程序为：
步骤(2)、以第一轮PCR反应液为模板，进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增的反应体系为：
S15酶 1ul
dNTPs 1ul
5X高保真PCRBuffer 10ul
首引物 1ul
尾引物 1ul
引物Mix 1ul
ddH2O TO50ul
第二轮PCR扩增的反应程序为：
其中，第一轮和第二轮PCR扩增中的首尾引物为(SEQ ID NO.17～42)：
步骤(3)、采用琼脂糖凝胶电泳回收第二轮PCR扩增的产物，将PCR产物平连PUC57-Amp上，酶切位点是ECORV，挑选单克隆进行菌检测序，获得正确克隆后，再用首尾引物PCR扩增条带即得所述的片段。
二、将获得的4个片段以1∶1∶1∶1的比例进行体外重组，具体为：其反应体系为：
48℃反应1h，然后转入Epi300感受态，冰浴30min，40℃热激80s，冰浴2min，然后加500ul LB培养基37℃恢复1h，涂于氯霉素抗性的LB固体培养基，过夜培养，挑选单克隆，选择阳性克隆送测，此时，测序获得的克隆就是所要的载体。
本实施例中SEQ ID NO.13序列的后部的GATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAGCAACAAAGCACTAGTATCG为可变序列，SEQ ID NO.14序列的前部的ATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAGCAACAAAGCACTAGTATCGT为可变序列。
即SEQ ID NO.1中的n为GATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAGCAACAAAGCACTAGTATCGT。
实施例2：
(1)、对实施例1制得的载体进行酶切及片段的扩增：酶切位点选择ASCⅠ，片段与载体，片段与片段之间的overlaps在80bps，各片段的序列如SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.11所示。用ASCⅠ酶切载体，PCR扩增片段。
(2)、片段及线性化载体的沉淀
将获得的线性化质粒与片段每个片段各取3ul，异丙醇等体积沉淀并加12％的NaAc，零下25℃沉淀1.5h，13,000转/分钟，室温离心10min，丢弃上清，用70％乙醇500ul洗2次，丢弃上清，在生物安全柜吹10min，用20ul无菌水溶解。
(3)、酵母电转感受态细胞的制备
a.所要制备感受态的酿酒酵母菌液于YPD固体培养基上划线，放入30℃恒温培养箱培养过夜；
b.用无菌的接种环在过夜培养的YPD平板上挑选单克隆，溶液5ml的YPD液体培养基，在30℃摇床，每分钟100～200转，培养过夜；
c.次日取培养过夜的酿酒酵母菌液转接到50ml的YPD液体培养基中，放入30℃摇床，每分钟200转，需保证有足够的空气，将菌液摇至OD600＝0.8～1.0；
d.在室温条件下将第3步获得的菌液以3000×g离心10min，丢弃上清；
e.用无菌ddH2O重悬；
f.在室温条件下将重悬的菌液以3000×g离心10min，丢弃上清；
g.用1M山梨醇重悬；
h.在室温条件下将重悬的菌液以3000×g离心10min，丢弃上清；
i.重复步骤h；
j.用500ul 1M山梨醇重悬菌体，以200ul每支分装。
(4)、电转
将用20ul无菌水溶解的混合物加入步骤(3)制得的酵母电转感受态细胞中，冰上静置30min，用电转仪调整SC2真菌电转程序，用2.0mm电转杯电转，用YPD培养基4ml30℃恢复1h。
(5)、培养
将恢复1h的菌液离心收集菌体，用1M山梨醇洗2次，最后加200ul山梨醇混匀，在带有筛选的平板上涂匀，放入30℃恒温培养箱培养2～3d。
(6)、挑斑抽提质粒
挑选单克隆于his缺陷型培养基，用酵母试剂盒提取质粒，将获得的质粒进行PCR检测，酵母菌液电泳图参见图2。
(7)、穿梭到大肠杆菌
检测到有条带的质粒用Epi300感受态细胞转化穿梭到大肠杆菌中，获得的单克隆进行菌检，获得阳性条带的菌液送测，穿梭到大肠杆菌中的电泳图参见图3。
(8)、测序：进行比对测序结果，测序结果如SEQ ID NO.12所示。
实施例3：
(1)、对实施例1制得的载体进行酶切及片段的扩增：酶切位点选择EcoR Ⅰ，片段与载体，片段与片段之间的overlaps在80bps，各片段的序列如SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.52所示。用EcoR Ⅰ酶切载体，PCR扩增片段。
(2)、片段及线性化载体的沉淀
将获得的线性化质粒与片段每个片段各取3ul，异丙醇等体积沉淀并加十分之一体积的NaAc，20℃沉淀1h，13,000转/分钟，室温，10min，丢弃上清，用70％乙醇500ul洗2次，丢弃上清，在生物安全柜吹10min，用20ul无菌水溶解。
(3)、酵母电转感受态细胞的制备
a.所要制备感受态的酿酒酵母菌液于YPD固体培养基上划线，放入30℃恒温培养箱培养过夜；
b.用无菌的接种环在过夜培养的YPD平板上挑选单克隆，溶液5ml的YPD液体培养基，在30℃摇床，每分钟100～200转，培养过夜；
c.第二天，取培养过夜的酿酒酵母菌液转接到50ml的YPD液体培养基中，放入30℃摇床，每分钟200转，需保证有足够的空气，将菌液摇至OD600＝0.8～1.0；
d.在室温条件下将第3步获得的菌液以3000×g离心10min，丢弃上清；
e.用无菌ddH2O重悬；
f.在室温条件下将重悬的菌液以3000×g离心10min，丢弃上清；
g.用1M山梨醇重悬；
h.在室温条件下将重悬的菌液以3000×g离心10min，丢弃上清；
i.重复步骤h；
j.用500ul 1M山梨醇重悬菌体，以200ul每支分装。
(4)、电转
将用20ul无菌水溶解的混合物加入步骤(3)制得的酵母电转感受态细胞中，冰上静置30min，用电转仪调整SC2真菌电转程序，用2.0mm电转杯电转，用YPD培养基4ml30℃恢复1h。
(5)、培养
将恢复1h的菌液离心收集菌体，用1M山梨醇洗2次，最后加200ul山梨醇混匀，在带有筛选的平板上涂匀，放入30℃恒温培养箱培养2～3d。
(6)、挑斑抽提质粒
挑选单克隆于his缺陷型培养基，用酵母试剂盒提取质粒，将获得的质粒进行PCR检测，酵母菌液电泳图参见图4。
(7)、穿梭到大肠杆菌
检测到有条带的质粒用Epi300感受态细胞转化穿梭到大肠杆菌中，获得得单克隆进行菌检，获得阳性条带的菌液送测，穿梭到大肠杆菌中的电泳图参见图5。
(8)、测序：进行比对测序结果，测序结果如SEQ ID NO.53所示，质粒的图谱参见图7。
对抽提出的质粒采用酶切方案Asc I/Apa I/Mlu I，14,230/8,187/7,350/3,903/3,439/2,720，
Marker从上到下大小：10,000/8,000/6,000/5,000/4,000/3,000/2,000/1,000/500，抽提出的质粒酶切后的电泳图参见图6。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种利于构建长片段DNA的穿梭载体，其特征在于：所述的穿梭载体能在酿酒酵母和大肠杆菌中穿梭，其拥有酵母复制起始位点oriV和大肠杆菌复制起始位点ori2，且是低拷贝的复制起始位点，在酵母和大肠杆菌中都可稳定复制，在酵母中的筛选标签是HIS3，在大肠杆菌中的筛选标签是氯霉素抗性。
2.根据权利要求1所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体，其特征在于：所述的穿梭载体的图谱见图1，序列见SEQ ID NO.1。
3.根据权利要求1所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体，其特征在于：所述的穿梭载体还包括tonB terminator、T7Te terminator、T7terminator、cat promoter、repE、incC、sopA、sopB、sopC、AmpR promoter、CEN/ARS、HIS3promoter、cos和loxP。
4.根据权利要求1所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体，其特征在于：所述的穿梭载体为环状质粒。
5.一种如权利要求1至4中任一项所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体的制备方法，其特征在于：所述的穿梭载体通过基因合成方法合成多个片段，然后将所述的多个片段进行体外重组后，经自身环化制得。
6.根据权利要求5所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体的制备方法，其特征在于：每个所述的片段的长度为0.3-6kb。
7.根据权利要求5所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体的制备方法，其特征在于：通过基因合成方法合成所述的片段的具体方法为：
步骤(1)、将每条20pM/ul的引物各加2～10ul，混合后用100ul ddH2O稀释，第一轮PCR反应体系为：
第一轮PCR反应程序为：
步骤(2)、以第一轮PCR反应液为模板，进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增的反应体系为：
第二轮PCR扩增的反应程序为：
步骤(3)、采用琼脂糖凝胶电泳回收第二轮PCR扩增的产物，将PCR产物平连PUC57-Amp上，酶切位点是ECORV，挑选单克隆进行菌检测序，获得正确克隆后，再用首尾引物PCR扩增条带即得所述的片段。
8.根据权利要求5所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体的制备方法，其特征在于：所述的体外重组的具体方法为：按每个所述的片段100ng的用量将所述的多个片段与5～15ul的Gibson预混液混合，然后用ddH2O加至反应体系总体积20～30ul，然后在42～58℃反应0.5～3h，然后转入Epi300感受态，冰浴15～50min，38～48℃热激60～100s，冰浴1～5min，然后加500ul LB培养基在35～40℃恢复0.5～3h，涂于氯霉素抗性的LB固体培养基，过夜培养，挑选单克隆，选择阳性克隆送测即得所述的穿梭载体。
9.一种以权利要求1至4中任一项所述的穿梭载体在酵母体内进行大片段组装的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤(a)、将所述的穿梭载体进行酶切获得线性化质粒，合成多个片段；
步骤(b)、将所述的线性化质粒、所述的多个片段与异丙醇等体积沉淀，并加入占所述的线性化质粒、所述的多个片段与所述的异丙醇总体积的5％～20％的NaAc，于零下80℃～零下15℃沉淀30～360min，然后在0～40℃下，以12000～14000转/分钟的转速离心8～12min，丢弃上清液，然后经多次洗涤后，在生物安全柜吹8～12min，然后用水溶解得到混合液；
步骤(c)、将步骤(b)得到的混合液加入酵母电转感受态细胞中，冰上静置25～35min，用电转仪电转，用YPD培养基在28～32℃下恢复30-360min；
步骤(d)、将经步骤(c)恢复后的菌液离心收集菌体，将所述的菌体经多次洗涤后用山梨醇混匀，然后在带有筛选的平板上涂匀，在28～32℃的恒温培养箱培养2～3d；
步骤(e)、在经步骤(d)培养后的平板上挑斑抽提质粒，挑选单克隆于his缺陷型培养基，用酵母试剂盒提取质粒，将获得的质粒进行PCR检测；
步骤(f)、将检测到有条带的质粒用Epi300感受态细胞转化到大肠杆菌中，获得单克隆进行菌检，获得阳性条带的菌液。
10.根据权利要求9所述的在酵母体内进行大片段组装的方法，其特征在于：步骤(a)中，选择ASC I酶切位点或EcoR Ⅰ酶切位点进行酶切。
11.根据权利要求9所述的在酵母体内进行大片段组装的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述的线性化质粒和所述的片段之间的重组臂、所述的片段与所述的片段之间的重组臂为30～150bps。
12.根据权利要求9所述的在酵母体内进行大片段组装的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述的线性化质粒、每个所述的片段、所述的水的体积比为1：0.6～1.5：5～8。
13.根据权利要求9所述的在酵母体内进行大片段组装的方法，其特征在于：步骤(b)中，采用质量百分比为60～80％的乙醇水溶液洗涤。
14.根据权利要求9所述的在酵母体内进行大片段组装的方法，其特征在于：步骤(c)中，电转时用电转仪调整SC2真菌电转程序，用电转杯电转。
15.根据权利要求9所述的在酵母体内进行大片段组装的方法，其特征在于：步骤(d)中，采用0.9～1.1moL/L的山梨醇洗涤。
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