CN104419701A

CN104419701A - 多片段dna的酵母快速组装方法

Info

Publication number: CN104419701A
Application number: CN201310389392.0A
Authority: CN
Inventors: 元英进; 贾斌; 林秋卉; 张文倩; 张金来; 李炳志; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2033-08-29
Also published as: CN104419701B

Abstract

本发明公开了一种多片段DNA的酵母快速组装方法，包括以下步骤：（1）将多个含有同源臂的DNA分子与线性化的酵母穿梭载体共转化酵母；（2）将整个筛选培养板上的全部转化后的酵母菌落洗脱下来，离心，弃上清，得到转化后的酵母菌细胞；（3）提取步骤（2）获得的酵母菌细胞的质粒DNA，转化大肠杆菌感受态细胞；（4）筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA。本发明的方法组装大片段DNA分子的速度快、简便可行、成功率高、成本低，效率高、易操作，可将多个小片段DNA分子组装成一个大片段DNA分子，有利于进行工业化规模扩大，用途广泛。

Description

多片段DNA的酵母快速组装方法

技术领域

本发明涉及合成生物学领域，基因组合成技术，代谢工程领域，具体地是涉及多片段DNA的酵母快速组装方法及该方法合成的大片段DNA及应用。

背景技术

合成大片段DNA分子的技术意义重大，一方面可以用于合成基因组的结构单元，另一方面可以用于组装对人类有重大生产应用价值的代谢通路。

如今的生物学发展已经逐步进入全基因组合成时代，合成基因组学对于人们认识生命，改造生命更好的为人类社会服务有着重大意义。基因组合成是合成底盘细胞的重要方面，在设计方面：人工设计作为底盘生物必需的生长功能基因和表达功能基因及其碱基编码方式、这些基因最优化合理的连接方式和基因间调控；在合成方面：发展DNA大片段和染色体的高保真合成和组装技术，合成并组装基因组。2008年，J.Craig Venter小组又化学合成了生殖道支原体（Mycoplasma genitalium）的基因组，长度约580Kb；2010年，J.Craig Venter小组将人工设计、合成、组装好的丝状支原体（Mycoplasma mycoides）移植入受体细胞中，一段时间后，该移植细胞完全由合成的基因组控制；2011年Jef Boeke小组成功合成并导入了酿酒酵母9号染色体的右臂，合成基因组学开始进入真核细胞领域。

天然化合物是来源于生物体内的次级代谢产物，很多具有重要的生理活性及医疗保健作用，也是许多临床药物的源头。如二萜类化合物紫杉醇是著名的抗癌药；倍半萜类化合物青蒿素为当今最有效的抗疟药；丹参酮则是主要的心血管类中药。天然化合物需求巨大，传统生产方法这些传统方法工艺流程复杂、能耗高、污染大，而且对野生植物资源造成严重破坏。如今使用合成生物学的方法构建组装完整的天然化合物代谢途径在酵母菌或大肠杆菌等微生物中可以更为高效地合成这些天然化合物。加州大学伯克利分校的Jay Keasling小组以大肠杆菌和酵母菌为宿主高效的生产青蒿素；MIT大学的Gregory Stephanopoulos小组在大肠杆菌中生产紫杉醇前体物紫衫二烯已经达到1g/L。全合成天然化合物微生物代谢通路已成为世界热点领域。

对于DNA全合成技术，首先是通过PCR反应合成的，其长度往往小于1kb。当前，要将多个1kb的小片段组装一个大片段DNA分子最常用的组装DNA技术是通过重叠延伸PCR技术来将小片段DNA分子融合为大片段DNA分子，效率受到DNA聚合酶的扩增能力和保真性以及序列的二级结构。虽然已经有能够扩增较长片段的高保真DNA聚合酶（例如Phusion DNA聚合酶），但是当DNA大小超过6kb时反应已经变得很困难。传统的克隆技术主要是通过用内切酶消化得到含有互补粘性末端的两种DNA，并用DNA连接酶将这两种DNA分子拼接为一个DNA分子，这种方法每次只能组装两种DNA分子，如果要将多个DNA分子组装在一起就要做好多轮亚克隆，时间周期很长，而且反复的酶切连接反应会增加合成的成本。酵母细胞内部的同源重组机制已经得到广泛的研究，已被广泛用于构建酵母人工合成染色体（YACs）。一些研究表明酵母细胞可以摄入多个DNA片段，可装配四或者五个重叠的DNA片段连接到载体DNA上（Raymond，C.K.et.al.Biotechniques(1999)26:134‐138）。但是现有的酵母重组技术都要逐个挑取酵母单菌落培养筛选，线性化酵母载体要经过PCR获得（Gibson,D G.et.al.Science(2008)5867:1215‐1220），整体时间会相应的延长，保真度会下降，操作的复杂性和工作量都会增加。因此如何能够低成本，快速高通量筛选正确克隆成为酵母组装大片段DNA分子方法的关键技术。

发明内容

本发明的目的是提供多片段DNA的酵母快速组装方法。

本发明的第二个目的是提供多片段DNA的酵母快速组装方法组装的大片段DNA。

本发明的第三个目的是提供多片段DNA的酵母快速组装方法组装的大片段DNA的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种多片段DNA的酵母快速组装方法，包括以下步骤：

（1）将多个含有同源臂的DNA分子与线性化的酵母穿梭载体共转化酵母；

（2）将整个筛选培养板上的全部转化后的酵母菌落洗脱下来，离心，弃上清，得到转化后的酵母菌细胞；

（3）提取步骤（2）获得的酵母菌细胞的质粒DNA，转化大肠杆菌感受态细胞；

（4）筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA。

所述含有同源臂的DNA分子的同源臂至少是40个碱基的特异性同源臂。

所述线性化的酵母穿梭载体优先的是使用内切酶对酵母穿梭载体进行单酶切后获得。

所述酵母穿梭载体优选为pRS416或pRS413。

上述多片段DNA的酵母快速组装方法组装的大片段DNA。

上述多片段DNA的酵母快速组装方法组装的大片段DNA的用途。

所述用途为组装合成基因组结构单元。

所述用途为生产β‐胡萝卜素。

所述用途为生产紫色杆菌素。

本发明的优点：

本发明的方法组装大片段DNA分子的速度快、简便可行、成功率高、成本低，效率高、易操作，可将多个小片段DNA分子组装成一个大片段DNA分子，有利于进行工业化规模扩大，用途广泛。

附图说明

图1是本发明的一种多片段DNA的酵母快速组装方法及应用合成流程示意图。

图2是本发明实施例1酵母组装K4‐4的示意图。

图3是本发明实施例1酵母组装K4‐4PCR得到五个DNA片段琼脂糖凝胶电泳图。

图4是本发明实施例1酵母组装K4‐4转化大肠杆菌蓝白斑筛选。

图5是本发明实施例1酵母组装K4‐4菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图。

图6是本发明实施例1酵母组装K4‐4质粒DNA酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。

图7是本发明实施例1酵母组装K4‐4合成基因组结构功能图。

图8是本发明实施例1合成大片段替换酵母基因组后在SC‐LEU筛选培养板生长图。

图9是本发明实施例1合成基因组PCR验证琼脂糖凝胶电泳图。

图10是本发明实施例2合成紫色杆菌素代谢通路PCR得到6种小分子DNA琼脂糖凝胶电泳图。

图11是本发明实施例2合成紫色杆菌素代谢通路结构图以及菌落颜色对比图。

图12是本发明实施例2合成紫色杆菌素代谢通路酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。

图13是本发明实施例2合成紫色杆菌素代谢通路发酵产物检测图。

图14是本发明实施例3合成β‐胡萝卜素代谢通路PCR得到7种小分子DNA琼脂糖凝胶电泳图。

图15是本发明实施例3合成β‐胡萝卜素代谢通路结构图以及菌落颜色对比图。

图16是本发明实施例3合成β‐胡萝卜素代谢通路酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。

图17是本发明实施例3合成β‐胡萝卜素代谢通路发酵产物检测图。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明，而不限于本发明的范围。在不背离权利要求书的范围的条件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。另外除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；

实施例1：一种多片段DNA的酵母快速组装方法，包括以下步骤：

（1）将多个含有同源臂的DNA分子与线性化的酵母穿梭载体共转化酵母：

①以SEQ ID NO.1所示的K410F为上游引物，SEQ ID NO.2所示的K410R为下游引物，以SEQ ID NO.3所示的pEasy‐K410为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段K410；以SEQ ID NO.4所示的K411F为上游引物，SEQ ID NO.5所示的K411R为下游引物，以SEQ ID NO.6所示的pEasy‐K411为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段K411；以SEQ ID NO.7所示的K412F为上游引物，SEQ ID NO.8所示的K412R为下游引物，以SEQ ID NO.9所示的pEasy‐K412为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段K412；以SEQ ID NO.10所示的K413F为上游引物，SEQ ID NO.11所示的K413R为下游引物，以SEQ ID NO.12所示的pEasy‐K413为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段K413；以SEQ ID NO.13所示的K414F为上游引物，SEQ ID NO.14所示的K414R为下游引物，以SEQ ID NO.15所示的pEasy‐K414为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段K414；所述上下游引物均金唯智公司合成，质粒模板也由金唯智公司全合成。

K410的上游引物K410F含有与酵母穿梭载体pRS413上EcoRI位点上游40bp同源的序列413F，K414的下游引物K414R含有与酵母穿梭载体pRS413上EcoRI位点下游40bp同源的序列413R；413F由SEQ ID NO.16所示，413R由SEQ ID NO.17所示。

使用50ul的PCR反应体系：ddH₂O28.5ul,5×PCR缓冲液10μl，2.5mM dNTPs5μl，M13F上游引物（10μM）2.5μl，M13R下游引物（10μM）2.5μl，Phusion DNA聚合酶0.5μl，模板DNA1ul。PCR反应条件：98℃预变性1min；98℃变性15s；51℃～66℃退火15s；72℃延伸30s；30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。跑胶检验条带大小，见图3。

②使用EcoRI对pRS413进行线性化。50ul的反应体系如下：pRS413质粒DNA1ug，10X cutsmart Buffer5ul,ddH₂O补足到49ul，NEB EcoRI内切酶1ul。37℃反应1小时，80℃热失活5分钟，4℃保存。

③取步骤①获得5种DNA片段K410，K411，K412，K413和K414各5ul与步骤②获得的片段10ul混合，DNA组装结构如图2所示，共同进行酿酒酵母BY4741转化：实验证明，酿酒酵母不限于这一种。

酿酒酵母转化步骤：

挑单菌落，30℃过夜培养；

接种6.25OD600的过夜培养液到50ml YPD中（0.125OD600/ml）。置30℃、200r/min培养，至OD600达到0.5（大约需要4‐5hrs）；

5000rpm离心2min，收集细胞；用10ml无菌水重悬并清洗细胞，同上离心，收集细胞；用10ml0.1M LiOAc重悬细胞，同上离心，收集细胞；将上清倒出，剩余的LiOAc重悬细胞，并转移到1.5ml EP管内，置于冰上，得到感受态细胞。

准备转化体系：

将转化体系加入50ul感受态细胞中，吹吸均匀，最高速涡旋10s；30℃培养箱中孵育30min；加入72ul DMSO，涡旋混匀10s；42℃热激13min；3600rpm离心30s，收集细胞；吸出上清，加入400ul5mM CaCl2，重悬细胞，静置15min；3600rpm离心30s，吸出上清，在无菌水中重悬后涂SC‐His筛选培养板筛选。

（2）待酵母在筛选培养板上生长2天，向筛选培养板上加入无菌水，用折弯的吸头将全部转化后的酵母菌落洗脱下来并在水中混合均匀，吸取混合菌液加入离心管中，离心，弃上清，得到转化后的酵母菌细胞；

（3）提取该管中的酵母质粒DNA，转化大肠杆菌感受态细胞；

①用天根酵母质粒小提试剂盒（Cat.#DP112‐02）提取酵母质粒DNA；

②取酵母质粒DNA10ul转化50ul大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含Xgal的氨苄LB平板。37℃培养16个小时。

（4）筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA;

①对转化后的大肠杆菌DH5α菌落进行蓝白斑筛选，见图4，蓝色的DH5α菌落表明载体自连或者载体线性化不完全，白色的菌落表明载体中有插入序列。挑取白色菌落进行菌落PCR验证。每个管子的PCR反应体系：10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTPs2μl，M13F引物（10μM）1μl，M13引物（10μM）1μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，加水补足至20μl。挑取白色菌落进行菌落PCR。PCR反应条件：95℃预变性2min～5min；95℃变性20s；51℃～66℃退火20s；72℃延伸4min，延伸时间1min/1kb；30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。跑胶检验DNA条带大小，见图5。将条带大小正确的克隆提质粒做酶切验证：50ul的反应体系如下：质粒DNA1ug，10X cutsmart Buffer5ul,ddH₂O补足到49ul，NEB‐FseI内切酶1ul。37℃反应1小时，80℃热失活5分钟，4℃保存。跑胶检验DNA条带大小，见图6。将酶切验证合格的克隆送测序，最终确定序列正确的克隆。其完整全序列K4‐4为SEQ IDNO.18所示。

②DNA片段K4‐4结构见图7，其中包含LEU2营养筛选标记，用于全合成酵母基因组中的替换过程，将K4‐4DNA分子转化酵母菌后涂布在SC‐LEU筛选培养板上30℃培养。3天后筛选培养板上转化后的酵母菌如图8所示，证明LEU2筛选标记已经整合到基因组上，对基因组验证PCR验证，如图9所示，K组的合成型已经完全替换了野生型。合成基因组的工作将促进对必须基因和非必须基因的研究以及最小基因组的研究。

组装由SEQ ID NO.18所示的大片段DNA K4‐4的工作属于酿酒酵母基因组人工合成计划(SC2.0Project)）全合成工作的一部分。

实施例2：一种多片段DNA的酵母快速组装方法，包括以下步骤：

①以SEQ ID NO.19所示的tetR‐F为上游引物，SEQ ID NO.20所示的tet‐R为下游引物，以SEQ ID NO.21所示的ptetR为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段TetR；以SEQ ID NO.22所示的VioAF为上游引物，SEQ ID NO.23所示的VioAR为下游引物，以SEQ ID NO.24所示的pVioA为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段VioA；以SEQ ID NO.25所示的VioBF为上游引物，SEQ ID NO.26所示的VioBR为下游引物，以SEQ ID NO.27所示的pVioB为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段VioB；以SEQ ID NO.28所示的VioCF为上游引物，SEQ ID NO.29所示的VioCR为下游引物，以SEQ ID NO.30所示的pVioC为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段K413；以SEQ ID NO.31所示的VioDF为上游引物，SEQID NO.32所示的VioDR为下游引物，以SEQ ID NO.33所示的pVioD为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段VioD；以SEQ ID NO.34所示的VioEF为上游引物，SEQ ID NO.35所示的VioER为下游引物，以SEQ ID NO.36所示的pVioE为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段VioE；

上述上下游引物均由金唯智公司合成，质粒模板从美国Biobrick购买获得。使用50ul的PCR反应体系：ddH₂O28.5ul,5×PCR缓冲液10μl，2.5mM dNTPs5μl，上游引物（10μM）2.5μl，下游引物（10μM）2.5μl，Phusion DNA聚合酶0.5μl，模板DNA1ul。PCR反应条件：98℃预变性1min；98℃变性15s；51℃～66℃退火15s；72℃延伸1min；30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。跑胶检验条带大小，见图10。

②使用EcoRI对pRS416进行线性化。50ul的反应体系如下：pRS416质粒DNA1ug，10X cutsmart Buffer5ul,ddH₂O补足到49ul，NEB EcoRI内切酶1ul。37℃反应1小时，80℃热失活5分钟，4℃保存。

③取步骤①获得的六种DNA片段TetR，VioA，VioB，VioC,VioD,VioE各5ul与10ul步骤②获得的片段混合，DNA组装结构如图11（a）所示，共同进行酿酒酵母BY4741转化：实验证明，酿酒酵母不限于这一种。

转化步骤同实施例1酿酒酵母转化步骤：

（3）提取该管中的酵母质粒DNA，转化大肠杆菌感受态细胞；

（4）筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA;

①对转化后的大肠杆菌DH5α菌落进行蓝白斑筛选，蓝色的DH5α菌落表明之载体自连或者载体线性化不完全，白色的菌落表明载体中有插入序列。挑取白色菌落进行菌落PCR验证。每个管子的PCR反应体系：10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTPs2μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，加水补足至20μl。挑取白色菌落进行菌落PCR。PCR反应条件：95℃预变性2min～5min；95℃变性20s；51℃～66℃退火20s；72℃延伸4min，延伸时间1min/1kb；30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。跑胶检验DNA条带大小。将条带大小正确的克隆提质粒做酶切验证：50ul的反应体系如下：质粒DNA1ug，10X cutsmart Buffer5ul,ddH₂O补足到48ul，NEB‐EcoRI内切酶1ul,NEB‐PstI内切酶1ul。37℃反应1小时，80℃热失活5分钟，4℃保存。跑胶检验DNA条带大小，见图12。将酶切验证合格的克隆送测序，最终确定序列正确的克隆，其完整序列VioABCDE为SEQ ID NO.37所示。

②步骤①合成的大片段DNA用于大肠杆菌发酵生产紫色杆菌素

大片段DNA紫色杆菌素代谢途径的基因结构如图11（a）所示，将步骤①测序正确的质粒转化大肠杆菌MG1655菌株涂布含四环素诱导LB培养板，菌落呈现为紫色，见图11（c），而未经转化的大肠杆菌MG1655菌株作空白对照，其菌落呈现白色，见图11（b）。挑取紫色的菌落进行100ml摇瓶发酵。取1ml发酵液离心，弃上清，重悬于50ul的10%SDS溶液，55℃振荡15min。加入250ul的甲醇，55℃再次振荡15min；12000转/分，离心10min，取200ul上清液于96孔板，在572nm处进行光谱定量分析。结果如图13所示，证明转化步骤①合成的大片段DNA大肠杆菌能够合成紫色杆菌素。紫色杆菌素属于吲哚衍生物,由两个色氨酸分子氧化缩合而成，有很重要的生物活性，可以作为潜在的抗肿瘤、抗病毒药物及生物染料，使用大肠杆菌发酵生产紫色杆菌素有广阔的应用前景。

实施例3：一种多片段DNA的酵母快速组装方法，包括以下步骤：

①以SEQ ID NO.38所示的TEF1p‐F为上游引物，SEQ ID NO.39所示的TEF1p‐R为下游引物，以酵母基因组为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得以SEQ ID NO.56所示的DNA分子片段TEF1p；以SEQ ID NO.40所示的PDX1t‐F为上游引物，SEQ ID NO.41所示的TDH3p‐R为下游引物，以酵母基因组为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得以SEQ ID NO.57所示的DNA分子片段PDX1t‐TDH3p；以SEQ ID NO.42所示的MPE1t‐F为上游引物，SEQ ID NO.43所示的FBA1p‐R为下游引物，以酵母基因组为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得以SEQ ID NO.58所示的DNA分子片段MPE1t‐FBA1p；以SEQ ID NO.44所示的TDH2t‐F为上游引物，以SEQ ID NO.45所示的TDH2t‐R为下游引物，以酵母基因组为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得以SEQ IDNO.59所示的DNA分子片段TDH2t；以SEQ ID NO.46所示的CrtE‐F为上游引物，SEQ ID NO.47所示的CrtE‐R为下游引物，以SEQ ID NO.48所示的CrtE为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段CrtE；以SEQ ID NO.49所示的CrtI‐F为上游引物，SEQ IDNO.50所示的CrtI‐R为下游引物，以SEQ ID NO.51所示的CrtI为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段CrtI；以SEQ ID NO.52所示的CrtYB‐F为上游引物，SEQ ID NO.53所示的CrtYB‐R为下游引物，以SEQ ID NO.54所示的CrtYB为模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA分子片段CrtYB；

上述上下游引物均由金唯智公司合成，质粒模板CrtE，CrtI和CrtYB从美国Biobrick购买获得，酵母基因组从酿酒酵母BY4741提取。使用50ul的PCR反应体系：ddH₂O28.5ul,5×PCR缓冲液10μl，2.5mM dNTPs5μl，上游引物（10μM）2.5μl，下游引物（10μM）2.5μl，Phusion DNA聚合酶0.5μl，模板DNA1ul。PCR反应条件：98℃预变性1min；98℃变性15s；51℃～66℃退火15s；72℃延伸1min；30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。跑胶检验条带大小，见图14。

③取步骤①中的小分子DNA片段TEF1p，PDX1t‐TDH3p，MPE1t‐FBA1p，TDH2t，CrtE，CrtI，CrtYB各5ul与10ul步骤②获得的片段混合，DNA组装结构如图15（a）所示，共同进行酿酒酵母BY4741转化：实验证明，酿酒酵母不限于这一种。

转化步骤同实施例1酿酒酵母转化步骤：

（3）提取该管中的酵母质粒DNA，转化大肠杆菌感受态细胞；

（4）筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA;

①对转化后的大肠杆菌DH5α菌落进行蓝白斑筛选，蓝色的DH5α菌落表明之载体自连或者载体线性化不完全，白色的菌落表明载体中有插入序列。挑取白色菌落进行菌落PCR验证。每个管子的PCR反应体系：10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTPs2μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，加水补足至20μl。挑取白色菌落进行菌落PCR。PCR反应条件：95℃预变性2min～5min；95℃变性20s；51℃～66℃退火20s；72℃延伸4min，延伸时间1min/1kb；30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。跑胶检验DNA条带大小。将条带大小正确的克隆提质粒做酶切验证：50ul的反应体系如下：质粒DNA1ug，10X cutsmart Buffer5ul,ddH₂O补足到49ul，NEB‐EcoRI内切酶1ul。37℃反应1小时，80℃热失活5分钟，4℃保存。跑胶检验DNA条带大小，见图16。将酶切验证合格的克隆送测序，最终确定序列正确的克隆。完整正确序列βCarotene为SEQ ID NO.55所示。

②步骤①合成的大片段DNA用于酵母菌发酵生产β‐胡萝卜素

大片段DNAβ‐胡萝卜素代谢途径的基因结构如图15（a）所示，将步骤①测序正确的质粒转化酿酒酵母BY4741菌株涂布SC‐URA筛选培养板，生长出的菌落呈现为橙色，见图15（c），而未经转化的酵母菌BY4741菌株作空白对照，其菌落呈现白色，见图15（b）。挑取橙色的菌落进行100ml摇瓶发酵。取1ml发酵液离心，弃上清，重悬于100ul的10%SDS溶液，加入石英砂0.1g，55℃振荡15min。加入250ul的正己烷，55℃再次振荡15min；12000转/分，离心10min，取200ul上清液于96孔板，在449nm处进行光谱定量分析。结果如图17所示，证明转化步骤①合成的大片段DNA的酵母能够合成β‐胡萝卜素。β‐胡萝卜素可以转化成维生素A，是目前最安全补充维生素A的产品。它可以维持眼睛和皮肤的健康，改善夜盲症、皮肤粗糙的状况，有助于身体免受自由基的伤害。使用酵母发酵生产β‐胡萝卜素有着潜在的工业生产价值。

Claims

1.一种多片段DNA的酵母快速组装方法，其特征在于包括以下步骤：

（4）筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA。

2.根据权利要求1所述的一种多片段DNA的酵母快速组装方法，其特征在于所述含有同源臂的DNA分子的同源臂至少是40个碱基的特异性同源臂。

3.根据权利要求1所述的一种多片段DNA的酵母快速组装方法，其特征在于所述线性化的酵母穿梭载体是使用内切酶对酵母穿梭载体进行单酶切后获得。

4.根据权利要求1或3所述的一种多片段DNA的酵母快速组装方法，其特征在于所述酵母穿梭载体为pRS416或pRS413。

5.权利要求1‐4之一的一种多片段DNA的酵母快速组装方法组装的大片段DNA。

6.权利要求5的大片段DNA的用途。

7.根据权利要求5的用途，其特征是所述用途为组装合成基因组结构单元。

8.根据权利要求5的用途，其特征是所述用途为生产β‐胡萝卜素。

9.根据权利要求5的用途，其特征是所述用途为生产紫色杆菌素。