CN108913612A - 一种菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及合成生物学领域，特别涉及基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。本申请人基于LoxPsym位点特异性重组的合成型基因组重排系统(SCRaMbLE)在单倍体合成型酿酒酵母中进行基因组重排发现YER151C基因的缺失对脱氧紫色杆菌素前体产量的增加有影响。并且通过全基因组测序验证了YER151C基因缺少与脱氧紫色杆菌素前体生产相关。因此本发明提供了YER151C基因的缺失及其应用、缺失该基因(YER151C)的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。

Description

一种菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用
技术领域
本发明涉及合成生物学领域，具体涉及基因的缺失及其应用、缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。
背景技术
紫色杆菌素(violacein，Vio)是一种主要由革兰氏阴性菌代谢生成的天然紫色颜料物质，最早在青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)中被分离得到，在其它细菌中这种青紫色色素也被观察到，如藤黄紫假交替单胞菌(Pseudoalteromonasluteoviolacea)和Pseudomonas sp.520P1and 710P1等。该物质的化学结构在1960年被Ballantine等人进行了完整的阐述，并成功将其化学合成出来，一般来说，紫色杆菌素包括3个结构单元，即1分子的5-羟基吲哚，1分子的2-羟基吲哚，还有一分子的2-吡咯烷酮，故又称其为双吲哚类化合物。紫色杆菌素不仅具有良好的着色效果，可作为生物染料，有很好的应用前景。紫色杆菌素还具有广谱抗菌、抗病毒、抗氧化、抗原生动物、抗肿瘤等多种重要生物活性，可作为潜在的抗肿瘤、抗病毒药物及保健类天然色素。
目前微生物生产紫色杆菌素的产量普遍较低。而且从生物中提取得到的紫色杆菌素很难将其分离纯化，一般除了紫色杆菌素之外，还含有较高浓度的脱氧紫色杆菌素。脱氧紫色杆菌素是比紫色杆菌素少一个氧原子的结构类似物，通常伴随紫色杆菌素产生，是紫色杆菌素合成途径的副产物。
脱氧紫色杆菌素前体(prodeoxyviolacein，PDV)是紫色杆菌素合成路径的关键中间产物，可在VioC的氧化作用下产生脱氧紫色杆菌素，在VioD的氧化作用下生成紫色杆菌素前体。紫色杆菌素前体在氧化酶VioC的催化作用下最终生成紫色杆菌素。
因此，提供产量高的脱氧紫色杆菌素前体的菌株及合成方法对紫色杆菌素的合成具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的问题，提供产量高的脱氧紫色杆菌素前体的菌株及合成方法，以提高脱氧紫色杆菌素前体的产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了基因YER151C的缺失在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。
进一步的，作为优选，所述微生物为酵母，所述次级代谢产物为芳香族氨基酸下游代谢产物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述次级代谢产物为脱氧紫色杆菌素前体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述微生物为合成脱氧紫色杆菌素前体的酵母菌株。
本发明还提供了菌株，其基因YER151C被敲除。
在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株其为合成脱氧紫色杆菌素前体的酵母菌株。
在此基础上，本发明还提供了所述的菌株在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。
作为优选，所述次级代谢产物为芳香族氨基酸下游代谢产物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述次级代谢产物为脱氧紫色杆菌素前体。
进一步，本发明还提供了脱氧紫色杆菌素前体的合成方法，本发明提供的菌株经发酵培养，收集发酵产物。
本申请人基于LoxPsym位点特异性重组的合成型基因组重排系统(SCRaMbLE)在单倍体合成型酿酒酵母中进行基因组重排发现YER151C基因的缺失对脱氧紫色杆菌素前体产量的增加有影响。并且通过全基因组测序验证了YER151C基因缺少与脱氧紫色杆菌素前体生产相关。因此本发明提供了YER151C基因的缺失及其应用、缺失该基因(YER151C)的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1pCAN-A质粒图；
图2示实施例1pCAN-B质粒图；
图3示实施例1pVioABE质粒图；
图4示实施例1整合脱氧紫色杆菌素路径示意图(a)和酵母菌在整合脱氧紫色杆菌素路径后，在固体培养基上生长形成绿色的菌落(b)；
图5示实施例2单倍体酵母在5轮迭代基因组重排中的表型频率；
图6示实施例2多轮重排后得到的菌株，在5ml SC培养基中30℃220rpm摇床发酵培养12h后的表型展示图；
图7示实施例2多轮重排后得到的菌株，在50mL SC培养基中30℃220rpm摇床发酵培养72h后HPLC进行脱氧紫色杆菌素前体相对定量的结果；
图8示实施例3线型合成型V号菌株yWJR006、yWJR040、yWJR085、yWJR104全基因组深度测序结果比较；
图9示实施例4“His”标签替换YER151C的示意图；
图10示实施例4基因改造菌株yWJV003的单菌落颜色展示；
图11示实施例4基因改造菌株yWJV003脱氧紫色杆菌素前体相对定量。
具体实施方式
本发明公开了基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1、
申请人设计构建了3个质粒：pCAN-A,pCAN-B和pVioABE(图1-3)。然后使用HindIII与SacI对pCAN-A,pCAN-B进行酶切回收片段，使用EcoRI对pVioABE进行酶切回收片段。将这三个DNA片段混合在一起，对合成型5号染色体酵母进行酵母转化(图4)，可以将VioABE代谢路径与Leu2营养标记一起整合到synV中的YEL063C/CAN1基因座中。涂在SC-His平板上，在30℃培养3天，获得绿色的酵母菌落yWJR001。
实施例2、基因组重排筛选高产脱氧紫色杆菌素前体
1.接3个单菌落分别到5mL SC-His(葡萄糖)液体培养基的试管里，作为3个生物学平行，30℃220rpm摇菌过夜培养，使细胞生长至对数生长期；
2.测量上述菌液的OD600值，后5000rpm，2min离心细胞，ddH2O水洗一次，转接到5mL SGal-His(半乳糖)液体培养基中，使终OD值在0.5-0.6左右；
3.在上述5mL SGal-His(半乳糖)液体培养基中加入1μL 0.5mM的雌二醇(乙醇溶液)，对照中只加入1μL无水乙醇，后将实验组和对照组试管放置于30℃220rpm的恒温培养箱中培养；
4.取样时间根据菌株类型有所区别，本发明中均在8h取样，取500μL菌液5000rpm，2min离心，收集菌体细胞，ddH2O水洗三次，彻底洗掉残留的雌二醇和半乳糖培养基，用500μL ddH2O重悬，取样后一般稀释104-105倍涂布平板，取100μL稀释后的菌液涂布SC-His(葡萄糖)的固体培养基平板，挑选比亲本菌株颜色更深的菌株进行发酵。
5.取三个独立的菌落接种到5mL SC培养基中培养24小时，然后以OD600为0.1接种于50mL的SC培养基(40g/L葡萄糖)，在30℃，220rpm摇床中发酵培养72小时。
6.离心收集2mL发酵培养物，并用500μL色谱纯甲醇从沉淀中提取脱氧紫色杆菌素前体。通过HPLC分析样品。流动相由甲醇-水(7:3v/v)组成，流速为0.3mL/min。
对线型V号合成型菌株分别进行了多轮基于LoxPsym位点特异性重组的合成型基因组重排系统(SCRaMbLE)实验。首先，我们选取第一轮颜色最深的菌株，将其划线分纯之后，以该菌作为第二轮SCRaMbLE的出发菌，筛选到颜色进一步加深的菌株后，再选取颜色最深的一株菌作为第三轮SCRaMbLE的出发菌，以此类推。每一轮涂布SC-His平板后，统计颜色加深的菌株数目占存活菌株数目的比例，样本总量约为1000个菌落，统计结果如图5所示。
出发菌yWJR001经多轮重排后得到一轮重排菌yWJR006、二轮重排菌yWJR040、三轮重排菌yWJR085、四轮重排菌yWJR104、五轮重排菌yWJR111。表型展示如图6，统计脱氧紫色杆菌素前体相对定量如图7。多轮重排后得到的菌株，在5ml SC培养基中30℃220rpm摇床发酵培养12h后，随着重排次数的增加，菌液颜色逐步增加，脱氧紫色杆菌素前体产量逐步增加，从一轮重排菌到五轮重排菌，产量分别提高了1.07倍、1.18倍、2.34倍、2.95倍、4.04倍。
实施例3、
将确定高产的线型合成型V号菌株yWJR006、yWJR040、yWJR085、yWJR104进行全基因组深度测序(Illumina HiSeq 2000平台)，验证与脱氧紫色杆菌素前体生产相关的基因组变异。根据基因组序列数据，通过将基因组变异在出发菌中重现的方式，来探究突变体中表型与基因型的关系。
结果如图8所示，在yWJR006、yWJR040、yWJR085、yWJR104的测序结果中都发现了YER151C基因缺失。
实施例4、
用“His”标签通过酵母同源重组的方式替换出发菌株yWJR001中的YER151C基因。具体操作为首先使用含有YER151C基因同源臂的一对引物TTAATTTCTCTTTTGATACATTAAAATATAGGCAGTCCTCCTAGTACACTCTATATTTTTTTATG与TCGTTCAGAATGACACGTATAGAATACGTATATAGGTGAACGGTAATAAGAGGGTAATTTTT对His基因进行扩增，然后进行酵母转化，将his基因利用同源重组方法整合到对照酵母(yWJR001的)基因组YER151C位点(9)。
在yWJR001中也插入了该标签作为对照菌(yWJR001-D)。将PCR验证正确的基因敲除菌yWJV003和对照菌yWJR001-D在SC培养基固体平板上进行点板产量比较。结果发现敲除后的单菌落颜色确实比对照要绿一些(图10)，经HPLC测定，产量大约提升了1.2倍(图11)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.基因YER151C的缺失在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物为酵母，所述次级代谢产物为芳香族氨基酸下游代谢产物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述次级代谢产物为脱氧紫色杆菌素前体。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述微生物为合成脱氧紫色杆菌素前体的酵母菌株。
5.菌株，其特征在于，其基因YER151C被敲除。
6.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，其为合成脱氧紫色杆菌素前体的酵母菌株。
7.权利要求5或6所述的菌株在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述次级代谢产物为芳香族氨基酸下游代谢产物。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述次级代谢产物为脱氧紫色杆菌素前体。
10.脱氧紫色杆菌素前体的合成方法，其特征在于，权利要求5或6所述的菌株经发酵培养，收集发酵产物。
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