CN109880862A - 一种异源从头生物合成丹酚酸b的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在酿酒酵母中引入外源功能基因构建的经由迷迭香酸从头生物合成丹酚酸B的方法，属于生物技术领域。采用外源基因与宿主菌株内源酶相结合的方法，构建了不需要添加苯丙素类化合物底物、以基本碳源和氮源为原料从头生物合成丹酚酸B的重组酿酒酵母菌株，开创了首例异源从头生物合成丹酚酸B的方法，为药用丹酚酸类化合物工业化生产奠定基础。

Description

一种异源从头生物合成丹酚酸B的方法

技术领域

本发明主要涉及一种从头生物合成丹酚酸B的方法，具体说，利用外源从头合成迷迭香酸的生物合成途径，与绿色微生物酿酒酵母W303a株系中内源酶共同催化作用下，通过发酵工艺，使工程菌株以基本碳源和氮源为原料，从头合成迷迭香酸与丹酚酸B的方法，属于生物技术领域。

发明背景

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一味传统中药，现多以注射剂型用于临床治疗心血管疾病，其他潜在的药理活性和应用仍在研究中，如抗糖尿病、抗炎、抗癌、抗类风湿和抗老年性痴呆。脂溶性二萜类(丹参酮)和水溶性酚酸类(丹酚酸)是丹参中主要的具有药理活性的成分。目前已确认结构的丹参酮约有30余种，包括甲基丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮IIA(TA-IIA)等，其中TA-IIA被认为是具有显著药理活性的具有代表性的化合物。丹酚酸包含丹参素(又称丹酚酸A，SAA)、丹酚酸B、C、D、E、K和L等20余种苯丙素类化合物，其中丹酚酸B(SAB)是丹参的主要活性成分且化学性质相对稳定。

2006年丹参多酚酸盐注射液正式成为临床用药，其主要药理活性成分是SAB，迷迭香酸(RA)是SAB前体化合物，有关RA在植物中的生物合成途径已基本阐明，RA至SAB的代谢通路尚未完全明了。文献报道，漆酶(laccase)可能参与了RA到SAB的生物合成。当前，丹参的根部是获取SAB的唯一来源。研究表明，我国各地栽培的丹参中其根部SAB含量在37.34mg/g～68.37mg/g之间。目前，大量研究表明可以通过生物或非生物的手段提高丹参中SAB的含量，甚至已有研究表明可成功通过微生物发酵生物合成一些迷迭香酸生物合成途径的中间产物及一些具有药理活性的衍生物。

在安全性较高的酿酒酵母菌株中构建从头合成RA的完整生物代谢通路，利用酵母底盘细胞内源酶与外源生物合成途径相结合，不仅对解决RA、SAB的资源问题具有重要意义，也提出一种新的高价值天然产物的异源合成途径优化思路。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于运用生物技术方法，克隆外源更高活性的关键酶基因替换酿酒酵母工程菌株YW-S4C2FG表达载体上的途径基因，获得新的重组酵母菌株YW-S3C3FG。该重组酵母菌在外源生物合成途径与酿酒酵母内源酶共同催化作用下，以基本碳源和氮源为原料，从头合成RA和SAB。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种异源从头生物合成SAB及RA的重组酵母工程菌YW-S3C3FG，其特征在于：对工程菌株YW-S4C2FG的途径基因进行组合优化，重组工程菌宿主菌株的优化，重组菌株发酵条件(温度及pH)的探索，发酵培养基中碳源与氮源的种类对重组酵母菌株生长曲线的影响，针对重组酵母菌株发酵中各中间产物的LC-MS定量方法的探究，及发酵罐中高密度发酵工艺流程的建立。

所述工程菌株YW-S4C2FG为同时含有丹参来源的酪氨酸转氨酶(TAT)、4-香豆酰-辅酶A连接酶(4CL)、对羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)、迷迭香酸合成酶(RAS)，彩叶草(Coleusblumei)来源的细胞色素P450酶(CYP)、细胞色素P450还原酶(CRP)，约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸解氨酶(TAL)和大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)来源的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(aroG)的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)YW-S4C2FG(专利申请号201810369553.2)；

本发明所述的一种异源从头生物合成SAB及RA的重组酵母工程菌YW-S3C3FG，其特征在于，包括如下具体步骤：

1.SAB生物合成途径设计与途径基因优化

(1)根据活性筛选的实验结果以彩叶草来源的HPPR替换原本途径中丹参来源的HPPR，保留途径中选用的丹参来源的TAT、彩叶草来源的CYP和CRP，结合酵母菌株内源酶的催化作用，将RA生物转化为SAB，整个生物合成SAB的过程包括9个关键酶，设计的SAB生物合成途径如图1所示；

(2)来源于丹参的途径基因4CL、RAS，分别记为：

Sm1(SmRAS，GenBank登录号：KM575933)、

Sm2(Sm4CL2，GenBank登录号：AY237164)；

来源于彩叶草和拟南芥的途径基因CYP、CPR，分别记为：

Cb1(CbCYP，GenBank登录号：AJ427452)、

Cb2(CbCPR，GenBank登录号：AM980997)、

At1(AtCYP，GenBank登录号：NM_118585)、

At2(AtCPR，GenBank登录号：NM_001342001.1)；

来源于丹参和彩叶草的途径基因TAT、HPPR，分别记为：

Sm3(SmTAT，GenBank登录号：DQ334606)、

Sm4(SmHPPR，GenBank登录号：DQ266514)、

Cb3(CbTAT，GenBank登录号：AJ458993)、

Cb4(CbHPPR，GenBank登录号：AJ507733)；

Fj来源于约氏黄杆菌的TAL原始序列经密码子优化后合成(FjTAL，GenBank登录号：KR095307)，本发明中Fj的来源以工程菌株YW-S4C2FG中pRS426-C2F质粒为模板克隆而得；

aroG来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，记为aroG(aroG，GenBank登录号：CP024826，1628265-1629317区)，本发明中aroG的来源以工程菌株YW-S4C2FG中pRS425-aroG质粒为模板克隆而得；

Laccase(EC 1.10.3.2)为宿主菌株酿酒酵母内源酶；

(3)Fj、aroG、Sm1、Sm2、Sm3、Sm4、Cb3、Cb4、Cb1、Cb2、At1和At2十二个基因以相应生物材料来源的cDNA为模板，采用高保真Taq酶进行PCR扩增，PCR反应体系如下表：

组成成分	体积
		ddH<sub>2</sub>O	3.6μl
2×高保真PCR预混液	5.0μl
		引物-F(10μM)	0.2μl
引物-R(10μM)	0.2μl
		丹参cDNA模板	1.0μl
总体积	10μl

PCR反应条件如下：

得到全长基因，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成；

Fj、aroG、Sm1、Sm2、Sm3、Sm4、Cb3、Cb4、Cb1和Cb2在PCR扩增或合成时，在两端分别引入KpnⅠ/XhoⅠ或XhoⅠ/XbaⅠ的酶切位点，At1和At2在PCR扩增或合成时，在两端分别引入KpnⅠ/SacⅠ和SmaⅠ/XbaⅠ的酶切位点。

2.SAB途径单基因酵母表达载体构建

(1)选用pAUR123、pRS424、pRS425、pRS426酵母表达载体。

pAUR123为大肠杆菌和酵母中进行复制的穿梭型表达载体，带有用于在酵母进行筛选的金担子素A(Aureobasidin A，AbA)抗性基因和大肠杆菌中筛选的氨苄青霉素抗性基因，在启动子P_ADH1、终止子T_ADH1序列之间有KpnⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ等酶切位点用于克隆目的基因，可用于构建“启动子-途径基因-终止子”的单基因表达单元；

pRS424、pRS425、pRS426分别为Trp^-、Leu^-、Ura^-营养缺陷型高拷贝穿梭型表达载体，其多克隆位点适用于插入“启动子-途径基因-终止子”基因表达单元。

所用pAUR123质粒来自TaKaRa公司，pRS424、pRS425、pRS426质粒来自Novagen公司。

(2)将测序确定后的十二个基因Fj、aroG、Sm1、Sm2、Sm3、Sm4、Cb3、Cb4、Cb1、Cb2、At1和At2与pAUR123分别用KpnⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ/XbaⅠ、KpnⅠ/SacⅠ或SmaⅠ/XbaⅠ进行双酶切，酶切提下如下：

组成成分	体积
		H<sub>2</sub>O	7μl
Sm1基因片段或pAUR123质粒	10μl
		10×FD Buffer	2μl
Kpn I(200U/μl)	0.5μl
		Xba I(200U/μl)	0.5μl
总体积	20ul

T4连接酶室温连接1小时，酶连体系如下：

组成成分	体积
		10×T4连接缓冲液	1μl
T4连接酶	1μl
		pAUR123载体片段	3μl
Sm1基因片段	5μl
		总体积	10μl

将连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃孵育45min～1h后涂布到带有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃静置培养12h～16h；

所用限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SacⅠ和SmaⅠ均购于赛默飞世尔科技公司，大肠杆菌菌株DH5α来自Invitrogen公司。

(3)挑取单菌落分别置于含1ml培养基的1.5ml离心管中，37℃，培养4h～6h,采用特异性引物对菌液进行菌液PCR鉴定，对比条带大小和阴性对照，初步判断阳性菌落；

(4)将阳性菌落摇菌，提质粒，酶切2h，电泳鉴定正确，得到重组质粒，即单基因酵母表达载体：pAUR123-Sm1、pAUR123-Sm2、pAUR123-Sm3、pAUR123-Sm4、pAUR123-Cb3、pAUR123-Cb4、pAUR123-Cb1、pAUR123-Cb2、pAUR123-Fj、pAUR123-aroG、pAUR123-At1和pAUR123-At2；

(5)设计引入同尾酶酶切位点的引物P_ADH1-F(带有Xho I和Avr II酶切位点)，

序列为：5’-GGCCGCCTCGAGAGTCCTAGGTCGAACAAGTCCGATCAGCTCATAA-3’；

引物T_ADH1-R(带有Not I和Sal I酶切位点)，

序列为5’-GGCCGCGCGGCCGCTAGTCGACTCGACTGAAGGCTAGGCTGTGGAT-3’；

分别以pAUR123-Sm1、pAUR123-Sm2、pAUR123-Sm3、pAUR123-Sm4、pAUR123-Cb3、pAUR123-Cb4、pAUR123-Cb1、pAUR123-Cb2、pAUR123-Fj、pAUR123-aroG、pAUR123-At1和pAUR123-At2重组质粒为模板，扩增出包含启动子P_ADH1、途径基因、终止子T_ADH1序列的单基因表达单元片段，记为“P_ADH1-途径基因-T_ADH1”，此处“途径基因”指本发明所述的Sm1、Sm2、Sm3、Sm4、Cb3、Cb4、Cb1、Cb2、Fj、aroG、At1及At2十二个基因；

所用限制性内切酶Xho I、Avr II、Not I和Sal I购于赛默飞世尔科技公司。

(6)将得到的PCR扩增产物“P_ADH1-途径基因-T_ADH1”片段与pRS424、pRS425、pRS426分别进行双酶切，酶切反应体系如下：

组成成分	体积
		ddH<sub>2</sub>O	7μl
P<sub>ADH1</sub>-Sm1-T<sub>ADH1</sub>基因表达单元片段或pRS424质粒	10μl
		10×FD Buffer	2μl
Avr II(200U/μl)	0.5μl
		SalⅠ(200U/μl)	0.5μl
总体积	20ul

T4连接酶连接，连接反应体系如下：

转化，鉴定得到重组质粒，即单基因营养缺陷型表达载体：pRS424-Sm1、pRS426-Sm3、pRS424-Sm4、pRS426-Cb3、pRS424-Cb4、pRS426-Cb1、pRS425-aroG和pRS425-Fj。

3.营养缺陷型多基因表达载体构建

(1)应用同尾酶策略，在单基因营养缺陷型表达载体基础上，把单个基因表达单元首尾相连，得到重组质粒，即多基因表达载体：

pRS426-CbCYP-CbCPR(记为pRS426-C2)，

pRS426-AtCYP-AtCPR(记为pRS426-A2)，

pRS424-SmRAS-Sm4CL2-SmTAT-CbHPPR(记为pRS426-S3C1)，

pRS424-SmRAS-Sm4CL2-CbHPPR-CbTAT(记为pRS426-S2C2)，

pRS424-SmTAT-Sm4CL2-SmHPPR-SmRAS(记为pRS424-S4)；

(2)将构建好的重组质粒采用热激法，共同转化酿酒酵母W303a感受态细胞，涂布于Trp^-/Leu^-/Ura^-三缺营养缺陷型固体培养基平板后，于30℃培养箱培养48h；

所用酿酒酵母W303a和BY4742来自Invitrogen公司。

(3)挑选单菌落，分别针对途径基因进行PCR鉴定，本发明中构建的所有株系如下表所示：

4.重组酵母菌发酵培养

(1)摇瓶发酵培养：

以5％接种量吸取-80℃冻存的甘油菌或从直接从平板上挑取单菌落，接种至3mL相应的营养缺陷型培养基中，200rpm，30℃震荡培养24h，此为一级种子；

取1mL上述一级种子接种至20mL YPD培养基中，30℃，200rpm震荡培养24h；

若需要添加底物则精密称取适量底物(底物均以粉末状态添加)，按1mM的终浓度添加到发酵液中，培养条件同上，继续培养72～120h不等。所得即为工程酵母菌的发酵液，不同时间点取样用于后续产物分析。

(2)发酵罐发酵培养：

按照(1)摇瓶发酵培养方法培养一级种子；

以5％接种量接种至50mL YPD培养基中，装于250mL锥形瓶中，、30℃200rpm震荡培养24h，即得二级种子；

将二级种子以5％接种量接种至装有3L已灭菌的YPD培养基的发酵罐中，通气量保持2L/min，搅拌速率300rpm，不通过流加酸碱控制发酵的pH，30℃搅拌培养24h；

不添加任何补料，开始计时为发酵时长，发酵36～96h不等，在此区间不同时间点取样，用于质谱定量分析；

5.生物合成途径中各产物的检测

(1)样品处理

UPLC-MS样品处理：每次取样取3mL发酵液于15mL干净离心管内，按照1:1体积比加入分析纯乙酸乙酯，剧烈震荡混匀，5000rpm离心5min，分批吸取上层液体至新的1.5mL离心管中，氮气吹干，直至上层液体完全取尽。按照浓缩20倍的比例取150μL色谱级甲醇至离心管内，超声3min，过0.22μm滤膜，备用；

(2)UPLC-MS检测

LC-MS配备有电喷雾离子源(ESI源)，负离子模式监测，毛细管电压为3.5kV，离子源温度为120℃，气体温度为350℃，脱溶气体流量为60L/h，色谱柱为资生堂(Shiseido)CAPCELL PAK C18(2μm，2.1mmI.D.×100mm)，柱温30℃，以0.4％甲酸+5mM醋酸铵水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速0.3mL/min，进样体积为5μL。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明采用三个质粒共同转化方法，在酿酒酵母W303a中构建了丹酚酸B的生物合成途径，得到重组酵母菌YW-S3C3FG。该菌株不需要添加苯丙素类化合物为底物，以培养基中基本碳源和氮源为原料生物合成RA和SAB。

所用酿酒酵母W303a来自Invitrogen公司。

本发明重点在于：在酿酒酵母工程菌中构建了完整的迷迭香酸合成途径，并在酵母宿主内源的催化作用下将RA生物转化为SAB，通过上罐发酵对RA积累的产物定量，并检测到SAB的存在。

现有的异源合成RA的报道，多为需要添加苯丙素类化合物作为底物，成本较为昂贵；还未有异源合成SAB的相关报道。

本发明解决了添加底物问题，可以在工程酵母菌中从头合成丹酚酸B，为丹酚酸B的工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1.本发明构建的从头生物合成丹酚酸B的途径示意图(所有实线箭头组成完整的RA外源合成途径，虚线箭头表示酵母宿主内源酶催化的生物转化反应)

图2.对照品LC-MS标准曲线(a.RA；b.PA；c.HPPA；d.DHPPA；e.CA；f.DHPL；g.pHPP；h.pHPL)。

图3.不同来源TAT和HPPR活性筛选图

图4.宿主菌株对外源生物合成途径表达效率的影响图(a.YW-S4C2FG发酵产物检测结果；b.W303a发酵产物检测结果；c.YW-S4C2FG发酵产物检测结果扣除W303a背景后的检测结果；d.YB-S4C2FG发酵产物检测结果；e.BY4742发酵产物检测结果；f.YB-S4C2FG发酵产物检测结果扣除BY4742背景后的检测结果)

图5.温度对外源基因表达水平的影响图

图6.不同pH培养基对酵母菌密度的影响图

图7.重组酵母菌YW-S3C3FG在不同碳氮源培养基中的生长曲线(a.氮源固定为蛋白胨不同氮源培养基的生长曲线；b.碳源固定为葡萄糖不同氮源的生长曲线；c.氮源固定为NaNO₃不同碳源的生长曲线；d.碳源固定位蔗糖不同氮源的生长曲线)

图8.负离子模式下717分子量质谱二级裂解规律图(a.发酵液中追踪717分子量二级裂解规律图；b.SAB标准品二级裂解规律图)

图9.重组酵母菌YW-S3C3FG外源质粒图谱(a.pRS424-S3C1质粒图谱；b.pRS425-aroG质粒图谱；c.pRS426-C2F质粒图谱)

图10.重组酵母菌YW-S3C3FG菌落PCR验证图(M：Wide 1000kb marker；1：CbHPPR；2：CbTAT；3：SmTAT；4：SmRAS；5：SmHPPR；6：Sm4CL2；7：FjTAL；8：aroG；9：AtCYP；10：CbCYP；11：AtCPR；12：CbCPR)

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细地说明，这些实例和附图仅起说明性作用，并不因此限制本发明的内容。因此，凡不违背本发明精神所做的修改及变形，均应包括在本发明范围内。

实施例1

pRS424-S4营养缺陷型多基因表达载体构建

(1)用Avr II和Not II限制性内切酶双酶切“P_ADH1-Sm2-T_ADH1”片段，用SalⅠ和NotⅠ限制性内切酶双酶切pRS424-Sm1表达载体，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收“P_ADH1-Sm2-T_ADH1”基因表达单元片段和pRS424-Sm1载体片段部分，酶切反应体系如下表所示，反应条件：37℃，2h。

组成成分	体积
		H<sub>2</sub>O	7μl
P<sub>ADH1</sub>-Sm2-T<sub>ADH1</sub>基因片段	10μl
		10×FD Buffer	2μl
Avr II(200U/μl)	0.5μl
		NotⅠ(200U/μl)	0.5μl
总体积	20ul

组成成分	体积
		H<sub>2</sub>O	7μl
pRS424-Sm1	10μl
		10×FD Buffer	2μl
NotⅠ(200U/μl)	0.5μl
		SalⅠ(200U/μl)	0.5μl
总体积	20ul

(3)P_ADH1-Sm2-T_ADH1基因表达单元片段与pRS424-Sm1载体片段连接，连接体系如下：

组成成分	体积
		10×T4连接缓冲液	1μl
T4连接酶	1μl
		pRS424-Sm1载体片段	3μl
P<sub>ADH1</sub>-Sm2-T<sub>ADH1</sub>	5μl
		总体系	10μl

(4)室温放置1h，进行连接反应；

(5)热激法转化大肠杆菌DH5α，转化方法同实施例2.菌液PCR鉴定阳性菌落。选择阳性克隆送样测序，鉴定“P_ADH1-Sm2-T_ADH1”基因片段已正确插入到pRS424-Sm1表达载体中。证明表达载体pRS424-Sm1-Sm2构建成功。

(6)采用步骤(1)～(5)同样策略，依次将“P_ADH1-Sm3-T_ADH1”、“P_ADH1-S4-T_ADH1”基因表达单元连接到pRS424-Sm1-Sm2后面，最终得到连有Sm1、Sm2、Sm3、Cb4共4个基因的载体pRS424-Sm1-Sm2-Sm3-Cb4，记为pRS424-S3C1。

实施例2

酵母菌感受态细胞的制备

(1)用无菌牙签在YPAD平板上挑取一个酵母菌株的单菌落，加入到5mL的YPAD液体培养基里，200rpm、30℃摇床振荡培养(同时将一瓶装有50ml 2×YPAD培养基的250mL培养瓶置于30℃培养箱进行预热)；

(2)酵母菌培养12h～16h后，测定培养液OD值，计算细胞浓度；

(3)取2.5×10⁸个细胞加到置于培养箱中预热的50mL 2×YPAD培养基的培养瓶中，计算细胞浓度为5×10⁶cell·mL^-1；

(4)200rpm、30℃摇床振荡培养4h～5h，至细胞浓度为2×10⁷cell·mL^-1；

(5)3000rpm、离心5min，25mL无菌水重悬细胞，室温离心，清洗，再重悬，再离心，最后用1.0mL的无菌水重悬酵母细胞；

(6)将酵母细胞悬浮液转移到1.5mL的无菌微量离心管中，13000g离心30s，弃去上清。用1.0mL的无菌水重悬，吸取包含有10⁸个细胞的100μl样品加入到新的1.5mL的无菌微量离心管中，悬浊液即为酵母菌感受态细胞。置-80℃冰箱保存，备用。

实施例3

重组质粒转化酵母菌感受态细胞

(1)取一管酵母菌感受态细胞，于13000g离心30s，弃去上清，得到沉淀于管底的酵母菌感受态细胞。

(2)混合转化液：

(3)将360μl转化液加入到第(1)步带有酵母菌感受态细胞的离心管中，用移液枪轻轻吹打重新悬浮酵母细胞，然后于42℃水浴40min；

(4)13000g离心30s，弃去上清，加入300μl无菌水，再次用移液枪温柔重悬细胞；

(5)吸取200μl细胞悬浮液，涂布到相应的Trp^-/Leu^-/Ura^-三缺的营养缺陷型培养基平板上(根据转化的质粒筛选标记选择相应缺陷型培养基平板)，30℃培养2d～3d；

(7)取单菌落进行菌落PCR鉴定，筛选阳性重组酵母菌YW-S3C3FG，结果如图2所示；阳性重组酵母菌YW-S3C3FG在液体培养基中培养1d～2d后，于-80℃冰箱保存，备用，该菌株中的质粒图谱如图3。

实施例4

LC-MS检测方法

LC-MS配备有电喷雾离子源(ESI源)，负离子模式监测，毛细管电压为3.5kV，离子源温度为120℃，气体温度为350℃，脱溶气体流量为60L/h，色谱柱为资生堂(Shiseido)CAPCELL PAK C18(2μm，2.1mmI.D.×100mm)，柱温30℃，以0.4％甲酸+5mM醋酸铵水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速0.3mL/min，进样体积为5μL。

1)全扫模式：按照90％A：10％B～64％A：36％B的梯度洗脱。洗脱时间12min，。分子量扫描范围50-800，MS/MS设置能量值为10eV，该方法可监测发酵液中化合物分子量，用于定性分析；

2)二级裂解模式：按照全扫模式中的梯度洗脱程序，分子量设定为717，MS/MS设置能量值为10eV，用该方法检测SAB标准品的二级离子碎片裂解规律和发酵液中717分子量的化合物二级裂解规律，结果如图4；

3)多反应监测模式：监测RA与SAB时用65％A和35％B等度洗脱5min，监测PA、pHPL、pHPP和DHPL时用75％A和25％等度洗脱5min，其他参数设置下表所示：

用该方法对各标品建立的标准曲线如图5；

实施例5

酶组合活性筛选

1TAT与HPPR酶组合活性筛选

1)按照实施例3中重组质粒转化酵母菌感受态细胞的方法生成YW-S2、YW-C2、YW-S1C1和YW-C1S1四种重组酵母菌株；

2)将上述四株重组酵母菌按照摇瓶培养方法进行发酵；

3)按照实施例4中LC-MS定量检测方法对发酵液主要中间产物PA、pHPP、pHPL和DHPL进行检测，结果如图6；

2CYP与CPR酶组合活性筛选

1)按照实施例1中多基因表达载体构建的方案构建pRS-424-S3C1、pRS424-S2C2、pRS426-C2和pRS426-A2四个多基因重组质粒；

2)按照实施例3中重组质粒转化酵母菌感受态细胞的方法生成YW-S3C3F、YW-S2C4F、YW-S3C1A2F和YW-S2C2A2F四种重组酵母菌株；

3)将上述四株重组酵母菌按照摇瓶培养方法进行发酵；

4)按照实施例4中LC-MS定量检测方法对发酵液PA、pHPL和RA进行检测，结果如下表：

实施例6

宿主菌株筛选

1)按照实施例1中所述构建出pRS424-S4多基因重组质粒；

2)按照实施例2中所述制备好W303a和BY4742两种酵母感受态细胞备用；

3)按照实施例3中重组质粒转化酵母菌感受态细胞的方法生成YW-S4C2FG和YB-S4C2FG两种重组酵母菌株；

4)将上述两株重组酵母菌按照摇瓶培养方法进行发酵；

5)按照实施例4中所述LC-MS定量检测方法对发酵液主要中间产物PA、pHPP、pHPL和DHPL进行检测，结果如图7；

实施例7

发酵条件的优化

1温度的优化

1)选择实施例6中生成的YW-S4C2FG重组酵母菌株进行温度的优化实验；

2)从10℃至30℃每隔五度设置一个实验发酵温度，按照摇瓶培养方法进行发酵；

3)按照实施例4中所述LC-MS定量检测方法对发酵液主要中间产物4-香豆酸(4-coumaric acid，PA)、4-羟基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvic acid，pHPP)和4-羟基苯乳酸(4-hydroxyphenyllactic acid，pHPL)pHPL进行检测，结果如图8；

2pH的优化

1)选择实施例6中生成的YW-S4C2FG重组酵母菌株和宿主菌株进行最适生长pH探究实验；

2)pH4.5至7.0每隔0.5设置一个pH实验点，培养基的pH利用不同pH的磷酸缓冲盐溶液进行调节，按照摇瓶培养方法进行发酵，发酵120h后取样测OD₆₀₀，酵母菌株最适生长pH如图9；

实施例8

不同碳源与氮源对酵母生长的影响

1)选取6种不同的碳源与氮源进行正交组合，形成如下表所示36种不同的培养基配方，按照表中配方配制培养基；

培养基配制方法：1)取20g酵母提取物溶解至1.6L去离子水中溶解并115℃灭菌15min作为不同碳氮源培养基的基底；2)分别按照表2.1.4中12种不同的碳源与氮源的终浓度的十倍配制相应的溶液，121℃20min灭菌后备用；3)于生物安全柜中取16mL培养基基底置于100mL锥形瓶中，并按表2.1.4中碳源与氮源的结合策略分别取2mL十倍浓度的碳氮源加至16mL培养基基底中，混匀。

2)按照摇瓶培养方法进行发酵，在发酵0h～120h之间多取样点测OD₆₀₀，绘制的生长曲线如图10；

实施例9

重组酵母菌YW-S3C3FG上罐发酵RA产率的定量

1)取出实施例3中保种的重组酵母菌YW-S3C3FG，按照上罐发酵培养方法进行发酵；

2)按照实施例4中所述LC-MS定量检测方法对发酵液主要中间产物CA、HPPA、PA、pHPL和RA进行检测，结果如图7；

Claims (7)

1.一种异源从头生物合成丹酚酸B的方法，其特征在于：外源生物合成途径与宿主内源酶共同催化SAB的生物合成。

2.一种异源从头生物合成丹酚酸B的方法，其特征在于：宿主菌株为酿酒酵母W303a株系。

3.一种异源从头生物合成丹酚酸B的方法,其特征在于：培养基以葡糖糖为碳源，蛋白胨为氮源，发酵温度为30℃，pH5.5最适宜酵母生长；

发酵罐发酵步骤如下：

(1)预培养：用接种环蘸取保存于-80℃冰箱的酵母工程菌YW-S4C2FG或从平板上挑取工程菌单菌落于3mL液体Trp^-/Leu^-/Ura^-三缺营养缺陷型培养基中，200rpm、30℃下震荡培养16h～24h，此为一级种子；

(2)扩大培养：以5％接种量将一级种子接种至50mL YPD培养基中，装于250mL锥形瓶中，、30℃200rpm震荡培养24h，即得二级种子；

(3)发酵罐接种：将二级种子以5％接种量接种至装有3L已灭菌的YPD培养基的发酵罐中，通气量保持2L/min，搅拌速率300rpm，不通过流加酸碱控制发酵的pH，30℃搅拌培养24h；

(4)发酵罐发酵：不添加任何补料，开始计时为发酵时长，发酵36～96h不等，在此区间不同时间点取样，用于质谱定量分析。

4.根据权利要求1-2的一种异源从头生物合成丹酚酸B的方法，其特征在于：

TAT、4CL、HPPR、RAS、CYP、CPR基因组合活性筛选，TAL和aroG基因的密码子优化，以及单基因、多基因酵母表达载体构建，重组工程菌宿主菌株的筛选，生物合成途径中各中间产物LC-MS分析方法，发酵条件的优化和发酵罐工艺流程。

5.根据权利要求1-3的一种异源从头生物合成丹酚酸B的方法，其特征在于：

RAS是迷迭香酸合成酶，4CL是4-香豆酰辅酶A连接酶，TAT是酪氨酸转氨酶，HPPR是4-羟基苯丙酮酸还原酶，CYP是细胞色素P450酶，CPR是细胞色素P450还原酶，TAL是酪氨酸解氨酶，aroG是3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶，用于编码这几个酶的基因依次记为：Sm1、Sm2、Sm3、Cb4、Cb1、Cb2、Fj、aroG。

6.根据权利要求1-2的一种异源从头生物合成丹酚酸B的方法，其特征在于：

Sm1、Sm2、Sm3三个基因来源于丹参(Salvia miltiorrhiza)，GenBank登录号依次是DQ334606、AY237164、DQ266514；

Cb1、Cb2、Cb4两个基因来源于彩叶草(Coleus blumei)，GenBank登录号依次是AJ427452、AM980997、AJ507733；

Fj基因来源于约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)，GenBank登录号是KR095307；

aroG基因来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，GenBank登录号是CP024826(1628265-1629317区)。

7.根据权利要求4的一种异源从头生物合成丹酚酸B的方法，其特征在于：所述的多基因表达载体构建采用同尾酶策略，通过引物设计引入同尾酶酶切位点，引物序列为：

P_ADH1-F：5’-GGCCGCCTCGAGAGTCCTAGGTCGAACAAGTCCGATCAGCTCATAA-3’

T_ADH1-R：5’-GGCCGCGCGGCCGCTAGTCGACTCGACTGAAGGCTAGGCTGTGGAT-3’。