CN109777814A

CN109777814A - 神经酰胺合成酶基因在调控灵芝三萜生物合成中的应用

Info

Publication number: CN109777814A
Application number: CN201910127690.XA
Authority: CN
Inventors: 赵明文; 鲁笑笑; 王云晓; 朱静; 任昂; 师亮; 于汉寿
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2039-02-21
Also published as: CN109777814B

Abstract

本发明提供了一种神经酰胺合成酶基因在调控灵芝三萜生物合成中的应用。通过基因沉默技术，将灵芝LAG2和LAG3基因共同沉默，以提高灵芝三萜的生物合成量。本专利通过RNA干扰手段，提供一种通过共同沉默神经酰胺合成酶基因LAG2和LAG3来提高灵芝三萜生物合成的重要遗传操作手段，为用基因工程技术手段提高灵芝三萜生物合成提供了理论基础。

Description

神经酰胺合成酶基因在调控灵芝三萜生物合成中的应用

技术领域

本发明主要以分子生物学领域为背景，具体涉及神经酰胺合成酶基因(Ceramidesynthase/Longevity assurance gene，LAG)在调控灵芝三萜生物合成中的应用。

背景技术

鞘脂、固醇和磷脂是构成细胞生物膜的三大脂质组分。其中，鞘脂以鞘氨醇、神经酰胺、葡萄糖基神经酰胺、肌醇磷脂酰神经酰胺等形式广泛存在于动物、植物和真菌中。其中，神经酰胺是鞘脂组成中最简单的部分。神经酰胺的从头合成途径包括：丝氨酸与棕榈酰辅酶A缩合反应生成3-羟基鞘氨醇；3-羟基鞘氨醇可进一步发生羟基化生成3，4-二羟基鞘氨醇；神经酰胺合成酶通过招募不同类型的鞘氨醇以及不同长度的脂肪酸链从而合成不同类型的神经酰胺。神经酰胺是鞘脂合成中心，可被葡萄糖神经酰胺合酶催化生成葡萄糖神经酰胺，也可被肌醇磷脂酰神经酰胺合成酶催化生成肌醇磷脂酰神经酰胺。因此，在鞘脂生物合成的过程中，神经酰胺合成酶(Ceramide synthase/Longevity assurance gene，LAG)是整个合成网络的中心。除此之外，鞘脂也参与广泛的生物学过程，如细胞信号转导、细胞抗逆反应，细胞的凋亡与自噬，调控膜的稳定性等。神经酰胺合成酶基因又称为寿命保证基因，对细胞正常的生长发育有重要的作用。鞘脂作为小分子物质，可将信号传递给下游，从调控次级代谢产物的合成。此外，LAG的同源基因在多种病原真菌中被报道参与生长，致病性以及鞘脂稳态等，如烟曲霉，白色念珠菌，新型隐球菌等。但是其确切的功能在大型担子菌中并没有研究报道。

灵芝(Ganoderma lucidum)是我国一种传统的药用真菌，是一种名贵的中草药，在我国传统医药学中应用历史悠久。经现代临床医学证明：灵芝具有抗肿瘤、保肝解毒、抗衰老、防中风、降血脂、治疗糖尿病、关节炎等疗效，药用前景广阔。目前，国内外研究人员已经从灵芝的子实体中分离出160多种化合物，主要包括：多糖、蛋白质、三萜等。其中三萜类化合物(又称灵芝酸Ganoderic acid)是灵芝重要药理活性的次级代谢产物之一，其含量多少亦成为衡量灵芝质量高低的重要指标。之前的研究主要集中在灵芝活性成分的分离，纯化和药理学分析，而对次级代谢生物合成的相关工作较少。目前灵芝基因组测序工作的完成，灵芝遗传转化体系和基因沉默技术的建立，为从分子遗传学水平探索灵芝三萜生物合成的研究提供技术支持。之前的研究报道了甲羟戊酸途径中的关键基因(甲羟戊酸脱羧酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶和鲨烯合酶)，参与ROS稳态相关基因(谷胱甘肽过氧化物酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶)，外源化学物质(水杨酸，乙酸和茉莉酸甲酯)均可以影响或调控灵芝三萜的合成。作为具有生物活性次生代谢产物的高级担子菌，灵芝已成为评估担子菌次生代谢的潜在模型真菌。

基于以上背景，本专利通过RNA干扰技术成功构建了LAG的沉默菌株，以此为材料研究了该基因在调控灵芝生长，鞘脂稳态以及三萜生物合成中的重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经酰胺合成酶LAG基因及其所编码的蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述灵芝LAG基因及其所编码的LAG蛋白在调节灵芝三萜生物合成或灵芝菌丝生长中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种提高灵芝三萜的生物合成量的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

灵芝LAG2和LAG3基因在调节灵芝三萜生物合成中的应用，所述LAG2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述LAG3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

作为一种优选技术方案，通过共同沉默灵芝菌丝体中的LAG2和LAG3基因来提高灵芝三萜的生物合成量。进一步优选的，共同沉默灵芝菌丝体中LAG2和LAG3基因的过程为：将所述LAG2和LAG3基因的共沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得灵芝LAG2和LAG3基因沉默的阳性转化子并进行培养。更进一步优选的，所述LAG2和LAG3基因的共沉默载体的构建过程为：设计正、反向上游引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得所述灵芝LAG2和LAG3基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的SpeI和KpnI酶切位点之间，获得所述LAG2和LAG3基因的共沉默载体。

一种灵芝LAG2和LAG3基因的共沉默载体，该载体的构建过程为：设计正、反向上游引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得所述灵芝LAG2和LAG3基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的SpeI和Kpn I酶切位点之间，获得所述LAG2和LAG3基因的共沉默载体(本发明也称为灵芝LAG23基因双沉默菌株)。

上述的灵芝LAG2和LAG3基因共沉默的载体或菌株在调节灵芝三萜生物合成中的应用。作为一种优选技术方案，通过共同沉默灵芝菌丝体中的LAG2和LAG3基因来提高灵芝三萜的生物合成量。进一步优选的，共同沉默灵芝菌丝体中LAG2和LAG3基因的过程为：将所述LAG2和LAG3基因的共沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得灵芝LAG2和LAG3基因沉默的阳性转化子并进行培养。

一种提高灵芝三萜的生物合成量的方法，通过共同沉默灵芝菌丝体中的LAG2和LAG3基因来提高灵芝三萜的生物合成量。优选的，将所述的LAG2和LAG3基因的共沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得灵芝LAG2和LAG3基因沉默的阳性转化子并进行培养。

本发明筛选了三种灵芝LAG基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示，灵芝中3个神经酰胺合成酶LAG1，LAG2和LAG3的cDNA全长分别为1089bp，1317bp和1431bp；灵芝LAG基因编码的LAG1,LAG2和LAG3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.6所示，分别含有362，438和476个氨基酸。

本发明通过构建灵芝LAG1，LAG2，LAG3和LAG23基因的沉默载体沉默灵芝菌丝体中的LAG1，LAG2和LAG3基因，研究灵芝LAG1，LAG2，LAG3基因对灵芝三萜生物合成的调控作用。

所述的灵芝LAG1，LAG2，LAG3和LAG23基因的沉默载体采用以下步骤构建：设计如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.14所示的正、反向上游引物，从灵芝总cDNA中扩增用于构建沉默载体的靶向干扰片段，所采用的基因沉默载体为pAN7-dual。

正向上游引物1：ACTGggtaccAGAGGAAGATGAACAGGAGC(SEQ ID NO.7)

反向上游引物1：ACTGactagtCAGGACAGCATGAATACGAC(SEQ ID NO.8)

正向上游引物2：ACTGggtaccTTTATTTCGCCTTCACG(SEQ ID NO.9)

反向上游引物2：ACTGactagtATCCACCAGACCAACCA(SEQ ID NO.10)

正向上游引物3：ACTGggtaccTCCCACCGAATACCTTC(SEQ ID NO.11)

反向上游引物3：ACTGactagtCGTAACTCCATCCCACTAG(SEQ ID NO.12)

正向上游引物4：ACTGggtaccCCCCGCAAGGACTATCA(SEQ ID NO.13)

反向上游引物4：ACTGactagtGCTCGTAATAGTCCTTGC(SEQ ID NO.14)

以上所示的序列为引物，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得灵芝LAG基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的KpnI和SpeI酶切位点之间，得到灵芝LAG1，LAG2，LAG3和LAG23基因沉默载体。构建沉默载体成功之后，将构建完成的基因沉默载体进行电穿孔转化方法，通过潮霉素抗性筛选，初步获得抗性菌株。最后经连续5次在不含有潮霉素的CYM培养基上转接培养，验证菌株的稳定性。通过LAG基因沉默后对灵芝胞内鞘脂稳态、灵芝三萜生物合成影响的研究结果表明，共同沉默灵芝菌丝体中的LAG2和LAG3基因可以显著提高灵芝三萜的生物合成量。

本发明的技术方案包括：1)灵芝3个LAG蛋白的氨基酸序列分析和进化树构建；2)灵芝LAG1，LAG2，LAG3,和LAG23基因沉默载体的构建；3)灵芝LAG沉默菌株的筛选；4)灵芝LAG在鞘脂稳态中的作用；5)灵芝LAG在灵芝三萜生物合成中的作用。本专利通过RNA干扰技术，提供了一种神经酰胺合成酶在调节灵芝菌丝三萜生物合中的重要作用，为今后采用遗传手段改造并提高灵芝三萜生物合成提供了理论基础。

本发明的有益效果：

本发明通过RNA干扰技术将灵芝神经酰胺合成酶基因LAG2和LAG3同时沉默后，提高了灵芝三萜的生物合成量。

附图说明

图1为灵芝中3个LAG蛋白的氨基酸序列比对

图2为LAG进化树分析

图3为LAG沉默载体的构建

图4为LAG沉默菌株的筛选

图5为LAG沉默后对鞘脂谱的影响

图6为LAG沉默后对灵芝三萜和三萜合成途径中关键中间代谢产物含量的检测及三萜合成途径中关键酶基因的表达水平检测

具体实施方式

实施例1：灵芝LAG沉默菌株的构建

1.灵芝LAG序列分析

本发明通过在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索得到的酿酒酵母神经酰胺合成酶LAG1和LAC1序列(登录编号分别为NP_011860.1和NP_012917.3)。将该序列在已知灵芝蛋白库中进比对(Chen et al.,2011)，得到三个灵芝中可能的神经酰胺合成酶LAG1，LAG2和LAG3(登录编号分别为MH145349，MH145350和MH145351)的cDNA序列。灵芝中神经酰胺合成酶基因LAG1全长为1089bp，编码362个氨基酸，LAG2的全长为1317bp，编码438个氨基酸，而LAG3的cDNA全长为1431bp，编码476个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示，灵芝中3个神经酰胺合成酶LAG1，LAG2和LAG3蛋白均含有经典的TLC结构域(图1)，除此之外，LAG2和LAG3的同源性较高，且都含有两个跨膜结构域，而LAG1蛋白只有一个跨膜结构域。说明LAG1与LAG2和LAG3在氨基酸序列以及结构域中就有明显区分。此外，我们也运用MEGA 6.0软件，将多个真菌的神经酰胺合成酶蛋白构建了进化树分析，结果显示灵芝中的神经酰胺合成酶LAG2和LAG3与其他物种的神经酰胺合成酶CerS2和CerS3的进化关系更近(图2)。

2.灵芝LAG沉默载体构建

(1)首先利用引物序列SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.14，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增，获得灵芝神经酰胺合成酶LAG1，LAG2，LAG3以及LAG23基因的靶向干扰片段。

用于扩增LAG1基因靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示；用于扩增LAG2基因靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示；用于扩增LAG3基因靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示；用于扩增LAG2和LAG3基因共同靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14所示。

如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.14所示的正、反向上游引物的序列如下所示：

正向上游引物1：ACTGggtaccAGAGGAAGATGAACAGGAGC(SEQ ID NO.7)

反向上游引物1：ACTGactagtCAGGACAGCATGAATACGAC(SEQ ID NO.8)

正向上游引物2：ACTGggtaccTTTATTTCGCCTTCACG(SEQ ID NO.9)

反向上游引物2：ACTGactagtATCCACCAGACCAACCA(SEQ ID NO.10)

正向上游引物3：ACTGggtaccTCCCACCGAATACCTTC(SEQ ID NO.11)

反向上游引物3：ACTGactagtCGTAACTCCATCCCACTAG(SEQ ID NO.12)

正向上游引物4：ACTGggtaccCCCCGCAAGGACTATCA(SEQ ID NO.13)

反向上游引物4：ACTGactagtGCTCGTAATAGTCCTTGC(SEQ ID NO.14)。

(2)将获得的PCR产物纯化回收，经KpnI和SpeI酶切后，连入沉默载体pAN7-dual(Mu et al.,2012，该载体的构建方法已在参考文献中公开，本领域技术人员根据公开的文献可以很容易构建该沉默载体pAN7-dual)中，转化大肠杆菌感受态细胞。

(3)挑取菌株进行菌落PCR验证后，将阳性菌株送华大基因进行测序，最终获得正确的沉默质粒，如附图3所示。

3.灵芝原生质体转化

(1)首先收集少量的培养4天的灵芝绒毛状菌丝体于1.5mL离心管中，加入1mL 2％(w/v，g/100ml)的溶壁酶，30℃水浴锅中溶解2小时，间或轻轻摇匀。离心后将上清去除，沉淀用0.6M的甘露醇洗涤2次。

(2)将获得的沉淀用电击缓冲液重悬，并加入步骤2中获得的正确的质粒后混匀，电击转化。将转化完的原生质体加入CYM上层培养基混匀后，倒入平板中，于28℃培养箱培养进行原生质体再生。

(3)将CYM平板上长出的菌落移入含有潮霉素抗性的平板中，经连续5次在不含有潮霉素的CYM培养基上转接后培养，获得生长稳定的菌株。

4.LAG沉默菌株的筛选鉴定

将步骤3中在潮霉素抗性平板上生长稳定的菌株，在CYM培养基中连续转接5次培养后，收集菌丝提取RNA，并反转录为cDNA(具体方法参考TAKARA试剂盒，货号RR014A)，用Real-time-PCR检测LAG基因的转录水平。

5.Real-time PCR具体操作及数值计算方法如下所示。

(1)扩增体系：根据TAKARA试剂盒(货号RR0036A)中的方法进行。

(2)Real-time PCR程序

根据TAKARA公司的Real-time PCR扩增程序对待测基因转录水平进行检测，通过溶解曲线峰是否单一来检测基因扩增的特异性。

(3)Real-time PCR数据处理

根据Real Time PCR的原理，运用△△Ct法，目标基因的相对量按公式得出：目标基因＝2-△△Ct，表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。其中△△Ct＝△Ct(Gene)-△Ct(Control).其中，△Ct(Gene)是样品目的基因的Ct值与同一样品的内参基因Ct值的差值。

结果如附图4所示，我们通过qRT-PCR筛选了两个沉默效率最高的菌株，分别为LAG1i-7和LAG1i-8，LAG2i-1和LAG2i-8，LAG3i-22和LAG3i-26以及LAG23i-4和LAG23i-5。

实施例2：神经酰胺合成酶基因LAG基因沉默后对灵芝胞内鞘脂稳态影响

神经酰胺是鞘脂组成中最简单的部分，也是鞘脂合成中心，可被葡萄糖神经酰胺合酶催化生成葡萄糖神经酰胺，也可被肌醇磷脂酰神经酰胺合成酶催化生成肌醇磷脂酰神经酰胺。通过对神经酰胺合成酶基因LAG基因沉默从而检测不同沉默菌株中鞘脂稳态的变化。

通过高效液相色谱串联质谱电喷雾法(LC-ESI-MS/MS)技术，系统地分析野生型(WT)，对照(SiControl),LAG1i，LAG2i和LAG3i的单沉默菌株以及LAG23i双沉默菌株鞘脂谱的变化，发现LAG2i-1和LAG2i-8，LAG3i-22和LAG3i-26的沉默菌株与野生型相比，其鞘脂谱无显著性变化(数据未显示)，而在LAG1i-7和LAG1i-8沉默菌株中，如图5所示，含有C14,C16和C18脂肪酸链(即总碳原子数分别为C32/C34/C36,比如34:0:2,34:0:3,34:0:4,36:0:2,36:2:2和36:3:2)的神经酰胺及复杂鞘脂含量显著降低，而大多数含有非常长链的C22,C24和C26脂肪酸(即总碳原子数分别为C40/C42，比如40:0:3,40:0:4,40:1:2,40:2:2和42:0:3)神经酰胺及复杂鞘脂含量显著升高；而LAG23i双沉默菌株中，主要是含有C22,C24和C26脂肪酸链的神经酰胺及复杂鞘脂含量显著降低，而含有长链脂肪酸(C14,C16和C18)的神经酰胺及复杂鞘脂含量显著升高。二者显示出截然不同的底物倾向性。

实施例3：神经酰胺合成酶基因LAG沉默后对灵芝三萜生物合成的影响

1.灵芝LAG对灵芝三萜生物合成的重要作用

在本专利中我们检测了LAG沉默菌株中灵芝三萜,关键中间代谢产物鲨烯和羊毛甾醇的含量。

总灵芝酸含量通过UPLC方法检测，具体方法如下：

(1)将培养好的菌丝最外沿的菌块接种于PDA液体培养基中，150rpm，28℃培养7天后用匀浆机进行无菌打碎，按照5％(v/v)的接种量接种于CYM液体培养基中，并150rpm，28℃发酵7天。将发酵完的菌丝收集后于60℃烘箱中烘干并研磨至粉末状，通过UPLC方法检测总灵芝酸的含量。

首先称取0.2g烘干的菌丝于10mL容量瓶中，加入95％(v/v)乙醇定容，用超声清洗仪超声破壁2小时，期间每20min摇动一次。超声完成后放于37℃恒温箱静置过夜，取8mL上层溶液，于60℃旋转蒸干后加入0.5mL甲醇进行溶解，溶解液用一次性有机相滤器过滤，通过UPLC(ultra-performance liquid chromatography)检测。

鲨烯和羊毛甾醇的测定方法：首先根据鲨烯和羊毛甾醇的标准品绘制标准曲线，具体操作和方法如下：

(1)使用Agilent 1290超高效液相色谱仪(UPLC)制备根据出峰时间和峰面积分别绘制鲨烯和羊毛甾醇的浓度梯度曲线，即标准曲线；

(2)将发酵完成的菌丝于60℃烘干至恒重并使用研钵研磨成粉末状；

(3)称取0.03g菌丝体粉末于2mL离心管中，加入1.5mL10％KOH-75％乙醇溶液于50℃水浴锅2h，期间20min轻轻摇匀一次；

(4)冷却后，12000g离心10min，取上清液于5mL离心管，加入相同体积的正己烷进行萃取，取上层溶液于新的试管中，重复萃取2～3次；

(5)用N₂将萃取液吹干，在试管中加入色谱级甲醇0.5mL进行充分溶解后使用0.22μm有机相滤器过滤到进样瓶中；

(6)UPLC上样，使用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱子，上样条件为：以100％甲醇为流动相，流速为0.5mL/min，进样量为1μL，检测波长为210nm。

(7)根据出峰时间和峰面积以及标准曲线计算鲨烯和羊毛甾醇的含量。

结果如图6所示，我们检测了各菌株中三萜，鲨烯和羊毛甾醇的含量以及及三萜合成途径中关键酶基因的表达水平检测。单独沉默LAG2，LAG3基因LAG2i-1和LAG2i-8，LAG3i-22和LAG3i-26沉默菌株的三萜，鲨烯和羊毛甾醇的含量没有发生显著变化，而同时沉默LAG2和LAG3，即LAG23i-4和LAG23i-5的灵芝三萜的含量显著升高。LAG23i-4和LAG23i-5沉默菌株中的三萜含量对比对照菌株的三萜含量高1.6倍和1.7倍(图6A)。同时三萜合成途径的关键酶中间代谢产物羊毛甾醇和鲨烯也有不同程度的显著上调(图6B和6C)，与野生菌株相比，LAG23i-4沉默菌株羊毛甾醇和鲨烯分别上调了约1.8和3.3倍，LAG23i-5沉默菌株羊毛甾醇和鲨烯分别上调了约1.7和4.3倍。同时，我们检测了各实验菌株中三萜的含量以及合成途径中关键酶基因的转录水平。在同时沉默LAG2和LAG3后，LAG23i-4和LAG23i-5的沉默菌株中三萜合成途径的关键酶基因hmgr、sqs和osc表达量也有不同程度的显著上调(图6D-6F)，这些结果表明将LAG2和LAG3基因共同沉默后能够显著提高灵芝三萜的含量。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 神经酰胺合成酶基因在调控灵芝三萜生物合成中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaataccg aggccgcccc cccgtggctt ccccgacagc tcgtcccctt ctttacgctt 60

tcctatccca ccgcacctcc tgcccacccc gactctttcc ccaattcaaa ctactatggc 120

gccggtcttc tcgacgcctg tatcctcgtc tccgctatcg ccgtcatggc cgttcttcgc 180

gacgtcacgc gtctttgggt ttgggagcca ttcgcccggt ggatactcac tcgggatttg 240

cgcaactcga agcggaacaa gctcgcgctt gccaacggca atggcaacac caacggcaag 300

gccaatggcg ccctgaacgg caacggccac gccgcccagt acttgatcac tcccgcggag 360

aagaggaaga tgaacaggag cgtcatgcgc ttcgccgagc agggctggtc cgtcatatac 420

tacactttca gttggtgtta cggcgtgtac gtgcaccgga acttccccac cgccgtcttg 480

aaccctatca acgtctggac cggttatccg catagtccgc tcgctggccc cgtcaagttc 540

tactacctcc tccagaccgc atgctacatt caccagatgc tcgtgctcaa tgctgaggct 600

cggagaaagg atcactggca gatgatgacc caccacgtta tcaccgtcgc gctcgagatc 660

gcgagttact tctacaactt cactcgtgtc ggctgcctcg tcttggtcct catggatctc 720

tgtgacggtc ttctgccgct ggccaagatg ctccgttact tgggcatgac cacgctatgt 780

gacctgacct tcgtcgtatt catgctgtcc tggttcttca cgcgacacgt cctcttcatg 840

tttgttatca aggccacctg ggagctctgg tatatcatcc cccgtgtatg ggacccctcg 900

cggggacact tcctcacgac ggagatctac tacgcgttta tctgtatgct tgtggcactt 960

caggtcattc agctggtctg gttctcgcag atctgccgcg tagcgtacag ggtagtgtcc 1020

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gacgactaa 1089

<210> 2

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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ccactcgggc aaggcgcgga ctcaccaggg cttcgcagca ttccaaatgc tccgtggtca 240

acccagtccc agggaacctg gaccgacatc agaaccctga gatgggtcat tgtgcctacc 300

tcgtctctca agatactctt gttcttcatc gtcctctggg ccaactggga actactctca 360

ccatatgtcg ccaaagacat ctcaaatccc ttctcccctc tcctcttcat ctcccatccg 420

ataccctcct cgtccgacca tgacccacgt taccagaagg gctacctcga cttcgttttc 480

ctcgcctact acattgtggt ttggtccttc gtgcgtcagg cgatcaccat ctacctctgc 540

cggccacttg caaggtggtt cggtatcaag aagtcggcga agatggatag attcggagag 600

caaggatatg ctatgattta tttcgccttc acgggtttct ggggtttgcg catcatgtct 660

caattaccaa cgtggtggta caacacgaag tacttctgga tcgactaccc tcattgggag 720

atgaagccag aattgaaggc atactatctc gtgcaggcgg cgtactggtg ccaacaactc 780

atcgtgcttc tcttgggact tgaaaagccc cgcaaggact atcacgagct tgtggctcac 840

catttcgtga cgctctggct tgtgggatgg agttacctag tcaacctcac cttcattggc 900

aacgctgtat acctcagcat ggacctcccg gattcaatat tcgcgttctc caagcttttg 960

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acctacttcc gccacttcct caactgggtc atcttgtact ctgtctggtt cgagtttgac 1080

ctcatgcccg agacatccaa gcggtggtcg ccagacgatg gcgtttggtt ggtctggtgg 1140

atgaaatatc agatattcgt accgctggtg ctgctacaag ctctcaacct cttctggtac 1200

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<210> 3

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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ctcatatccc gctcacctcg cccctctcct cccgacgcgc acttccccca tcccccacat 120

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gcgtactata tcgtattctg gtctttcatc cggcaagcgg tcaccatcta cctctgcctg 660

ccaattgcgc gttggtttgg tatcaagaag agggcgaaat tggaccgatt cggggagcag 720

ggttacgctg tgatttactt cgccttcaca gctagctggg gtatgcgcat tatgtcccaa 780

ttgccaacat ggtggtataa cacgaagtac ttttggattg actatccaca ctgggatatg 840

aagccagaac tcaaggcata ctatcttatg caagcagcat actggtgcca acagcttatc 900

gttcttctcc tgggactcga gaagcctcgc aaggactatt acgagctcgt agcccaccat 960

tttgtcacac tatggctagt gggatggagt tacgtcgtca atcttaccct catcggcaac 1020

gccgtatacc tcagcatgga tcttcccgat tcattacttg ggttctccaa gcttttaaac 1080

tatatccagt gggacaggac caagatcgcc acgttcgcat ttttcattgg tgtgtggagc 1140

tatttccgtc actggctcaa ctgggtcatc ctgtactcgg tttggttcga gtttgacctc 1200

atgcctgaga cgtccaaacg gtggtcgccg gaagacggtg tttggatggc gtcgtggatg 1260

aaatatcaag tgttcgcacc actggtgctg ctacaggctc tcaacctctt ctggtacttc 1320

ttgatcttgc gcattgccgc ccgggccgtg aaggacgtgg gcgtctctga cgtgcgttca 1380

gacgaagaag atgatggtca agacgacacc gatgacgaca aggaagacta g 1431

<210> 4

<211> 362

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Asn Thr Glu Ala Ala Pro Pro Trp Leu Pro Arg Gln Leu Val Pro

1 5 10 15

Phe Phe Thr Leu Ser Tyr Pro Thr Ala Pro Pro Ala His Pro Asp Ser

20 25 30

Phe Pro Asn Ser Asn Tyr Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Asp Ala Cys Ile

35 40 45

Leu Val Ser Ala Ile Ala Val Met Ala Val Leu Arg Asp Val Thr Arg

50 55 60

Leu Trp Val Trp Glu Pro Phe Ala Arg Trp Ile Leu Thr Arg Asp Leu

65 70 75 80

Arg Asn Ser Lys Arg Asn Lys Leu Ala Leu Ala Asn Gly Asn Gly Asn

85 90 95

Thr Asn Gly Lys Ala Asn Gly Ala Leu Asn Gly Asn Gly His Ala Ala

100 105 110

Gln Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Glu Lys Arg Lys Met Asn Arg Ser Val

115 120 125

Met Arg Phe Ala Glu Gln Gly Trp Ser Val Ile Tyr Tyr Thr Phe Ser

130 135 140

Trp Cys Tyr Gly Val Tyr Val His Arg Asn Phe Pro Thr Ala Val Leu

145 150 155 160

Asn Pro Ile Asn Val Trp Thr Gly Tyr Pro His Ser Pro Leu Ala Gly

165 170 175

Pro Val Lys Phe Tyr Tyr Leu Leu Gln Thr Ala Cys Tyr Ile His Gln

180 185 190

Met Leu Val Leu Asn Ala Glu Ala Arg Arg Lys Asp His Trp Gln Met

195 200 205

Met Thr His His Val Ile Thr Val Ala Leu Glu Ile Ala Ser Tyr Phe

210 215 220

Tyr Asn Phe Thr Arg Val Gly Cys Leu Val Leu Val Leu Met Asp Leu

225 230 235 240

Cys Asp Gly Leu Leu Pro Leu Ala Lys Met Leu Arg Tyr Leu Gly Met

245 250 255

Thr Thr Leu Cys Asp Leu Thr Phe Val Val Phe Met Leu Ser Trp Phe

260 265 270

Phe Thr Arg His Val Leu Phe Met Phe Val Ile Lys Ala Thr Trp Glu

275 280 285

Leu Trp Tyr Ile Ile Pro Arg Val Trp Asp Pro Ser Arg Gly His Phe

290 295 300

Leu Thr Thr Glu Ile Tyr Tyr Ala Phe Ile Cys Met Leu Val Ala Leu

305 310 315 320

Gln Val Ile Gln Leu Val Trp Phe Ser Gln Ile Cys Arg Val Ala Tyr

325 330 335

Arg Val Val Ser Gly Gln Gly Ala Glu Asp Thr Arg Ser Asp Asp Glu

340 345 350

Asp Asp Asp Asp Asp His Lys Lys Asp Asp

355 360

<210> 5

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ser Arg Pro Leu Lys Asn Arg Lys Lys Pro Leu Pro Gln Ile Arg

1 5 10 15

Thr Phe Thr Asp Arg Ile Glu His Asp Pro Ser His His Leu Thr Gly

20 25 30

Pro Phe Arg Pro Gln Thr Ser Ala His Tyr Arg Pro Phe Ser Asp Leu

35 40 45

Asn Asp Ala Val Phe Thr Arg Phe Thr Arg Ser Arg Pro Leu Gly Gln

50 55 60

Gly Ala Asp Ser Pro Gly Leu Arg Ser Ile Pro Asn Ala Pro Trp Ser

65 70 75 80

Thr Gln Ser Gln Gly Thr Trp Thr Asp Ile Arg Thr Leu Arg Trp Val

85 90 95

Ile Val Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ile Leu Leu Phe Phe Ile Val Leu

100 105 110

Trp Ala Asn Trp Glu Leu Leu Ser Pro Tyr Val Ala Lys Asp Ile Ser

115 120 125

Asn Pro Phe Ser Pro Leu Leu Phe Ile Ser His Pro Ile Pro Ser Ser

130 135 140

Ser Asp His Asp Pro Arg Tyr Gln Lys Gly Tyr Leu Asp Phe Val Phe

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Tyr Ile Val Val Trp Ser Phe Val Arg Gln Ala Ile Thr

165 170 175

Ile Tyr Leu Cys Arg Pro Leu Ala Arg Trp Phe Gly Ile Lys Lys Ser

180 185 190

Ala Lys Met Asp Arg Phe Gly Glu Gln Gly Tyr Ala Met Ile Tyr Phe

195 200 205

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210 215 220

Trp Trp Tyr Asn Thr Lys Tyr Phe Trp Ile Asp Tyr Pro His Trp Glu

225 230 235 240

Met Lys Pro Glu Leu Lys Ala Tyr Tyr Leu Val Gln Ala Ala Tyr Trp

245 250 255

Cys Gln Gln Leu Ile Val Leu Leu Leu Gly Leu Glu Lys Pro Arg Lys

260 265 270

Asp Tyr His Glu Leu Val Ala His His Phe Val Thr Leu Trp Leu Val

275 280 285

Gly Trp Ser Tyr Leu Val Asn Leu Thr Phe Ile Gly Asn Ala Val Tyr

290 295 300

Leu Ser Met Asp Leu Pro Asp Ser Ile Phe Ala Phe Ser Lys Leu Leu

305 310 315 320

Asn Tyr Ile Gln Trp Asp Arg Ala Lys Val Val Thr Phe Ser Leu Phe

325 330 335

Val Cys Ile Trp Thr Tyr Phe Arg His Phe Leu Asn Trp Val Ile Leu

340 345 350

Tyr Ser Val Trp Phe Glu Phe Asp Leu Met Pro Glu Thr Ser Lys Arg

355 360 365

Trp Ser Pro Asp Asp Gly Val Trp Leu Val Trp Trp Met Lys Tyr Gln

370 375 380

Ile Phe Val Pro Leu Val Leu Leu Gln Ala Leu Asn Leu Phe Trp Tyr

385 390 395 400

Phe Leu Ile Trp Arg Val Ala Ala Arg Ala Leu Ser Asn Gln Asn Ile

405 410 415

Thr Asp Val Arg Ser Asp Asp Glu Asp Asp Gly Glu Asp Asp Gly His

420 425 430

Asp Asp Lys Lys Glu Asp

435

<210> 6

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ser Ala Arg Trp Met Pro Gly Ser Pro Ser Leu Gly Glu Arg Leu

1 5 10 15

Ile Leu Pro Leu Ile Ser Arg Ser Pro Arg Pro Ser Pro Pro Asp Ala

20 25 30

His Phe Pro His Pro Pro His Ser Leu Ser Leu Gly Leu Ile Val Arg

35 40 45

Ser Ser Val Gln Met Pro Arg Leu Pro Glu Ala Lys Lys Arg Pro Leu

50 55 60

Pro Pro Ile Arg Thr Phe Thr His Arg Ile Glu Asp Asp Pro Ser His

65 70 75 80

His Leu Val Gly Pro Phe Arg Pro Gln Thr Pro Leu Gly Gln Glu Ser

85 90 95

Val Pro Ser Ser Pro Gly Thr Pro Val Trp Val Asn Gly His Pro Leu

100 105 110

Ser Ser Trp Ser Thr Gln Ser His Gly Phe Trp Thr Asp Ile Lys Thr

115 120 125

Leu Arg Trp Val Ile Val Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ile Leu Leu Phe

130 135 140

Phe Val Val Leu Trp Ala Asn Trp Glu Ile Leu Ser Pro Tyr Met Ala

145 150 155 160

Lys Asp Ala Gln Pro Pro Asn Pro Phe Thr Pro Phe Leu Phe Ile Ser

165 170 175

His Arg Ile Pro Ser Ser Pro Asp Asn Asp Pro Arg Tyr Gln Lys Gly

180 185 190

Phe Leu Asp Phe Ala Phe Leu Ala Tyr Tyr Ile Val Phe Trp Ser Phe

195 200 205

Ile Arg Gln Ala Val Thr Ile Tyr Leu Cys Leu Pro Ile Ala Arg Trp

210 215 220

Phe Gly Ile Lys Lys Arg Ala Lys Leu Asp Arg Phe Gly Glu Gln Gly

225 230 235 240

Tyr Ala Val Ile Tyr Phe Ala Phe Thr Ala Ser Trp Gly Met Arg Ile

245 250 255

Met Ser Gln Leu Pro Thr Trp Trp Tyr Asn Thr Lys Tyr Phe Trp Ile

260 265 270

Asp Tyr Pro His Trp Asp Met Lys Pro Glu Leu Lys Ala Tyr Tyr Leu

275 280 285

Met Gln Ala Ala Tyr Trp Cys Gln Gln Leu Ile Val Leu Leu Leu Gly

290 295 300

Leu Glu Lys Pro Arg Lys Asp Tyr Tyr Glu Leu Val Ala His His Phe

305 310 315 320

Val Thr Leu Trp Leu Val Gly Trp Ser Tyr Val Val Asn Leu Thr Leu

325 330 335

Ile Gly Asn Ala Val Tyr Leu Ser Met Asp Leu Pro Asp Ser Leu Leu

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Leu Asn Trp Val Ile Leu Tyr Ser Val Trp Phe Glu Phe Asp Leu Met

385 390 395 400

Pro Glu Thr Ser Lys Arg Trp Ser Pro Glu Asp Gly Val Trp Met Ala

405 410 415

Ser Trp Met Lys Tyr Gln Val Phe Ala Pro Leu Val Leu Leu Gln Ala

420 425 430

Leu Asn Leu Phe Trp Tyr Phe Leu Ile Leu Arg Ile Ala Ala Arg Ala

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Val Lys Asp Val Gly Val Ser Asp Val Arg Ser Asp Glu Glu Asp Asp

450 455 460

Gly Gln Asp Asp Thr Asp Asp Asp Lys Glu Asp

465 470 475

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actgggtacc agaggaagat gaacaggagc 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actgactagt caggacagca tgaatacgac 30

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actgggtacc tttatttcgc cttcacg 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actgactagt atccaccaga ccaacca 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

actgggtacc tcccaccgaa taccttc 27

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

actgactagt cgtaactcca tcccactag 29

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

actgggtacc ccccgcaagg actatca 27

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actgactagt gctcgtaata gtccttgc 28

Claims

1.灵芝LAG2和LAG3基因在调节灵芝三萜生物合成中的应用，所述LAG2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述LAG3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过共同沉默灵芝菌丝体中的LAG2和LAG3基因来提高灵芝三萜的生物合成量。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，共同沉默灵芝菌丝体中LAG2和LAG3基因的过程为：将所述LAG2和LAG3基因的共沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得灵芝LAG2和LAG3基因沉默的阳性转化子并进行培养。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述LAG2和LAG3基因的共沉默载体的构建过程为：设计正、反向上游引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得所述灵芝LAG2和LAG3基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的SpeI和KpnI酶切位点之间，获得所述LAG2和LAG3基因的共沉默载体。

5.一种灵芝LAG2和LAG3基因的共沉默载体，其特征在于，该载体的构建过程为：设计正、反向上游引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得所述灵芝LAG2和LAG3基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的SpeI和KpnI酶切位点之间，获得所述LAG2和LAG3基因的共沉默载体。

6.灵芝LAG2和LAG3基因共沉默的载体或菌株在调节灵芝三萜生物合成中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过共同沉默灵芝菌丝体中的LAG2和LAG3基因来提高灵芝三萜的生物合成量。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，共同沉默灵芝菌丝体中LAG2和LAG3基因的过程为：将所述LAG2和LAG3基因的共沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得灵芝LAG2和LAG3基因沉默的阳性转化子并进行培养。

9.一种提高灵芝三萜的生物合成量的方法，其特征在于：通过共同沉默灵芝菌丝体中的LAG2和LAG3基因来提高灵芝三萜的生物合成量。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：将所述的LAG2和LAG3基因的共沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得灵芝LAG2和LAG3基因沉默的阳性转化子并进行培养。