CN108913708B

CN108913708B - 一种硫化氢合酶基因在调控灵芝三萜生物合成中的应用

Info

Publication number: CN108913708B
Application number: CN201810616054.9A
Authority: CN
Inventors: 赵明文; 田嘉龙; 任昂; 朱静; 师亮; 于汉寿
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Lianyungang Daqing Edible Fungi Co.,Ltd.
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: CN108913708A

Abstract

本发明公开了一种硫化氢合酶基因在调控灵芝三萜生物合成中的应用。通过基因沉默技术，将灵芝CBS基因沉默，以提高灵芝三萜的生物合成量。本专利通过RNA干扰手段，提供一种通过沉默硫化氢合酶基因来提高灵芝三萜生物合成的重要遗传操作手段，为用基因工程技术手段提高灵芝三萜生物合成提供了理论基础。

Description

一种硫化氢合酶基因在调控灵芝三萜生物合成中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种硫化氢合酶基因(cystathionine β-synthase，CBS)在调控灵芝三萜生物合成中的应用。

背景技术

真菌在生长过程中受到一系列外界环境的胁迫，包括氧化胁迫，渗透压胁迫，高温胁迫等。而在经受各种外界环境的刺激之后，真菌也随之进化出了各种相应的生理机制来保护自身、抵御外界环境胁迫。硫化氢作为近年来新兴的第三种气体信号分子，相关的生理学和功能学研究也日趋深入。在动物方面，硫化氢研究集中在内源性硫化氢发挥功能的机理上如对于靶向蛋白的研究和与其他信号分子之间的互作上；而在植物中的研究主要集中在抵御外界环境胁迫如重金属胁迫、盐胁迫等；在微生物中，硫化氢的研究方面则相对集中在降低酿酒酵母发酵葡萄酒过程中如何降低硫化氢的生成。胱硫醚-β-合酶(cystathionine β-synthase，CBS)是生物体中主要内源性硫化氢合酶之一，并被广泛应用于各研究模型。

灵芝(Ganoderma lucidum)是一种著名的药用担子菌，能产生大量的具有生物活性的化合物，并具有相应的调节免疫、抗肿瘤和抗氧化等功效。在中国和东南亚地区长期以来一直被用作治疗疾病的辅助药物。先前的研究大部分集中于灵芝活性成分的分离和结构测定。灵芝三萜(GA)是一种三萜类化合物，是灵芝体内具有药理活性的最重要的次级代谢产物之一，因此被作为灵芝中重要的药用指标之一。目前，与灵芝中活性成分的分离，纯化和药理学分析相比，次级代谢生物合成的分析工作较少。近年来灵芝全基因组序列测定的完成以及灵芝遗传转化体系和基因沉默技术的发展，为对灵芝进行进一步的基础生物学研究提供了平台。多个研究报道了能够影响或调控灵芝三萜合成的基因，包括甲羟戊酸途径中的关键基因(甲羟戊酸脱羧酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、鲨烯合酶、细胞色素P450还原酶)、参与ROS稳态相关基因(谷胱甘肽过氧化物酶、细胞色素P450还原酶)等。因此，作为具有生物活性次生代谢产物的高级担子菌，灵芝已成为评估环境因子如何调节担子菌次生代谢的潜在模型真菌。

基于以上背景，本专利通过RNA干扰技术成功构建了CBS的沉默菌株，以此为材料研究了该基因在调控灵芝胞内硫化氢含量及三萜生物合成中的重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵芝硫化氢合酶基因CBS及其所编码的蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述灵芝硫化氢合酶基因CBS在调节灵芝三萜生物合成中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种提高灵芝三萜的生物合成量的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明提供的灵芝CBS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA全长1191bp；该灵芝CBS基因编码的CBS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有396个氨基酸。

ATGGCTCGTACACCGCAAATCATCGACAACGCTCTCGGGGCTGTCGGAAACACTCCGCTCGTCAGGCTAGACCGAATTGCCAAGGAAGAGGGATTACAATGCAATTTACTGGGAAAGGTTGAATATATGTCAGCGGGGGGATCCGTTAAGGACCGCATTGCAAAGCGCATGGTTGAGGAGGCTGAGAGAGAAGGGAAGCTCATTCCGGGGCACAGTGTCGTTATTGAGCCGACCTCTGGCAACACTGGCATTGGCCTCGCAATGGCTTGCGCAATCAAGGGATACTCTGTGATCATCACGTTGCCTAACAAGATGTCGTTGGAAAAGGAAGCCACTTTGCGAGCATTAGGGGCGGAAGTCGTCAGGACTCCTACCGAAGCTGCTTGGGACTCGCCAGAGTCACACATAGGAGTTGCGAATCGGCTTCAACGTGAGATCCCAGATGGTATTATCCTAGACCAATACCGCAACATCAACAATCCTCTTGCTCACGAGTACACCACCGGCCCGGAAATTGTCGAGTCGGTTACTTCAACACCGTCGACTGCCGAGCGACCATCCTCAGGAAAGGTCGATGCTCTGGTCGCAGGTGCTGGTACTGGTGGCACGATTACTGGTCTGTCTCGAGCAATCAAGAAGAAGCACAACAGGAATTGTGTTGTCGTTGGAGTTGATCCCAAAGGCAGCATTCTTGCGTACCCTGATGACCTCAACATCGAAGGCTCAGGCGACCCGTATGTGGTTGAAGGCATTGGTTACGACTTCATCCCGCATGTTCTTTCGCGTGACCCAGTGGACGTGAACGAGTGGCTGAAGACCTCCGACGCGGAAGCATTCGATGCCGTCCGGCTCCTCATGCGCCATGAAGGCCTCCTTGTCGGGGGGAGCAGTGGAAGCGCACTGAGCGGCGCCCTTCGCTGGCTCCGGAGCGACAAGGGCCGGGCTATCGCCCAGACCCAGGGCGCGAACGTCGTGGTGCTCCTTCCAGACGGCATTCGTAACTATATGAGCAAACCGTGGTTCCTGAAGATGGCACTAGAAGCCGAACCGACCCCTCTCGCTCGTCGCATTGCCGACGTGCTCTCGACGCCGGAGAACGCCGTGCGTCCCAATGACAATGGCAGCGCAAACGGTACTTCAACCTCAGATGCCAAGGATCGGCTCAACGCTGTCGGGGAGGCGTCACGTTGA(SEQ ID NO.1)。

MARTPQIIDNALGAVGNTPLVRLDRIAKEEGLQCNLLGKVEYMSAGGSVKDRIAKRMVEEAEREGKLIPGHSVVIEPTSGNTGIGLAMACAIKGYSVIITLPNKMSLEKEATLRALGAEVVRTPTEAAWDSPESHIGVANRLQREIPDGIILDQYRNINNPLAHEYTTGPEIVESVTSTPSTAERPSSGKVDALVAGAGTGGTITGLSRAIKKKHNRNCVVVGVDPKGSILAYPDDLNIEGSGDPYVVEGIGYDFIPHVLSRDPVDVNEWLKTSDAEAFDAVRLLMRHEGLLVGGSSGSALSGALRWLRSDKGRAIAQTQGANVVVLLPDGIRNYMSKPWFLKMALEAEPTPLARRIADVLSTPENAVRPNDNGSANGTSTSDAKDRLNAVGEASR(SEQ ID NO.2)。

本发明中提供的灵芝CBS基因沉默载体，采用以下步骤构建：设计如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的正、反向上游引物，从灵芝总cDNA中扩增用于构建沉默载体的靶向干扰片段，所采用的基因沉默载体为pAN7-dual。

正向上游引物：ACTGggtaccAGGTGCTGGTACTGGTGG(SEQ ID NO.3)

反向上游引物：ACTGactagtCCTGGGTCTGGGCGATA(SEQ ID NO.4)

以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列为引物，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得灵芝CBS基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的KpnI和SpeI酶切位点之间，得到灵芝CBS基因沉默载体。

本发明所述CBS基因沉默的方法，具体为：首先通过PCR扩增获得灵芝CBS基因的靶向干扰片段，并加入适当酶切位点(KpnI和SpeI)后连接入基因沉默载体中，构建沉默载体成功之后，其次将构建完成的基因沉默载体进行电穿孔转化方法，通过潮霉素抗性筛选，初步获得抗性转化子。最后经连续5次在不含有潮霉素的CYM培养基上转接培养，验证转化子的稳定性。

上述的灵芝CBS基因或灵芝CBS基因沉默载体在调节灵芝三萜生物合成中的应用。该应用是通过沉默灵芝菌丝体中的CBS基因来提高灵芝三萜的生物合成量。该应用具体为，将所述的灵芝CBS基因沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得CBS基因沉默的阳性转化子并进行培养。

一种提高灵芝三萜的生物合成量的方法，通过沉默灵芝菌丝体中的CBS基因来提高灵芝三萜的生物合成量。

本发明还提供利用荧光染料SF7-AM检测CBS沉默后胞内硫化氢的水平的方法。具体步骤为：获得少量灵芝菌丝，用10μM的SF7-AM荧光探针染液，37℃染色30分钟，在荧光显微镜激发光波长488nm条件下观察绿色荧光强度。

本发明提供灵芝三萜含量的检测方法。具体为首先称取0.02g烘干的灵芝菌丝，放入10mL容量瓶中，加入95％乙醇定容，超声波破壁2小时，期间每20min摇动一次。其次取8mL于37℃静置过夜后，60℃旋转蒸干，加入0.5mL甲醇溶解，溶解液置于1.5mL离心管中。最后将溶液离心后，用一次性有机相滤器过滤，通过UPLC(ultra-performance liquidchromatography)检测。

本发明的技术方案包括：1)灵芝CBS蛋白的氨基酸序列分析和进化树构建；2)灵芝CBS基因沉默载体的构建；3)灵芝CBS沉默菌株的筛选；4)灵芝CBS影响胞内硫化氢的水平；5)灵芝CBS及其调控的硫化氢含量在灵芝三萜生物合成中的作用。本专利通过RNA干扰技术，提供了一种硫化氢合酶CBS在调节灵芝菌丝三萜生物合中的重要作用，为今后采用遗传手段改造并提高灵芝三萜生物合成提供了理论基础。

本发明的有益效果：

本发明通过RNA干扰技术将灵芝硫化氢合酶基因CBS沉默后，验证了该基因产生的硫化氢在灵芝三萜合成中的作用。

附图说明

图1为CBS蛋白的氨基酸序列分析

图2为CBS进化树分析

图3为CBS沉默载体的构建

图4为CBS沉默菌株的筛选

图5为CBS沉默后对胞内硫化氢的影响

图6为灵芝三萜含量及三萜合成途径中关键中间代谢产物含量的检测

图7为CBS通过调控胞内硫化氢影响灵芝三萜的生物合成

具体实施方式

实施例1：灵芝CBS沉默菌株的构建

1.灵芝CBS序列分析

本发明通过在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索得到的污叉丝孔菌CBS蛋白(蛋白编号为XP_007359872.1)的氨基酸序列。将该序列在已知灵芝蛋白库中进比对(Chen et al.,2011)，得到一个灵芝中可能的CBS蛋白(蛋白编号为MG552121.1)，并根据此蛋白编号在灵芝cDNA库中得到对应序列。CBS含有1191个碱基(如SEQ ID NO.1所示)，编码396个氨基酸(如SEQ ID NO.2所示)。多序列比对结果显示，灵芝CBS蛋白含有经典的CBS_like复合结构域(图1)，说明我们找到的蛋白可能是灵芝CBS蛋白，并且在功能上与其他真菌中的CBS类似。此外，我们也运用MEGA 6.0软件，将多个真菌的CBS蛋白构建了进化树分析，结果显示灵芝CBS与污叉丝孔菌进化关系更近(图2)。

2.灵芝CBS沉默载体构建

(1)首先利用引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增，获得灵芝CBS基因的靶向干扰片段。

(2)将获得的PCR产物纯化回收，经KpnI和SpeI酶切后，连入沉默载体pAN7-dual(Mu et al.,2012，该载体的构建方法已在参考文献中公开，本领域技术人员根据公开的文献可以很容易构建该沉默载体pAN7-dual)中，转化大肠杆菌感受态细胞。

(3)挑取转化子进行菌落PCR验证后，将阳性转化子送华大基因进行测序，最终获得正确的沉默质粒pAN-7-dual-CBS，如附图3所示。

3.灵芝原生质体转化

(1)首先收集少量的培养4天的灵芝绒毛状菌丝体于1.5mL离心管中，加入1mL 2％(w/v，g/100ml)的溶壁酶，30℃水浴锅中溶解2小时，间或轻轻摇匀。离心去除上清，沉淀用0.6M的甘露醇洗涤2次。

(2)将获得的沉淀用电击缓冲液重悬，并加入步骤2中获得的正确的pAN-7-dual-CBS质粒后混匀，电击转化。将转化完的原生质体加入CYM上层培养基混匀后，倒入平板中，于28℃培养箱培养进行原生质体再生。

(3)将CYM平板上长出的菌落移入含有潮霉素抗性的平板中，经连续5次在不含有潮霉素的CYM培养基上转接后培养，获得生长稳定的转化子。

4.CBS沉默菌株的筛选鉴定

将步骤3中在潮霉素抗性平板上生长稳定的转化子，在CYM培养基中连续转接5次培养后，收集菌丝提取RNA，并反转录为cDNA(具体方法参考TAKARA试剂盒，货号RR014A)，用Real-time-PCR检测CBS基因的转录水平。

5.Real-time PCR具体操作及数值计算方法如下所示。

(1)扩增体系：根据TAKARA试剂盒(货号RR0036A)中的方法进行。

(2)Real-time PCR程序

根据荧光定量PCR的原理，根据TAKARA公司的Real-time PCR扩增程序，对待测基因转录水平进行检测，基因扩增的特异性通过溶解曲线来检测。

(3)Real-time PCR数据处理

根据Real Time PCR的原理，目标基因的相对表达量按2^-ΔΔCt公式来计算，表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。其中△△Ct＝△Ct(实验组)-△Ct(对照)，△Ct(实验组)为样品目的基因的Ct值与同一样品的内参基因Ct值的差值，△Ct(对照)为对照组目的基因的Ct值与内参基因Ct值之差。

结果如附图4所示，我们通过qRT-PCR筛选了两个沉默效率为70％和65％的沉默菌株，分别为CBSi15和CBSi29。

实施例2：硫化氢合成酶基因(CBS)对胞内硫化氢含量的影响

1、灵芝胞内硫化氢的检测

目前普遍认为CBS基因是生物体内合成内源性硫化氢的重要合酶，因此本专利检测了该基因沉默后灵芝菌丝内硫化氢水平。

本发明提供利用荧光染料SF7-AM检测CBS沉默后胞内硫化氢的水平的方法。具体步骤如下：将菌块接种于CYM固体培养基中生长4天后，将盖玻片斜插在菌丝周围，继续培养。待菌丝长到盖玻片中部时，将盖玻片取下，去除一侧菌丝，将另一侧菌丝孵育在10μM的SF7-AM荧光探针染液中，37℃染色30分钟，在荧光显微镜激发光波长488nm条件下观察绿色荧光强度，荧光显微镜拍照观察。

2、灵芝CBS基因对于胞内硫化氢合成的影响

结果如图6A所示，通过荧光染料SF7-AM染色后，在荧光显微镜下观察，CBS沉默菌株中的硫化氢荧光强度比野生菌株中的显著降低。在前人研究报道中，CBS作为生物体内主要合成内源硫化氢的合酶发挥着重要的生物学功能，而在本研究中，我们也发现了在灵芝体内，CBS基因负责内源性硫化氢的生物合成作用，当我们使用RNA干扰技术对其进行基因沉默之后，检测发现灵芝体内的硫化氢生成确实降低了。

实施例3：硫化氢合酶基因CBS沉默后对灵芝三萜生物合成的影响

1.灵芝CBS对灵芝三萜生物合成的重要作用

在本专利中我们检测了CBS沉默菌株中灵芝三萜含量及关键中间代谢产物鲨烯和羊毛甾醇的含量。

UPLC方法检测总灵芝酸含量的方法具体如下：

(1)选择PDA平板中菌丝生长最外沿的菌块接种于液体PDA中，150rpm，28℃培养7天。将制备好的液体菌种用匀浆机进行无菌打碎，按5％(v/v)的接种量接种于CYM液体培养基中，150rpm 28℃发酵7天。收集发酵完的菌丝于70℃烘箱中烘干，液氮研磨至粉末状，UPLC方法检测总灵芝酸的含量。首先称取0.02g烘干的灵芝菌丝，放入10mL容量瓶中，加入95％(v/v)乙醇定容，超声波破壁2小时，期间每20min摇动一次。其次取8mL于37℃静置过夜后，60℃旋转蒸干，加入0.5mL甲醇溶解，溶解液置于1.5mL离心管中。最后将溶液离心后，用一次性有机相滤器过滤，通过UPLC(ultra-performance liquid chromatography)检测。

鲨烯和羊毛甾醇的测定方法：鲨烯和羊毛甾醇测定使用文献中报道的方法(Renet al.,2010)，首先使用鲨烯和羊毛甾醇的标准品绘制标准曲线，具体操作和方法如下：

(1)使用Agilent 1290超高效液相色谱仪(UPLC)制备根据出峰时间和峰面积分别绘制鲨烯和羊毛甾醇的浓度梯度曲线，即标准曲线；

(2)收取发酵完成的灵芝菌丝，于60℃烘干至恒重并使用研钵研磨成粉末状；

(3)在2mL离心管中称取粉末0.03g，加入10％KOH-75％乙醇溶液1.5mL，于50℃水浴锅孵育2h，间或轻轻摇匀；

(4)冷却后，12000g，10min离心，取上清液于5mL离心管，使用相同体积的正己烷萃取，取上层溶液到新的试管中，重复萃取2～3次；

(5)使用N₂吹干，在试管中加入色谱级甲醇500μL进行溶解，充分溶解后使用0.22μm有机相滤器过滤；

(6)UPLC上样，使用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱子，上样条件为：以100％甲醇为流动相，进样流速为0.5mL/min，进样量为1μL，检测波长为210nm。

(7)根据出峰时间和峰面积以及标准曲线计算鲨烯和羊毛甾醇的含量。

结果如图5所示，我们检测了各实验菌株中三萜的含量以及合成途径中关键次级代谢产物的含量。在CBS基因沉默后，灵芝三萜的含量显著升高。两个CBS沉默菌株中的三萜含量对比对照菌株的三萜含量高1.65倍和1.64倍(图5A)。同时三萜合成途径的关键酶中间代谢产物羊毛甾醇和鲨烯也有不同程度的显著上调(图5B和5C)，与野生菌株相比，分别上调了约1.4和1.9倍。这些结果表明将CBS基因沉默后能够显著提高灵芝三萜的含量。

实施例4：CBS基因通过影响胞内硫化氢的水平进而调节灵芝三萜的合成

硫化氢作为一种近年来新发现的气体信号分子，被广泛研究和报道其相关生理学作用，而灵芝体内硫化氢是否能够调控刺激代谢产物灵芝酸则是本研究所关注的重点。

前期研究结果发现，硫化氢合酶基因CBS被沉默后，体内硫化氢的含量显著降低，并且灵芝体内灵芝酸的含量显著升高，因此我们推测CBS突变菌株中硫化氢水平的降低导致了灵芝三萜含量的升高。

在本专利中，我们通过外源添加外源硫化氢供体——硫氢化钠(NaHS)对该猜测进行了进一步验证。结果如图6B所示，添加了NaHS后能够提高CBS突变菌株中的硫化氢水平。随即我们也通过UPLC方法检测灵芝三萜含量，结果发现添加NaHS后能够降低CBS突变菌株中灵芝三萜的含量，结果显示突变菌株中的灵芝三萜含量基本恢复至野生菌株的水平(图7A)，相应的灵芝三萜合成途径中的关键中间代谢产物也与野生型的无明显差异(图7B和7C)。

这些结果暗示了CBS基因功能的缺失，能够通过降低胞内硫化氢的水平进而提高灵芝三萜的生物合成。这一结果能为在生产实践中，通过基因工程手段提高灵芝三萜的产量提供重要的理论基础。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种硫化氢合酶基因在调控灵芝三萜生物合成中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1191

<212> DNA

<213> 灵芝(Ganoderma lucidum)

<400> 1

atggctcgta caccgcaaat catcgacaac gctctcgggg ctgtcggaaa cactccgctc 60

gtcaggctag accgaattgc caaggaagag ggattacaat gcaatttact gggaaaggtt 120

gaatatatgt cagcgggggg atccgttaag gaccgcattg caaagcgcat ggttgaggag 180

gctgagagag aagggaagct cattccgggg cacagtgtcg ttattgagcc gacctctggc 240

aacactggca ttggcctcgc aatggcttgc gcaatcaagg gatactctgt gatcatcacg 300

ttgcctaaca agatgtcgtt ggaaaaggaa gccactttgc gagcattagg ggcggaagtc 360

gtcaggactc ctaccgaagc tgcttgggac tcgccagagt cacacatagg agttgcgaat 420

cggcttcaac gtgagatccc agatggtatt atcctagacc aataccgcaa catcaacaat 480

cctcttgctc acgagtacac caccggcccg gaaattgtcg agtcggttac ttcaacaccg 540

tcgactgccg agcgaccatc ctcaggaaag gtcgatgctc tggtcgcagg tgctggtact 600

ggtggcacga ttactggtct gtctcgagca atcaagaaga agcacaacag gaattgtgtt 660

gtcgttggag ttgatcccaa aggcagcatt cttgcgtacc ctgatgacct caacatcgaa 720

ggctcaggcg acccgtatgt ggttgaaggc attggttacg acttcatccc gcatgttctt 780

tcgcgtgacc cagtggacgt gaacgagtgg ctgaagacct ccgacgcgga agcattcgat 840

gccgtccggc tcctcatgcg ccatgaaggc ctccttgtcg gggggagcag tggaagcgca 900

ctgagcggcg cccttcgctg gctccggagc gacaagggcc gggctatcgc ccagacccag 960

ggcgcgaacg tcgtggtgct ccttccagac ggcattcgta actatatgag caaaccgtgg 1020

ttcctgaaga tggcactaga agccgaaccg acccctctcg ctcgtcgcat tgccgacgtg 1080

ctctcgacgc cggagaacgc cgtgcgtccc aatgacaatg gcagcgcaaa cggtacttca 1140

acctcagatg ccaaggatcg gctcaacgct gtcggggagg cgtcacgttg a 1191

<210> 2

<211> 396

<212> PRT

<213> 灵芝(Ganoderma lucidum)

<400> 2

Met Ala Arg Thr Pro Gln Ile Ile Asp Asn Ala Leu Gly Ala Val Gly

1 5 10 15

Asn Thr Pro Leu Val Arg Leu Asp Arg Ile Ala Lys Glu Glu Gly Leu

20 25 30

Gln Cys Asn Leu Leu Gly Lys Val Glu Tyr Met Ser Ala Gly Gly Ser

35 40 45

Val Lys Asp Arg Ile Ala Lys Arg Met Val Glu Glu Ala Glu Arg Glu

50 55 60

Gly Lys Leu Ile Pro Gly His Ser Val Val Ile Glu Pro Thr Ser Gly

65 70 75 80

Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Met Ala Cys Ala Ile Lys Gly Tyr Ser

85 90 95

Val Ile Ile Thr Leu Pro Asn Lys Met Ser Leu Glu Lys Glu Ala Thr

100 105 110

Leu Arg Ala Leu Gly Ala Glu Val Val Arg Thr Pro Thr Glu Ala Ala

115 120 125

Trp Asp Ser Pro Glu Ser His Ile Gly Val Ala Asn Arg Leu Gln Arg

130 135 140

Glu Ile Pro Asp Gly Ile Ile Leu Asp Gln Tyr Arg Asn Ile Asn Asn

145 150 155 160

Pro Leu Ala His Glu Tyr Thr Thr Gly Pro Glu Ile Val Glu Ser Val

165 170 175

Thr Ser Thr Pro Ser Thr Ala Glu Arg Pro Ser Ser Gly Lys Val Asp

180 185 190

Ala Leu Val Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Leu Ser

195 200 205

Arg Ala Ile Lys Lys Lys His Asn Arg Asn Cys Val Val Val Gly Val

210 215 220

Asp Pro Lys Gly Ser Ile Leu Ala Tyr Pro Asp Asp Leu Asn Ile Glu

225 230 235 240

Gly Ser Gly Asp Pro Tyr Val Val Glu Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Ile

245 250 255

Pro His Val Leu Ser Arg Asp Pro Val Asp Val Asn Glu Trp Leu Lys

260 265 270

Thr Ser Asp Ala Glu Ala Phe Asp Ala Val Arg Leu Leu Met Arg His

275 280 285

Glu Gly Leu Leu Val Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Leu Ser Gly Ala

290 295 300

Leu Arg Trp Leu Arg Ser Asp Lys Gly Arg Ala Ile Ala Gln Thr Gln

305 310 315 320

Gly Ala Asn Val Val Val Leu Leu Pro Asp Gly Ile Arg Asn Tyr Met

325 330 335

Ser Lys Pro Trp Phe Leu Lys Met Ala Leu Glu Ala Glu Pro Thr Pro

340 345 350

Leu Ala Arg Arg Ile Ala Asp Val Leu Ser Thr Pro Glu Asn Ala Val

355 360 365

Arg Pro Asn Asp Asn Gly Ser Ala Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asp Ala

370 375 380

Lys Asp Arg Leu Asn Ala Val Gly Glu Ala Ser Arg

385 390 395

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgggtacc aggtgctggt actggtgg 28

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actgactagt cctgggtctg ggcgata 27

Claims

1.如SEQ ID NO.1所示的灵芝CBS基因在调节灵芝三萜生物合成中的应用，其特征在于，通过沉默灵芝菌丝体中的CBS基因来提高灵芝三萜的生物合成量。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，沉默灵芝菌丝体中CBS基因的过程为：将所述灵芝CBS基因的沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得灵芝CBS基因沉默的阳性转化子并进行培养。

3.灵芝CBS基因沉默载体在调节灵芝三萜生物合成中的应用，其特征在于，通过沉默灵芝菌丝体中的CBS基因来提高灵芝三萜的生物合成量；该沉默载体的构建过程为：设计如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的正、反向上游引物，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得灵芝CBS基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的KpnI和SpeI酶切位点之间，获得灵芝CBS基因沉默载体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，沉默灵芝菌丝体中CBS基因的过程为：将所述的灵芝CBS基因沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得灵芝CBS基因沉默的阳性转化子并进行培养。

5.一种提高灵芝三萜的生物合成量的方法，其特征在于：通过沉默灵芝菌丝体中的CBS基因来提高灵芝三萜的生物合成量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将灵芝CBS基因沉默载体转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得灵芝CBS基因沉默的阳性转化子并进行培养；该沉默载体的构建过程为：设计如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的正、反向上游引物，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得灵芝CBS基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的KpnI和SpeI酶切位点之间，获得灵芝CBS基因沉默载体。