CN110331101A

CN110331101A - 紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法

Info

Publication number: CN110331101A
Application number: CN201910288179.8A
Authority: CN
Inventors: 张婵; 王成涛; 孙宝国
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2019-10-15

Abstract

本发明公开了一种紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法，包括下列步骤：（一）菌种培养，（二）mokH缺失菌株构建。本发明成功构建了mokH缺失菌株，对于探究mokH基因在紫色红曲菌中的作用提高了研究基础。

Description

紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法

技术领域：

本发明涉及一种紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法，属于生物基因工程领域。

背景技术：

红曲菌又称“红曲霉”，在真菌分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，不整子囊菌纲，红曲菌科，红曲霉属。红曲菌可以产生多种次级代谢产物，如红曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸和桔霉素等，其中许多代谢产物被广泛的应用于食品色素、医药、酿酒等方面，MonacolinK又称“洛伐他汀”，是红曲菌产生的一种具有生理活性的聚酮类物质。研究发现，MonacolinK具有抑制胆固醇合成中关键酶HMG-CoA活性的作用，能够有效的抑制胆固醇合成，因此，Monacolin K被国内外视为降胆固醇的理想药

基因敲除技术在分子生物学领域中具有重要意义，曾有研究人员通过置换型同源重组方式敲除黑曲霉TNA-09中α-葡萄糖苷酶基因来探究该基因的功能，经筛选得到可稳定遗传的α-葡萄糖苷酶基因缺失菌株TGA101，与原始菌株相比α-葡萄糖苷酶活力下降了61.15%。也有人通过置换型同源重组方式敲除黑曲霉中的苹果酸酶基因来探究其对黑曲霉三羧酸循环的代谢的影响，经筛选得到遗传性能稳定的苹果酸酶基因缺失株，与野生菌株对比发现，苹果酸酶基因的缺失对三羧酸循环没有明显影响。而对于红曲菌的基因敲除，曾有研究人员在丛毛红曲中对其中的mokH基因进行敲除，从而对mokH基因在Monacolin K生物合成过程中的作用进行探讨，发现mokH缺失菌株的Monacolin K的产量相对野生型菌株有明显下降，而对于紫色红曲菌，并未有人对该种菌内的Monacolin K合成基因进行分析，因此，本实验从该方面切入，从紫色红曲菌M1基因组中克隆mokH基因，将mokH基因酶切回收后连接到pUC18质粒上，再以pCAMBIA302质粒为模版克隆CaMV 35S启动子及潮霉素B抗性基因，将带有启动子的潮霉素B抗性基因插入到pUC18-mokH重组质粒的mokH中，从而构建置换型打靶载体pUC18-mokH-hph，通过基因水平和代谢水平来验证mokH缺失工程菌，继而探讨mokH基因在Monacolin K生物合成途径中的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

（一）菌种培养

菌株培养：将M1菌株在马铃薯固体培养基上活化2代，取适量菌液接种到种子培养基中，30 ℃、200 r/min培养2 d，按10%的接种量将种子液接种到发酵养基中，30 ℃、150 r/min培养2 d，再25 ℃、150 r/min培养13 d。

（二）mokH缺失菌株构建

从紫色红曲菌M1基因组中克隆mokH基因，将mokH基因酶切回收后连接到pUC18质粒上，再以pCAMBIA302质粒为模版克隆CaMV 35S启动子及潮霉素B抗性基因，将带有启动子的潮霉素B抗性基因插入到pUC18-mokH重组质粒的mokH中，从而构建置换型打靶载体pUC18-mokH-hph，并采用REMI转化法将打靶载体转化到紫色红曲菌M1原生质体中，使其与紫色红曲菌M1基因组DNA发生置换型同源重组，将潮霉素B基因整合到基因组上，使mokH基因失活，从而构建mokH基因缺失株。

本发明的有益效果：

将扩增的调控因子mokH基因及潮霉素hph基因按已设计的思路连接到自杀质粒pUC18上，从而构建置换型打靶载体pUC18-mokH-hph，然后采用REMI介导转化法将其转化到紫色红曲霉M1原生质体中，进行置换型同源重组，将hph基因整合到基因组上，使mokH基因失活，从而构建mokH基因缺失突变株。通过基因水平验证可知，置换型打靶载体pUC18-mokH-hph上的hph基因已成功交换到紫色红曲霉M1的基因组上，即mokH基因敲除成功；通过代谢水平验证可知，mokH缺失菌株产Monacolin K的能力较野生菌株下降了52.05%，且mokH缺失菌株的形态结构也发生了明显的变化，推测mokH基因对红曲霉中Monacolin K的合成代谢有显著影响，且呈现明显的负调节效应。

附图说明：

图1是置换型打靶载体pUC18-mokH-hph的基因敲除原理。

图2是pUC18-mokH-hph重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图，M：Supercoiled DNALadder Marker；泳道 1：载体自连；泳道 2-5：pUC18-mokH-hph重组质粒。

图3是缺失菌株基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳图，M：DL10000 DNA Marker；泳道1：M1 基因组；泳道 2：mokH-1 基因组。

图4是 PCR 扩增mokH基因的琼脂糖凝胶电泳图，M：DL10000 DNA Marker；泳道 1：M1 PCR 产物；泳道2：mokH-1 PCR 产物。

图 5 是PCR 扩增hph基因的琼脂糖凝胶电泳图，M：DL2000 DNA Marker；泳道 1：M1 PCR 产物；泳道 2：mokH-1 PCR 产物。

图6是野生菌M1（A）和mokH缺失菌株（B）不同倍率下的扫描电镜图。

具体实施方式：

实施例1

本实施例提供一种紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法，包括下列步骤：

（一）菌种培养

菌株培养：将M1菌株在马铃薯固体培养基上活化2代，取适量菌液接种到种子培养基中，30 ℃、200 r/min培养2 d，按10%的接种量将种子液接种到发酵培养基中，30 ℃、150r/min培养2 d，再25 ℃、150 r/min培养13 d。

（二）.mokH缺失菌株构建

从紫色红曲菌M1基因组中克隆mokH基因，将mokH基因酶切回收后连接到pUC18质粒上，再以pCAMBIA302质粒为模版克隆CaMV 35S启动子及潮霉素B抗性基因，将带有启动子的潮霉素B抗性基因插入到pUC18-mokH重组质粒的mokH中，从而构建置换型打靶载体pUC18-mokH-hph，并采用REMI转化法将打靶载体转化到紫色红曲菌M1原生质体中，使其与紫色红曲菌M1基因组DNA发生置换型同源重组，将潮霉素B基因整合到基因组上，使mokH基因失活，从而构建mokH基因缺失株。

实施例2缺失菌株的验证

置换型打靶载体pUC18-mokH-hph的基因敲除原理如图1所示，打靶载体的2个同源臂分别与紫色红曲霉M1基因组上的同源序列发生2次同源重组，从而用hph片段置换掉基因组DNA上的mokH片段，最终将hph抗性基因整合到基因组上，使得mokH基因失活，从而达到敲除的目的。

将筛选得到的转化子连续传5代，来筛选稳定遗传的转化子。提取转化子的基因组DNA并以其为模板，分别用mokH-F、mokH-R和hph-F、hph-R引物来扩增mokH和hph。如果转化菌株未能扩增出mokH基因而能扩增出hph基因；对照菌株能扩增出mokH却不能扩增出hph基因，则初步证明该转化子已成功进行了置换型同源重组，mokH缺失菌株构建成功。

一、重组质粒的构建

mokH基因提取纯化后，进行扩增，然后与pUC18相连接形成pUC18-mokH重组质粒，对其进行酶切验证。以 pCAMBIA1302 质粒为模版，以hph-H-F、hph-H-R 为上下游引物来扩增目的片段hph，用QuickCutSalI双酶切 pUC18 和hph，酶切产物纯化后进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态TOP10，提取阳性转化子质粒，进行电泳检测，证明hph克隆成功。纯化的pUC18-mokH线性片段与酶切纯化的hph片段进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态TOP10 中，通过蓝白斑筛选阳性转化子，提取阳性转化子质粒，取 7 μL 质粒进行电泳检测，如图2所示，阳性转化子质粒的大小约在 6200 bp左右，而 pUC18-mokH线性片段自连质粒大小约在 4000 bp左右，与预期大小相符，初步判断pUC18-mokH-hph重组质粒构建成功。

二、红曲菌基因组RNA的提取

提取对照菌株 M1 及缺失菌株mokH-1 基因组 DNA，分别取 7 μL基因组进行电泳检测，如图3所示，对照菌株与缺失菌株均在 10 kb 以上有单一条带，与预期大小相符，初步说明基因组提取成功，可作为后续 PCR 扩增模版。

三、PCR验证mokH基因

分别以紫色红曲菌 M1 和缺失菌株mokH-1 基因组 DNA 为模版，mokH-F、mokH-R 为上下游引物，PCR 扩增mokH基因，取 7 μL PCR 产物进行电泳检测，如图4所示，对照菌株 M1能扩增出 1400 bp左右的mokH基因，而缺失菌株mokH-1 未能扩增出mokH基因，与预期结果相符，初步判断mokH缺失菌株构建成功。

四、PCR验证hph基因

分别以紫色红曲菌 M1 和缺失菌株mokH-1 基因组 DNA 为模版，以hph-F、hph-R 为引物，PCR 扩增hph基因，取 7 μL PCR 产物进行电泳检测，如图5所示，对照菌株 M1 为未能扩增出 1000 bp左右的hph基因，而缺失菌株mokH-1能扩增出hph基因，与预期结果相符，初步判断mokH缺失菌株构建成功。

五、扫描电镜观察

mokH缺失突变菌株菌丝体结构的观察

将野生菌M1和mokH缺失菌株的菌丝体样品置于扫描电镜下分别放大2000和4000倍来观测菌体的结构，并分析比较两株菌的结构差异，如图6，A图为野生菌M1放大2000和4000倍观测的结果图，B图为mokH缺失菌株放大2000和4000倍观测的结果图。通过A和B图可知，mokH缺失菌株的部分菌丝体表面出现明显的褶皱和膨大现象，而野生菌M1菌丝体表面则比较平整。推测该现象是由于mokH基因缺失后，菌体的基因型发生了改变，从而对菌体形态结构产生一定程度上的影响。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctctagaat ggccctatcg ccagt 25

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccaagcttt taggaggcca ggttgtgtt 29

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgcgtcgac gtttgcgtat tggctagagc 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgcgtcgac taattcgggg gatctggatt t 31

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaaaaagc ctgaactcac cgc 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctatttcttt gccctcggac g 21

Claims

1.紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

(一)菌种培养

菌株培养：将M1菌株在马铃薯固体培养基上活化2代，取适量菌液接种到种子培养基中，30℃、200r/min培养2d，按10％的接种量将种子液接种到发酵养基中，30℃、150r/min培养2d，再25℃、150r/min培养13d；

(二)mokH缺失菌株构建

从紫色红曲菌M1基因组中克隆mokH基因，将mokH基因酶切回收后连接到pUC18质粒上，再以pCAMBIA302质粒为模版克隆CaMV35S启动子及潮霉素B抗性基因，将带有启动子的潮霉素B抗性基因插入到pUC18-mokH重组质粒的mokH中，从而构建置换型打靶载体pUC18-mokH-hph，并采用REMI转化法将打靶载体转化到紫色红曲菌M1原生质体中，使其与紫色红曲菌M1基因组DNA发生置换型同源重组，将潮霉素B基因整合到基因组上，使mokH基因失活，从而构建mokH基因缺失株。

克隆mokH基因的具体步骤是：根据紫色红曲菌M1基因组DNA浓度将其稀释10倍后作为模版来扩增mokH基因；mokH基因的扩增所需PCR反应体系和条件如下：

mokH基因的PCR反应体系

PCR反应体系体积 PrimeSTAR Max Premix(2X) 12.5μL mokH-F 1μL mokH-R 1μL M1基因组DNA 1μL ddH<sub>2</sub>O 9.5μL 总体系 25μL

PCR反应条件：

克隆CaMV35S启动子及潮霉素B抗性基因，hph基因的扩增所需PCR反应体系和条件如下：

hph基因PCR反应体系

PCR反应体系体积 2×Taq PCR mix 25μL hph-H-F 1μL hph-H-R 1μL pCAMBIAl3O2质粒 2μL ddH<sub>2</sub>O 21μL 总体系 50μL

PCR反应条件：

所使用的引物序列如下：

Primer Sequence(5’-3’) mokH-F GCTCTAGAATGGCCCTATCGCCAGT(XbaI) mokH-R CCCAAGCTTTTAGGAGGCCAGGTTGTGTT(HindIII) hph-H-F ACGCGTCGACGTTTGCGTATTGGCTAGAGC(SalI) hph-H-R ACGCGTCGACTAATTCGGGGGATCTGGATTT(SalI) hph-F(未带启动子) ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC hph-R(未带启动子) CTATTTCTTTGCCCTCGGACG

。