CN104830888B - 一种新的新金色分枝杆菌表达体系及其在转化植物甾醇合成add中的应用 - Google Patents
一种新的新金色分枝杆菌表达体系及其在转化植物甾醇合成add中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新金色分枝杆菌表达载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明的新金色分枝杆菌表达载体pMTac‑2，可用于在新金色分枝杆菌高效表达蛋白，适用于分枝杆菌代谢产物的研究和生产。利用pMTac‑2在新金色分枝杆菌中过量表达KSDD，使重组菌M.neoaurum JC‑12/pMTac‑2‑ksdd胞内的KSDD活性比原始菌提高15.12倍。以30g/L植物甾醇为底物，5L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC‑12/pMTac‑2‑ksdd的ADD产量达到15g/L以上，为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。因此，该表达体系能够有效利用于新金色分枝杆菌的遗传改造。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型新金色分枝杆菌表达体系及其在转化植物甾醇合成ADD中的应用，属于微生物基因工程领域。
技术背景
甾体类药物是仅次于抗生素的一大类药物，广泛应用于抗肿瘤、消炎、抗菌、抗病毒、抗真菌、抗雌激素、抗惊厥等领域。全球每年对甾体类药物的需求量超过100万吨，总价值超100亿美元。甾体药物中间体的合成一般采用微生物转化法。植物甾醇作为合成甾体激素类药物中间体的原料，具有廉价易得，微生物易于降解其侧链等特点。微生物代谢植物甾醇的主要中间产物有雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)、睾酮、宝丹酮、9OH-AD等，其中AD和ADD市场需求量最高，因此利用廉价的底物植物甾醇高效合成AD和ADD具有巨大的商业价值。
3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD，EC 1.3.99.4)在甾体化合物代谢中具有重要的作用，它催化AD脱去2个氢生成ADD，同时也可催化9OH-AD合成9OH-ADD，9OH-ADD随后自发打开母核进而被进一步降解成CO2和H2O。基因敲除实验已经验证KSDD是甾醇代谢过程中关键酶，敲除KSDD的编码基因将不能获得ADD。目前，由于没有合适的工具—表达载体，利用分子生物学方法对分枝杆菌进行改造生产ADD比较困难。虽然已有对KSDD同源加强表达的研究，但并未给出具体的酶活数据及蛋白表达情况。
Mycobacterium neoaurum能够降解植物甾醇合成激素类药物中间体。M.neoaurumJC-12是本研究室从土壤中筛选到的菌株，具有降解植物甾醇合成AD和ADD的能力。实验室前期克隆表达出M.neoaurum JC-12的ksdd基因，并对KSDD的转化能力进行了研究。在分支杆菌中加强表达KSDD是促进ADD高效生产的一个重要途径，然而，分枝杆菌表达系统还不完善，缺乏高效表达载体，这已成为目前分枝杆菌降解植物甾醇合成药物中间体研究中的瓶颈。tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，在大肠杆菌中具有很高的转录水平，用于钝齿棒杆菌、黄色短杆菌和谷氨酸棒杆菌等阳性菌表达基因也有较高的表达效率。启动子的结构分析表明启动子包含一个保守的-10区tgngnta(c/t)aatgg和一个保守性相对较差的-35区，而且在阳性杆菌中启动子-10区对启动子和RNA聚合酶的互相作用起主要作用，因此本发明设计对tac启动子的-10区序列进行优化。
所以，本研究构建了具有tac启动子的分枝杆菌表达载体，并通过表达绿色荧光蛋白GFP验证其在M.neoaurum JC-12中的高效表达，为后续在分枝杆菌中高效表达KSDD奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供：通过启动子替换和启动子-10区序列的优化构建得到一种新型分枝杆菌表达载体，通过在新金色分枝杆菌过量表达3-甾酮-△1-脱氢酶，高效降解植物甾醇合成药物中间体雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。
本发明的技术方案：利用基因工程手段将载体pMF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac。通过GFP亮度验证载体pMTac的在新金色分枝杆菌中的表达效果。对载体pMTac的tac启动子的-10区序列进行优化得到相应的六个新载体，并且通过过量表达KSDD比较这几个载体在新金色分枝杆菌中的作用。利用新载体过量表达KSDD重组分枝杆菌的KSDD酶活测定及发酵产物产量也进一步验证了其表达效果。本发明成功构建了一种金色分枝杆菌表达载体，并构建了一株加强表达3-甾酮-△1-脱氢酶高效降解植物甾醇合成药物中间体ADD的分枝杆菌工程菌株，其3-甾酮-△1-脱氢酶活力及ADD产量较原始菌有较大的提高。
主要试剂：植物甾醇(大豆甾醇≥95％)购自礼来生物技术(湖州)有限公司；雄甾-4-烯-3,17-二酮及雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮标准样品购于Sigma公司。
1.表达载体pMTac的构建及功能验证方法：
(1)表达载体pMTac的构建
根据tac启动子的序列设计引物tac-F和tac-R，以pETac载体为模板，通过PCR扩增出tac启动子的序列。
PCR反应体系：10×ExTaq Buffer 5μL，dNTP 4μL，模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶1μL，ddH2O补齐至总体积50μL。PCR反应条件：95℃变性3min；95℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min。
PCR产物和质粒pMF41进行XbaⅠ和BamHⅠ双酶切，T4DNA连接酶与16℃连接纯化后的产物，连接产物转化大肠杆菌JM109，阳性转化子经酶切电泳验证。新载体命名为pMTac。
(2)绿色荧光蛋白表达菌株的构建
根据GenBank中登记的绿色荧光蛋白基因gfp设计引物gfp-F1、gfp-R和gfp-F2，以pCAMBIA1302为模板，分别以gfp-F1和gfp-R，gfp-F2和gfp-R为上下游引物，PCR扩增片段经双酶切后分别连接到同样经双酶切的pMF41和pMTac上，得重组载体pMF41-gfp和pMTac-gfp。采用电击转化法将空载体及重组载体电转到M.neoaurum JC-12中，用终浓度为30μg/mL的固体培养筛选阳性转化子，并提质粒酶切验证。
(3)重组菌的GFP荧光检测
重组菌M.neoaurum JC-12/pMF41-gfp培养至OD600为0.8左右时，加入终浓度为0.02％乙酰胺诱导，继续培养24h。重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-gfp不需诱导。取重组菌发酵液，离心收集细胞，50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液洗涤3次，重悬，稀释至适当浓度取少许于载玻片上，盖上盖玻片，在Nikon ECLIPSE 50荧光显微镜下观察。以原始菌M.neoaurum JC-12作为对照。
2.3-甾酮-△1-脱氢酶加强表达菌株的构建方法：
(1)3-甾酮-△1-脱氢酶序列的克隆
根据分枝杆菌JC-12的3-甾酮-△1-脱氢酶编码基因ksdd设计引物ksdd-F1、ksdd-F2和ksdd-R，以分枝杆菌JC-12基因组DNA为模板，进行PCR获得ksdd片段。PCR反应条件：95℃变性3min；95℃变性30s，65℃复性90s，72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min。
(2)重组质粒pMF41-ksdd和pMTac-ksdd的构建
上述所得ksdd片段经BamH I和EcoR I双酶切，分别连接到同样双酶切pMF41和pMTac上，得重组载体pMF41-ksdd和pMTac-ksdd。采用电击转化法将重组载体电转到M.neoaurum JC-12中，用终浓度为30μg/mL的固体培养筛选阳性转化子，并提质粒酶切验证。
(3)3-甾酮-△1-脱氢酶的表达及酶活测定
重组菌pMF41-ksdd培养至OD600为0.8左右时，加入终浓度为0.02％乙酰胺诱导，继续培养24h。重组菌pMTac-ksdd不需诱导。取重组菌发酵液，离心收集细胞，50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液洗涤3次，重悬，超声波碎细胞，破碎液8000r/min离心30min后得破碎细胞上清液。12％SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
采用PMS-DCPIP法测定KSDD酶活。KSDD脱去底物AD的两个氢生成ADD，蛋白自身的FAD接受脱去的2H+和2e-成FADH2，然后FADH2将DCPIP还原，DCPIP在600nm处有吸收峰。3mL反应混合物由100μL粗酶液、50mmol/L的Tris-HCl(pH 7.0)、40μmol/L的DCPIP、1.5mmol/L的PMS、500μmol/L AD(溶于2％的甲醇)所组成，检测600nm处的吸光值变化。酶活单位定义：将在1分钟内还原1μmol DCPIP所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
3.pMTac启动子序列的优化
(1)几种启动子的-10区序列
选择六种不同来源的启动子，通过启动子在线分析(http://www.fruitfly.org)得到-10区序列。以这六个启动子的-10区序列替换tac启动子的-10区序列设计出六个启动子分别为tac-1、tac-2、tac-3、tac-4、tac-5以及tac-6，他们与tac启动子的区别仅在于-10区序列。启动子tac、tac-1、tac-2、tac-3、tac-4、tac-5以及tac-6的-10区序列及来源如表1。
表1 几种启动子的-10区序列及来源
Table 1 The-10region sequence and resource of promoters
(2)六个新载体的构建
合成这六条启动子的核苷酸片段，上游加入Xba Ⅰ酶切位点，下游加入BamH Ⅰ酶切位点，这六条启动子片段的大小均为268bp。这六条启动子片段经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接到将同样酶双酶切的pMTac上，替换其上的tac启动子，得到六个新载体，分别命名为pMTac-1、pMTac-2、pMTac-3、pMTac-4、pMTac-5和pMTac-6。
(3)重组载体的构建
将以ksdd-F2和ksdd-R为上下游引物进行PCR所得的ksdd片段经BamH I和EcoR I双酶切，分别连接到同样双酶切pMTac-1、pMTac-2、pMTac-3、pMTac-4、pMTac-5和pMTac-6上，得重组载体。采用电击转化法将重组载体电转到M.neoaurum JC-12中，用终浓度为30mg/mL的固体培养筛选阳性转化子，并提质粒酶切验证。
(4)3-甾酮-△1-脱氢酶的表达及酶活测定
重组菌活化后，转接至50mL培养基中继续培养72h。取表达后的重组菌，离心收集细胞，50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液洗涤3次，重悬，超声波碎细胞，破碎液8000r/min离心30min后得破碎细胞上清液。12％SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
4.重组分枝杆菌的发酵实验及产物检测方法
(1)5L发酵罐发酵
将活化好的种子接种至2L发酵培养基中，10％接种量，30℃，400r/min，pH为维持在7.0-7.5。每12h取一次样，测定葡萄糖浓度、菌体量及AD和ADD的产量。
发酵罐培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，K2HPO4·3H2O 3，MnCl20.0005，MgSO4·7H2O0.2，植物甾醇30，环糊精60，pH 7.0(5L发酵罐，装液量2L)。转速400r/min，30℃，通气量1vvm,发酵过程中流加葡萄糖(母液浓度为800g/L)。
(2)发酵产物的检测
分枝杆菌JC-12降解植物甾醇的主要产物是AD和ADD。AD和ADD在254nm处均有吸收峰，因此可以采用高效液相色谱法(HPLC)对产物进行定量的分析。取1mL发酵液，加入5mL乙酸乙酯萃取，漩涡震荡充分混匀，0.22μm尼龙滤膜过滤。HPLC条件：色谱柱：dimosoil C18(250×4.6mm，5μL)；流动相：70％甲醇(V甲醇/V水＝7∶3)；检测器与检测波长：UV检测器，254nm；进样量：10μL；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。
本发明的有益效果：通过基因工程手段扩增得到tac启动子序列，并将其连接到酶切掉pACE启动子的pMF41上，得新型载体pMTac。通过表达GFP报告基因和过量表达KSDD验证了pMTac在新金色分枝杆菌中的表达效果。通过启动子序列优化得到一个表达效果更优的新载体pMTac-2，并且利用pMTac-2在新金色分枝杆菌中过量表达KSDD，结果M.neoaurumJC-12/pMTac-2-ksdd细胞中的KSDD活性比原始菌提高了15.12倍。以30g/L植物甾醇为底物，5L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的ADD产量达到15.28g/L，为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。以上结果表明，构建的新型表达载体pMTac-2适用于在M.neoaurum JC-12中加强表达关键酶KSDD，而在M.neoaurum JC-12中过量表达KSDD有助于ADD产量的提高。
具体实施方法
实施例1：表达载体pMTac的构建及功能验证
根据tac启动子的序列设计引物，以pETac为模板进行PCR，获得tac启动子基因片段。pMF41经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切去除启动子pACE，连接同样经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切的tac启动子PCR产物，得新型载体pMTac。
根据gfp的序列及载体pMF41和pMTac的特点设计引物，以pCAMBIA1302为模板进行PCR，获得相应的gfp片段。PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切后，分别连接同样经BamH I和EcoR I双酶切的pMF41和pMTac，构建重组载体pMF41-gfp和pMTac-gfp。通过电转化法将重组载体转化至分枝杆菌JC-12，获得重组菌。
重组菌pMF41-gfp培养至OD600为0.8左右时，加入终浓度为0.02％乙酰胺诱导，继续培养24h。重组菌pMTac-gfp不需诱导。取重组菌发酵液，离心收集细胞，50mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液洗涤3次，重悬，稀释至适当浓度取少许于载玻片上，盖上盖玻片，在NikonECLIPSE 50荧光显微镜下观察。以原始菌M.neoaurum JC-12作为对照。荧光照片的结果显示，原始菌M.neoaurum JC-12无荧光；M.neoaurum JC-12/pMF41-gfp和M.neoaurum JC-12/pMTac-gfp都有荧光亮度，但是M.neoaurum JC-12/pMTac-gfp的亮度明显高于M.neoaurumJC-12/pMF41-gfp，说明tac启动子可以用于分枝杆菌中表达基因，而且强度高于pACE。
实施例1中使用的引物序列如下：
tac-F：GCTCTAGAGGAGCTTATCGACTGCAC
tac-R：CGGGATCCTTCTGTTTCCTGTGTGAA
gfp-F1：CGCGGATCCATGGTAGATCTGACTAGT
gfp-F1：CGCGGATCCAAAGGAGGGAAATCATGGTAATCTGAC
gfp-R：ACCGGAATTCTCACACGTGGTGGTGGTGGT
ksdd-F1：CGCGGATCCATGTTCTACATGACAGCCCAGG
ksdd-F2：CGCGGATCCAAAGGAGGGAAATCATGTTCTACATGACAGCC
ksdd-R：ACCGGAATTCTTAGGCCTTTCCAGCGAGATG
实施例2：3-甾酮-△1-脱氢酶加强表达菌株的构建及酶活测定
根据新金色分枝杆菌3-甾酮-△1-脱氢酶编码基因ksdd的序列及载体pMF41和pMTac的特点设计引物，以新金色分枝杆菌JC-12的基因组DNA为模板进行PCR，获得相应的ksdd片段。PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切后，分别连接同样经BamH I和EcoR I双酶切的pMF41和pMTac，构建重组载体pMF41-ksdd和pMTac-ksdd，并电转化至M.neoaurum JC-12中，获得重组菌。
重组菌pMF41-ksdd培养至OD600为0.8左右时，加入终浓度为0.02％乙酰胺诱导，继续培养24h。重组菌pMTac-ksdd不需诱导。取重组菌发酵液，离心收集细胞，50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液洗涤3次，重悬，超声波碎细胞，破碎液8000r/min离心30min后得破碎细胞上清液。酶活测定方法：3mL反应混合物由100μL粗酶液、50mmol/L的Tris-HCl(pH7.0)、40μmol/L的DCPIP、1.5mmol/L的PMS、500μmol/L AD(溶于2％的甲醇)所组成，检测600nm处的吸光值变化。酶活单位定义：将在1分钟内还原1μmol DCPIP所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。酶活测定结果如表1。重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd破碎细胞上清液中KSDD酶活比原始菌提高了6.53倍，比M.neoaurum JC-12/pMF41-ksdd提高了4.36倍。
表2 重组菌株KSDD酶活的测定
Table 2 The KSDD activity of recombinant cells
实施例3：pMTac启动子序列的优化
将合成的六条启动子片段经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切后连接到将同样酶双酶切的pMTac上，替换其上的tac启动子，得到六个新载体，分别命名为pMTac-1、pMTac-2、pMTac-3、pMTac-4、pMTac-5和pMTac-6，他们的大小与pMTac相同均为4352bp，它们的序列仅启动子的-10区不一样，其余部分均相同。
上述六个载体经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后分别连接同样经双酶切的ksdd基因片段，获得重组载体pMTac-1-ksdd、pMTac-2-ksdd、pMTac-3-ksdd、pMTac-4-ksdd、pMTac-5-ksdd和pMTac-6-ksdd。将这六个重组载体分别电转化至M.neoaurum JC-12感受态细胞中，经卡那霉素抗性平板筛选及提质粒酶切验证得到阳性转化子，获得了重组分枝杆菌M.neoaurum JC-12/pMTac-1-ksdd、M.neoaurum JC-12/pMTac-2-ksdd、M.neoaurum JC-12/pMTac-3-ksdd、M.neoaurum JC-12/pMTac-4-ksdd、M.neoaurum JC-12/pMTac-5-ksdd和M.neoaurum JC-12/pMTac-6-ksdd。
重组菌中KSDD表达后，离心收集细胞，超声波破碎，离心获得粗酶液，测粗酶液中KSDD的活性。重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-1-ksdd、M.neoaurum JC-12/pMTac-2-ksdd、M.neoaurum JC-12/pMTac-3-ksdd、M.neoaurum JC-12/pMTac-4-ksdd、M.neoaurum JC-12/pMTac-5-ksdd和M.neoaurum JC-12/pMTac-6-ksdd粗酶液中KSDD的活性，分别为0.43、5.16、0.68、2.08、0.41、0.65U/mg。其中M.neoaurum JC-12/pMTac-2-ksdd的KSDD活性明显提高，分别比原始菌和M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的KSDD活性提高了15.12和1.14倍。
实施例4：重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-2-ksdd的5L发酵罐发酵
以30g/L植物甾醇为底物，环糊精为底物助溶剂进行发酵罐发酵。菌株活化48h后以10％的接种量接种到发酵罐中30℃，400r/min，pH为维持在7.0-7.5。每12h取一次样，测定葡萄糖浓度、菌体量及AD和ADD的产量。发酵72h开始流加葡萄糖，维持葡萄糖浓度在4-5g/L。发酵168h后重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-2-ksdd的ADD产量达到15.28g/L，比原始菌提高了36.5％，AD的产量为0.14g/L，比原始菌降低了90.7％。
Claims (1)
1.一种利用构建的重组分枝杆菌发酵植物甾醇合成ADD的方法，其特征是：将重组分枝杆菌菌株活化48h后以接种到含30g/L植物甾醇的发酵罐中，10％接种量，30℃，400r/min，1vvm通气量，pH为维持在7.0-7.5；发酵72h开始流加葡萄糖，维持葡萄糖浓度在4-5g/L；
其中重组分枝杆菌为通过PCR技术获得新金色分枝杆菌3-甾酮-△1-脱氢酶编码基因ksdd，并连接到pMTac-2上，获得重组载体pMTac-2-ksdd；将重组载体分别电转化至M.neoaurum JC-12中，获得KSDD加强表达的重组分枝杆菌M.neoaurum JC-12/pMTac-2-ksdd；其中pMTac-2的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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| 新金色分枝杆菌中AD转化为ADD关键酶KSDD的研究;韩冷 等;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑 A006-99》;20120215(第2期);参见摘要，第26页3.3.1节-第32页3.3.6节，第34-35页 * |
| 黄色短杆菌载体系统的构建及其产L-缬氨酸代谢工程育种的初步研究;徐大庆;《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑 B018-4》;20110615(第6期);全文 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104830888A (zh) | 2015-08-12 |
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