CN102703494A - 一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化AD生成ADD的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化AD生成ADD的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明首先获得新金色分枝杆菌中3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KSDD)的基因扩增，然后利用pMA5质粒，实现了该基因在模式菌株枯草芽孢杆菌168中的过量表达。本发明构建以4-AD为底物全细胞转化为方法的高产ADD的枯草芽孢杆菌工程菌株，对该菌株的酶活力及发酵性能进行研究发现3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的活力较出发菌株有了明显提高，以0.1％(w/v)4-AD为底物，全细胞转化10h，底物摩尔转化率达到65.7％，是出发菌株相对转化率的20倍。本发明为微生物一步发酵法生产ADD的工业化提供了有益的指导。

Description

一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化AD生成ADD的方法

技术领域

一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化AD生成ADD的方法，属于基因工程和酶工程领域。 

技术背景

甾体药物可通过全合成或对天然甾体化合物的降解和其官能团的转化获得，甾体药物具有很强的抗感染、刚过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物，2000年甾体药物在全球药物市场的销售额已突破200亿美元，约占世界医药总销售额的6％。 

甾体激素类药物分类：肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等。可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。 

早期合成甾体药物的原料大多从动物组织液中直接提取，由于这些原料的含量低、来源少、合成路线复杂、回收率低、代价高昂，不能满足生产的需要。薯蓣皂素的发现和应用，为甾体药物的工业化生产提供了丰富而又廉价的原料，但是生产过程需要消耗大量的薯蓣皂素，使皂素价格不断上升，增加了生产成本，且生产过程严重污染环境。 

近年来，薯蓣皂苷元的日益枯竭，各国都在积极寻找新的资源或新方法。植物甾醇作为新的资源为甾体工业注入了新的生命力，并可以从一些废油的下脚料和各类农作物中获得。可以通过微生物选择性边链降解获得重要的甾体药物中间体AD和ADD。可以说目前几乎所有甾体激素药物都是以AD或ADD作为起始原料进行生产的。微生物法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。世界先进国家目前进行甾体药物制备，大多以动植物甾醇为起始原料进行微生物转化，得到AD和ADD后，再进一步制备。 

3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(3-ketosteroid-Δ¹-dehydrogenase，KSDD或KSTD)也称C1，2位脱氢酶，它是甾体母核降解的关键酶，属于黄素蛋白酶类，位于细胞膜上，能在甾体母核C1和C2之间引入双键，提高原有底物的抗炎活性及经济价值，实现AD向ADD转化，在甾体药物开发上发挥着重要作用。对3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KSDD)的深入研究对整个甾体药物行业的发展意义深远。生产更高附加值的ADD最直接有效的方法就是以4-AD为底物，通过微生物一步转化。 

近年来，众多学者成功实现了来源于不同菌株的KSDD的外源表达。不同来源的KSDD在大肠杆菌系统中表达时，主要以无活性的包涵体形式存在，检测不到KSDD酶活或者酶活水平较低。本实验室前期实现了分枝杆菌的KSDD在大肠杆菌体系中的表达，以无活性的包涵体形式存在，未检测到酶活与相关报道的一致。 

本发明通过质粒pMA5，实现了分枝杆菌KSDD在枯草芽孢杆菌168中的可溶性过量表达，酶活达1.75U/mg，全细胞转化AD 12h后转化率达65.7％。分枝杆菌KSDD在枯草系统中表达及全细胞转化AD均为首次报道，且重组子表达的酶活及AD的转化率均较高。枯草 芽孢杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，成为微生物甾醇发酵工业潜在生产菌株。 

发明内容

本发明的目的在于提供：通过基因工程手段来获得具有全细胞转化生产ADD能力的微生物的方法。对构建的重组菌株进行酶活力及发酵性能进行研究发现3-甾酮-Δ¹-脱氢酶活力为出发菌的6倍左右，并且得到了较高的转化率。为微生物发酵生产ADD的工业化提供了有益的指导。 

本发明的技术方案：是以基因工程为手段构建一株全细胞转化AD生成ADD重组枯草芽孢杆菌，以TLC及HPLC为方法检测发酵液中产物的生成，筛选阳性重组子，通过酶活力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力及底物转化率。本发明成功构建了一株以4-AD为底物全细胞转化为方法的高产ADD的枯草芽孢杆菌工程菌株，其3-甾酮-Δ¹-脱氢酶活力和底物转化率较出发菌株有较大提高。 

主要试剂：AD，ADD购自美国SIGMA公司 

重组菌株构建方法： 

(1)3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KSDD)基因全序列的克隆 

根据GENBANK网站公布的Mycobacterium neoaurum strain NWIBL-01 ksdD基因序列(GQ228843.1)，以及pMA5质粒上的酶切位点设计ksdD基因引物。以制备的新金色分枝杆菌染色体DNA为模板，以ksdD F、ksdD R为引物，通过PCR扩增出ksdD全序列。 

PCR反应体系：10×ExTaq Buffer2.5μL，dNTP 2μL，模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶0.5μL，ddH₂O补齐至总体积25μL。PCR反应条件：94℃4min，94℃90s，59℃90s，72℃120s，循环30次，72℃10min，15℃10min。 

(2)重组表达载体pMA5-ksdD的构建 

参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与pMD18-T vector过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamH I/ Nde I酶切释放出大小为2.7kb和1.7kb的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-ksdD。 

提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-ksdD和pMA5，质粒pMD18-T-ksdD和pET-28a经BamHI/Nde I双酶切，胶回收纯化，T4DNA连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamH I/NdeI双酶切后释放出大小为7.2kb和1.7kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMA5-ksdD。 

(3)重组质粒pMA5-ksdD化学转化法转化模式菌株Bacillus subtilis 168中 

将经验证构建成功的重组质粒pMA5-ksdD用化学转化法转化至模式菌株Bacillus subtilis168中表达。转化方法为采用改进的Spizizen法。 

(4)重组菌株Bacillus subtilis 168阳性转化子的筛选； 

挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证。 

(5)重组Bacillus subtilis 168酶活测定，TLC及HPLC分析 

酶活测定方法：采用PMS-DCPIP的方法。具体方法如下：取培养24h的菌液50mL，4℃，8,000r/min离心5min收集菌体，用50mL pH 7.0的Tris-HCL缓冲液洗涤二次，重悬于3ml的该缓冲液中。冰浴中40％功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间10min。10,000r/min离心30min获得上清液，取0.1mL上清液，加入含50mM的Tris-HCL(PH7.0)、40μM的2，6-二氯酚靛酚、1.5mM的吩嗪硫酸甲酯、500μMAD(溶于2％的甲醇)总反应体系达3m L。30℃反应10min，检测600nm波长下吸光值变化情况。将每分钟内能引起0.01个吸光度单位变化的酶量定义为一个单位U。 

TLC分析：重组Bacillus subtilis 168以2％接种量接种于50ml发酵液，培养24h，按0.1％(w/v)投4-AD和0.1％(v/v)tween-80，继续培养8h取样，进行TLC分析；TLC展开剂：石油醚/乙酸乙酯(6∶4)；TLC显色：显色剂20％硫酸溶液，均匀喷洒，100℃烘烤五分钟标准曲线对产物进行定量分析。色谱条件：色谱柱：dimosoilC₁₈(5μl，250mm×4.6mm)，流动相：甲醇-水(V/V＝70∶30)，检测器：UV Detector，检测波长：254nm，柱温：30℃，进样量：10μL。 

HPLC分析：AD与ADD在254nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法制定10μL，流速：1.0ml/min。 

LB培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/L，NaCL10g/L(固体培养基加入2％琼脂粉) 

转化条件：将重组枯草芽孢杆菌168以1％接种量接种于100mL LB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCL(PH7.0)缓冲液复溶，按0.1％(w/v)投4-AD和0.1％(v/v)tween-80，继续在30℃，160rpm培养。 

本发明的有益效果：通过基因工程手段扩增本实验已有的具有3-甾酮-Δ¹-脱氢酶能力的新金色分枝杆菌的该酶基因，借助本实验室有的枯草表达体系，实现了3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因在模式菌株枯草芽孢杆菌168中的过量表达。将该菌株接种于以1％接种量接种于100mLLB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCL(PH7.0)缓冲液复溶，加入0.1％(w/v)4-AD和0.1％(v/v)tween-80，继续在30℃，160rpm培养10h。最终底物摩尔转化率达到65.7％，比原始菌提高了约20倍。 

将底物4-AD一步转化成具有更高附加价值的ADD，其是重要医药中间体；同时用微生物法生产ADD，其较之化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。 

附图说明

图1AD/ADD标样HPLC检测图 

图2重组菌株全细胞转化液TLC分析图 

lane1，B.subtilis 168/pMA5-ksdD全细胞转化液； 

Lane2，B.subtilis 168/pMA5全细胞转化液； 

Lane3，B.subtilis 168全细胞转化液； 

Lane4，标样AD； 

Lane5，标样ADD； 

图3重组菌全细胞转化液中AD/ADD的HPLC测定 

具体实施方法 

实施例1：重组Bacillus subtilis 168菌株的构建 

以实验室具有3-甾酮-Δ¹-脱氢酶活力的新金色分枝杆菌作为出发菌株，以其染色体为模板，利用PCR手段获得该酶的基因，连接克隆载体，实现基因的大量扩增。将大量扩增的KSDD基因片段，纯化后连接到pMA5载体上，验证成功后，转化模式菌株枯草芽孢杆菌168。在抗性平板上筛选阳性转化子，接种摇瓶发酵，用TLC和HPLC检测发酵液中产物ADD。检测到有产物ADD的为构建成功的具有转化AD为ADD能力的重组菌株。本发明最终得到具有转化AD产ADD的重组枯草芽孢杆菌168菌株。 

实施例2：重组菌株的酶活力测定 

菌株在LB培养基中过夜培养，8000rpm离心10min，pH7.0的50mM Tris-HCL缓冲液清洗3次，悬浮在该缓冲液中，超声波破碎处理制备粗酶液。3ml反应混合物由100μL粗酶液、50mM的Tris-HCL(PH7.0)、40μM的2，6-二氯酚靛酚、1.5mM的吩嗪硫酸甲酯、500μM AD(溶于2％的甲醇)所组成，检测600nm下的吸光值变化情况。酶活单位定义为：每分钟内能引起0.01个吸光度单位变化的酶量定义为一个单位U。测得重组菌株酶活为1.75U/mg。 

实施例3：重组菌株全细胞转化性能检测 

将重组枯草芽孢杆菌168以1％接种量接种于100ml LB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCL(pH7.0)缓冲液复溶，加入0.1％(w/v)4-AD和0.1％(v/v)Tween-80，继续在30℃，160rpm培养10h。经HPLC检测分析后，如图3所示，最终底物摩尔转化率达到65.7％，比出发菌提高了约20倍。 

Claims (3)

1.一种重组表达载体pMA5-ksdD，其特征是：

通过PCR技术获得来源于新金色分枝杆菌的KSDD基因，与克隆载体pMD-18T相连，获得该基因的大量克隆，经双酶切，片段纯化后与表达载体pMA5连接。

2.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征是：

将权利要求1中构建的重组载体pMA5-ksdD，用化学转化法转化模式菌株Bacillus subtilis 168，重组枯草芽孢杆菌KSDD酶活较基因来源菌有较大的提高。

3.将权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌全细胞转化4-AD产ADD的方法，其特征是：将该菌株以1％接种量接种于100mL LB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCl PH7.0缓冲液复溶，加入0.1％(w/v)4-AD和0.1％(v/v)tween-80，继续在30℃，160rpm培养10h。最终底物摩尔转化率达到65.7％，比新金色分枝杆菌这个出发菌株的转化率提高了约20倍。 

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