CN108085317B - 一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用 - Google Patents

一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR‑B基因编辑方法及应用，基因序列如SEQ ID NO.1所示；基因编辑方法包括以下步骤：步骤1：在基因序列前连接乳酸脱氢酶启动子Ldhp，形成Ldhp+CRISPR‑B；步骤2：通过酶切和连接将Ldhp+CRISPR‑B连接到线性质粒pDL278，形成CRISPR编辑载体；步骤3：通过聚合酶链式反应扩增敲除目的基因gtfB上游序列作为upstream；步骤4：通过聚合酶链式反应扩增敲除目的基因gtfC下游序列作为downstream；步骤5：将步骤3得到的upstream和步骤4得到的downstream连接形成同源重组模板HR‑BC；步骤6：将步骤2得到的CRISPR编辑载体和步骤5得到的同源重组模板HR‑BC转入变异链球菌中，即可实现同时编辑gtfB和gtfC；本发明可最大程度抑制变异链球菌胞外多糖的合成和生物膜的形成。

Description

一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方 法及应用
技术领域
本发明涉及基因序列，具体涉及一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用。
背景技术
龋病是人类常见的口腔疾病之一，是由致龋微生物代谢产酸所导致的慢性感染性疾病(Petersen P E,Kwan S.World Health Organization global oral healthstrategies for oral health promotion and disease prevention in the twenty-first century[J].Prvention Und Gesundheitsfrderung,2009,4(2):100-104.)；变异链球菌(Streptococcus mutans)是目前世界公认的致龋微生物之一，其致龋特性主要体现在以下几个方面：较强的产酸和耐酸能力、较强的环境适应能力、合成细胞外不可溶性多糖(Extracellular polysaccharide，EPS)以及对牙齿表面较强的粘附能力等；其中，合成胞外不可溶性多糖及粘附能力是变异链球菌区别于其它致龋性微生物的主要特征(Marsh PD.Microbiology of dental plaque biofilms and their role in oral health andcaries[J].Dental Clinics of North America,2010,54(3):441-54.)；同时，由变异链球菌合成的大量胞外不可溶性多糖还可以为牙菌斑生物膜中其它致龋微生物提供粘附位点，形成协同致龋效应；因此，如何有效抑制变异链球菌的过度生长，控制牙菌斑系统的生态平衡成为预防龋病的主要难点，而如何有选择性地有效抑制变异链球菌的生物膜形成能力，尤其是胞外多糖合成能力则成为了上述难点中的关键问题。
葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase，Gtfs)是变异链球菌重要的毒力因子；变异链球菌利用其Gtfs代谢碳水化合物产生胞外多糖，在口腔细菌对牙面的粘附及生物膜形成方面具有重要作用；相关研究表明，变异链球菌中gtfB、gtfC和gtfD基因(分别编码GtfB、Gtf C和Gtf D蛋白质，简称Gtfs)与合成胞外多糖密切相关，其中gtfB是合成胞外不可溶性多糖最主要的基因；当把Gtfs敲除后，会影响胞外基质与生物膜的形成，从而使变异链球菌生物膜形成功能不全(Koo H,Xiao J,Klein M I,et al.Exopolysaccharides Producedby Glucosyltransferases Modulate the Establishment of Microcolonies withinMultispecies Biofilms[J].)；这一研究结果提示，如果通过外源性手段特异性抑制变异链球菌Gtfs，控制胞外多糖的合成，可抑制口腔生物膜形成。
截至目前，抑制变异链球菌Gtfs活性的方法大多是通过体外加入某些天然有机化合物或者无机化合物等小分子，如：黄酮类、喹喔啉亚胺类和氟化物等(Ren Z,Chen L,LiJ,et al.Inhibition of Streptococcus mutans polysaccharide synthesis bymolecules targeting glycosyltransferase activity[J].Journal of OralMicrobiology,2016,8(1):31095.)；尽管它们能够很好的抑制Gtfs的活性，但仍然存在一些不足：第一，筛选的盲目性，不能高效准确的找到特异性强的小分子；第二，其具体的作用机理大多尚不清楚，没有进行系统的阐释；第三，某些小分子虽有很强的抑制作用，具体有没有副作用还不得而知；第四，某些小分子的提纯或合成成本昂贵，步骤繁琐；第五，某些化合物虽然来自于天然药物，是否会埋下潜在的毒性也尚未报道；第六，小分子的本身的物理化学属性(如溶解度，作用时间等)是否有利于抑制Gtfs活性等等；此外，也有利用传统的基因敲除方法敲除gtfB、gtfC或gtfD，虽然也能达到抑制效果，但存在效率低、步骤繁琐和特异性差等缺点；因此，综合以上原因，亟需寻找一种新的策略来弥补当前技术的不足。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，简称CRISPR系统，大约40％的细菌和90％的古细菌拥有CRISPR系统，它是细菌为应对病毒或质粒不断攻击演化而来的获得性免疫防御机制(Makarova K S,Haft D H,Barrangou R,etal.Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.[J].Nature ReviewsMicrobiology,2011,9(6):467-77.)；其中，目前研究和应用较多的一种是II-A型：CRISPR/Cas9。II-A型CRISPR/Cas9系统基因座结构包括：5'端tracrRNA(trans-activating CRISPRRNA)基因，它主要是与成熟的crRNA结合形成复合体，指导Cas9蛋白特异性切割外源DNA；中间是一系列Cas蛋白编码基因(包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2)，主要发挥核酸酶剪切作用；以及3'端的CRISPR基因座：由启动子区域、大量间隔序列(spacers)和重复序列(directrepeats)顺序构成，其中间隔序列(spacers)是来自病毒或质粒的DNA；此外，前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM：NGG)的主要功能是帮助Cas9能够精确区分需要进行降解的非自身DNA和序列完全相同的自身DNA，从而实现特异靶向切割(Jinek M,Chylinski K,Fonfara I,et al.A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonucleasein Adaptive Bacterial Immunity[J].Science,2012,337(6096):816.)；因此，当细菌再次遭遇外源DNA的入侵时，CRISPR基因座就会转录产生tracrRNA和crRNA，并与Cas9结合形成最小功能复合体，进而crRNA将特异性指导Cas9靶向剪切清除外源DNA；然而，在龋病微生物研究中，尤其是变异链球菌的基因编辑中，该技术仍然处于起步阶段。
发明内容
本发明提供一种与变异链球菌胞外多糖合成有关的特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR基因序列(以下简称：CRISPR-B)、基因编辑方法及应用。
本发明采用的技术方案是：一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR基因序列，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。
一种采用特异性靶向gtfB基因位点的CRISPR-B基因序列的基因编辑方法，包括以下步骤：
步骤1：在基因序列前连接乳酸脱氢酶启动子Ldhp，形成Ldhp+CRISPR-B；
步骤2：通过酶切和连接将Ldhp+CRISPR-B连接到线性质粒pDL278，形成CRISPR编辑载体；
步骤3：通过聚合酶链式反应扩增敲除目的基因gtfB上游序列作为upstream；
步骤4：通过聚合酶链式反应扩增敲除目的基因gtfC下游序列作为downstream；
步骤5：将步骤3得到的upstream和步骤4得到的downstream连接形成同源重组模板HR-BC；
步骤6：将步骤2得到的CRISPR编辑载体和步骤5得到的同源重组模板HR-BC转入变异链球菌中，即可实现同时编辑gtfB和gtfC。
一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因序列的应用，所述基因序列用于抑制变异链球菌繁殖。
进一步的，所述基因序列能够抑制变异链球菌胞外多糖的合成。
进一步的，所述基因序列能够抑制变异链球菌生物膜的形成。
进一步的，所述基因序列用于制备抗龋药物。
一种采用特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因序列的基因编辑方法的应用，所述基因编辑方法用于抑制变异链球菌繁殖。
进一步的，所述基因编辑方法用于抑制变异链球菌胞外多糖的合成。
进一步的，所述基因编辑方法用于抑制变异链球菌生物膜的形成。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的基因序列，可敲除目的基因gtfB和gtfC，可最大程度抑制胞外多糖的合成和生物膜的形成；并且可将上述两基因一步实现敲除，表型易检测，能够直观准确的反应基因编辑的结果；
(2)本发明通过体外构建CRISPR编辑载体和同源重组模板，然后将它们转化至变异链球菌；CRISPR编辑载体转录的crRNA将指导Cas9切割编辑位点产生双链断裂(DSB)，此时诱导细菌修复机制的发生，利用提供的同源重组模板进行同源重组修复，导致gtfB和gtfC的缺失，从而减少胞外多糖的合成和生物膜的形成。
附图说明
图1为蒽酮法检测野生型菌株、gtfBgtfC双敲除菌株以及BHI培养基阴性对照组的胞外多糖含量。
图2为结晶紫法检测野生型菌株、gtfBgtfC双敲除菌株以及BHI培养基阴性对照组的生物膜含量。
图3为扫描隧道电子显微镜(SEM)观察野生型菌株和gtfBgtfC双敲除菌株的胞外多糖含量变化。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。
一、菌株的培养
供试菌株的准备：
本发明所有实施例的供试菌株为变异链球菌(菌株编号：32401；从中国医学细菌保藏管理中心获得，网址：http://www.cmccb.org.cn/)。
培养基的组分及制备：
牛心脑浸液(以下简称BHI)液体培养基的组分及其配制方法：将37g商购的BHI粉末(OXOID，美国，货号：CM1135，以下类同)加入1000mL蒸馏水中，高温高压(121℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用；该液体培养基是针对变异链球菌浮游培养的典型液体培养基。
BHI蔗糖液体培养基的组分及其配制方法：分别将37g商购BHI粉末和10g蔗糖(Thermo Fisher Scientific，美国，货号：S3-500)加入1000mL蒸馏水中，高温高压(121℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用；该液体培养基是针对变异链球菌生物膜培养的典型液体培养基。
BHI固体培养基的组分及其配制方法：将37g商购BHI粉末和15g商购琼脂粉末(北京索莱宝科技有限公司，中国，货号：A8190，以下类同)加入1000mL蒸馏水中，高温高压(121℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用；该固体培养基是针对变异链球菌菌落分离培养的典型固体培养基。
Luria-Bertani液体培养基(简称LB培养基)的组分及其配置方法：分别将商购胰蛋白胨10g(OXOID，美国，货号：LP0047B，以下类同)、酵母提取物5g(OXOID，美国，货号：LP0021B，以下类同)和氯化钠10g(Biofroxx，德国，货号：1249GR500，以下类同)加入1000mL蒸馏水中，高温高压(121℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用；该液体培养基是针对大肠杆菌浮游培养的典型液体培养基。
LB固体培养基的组分及其配制方法：将商购胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g和15g琼脂粉末加入1000mL蒸馏水中，高温高压(121℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用；该固体培养基是针对大肠杆菌菌落分离培养的典型固体培养基。
接种及培养方法
将变异链球菌(菌种编号为：32401)菌液接种于BHI固体培养基上，37℃、10％H2、5％CO2和85％N2厌氧条件下培养24小时。用接种环挑取一个单菌落接种于3mL BHI液体培养基，37℃、10％H2、5％CO2和85％N2厌氧条件下培养；用紫外可见光分光光度计测定其在600nm波长的吸收值(OD600)，将培养至对数生长期(OD600≈0.5～0.6)的菌悬液按照1:100比例稀释于BHI液体培养基(用于培养浮游状态的变异链球菌)或BHI蔗糖液体培养基(用于培养变异链球菌生物膜)并分装到96孔板中继续培养。此外，大肠杆菌在37℃自然环境下培养即可。整个操作在生物安全柜的无菌条件下进行。
二、CRISPR靶向位点的选择及同源重组模板的设计
CRISPR靶向位点的选择
CRISPR即成簇规律间隔的短回文序列，其核心部分主要由两种序列类型构成：重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)；前者经加工后与tracrRNA完全互补配对并与Cas9形成最小的功能复合体；后者是来自病毒或者质粒的部分DNA序列，这两种序列相间排列，从而构成完整的CRISPR靶向位点；本实验设计的重复序列(repeat)来自于变异链球菌CRISPR系统本身；间隔序列(spacer)为特异靶向gtfB基因的部分序列，它不仅与gtfB部分序列完全互补配对且相对保守；即这两种序列相间排列构成特异靶向gtfB基因的CRISPR编辑序列(即：CRISPR-B)，具体序列见SEQ ID NO.1。
同源重组模板的设计
根据同源重组原理，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)扩增敲除目的基因gtfB上游序列作为upstream(引物为gtfBupF：5’-TCCCTATGCTGTTGTGCAG-3’；gtfBupR：5’-CTTGTCCATTAGGAACCTCCAAA-3’)，同理获得gtfC下游序列作为downstream(引物为gtfCdnF：5’-TTTGGAGGTTCCTAATGGACAAGTAATACTTATCTTAGAAGAATAG-3’；gtfCdnR：5’-CACGTTTAGCATGACTAGCAG-3’)；然后将upstream和downstream通过融合PCR(PCR Overlap Extension)连接起来作为同源重组模板，模板标记为：HR-BC。
upstream、downstream以及upstream与downstream融合的PCR体系如下：
表1 upstream基因PCR扩增反应体系及程序
PCR结束后，将其产物进行琼脂糖凝胶电泳验证并切胶回收目的条带，以下所有PCR反应类同。
注：KOD-PLus DNA聚合酶(Toyobo，日本，货号：KOD-201)；细菌基因组DNA抽提试剂盒，PCR产物纯化回收试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司，中国，货号依次为：DP302-02；DP204-02；DP209-02)；引物合成(成都擎科梓熙生物技术有限公司，中国)。
表2 downstream基因PCR扩增反应体系及程序
表3 upstream与downstream融合PCR扩增反应体系及程序
三、CRISPR编辑载体的构建
为了CRISPR系统能够更好地发挥功能，因此在CRISPR编辑序列前面连接乳酸脱氢酶启动子Ldh promotor(Ldhp)，即Ldhp+CRISPR-B，然后通过酶切和连接将此片段连接到载体pDL278上，最后通过转化与测序验证得到正确克隆。
目的基因的获取
通过PCR获得Ldhp片段。
表4 Ldhp基因PCR扩增反应体系及程序
引物如下：
Ldhp-F-Sac I：5’-TTTTGAGCTCCCGAGCAACAATAACACTC-3’
Ldhp-R-Xho I：5’-TGTCATCTCGAGAACATCTCCTTATAATTTATTAAG-3’
CRISPR-B基因由公司合成；(生工生物(上海)股份有限公司，中国)。
Ldhp和CRISPR-B酶切
Ldhp与CRISPR-B分别进行酶切，酶切位点为：Xho I
表5 Ldhp和CRISPR-B酶切反应体系
注：限制性核酸内切酶Quick Cut Xho I(Takara，日本，货号：1635)
按上述体系加入后，轻轻混匀，37℃孵育5min，然后将上述酶切产物用DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收，以获取目的基因。
Ldhp与CRISPR-B的连接与富集
连接
将具有相同酶切位点的Ldhp与CRISPR-B连接，体系如下：
表6 Ldhp与CRISPR-B连接体系
注：T4DNA连接酶(Takara，日本，货号：2011A)
按上述体系加入后，轻轻混匀，16℃孵育16h。
连接产物的富集
以上一步中连接产物为模板进行PCR扩增。
表7 Ldhp+CRISPR-B连接产物PCR扩增富集反应体系及程序
引物如下：
M13+(-47)：5’-AGGGTTTTCCCAGTCACG-3’
Ldhp+CRISPR-B和pDL278双酶切
Ldhp+CRISPR-B进行双酶切，酶切位点为：Sac I和Sal I。
表8 Ldhp+CRISPR-B酶切反应体系
注：限制性核酸内切酶Quick Cut Sac I和Quick Cut Sal I(Takara，日本，货号依次为：1627；1636)
按上述反应体系加入后，轻轻摇匀，37℃孵育30min，然后将上述酶切产物用DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收，以获取目的基因。
质粒pDL278进行双酶切，酶切位点为：Sac I和Sal I
表9 质粒pDL278酶切反应体系
注：大肠杆菌-变异链球菌穿梭载体pDL278(6733bp，Spectinomycin)由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。
按上述反应体系加入后，轻轻摇匀，37℃孵育20min，然后将上述酶切产物用DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收，获取线性质粒pDL278。
Ldhp+CRISPR-B与线性质粒pDL278连接
将具有相同酶切位点的Ldhp+CRISPR-B与线性质粒pDL278连接，体系如下：
表10 Ldhp+CRISPR-B与线性质粒pDL278连接反应体系
按上述体系加入后，轻轻混匀，16℃孵育16h。
连接产物的转化及克隆验证
(1)取感受态细胞DH5α(北京天根生化科技有限公司，中国，货号：CB101-01)置于冰浴中，冰上融化并分装每个离心管50μL；
(3)向感受态细胞悬液中加入连接产物5μL，轻弹混匀，在冰浴中静置30min；
(3)将离心管置于42℃水浴中放置60-90sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min，该过程不要摇动离心管；
(4)向每个离心管中加入450μL无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min(150rpm)；
(5)将上一步培养物离心(4000r/min)2min，然后去除上清300μL，剩下200μL混匀，吸取100μL均匀涂布于含有壮观霉素(100μg/mL，Omega，美国，货号：S0692)的LB固体琼脂培养基上，将平板置于室温直到液体被完全吸收，倒置平板，37℃自然条件下培养12-16h；
(5)从上一步转化平板上挑取单克隆复苏，并测序验证(测序引物：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)。
CRISPR编辑载体转化变异链球菌并置换gtfB基因
将重组质粒(pDL278-CRISPR-B)以及编辑模板(HR-BC)共同转入变异链球菌中，以达到同时编辑gtfB和gtfC的目的；转化步骤如下：
(1)在10％H2、5％CO2和85％N2厌氧条件下，BHI培养基中接种变异链球菌，37℃培养16h；
(2)用预热的BHI培养基，1:20稀释上一步复苏菌种，相同条件下继续培养2-3h，使OD600≈0.2-0.3；
(3)取上一步的细菌500μL，分别加入500ng重组质粒(pDL278-CRISPR-B)、感受态CSP(400nM，郑州派和泰德医药科技有限公司，中国，N→C：SGSLSTFFRLFNRSFTQA)和500ng编辑模板(HR-BC)，然后在相同条件下培养2-3h；
(4)将上述500μL细菌离心(4000r/min)2min，去上清400μL，剩下100μL混匀后涂布在含有壮观霉素(1000μg/mL)的BHI固体琼脂培养基上，然后在相同条件下培养24-48h；
(5)从上一步转化平板上挑取单克隆复苏，并测序验证(测序引物：5’-GACGGCACGCAAGTAACTAACTCTG-3’)；得到gtfBgtfC双敲除菌株。
实施例1
CRISPR编辑载体抑制变异链球菌胞外多糖效果的检测(蒽酮法)
实验原理：糖在浓硫酸的作用下，可经脱水反应生成糠醛或者羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物；在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量；糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为625nm，故在此波长下进行比色。
(1)在10％H2、5％CO2和85％N2厌氧条件下，BHI培养基中接种gtfBgtfC双敲除菌株，37℃培养16h；
(2)用预热的BHI培养基1:10稀释上一步的复苏菌种，相同条件下继续培养2-3h，使OD≈0.5-0.6；
(3)用BHI+1％蔗糖培养基将上一步细菌按1:100稀释，然后将稀释后的细菌取200μL点在96孔板中，相同条件下培养24h。每个样本至少三个重复；
(4)取出96孔板，将其离心(4000r/min)10min，弃上清，沉淀用PBS清洗2-3次，再离心(4000r/min)10min，然后弃上清；
(5)向96孔板中加入0.4mol/L NaOH溶液100μL，并刮下生物膜使完全溶解于NaOH溶液中，再离心(4000r/min)10min，然后收集上清于干净的离心管中，此步骤重复一次；
(6)向上一步的离心管中加600μL蒽酮试剂(200mg蒽酮溶解于100mL浓硫酸)，上下颠倒混匀，95℃煮6min；
(7)待上一步溶液冷却至室温，取100μL于96孔板中，酶标仪读取OD625。
结果如图1，从图中可以看出gtfBgtfC双敲除菌株相比于野生型菌株，其光吸收值明显降低，且存在极显著性差异，即前者胞外多糖含量明显少于后者，进而证明了该技术能够抑制变异链球菌胞外多糖的合成。
实施例2
CRISPR编辑载体抑制变异链球菌生物膜效果的检测(结晶紫法)
实验原理：结晶紫染液能够将细菌的生物膜染成紫色，而乙醇能够使厚的生物膜结构脱水，导致染到生物膜上的结晶紫被竞争下来；通过检测被乙醇复吸后的溶液在562nm波长处的吸收光值，即可对生物膜进行定量分析。
(1)在10％H2、5％CO2和85％N2厌氧条件下，BHI培养基中接种gtfBgtfC双敲除菌株，37℃培养16h；
(2)用预热的BHI培养基1:10稀释上一步的复苏菌种，相同条件下继续培养2-3h，使OD≈0.5-0.6；
(3)用BHI+1％蔗糖培养基将上一步细菌按1:100稀释，然后将稀释后的细菌取200μL点在96孔板中，相同条件下培养24h。每个样本至少三个重复；
(4)取出96孔板，弃上清，并用ddH2O清洗2-3次，然后加入200μL0.1％结晶紫染液，温和振荡10min；
(5)将上一步96孔板用PBS清洗2-3次，然后加入200μL30％乙酸，温和振荡15min；
(6)从96孔板中吸取100μL乙酸洗脱液，酶标仪读取OD562。
结果如图2，从图中可以看出，gtfBgtfC双敲除菌株相比于野生型菌株，其光吸收值明显降低，且存在极显著性差异，即前者生物膜含量明显少于后者，进一步证明了该技术能够抑制变异链球菌生物膜的形成。
实施例3
CRISPR编辑载体抑制变异链球菌生物膜效果的检测(SEM)
实验原理：扫描电镜(Scanning Electron Microscope，SEM)是对样品表面形态进行观测的一种仪器，分辨较高，能清晰的观察细菌表面的形态。本实验是通过培养变异链球菌生物膜，观察细菌表面胞外多糖的含量变化。
(1)在10％H2、5％CO2和85％N2厌氧条件下，BHI培养基中接种gtfBgtfC双敲除菌株，37℃培养16h。
(2)用预热的BHI培养基1:10稀释上一步的复苏菌种，相同条件下继续培养2-3h，使OD≈0.5-0.6。
(3)用BHI+1％蔗糖培养基将上一步细菌按1:100稀释，然后将稀释后的细菌取1000μL加到放有无菌玻璃片的24孔板中，在10％H2、5％CO2和85％N2厌氧条件下，37℃培养24h。每个样本至少三个重复。
(4)除去上一步24孔板中的培养液，用无菌PBS漂洗生物膜表面物质2-3次，然后向每孔中加入1mL2.5％戊二醛溶液，4℃静置2-16小时，固定生物膜。
(5)除去上一步的戊二醛溶液，用无菌PBS漂洗2次，每次10min。
(6)将上一步的生物膜玻璃片用不同浓度梯度(30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％)乙醇溶液进行脱水，每个梯度15min。
(7)将上一步的生物膜玻璃片放入100％乙酸正戊酯溶液中做置换处理5min，然后在二氧化碳临界点干燥仪中进行干燥，最后进行喷金处理，上机观察。
结果如图3，从图中可以看出，从图中可以很直观的看出(红色箭头处代表细菌合成的胞外多糖)，野生型菌株表面包裹大量胞外多糖且集聚在一起，而gtfBgtfC双敲除菌株，几乎没有胞外多糖存在，细菌分散排列。因此，本实施例也同样证明了该技术的可行性。
本发明旨在利用变异链球菌自身CRISPR/Cas9系统，建立一种新的特异抑制Gtfs活性的方法：高效特异的定向编辑gtfB和gtfC基因，该技术克服了上述现有Gtfs抑制技术的难点与不足，有效抑制变异链球菌胞外多糖的合成和生物膜的形成能力，进而为龋病的预防或治疗提供技术储备。
本发明的基因序列，可敲除目的基因gtfB和gtfC，可最大程度抑制胞外多糖的合成和生物膜的形成；并且可将上述两基因一步实现敲除，表型易检测，能够直观准确的反应基因编辑的结果；通过体外构建CRISPR编辑载体和同源重组模板，然后将它们转化至变异链球菌；CRISPR编辑载体转录的crRNA将指导Cas9切割编辑位点产生双链断裂(DSB)，此时诱导细菌修复机制的发生，利用提供的同源重组模板进行同源重组修复，导致gtfB和gtfC的缺失，从而减少胞外多糖的合成和生物膜的形成。
本发明的方法具有高效性、特异性强、脱靶率低、周期短、克服药物筛选的盲目性的特点；在自然条件下，同源重组发生的概率极低，而本方法的CRISPR系统能够精确高效产生双链断裂，诱导细菌同源重组修复的发生，编辑效率高；因为crRNA通过碱基互补配对原则精确靶向编辑位点，且在基因组上有PAM位点存在时，Cas9才发挥剪切功能，两种要求同时满足确保不会对其他基因造成影响；CRISPR编辑位点载体可在细菌体内形成多拷贝，crRNA表达量相对较高，切割效率显著提高；并且本发明方法步骤简单，只要将CRISPR编辑载体和同源重组模板共同转化就能完成两个基因的同时敲除；并且本发明方法仅需设计CRISPR编辑载体和同源重组模板即可完成该基因的定向编辑，从而使Gtfs活性得到有效抑制。
SEQ ID NO.1
<110> 四川大学
<120> 一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 230
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatgttctcg aggttttaga gctgtgttgt ttcgaatggt tccaaaacca aagaggttgt 60
aagtaatcct tatactgtgt tttagagctg tgttgtttcg aatggttcca aaaccaaaga 120
ggttgtaagt aatccttata ctgtgtttta gagccatgtt agttactgat ttactaaaac 180
ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt gtcgaccccc 230

Claims (2)

1.一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示，记为CRISPR-B基因序列。
2.一种如权利要求1所述的特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因序列的应用，其特征在于，所述基因序列用于制备抗龋药物。
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