CN104774835A

CN104774835A - 方便克隆长片段dna且稳定遗传的质粒及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN104774835A
Application number: CN201510215582.XA
Authority: CN
Inventors: 孔庆科; 韩月; 刘青; 赵新新; 刘琼; 易洁; 位玉南
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: CN104774835B

Abstract

本发明提供了方便克隆长片段DNA且稳定遗传的质粒的构建方法，该方法包括如下步骤：1）扩增带有Sbf I和Not I酶切位点的T1T2-pSC101-asd片段；2）扩增带有Sbf I 和Not I酶切位点的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段；3）消化步骤1）和2）所得的片段；4）回收T1T2-pSC101-asd片段和带有相同黏性末端的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段；5）连接步骤4）所得片段；6）将步骤5）所得连接产物转化入DH5α感受态细胞中，过夜培养；7）挑取单菌落培养后，提取质粒，经酶切消化、电泳鉴定后，回收获取重组质粒DNA。本发明还公布了由上述方法得到的质粒及其在同时容纳多个DNA片段用于长片段DNA或基因簇组装并稳定表达的应用。本发明质粒为低拷贝质粒，可实现含长片段DNA的质粒从酵母向原核宿主中转化和稳定表达。

Description

方便克隆长片段DNA且稳定遗传的质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及方便克隆长片段DNA且稳定遗传的质粒及其构建方法和应用。

技术背景

细菌等原核生物的基因组较大，通常含有较长的基因和基因簇，长度大小不等，直接对长基因或基因簇扩增难度较大。因此，通常选择截段扩增再拼接的方法对长基因或基因簇进行克隆及表达，常见的基因拼接方法主要是酶切、连接，但是用常规的酶切、连接方法对较长的基因或基因簇进行拼接时往往找不到合适的酶切位点而表现出一定的局限性。现在发展起来的更为有效、方便的拼接方法为同源重组拼接法，常见的overlap PCR方法便是实验室中最常见的一种同源重组方法，但过多的体外操作会产生较多的突变，文献报道酵母具有强大的同源重组功能，它可以对转进去的具有同源序列的片段实现无缝连接、组装成完整的长片段。但是要达到异源表达的目的，该方法还存在一些缺陷，即酵母细胞通常不是所要表达的长片段的最终宿主，实验过程中往往需要将在酵母细胞中组装好的长片段转移到原核生物中进行异源表达，以观察所组装的大片段对异源宿主的影响或者在原核递送载体的作用下获得重组菌株，达到生物合成细菌联苗的目的。因此，需要一个可以与长片段DNA在酵母中组装成环状质粒的线性化载体片段，同时该载体又可以将在酵母中构建好的长片段质粒转化到所要进行表达的异源宿主中。因此，本研究利用分子生物学方法构建了这样一种既可以在酵母中组装又可以在原核细胞中表达的低拷贝穿梭质粒，一方面便于在酵母中进行长片段的组装，另一方面又可以实现在原核细胞中的稳定表达。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的一个目的在于提供方便克隆长片段DNA且稳定遗传的质粒的构建方法，该方法包括如下步骤：

1）PCR扩增带有Sbf I和Not I酶切位点的T1T2-pSC101-asd片段；

2）PCR扩增带有Sbf I 和Not I酶切位点的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段；

3）使用限制性内切酶Sbf I和Not I消化步骤1）和2）所得的片段；

4）对步骤3）所得物进行电泳观察和回收，得到T1T2-pSC101-asd片段和带有相同黏性末端的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段；

5）连接步骤4）所得T1T2-pSC101-asd片段和带有相同黏性末端的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段；

6）将步骤5）所得连接产物转化入DH5α感受态细胞中，并于含盐酸大观霉素的LB固体培养基进行过夜培养；

7）挑取单菌落接种于含盐酸大观霉素的液体LB培养基，于37 ℃摇床培养12 h，提取质粒，经酶切消化、电泳鉴定后，分别切胶回收获取重组质粒DNA（命名为pQK237）。

步骤1）和步骤2）所述PCR扩增的步骤包括：分别以pYA3337和pYES1L为模板，设计引物对其中的T1T2-pSC101-asd片段和TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段进行PCR扩增；所述引物为：

pYA3337-F: GCGGCCGC CATTCTGAAATGAGCTGTTGAC

pYA3337-R: CCTGCAGG ACCCGTGGGATTAAGCTAC

pYES1L-F: CCTGCAGG CGCCTTGATTATTTGACGTGGTTT

pYES1L-R: GCGGCCGC AGTCAGTGAGCGAGGAAG；

所述PCR的扩增条件为：先于98℃变性2 min，经98℃变性10s、55℃ 退火10s、72℃延伸30s，循环扩增35次，再于72℃延伸10min。

所述步骤3）的酶切体系为：质粒和片段≤2000ng，Sbf I 1 μL，Not I 1 μL，10×buffer 5 μL，加ddH₂O 补足到50 μL。

所述步骤5）的连接体系为：T1T2-pSC101-asd:TRP1-ARS4/CEN5-Spec=1:1；连接试剂为T4 DNA连接酶。

步骤6）所述转化的方法为化学转化法，步骤为：冰浴30 min，42 ℃ 热激90 S，冰浴2 min，加入800 μL LB重悬并于37 ℃复苏45 min，5000 rpm 离心3 min，100 μL上清重悬沉淀，涂布于浓度为50 μg/mL 的Spec LB平板上，培养过夜。

本发明的第二个目的在于提供由上述方面构建得到的质粒，该质粒为低拷贝质粒，具有酵母复制子ARS4和CEN5以及原核复制子pSC101；所述质粒具有TRP、Spec、asd的筛选标记，可以实现在酵母和原核宿主中的筛选，可以同时容纳多个DNA片段用于克隆长片段DNA或基因簇的克隆和稳定表达。

本发明质粒可用于组装多个DNA片段形成完整DNA长片段，用于长基因簇克隆；该质粒能稳定遗传于大肠杆菌等细菌中，而不需要额外添加抗生素等物质；该质粒能用来合成与克隆基因簇相关的某些物质，可以是多糖，也可以是与疾病治疗有关的小分子物质等；该质粒为低拷贝质粒，可实现含长片段DNA的质粒从酵母向原核宿主中转化和稳定遗传，合成相关物质。

本发明的第三个目的在于提供上述质粒在克隆长片段DNA用于长片段DNA或基因簇组装和稳定表达，其特征在于，所述应用包括表达长度为10247bp和15922bp的禽致病性大肠杆菌O1血清型的O抗原基因簇。

所述表达长度为10247bp的禽致病性大肠杆菌O1血清型的O抗原基因簇的应用，包括如下步骤：

1）O抗原基因簇的截段扩增

设计引物，PCR扩增出含有同源序列的大小分别为5551bp、5391bp的O1-1，O1-2片段；所述引物为：

O1-1F:GCCGCCATTCTGAAATCGTTGGTCGCTATGTGCTTTCTGC

O1-1R:GGCCAAGGAGAGTAAATATCCCCTG

O1-2F:AATAAAAGTTTGTCATGTGGAAGC

O1-2R:ATTGTCTCATGAGCGAAATAGAGACGGTATAACCACGGC；

2）线性化的质粒（pQK237)的扩增

设计引物，Vector-F:AAACCACGTCAAATAATCAAGGCGCC

Vector-R:CCTGCAGGACCCGTGGGATT

扩增出大小为7562bp的片段

3）制备Mav203酵母感受态细胞

将扩增的pYA3337、O1-1、O1-2线性化片段按相同比例加入到制备的酵母感受态细胞中，采用LiAc化学转化法将线性化片段转入酵母细胞中，利用酵母细胞的重组功能重组成环形质粒，涂布于SD-Trp营养缺陷型平板上；

4)挑取阳性克隆，根据两两相邻的发生同源重组片段的上游、下游序列设计引物：

F1：GTTTGATTCAGAAGCAGGTGG

R1：GACTAAATGATCGCTGGATG

F2：AGTCATACTTATTAGAGAAG

R2：GTTGACAAAGCAATTGTCAC

F3：TGATCCGATTTATGATCTTC

R3：CAACGAACCACACTAGAGAAC

5）用酵母质粒提取试剂盒提取经转化后的Mav203酵母细胞中的质粒，命名为pQK238，再用电转化法转化到鼠伤寒沙门氏菌UK1ΔasdΔrfbp感受态细胞中，进行表性性分析。

步骤1）所述的PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min，经94 ℃变性30 s、60 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸1 min，循环扩增10次，再经94 ℃变性30 s、48 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸1 min，再于72 ℃延伸10 min。

F1和R1用于鉴定线性化的质粒的5’端与O1-1片段的连接效果，F2和R2用于鉴定O1-1与O1-2片段之间的连接效果，F3和R3用于鉴定O1-2与线性化的pQK237片段的3’端的连接效果；对扩增的pYA3337、O1-1、O1-2三个线性化片段中两两相邻的片段之间的重组效果进行PCR鉴定，三个片段都连接正确的话，则在PCR扩增中可以同时扩增出大小为1586bp，435bp，1017bp的PCR产物，以此判断阳性克隆。

可以理解的是，本发明同样可以应用在大肠杆菌O2血清型的O抗原基因簇的表达上，也可以应用到大肠杆菌另外其它O-抗原基因簇的克隆表达，以及其它细菌O-抗原基因簇的克隆表达，如志贺氏菌，霍乱弧菌等。

本发明利用酵母细胞具有较强的同源重组功能实现长片段DNA的拼接及与线性化载体的组装，将长片段DNA等分为大小接近的若干片段，分别设计与相邻片段含有同源序列的引物来扩增带有同源序列的DNA片段及线性化的载体片段，将这几个片段转化至酵母细胞中进行同源重组，实现无缝拼接。利用Trp营养缺陷型培养基进行筛选，在相邻片段之间发生同源重组部位的上游和下游序列中设计引物进行PCR鉴定，获取阳性克隆。提取酵母中组装好的质粒并转化到沙门氏菌asd基因缺失株中，利用质粒-宿主构成的asd平衡致死系统使长片段DNA在宿主中稳定存在及异源表达。最后，依次通过PCR鉴定、血清凝集反应、银染、Western-blot反应等生物学特性对阳性克隆进行验证，鉴定正确的克隆即为表达异源抗原的沙门氏菌。与其它同类质粒相比具有体积小、容纳片段大、无抗性稳定存在及方便筛选等优点。

本发明的有益效果：

1、构建的重组穿梭质粒具有既可以在酵母中复制又可以在原核细胞中复制的特点，实现含长片段DNA的质粒从酵母向原核宿主中转化；

2、可以实现含长片段DNA的质粒在异源原核宿主中的稳定存在及表达；较其他表达异源DNA长片段的方法更为快捷、高效；

3、本发明构建的质粒为低拷贝质粒，不会对异源宿主菌的基因组造成影响，亦不会影响宿主菌已知的生物学特性。

附图说明

图1为本发明质粒载体（pQK237）的构建示意图，对pYA3337质粒及扩增出的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段进行Sbf I、Not I双酶切后，分别获得载体pYA3337和质粒pYES1L中的复制子、筛选标记，通过T4 DNA连接酶构建重组穿梭质粒pQK237。

图2为在构建好的质粒中组装进禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherchia coli）APEC O1血清型的O抗原基因簇的pQK238的质粒图谱。

图3为pQK238质粒转化到沙门氏菌UK1ΔasdΔrfbp中的PCR鉴定图；泳道1: DNA ladder；泳道2: pYA3337和O2-1的连接鉴定, PCR产物大小为1586bp；泳道3: O2-1和O2-2的连接鉴定，PCR产物大小为 435bp；泳道3:O2-2和pYA3337的连接鉴定, PCR产物大小为1017bp。

图4为将构建好的pQK238质粒转化入沙门氏菌UK1ΔasdΔrfbp中的银染图，以及用E.coli O1血清与重组沙门氏菌进行免疫学反应的Western-blot鉴定图；A: UK1ΔasdΔrfbp和UK1ΔasdΔrfbp-APEC O1的银染图；泳道1和泳道2: UK1ΔasdΔrfbp-APEC O1菌株；泳道3: UK1ΔasdΔrfbp菌株； Lane 4: 含有对照质粒pYA3337的UK1 ΔasdΔrfbp菌株； B: UK1ΔasdΔrfbp and UK1ΔasdΔrfbp-APEC O1的Western-Blot 鉴定；泳道1和泳道2: UK1ΔasdΔrfbp-APEC O1菌株；泳道3: UK1ΔasdΔrfbp菌株. Lane 4: 含有对照质粒pYA3337的UK1 ΔasdΔrfbp菌株。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

常规细菌培养使用LB液体培养基配方如下：胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，NaCl 10g，加蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min备用。LB固体培养基：在每1 L LB液体培养基中加入18 g琼脂粉，121 ℃灭菌20 min，冷至65 ℃混匀后倾注于灭菌平皿中。

按照每100 mg加入1 mL的比例溶解盐酸大观霉素粉末，配制100 mg/mL 的Spec母液。使用时按照1:2000的比例加入灭菌LB培养基内混匀，制备壮观LB（50 ug/mL）培养基。

YPDA培养基配方如下：称取6.7g YNB(Yeast Nitrogen Base without amino acids)培养基，2%的葡萄糖，0.003%的腺嘌呤硫酸盐，调整pH至6.5。

SD/-Trp液体培养基配方如下：称取6.7g YNB，100mL 10×Trp dropout solution，2%的葡萄糖，0.003%的腺嘌呤硫酸盐，调整pH至5.8，115℃灭菌20minm备用， SD/-Trp固体培养基：在每1LSD/-Trp液体培养基中加入18g琼脂粉，115℃灭菌20min，冷至65℃混匀后倾注于灭菌平皿中。

穿梭质粒构建转化的DH5α感受态使用CaCl₂溶液常规方法制备，在酵母细胞中组装质粒时使用PEG/LiAc制备酵母细胞感受态，原核宿主菌使用10%甘油制备电转化感受态细胞。

pYES1L质粒购自Invitrogen公司GeneArt High-Order Genetic Assembly System，catalog number A13285，A13286；p3337质粒，由本实验室构建、保存，带有asd基因及Spec盐酸大观抗性，为了使重组的DNA长片段质粒能够更好地存在于沙门氏菌中，我们构建了沙门氏菌的asd基因缺失株，即UK1Δasd缺失株，形成具有asd平衡致死系统功能的质粒-沙门氏菌。

实施例1

1.重组穿梭质粒载体的构建

1.1 pYA3337质粒的提取，使用质粒提取试剂盒进行提取质粒。取8 mL 37 ℃培养过夜的菌液，使用限制性内切酶Sbf I和Not I消化pYA3337质粒DNA。

1.2 PCR扩增带有Sbf I 和Not I酶切位点的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段，以质粒pYES1L为模板，设计引物对其中的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段进行PCR扩增、经DNA纯化试剂盒进行产物的纯化与回收。获得含有Sbf I 和Not I酶切位点的 TRP1-ARS4/CEN5-spec片段。具体PCR扩增条件为：先于98℃变性2 min，经98℃变性10s、55℃ 退火10s、72℃延伸30s，循环扩增35次，再于72℃延伸10min。

1.3 对1.1中提取的pYA3337质粒和1.2中回收的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段进行Sbf I和Not I酶切，使用1%的琼脂糖凝胶电泳观察和回收DNA，获得在原核中复制、筛选所需的元件T1T2-pSC101-asd片段和带有相同黏性末端的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段。所用的酶切体系为：质粒和片段≤2000ng，Sbf I 1 μL，Not I 1 μL，10×buffer 5 μL，ddH₂O 补足到50 μL。

1.4 使用Solution I将1.3中酶切后的两个片段进行连接，连接体系为T1T2-pSC101-asd:TRP1-ARS4/CEN5-Spec=1:1。

1.5 制备大肠杆菌DH5α化学感受态，将连接体系转化入DH5α感受态中，所用的化学转化方法为：冰浴30 min，42 ℃热激90 S，冰浴2 min，加入800 μL LB重悬并于37 ℃复苏45 min，5000 rpm 离心3 min，100 μL上清重悬沉淀，涂布于浓度为50 μg/mL 的Spec LB平板上，培养过夜。

1.6 筛选阳性克隆，挑取单菌落接种液体LB（Cm，30 μg/mL），37 ℃摇床培养12 h，提取质粒，经酶切消化、电泳鉴定正确的重组质粒载体，分别切胶回收获取pQK237质粒重组质粒DNA。重组穿梭质粒的构建参见附图1。

实施例2

2.禽致病性大肠杆菌O1（APEC O1）血清型O抗原基因簇的组装

2.1 PCR扩增获得线性化的质粒DNA片段

设计引物扩增线性化的pQK237质粒片段

Vector-F: TTATACCGTCTCTATTTCGCTCATGAGACAATAACCCT

Vector-R: ACATAGCGACCAACGATTTCAGAATCAGAATGGCGGCCGCAGTCAG

2.2 O抗原基因簇的截段扩增

设计引物，扩增出含有同源序列的大小分别为5551bp、5391bp的O1-1，O1-2片段

O1-1F:GCCGCCATTCTGAAATCGTTGGTCGCTATGTGCTTTCTGC

O1-1R:GGCCAAGGAGAGTAAATATCCCCTG

O1-2F:AATAAAAGTTTGTCATGTGGAAGC

O1-2R:ATTGTCTCATGAGCGAAATAGAGACGGTATAACCACGGC

具体的PCR扩增条件为：具体PCR扩增条件为：98 ℃预变性2 min，经98 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸3 min，循环扩增10次，再经98 ℃变性15 s、48 ℃退火30 s、72 ℃延伸3 min，再于72 ℃延伸10 min。

2.2 制备Mav203酵母感受态细胞，将扩增的pYA3337、O1-1、O1-2线性化片段按相同比例加入到制备的酵母感受态细胞中，采用LiAc化学转化法将线性化片段转入酵母细胞中，利用酵母细胞的重组功能重组成环形质粒，涂布于SD-Trp营养缺陷型平板上。

2.3 挑取阳性克隆，根据两两相邻的发生同源重组片段的上游、下游序列设计引物

F1：GTTTGATTCAGAAGCAGGTGG

R1：GACTAAATGATCGCTGGATG

F2：AGTCATACTTATTAGAGAAG

R2：GTTGACAAAGCAATTGTCAC

F3：TGATCCGATTTATGATCTTC

R3：CAACGAACCACACTAGAGAAC

其中，F1/R1用于鉴定线性化的pQK237质粒的5’端与O1-1片段的连接效果，F2/R2用于鉴定O1-1与O1-2片段之间的连接效果，F3/R3用于鉴定O1-2与线性化的pQK237质粒的3’端的连接效果。以此对三个片段中两两相邻的片段之间的重组效果进行PCR鉴定，如果三个片段都连接正确的话在PCR扩增中可以同时扩增出大小为1586bp，435bp，1017bp的PCR产物，如果三个片段没能正确连接的话则三条PCR产物不能同时扩增出来，以此判断方式来筛选阳性克隆。

鉴定结果表明，可以同时扩增到大小为1586bp，435bp，1017bp的条带，由此可以推测携带有O抗原基因簇的重组质粒pQK238构建成功。参见附图3

具体PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min，经94 ℃变性30 s、60 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸1 min，循环扩增10次，再经94 ℃变性30 s、48 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸1 min，再于72 ℃延伸10 min。

2.4 用酵母质粒提取试剂盒提取酵母细胞中的pQK238 质粒，电转化法转化到鼠伤寒沙门氏菌UK1ΔasdΔrfbp感受态细胞中，同样用上述引物进行PCR鉴定，可以同时扩增到大小为1586bp，435bp，1017bp的条带。鉴定结果表明APEC O1的O抗原在沙门氏菌中转化成功，重组菌株命名为UK1ΔasdΔrfbp-APEC O1。

2.5 对转化前的亲本株UK1ΔasdΔrfbp和转化后的UK1ΔasdΔrfbp-APEC O1菌株进行表型分析，首先与E.coli O1 血清进行血清凝集反应检测表达的是否为O1血清型的O抗原，其次通过银染试验检测该质粒转化UK1ΔasdΔrfbp前后对异源菌株LPS的影响，进而通过Western-blot对转化前后的菌株与O1血清的免疫学反应进行检测。参见附图3。

Claims

1.一种方便克隆长片段DNA、无抗性且稳定遗传的质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）PCR扩增带有Sbf I和Not I酶切位点的T1T2-pSC101-asd片段；

2）PCR扩增带有Sbf I 和Not I酶切位点的TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段；

7）挑取单菌落接种于含盐酸大观霉素的液体LB培养基，于37 ℃摇床培养12 h，提取质粒，经酶切消化、电泳鉴定后，分别切胶回收获取重组质粒DNA。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1）和2）所述PCR扩增的步骤包括：分别以pYA3337和pYES1L为模板，设计引物对其中的T1T2-pSC101-asd片段和TRP1-ARS4/CEN5-Spec片段进行PCR扩增；所述引物为：

pYA3337-F: GCGGCCGC CATTCTGAAATGAGCTGTTGAC

pYA3337-R: CCTGCAGG ACCCGTGGGATTAAGCTAC

pYES1L-F: CCTGCAGG CGCCTTGATTATTTGACGTGGTTT

pYES1L-R: GCGGCCGC AGTCAGTGAGCGAGGAAG；

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1）和步骤3）的酶切体系为：质粒和片段≤2000ng，Sbf I 1 μL，Not I 1 μL，10×buffer 5 μL，加ddH₂O 补足到50 μL。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5）的连接体系为：T1T2-pSC101-asd:TRP1-ARS4/CEN5-Spec=1:1；连接试剂为T4 DNA连接酶。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤6）所述的转化方法为化学转化法，步骤为：冰浴30 min，42 ℃热激90 S，冰浴2 min，加入800 μL LB重悬并于37 ℃复苏45 min，5000 rpm离心3 min，100 μL上清重悬沉淀，涂布于浓度为50 μg/mL的含盐酸大观霉素的LB固体培养基上，培养过夜。

6.一种由权利要求1-5任一项所述的构建方法构建而得的质粒，其特征在于，所述质粒具有酵母复制子ARS4/CEN5、原核复制子pSC101，TRP、Spec筛选标记和asd平衡致死系统，可以实现在酵母和原核宿主中的筛选及无抗性稳定遗传；所述质粒为低拷贝质粒，可实现含长片段DNA的质粒从酵母向原核宿主中的转化和稳定遗传表达。

7.权利要求6所述的质粒在同时容纳多个DNA片段用于长片段DNA或基因簇组装并稳定表达的应用，其特征在于，所述应用包括表达长度为10247bp的禽致病性大肠杆菌O1血清型的O抗原基因簇。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述表达长度为10247bp的禽致病性大肠杆菌O1血清型的O抗原基因簇的应用，包括如下步骤：

1）O抗原基因簇的截段扩增

O1-1F:GCCGCCATTCTGAAATCGTTGGTCGCTATGTGCTTTCTGC

O1-1R:GGCCAAGGAGAGTAAATATCCCCTG

O1-2F:AATAAAAGTTTGTCATGTGGAAGC

O1-2R:ATTGTCTCATGAGCGAAATAGAGACGGTATAACCACGGC；

2)线性化的质粒载体的扩增

设计引物，Vector-F:AAACCACGTCAAATAATCAAGGCGCC

Vector-R:CCTGCAGGACCCGTGGGATT

扩增出大小为7562bp的片段；

3）制备Mav203酵母感受态细胞

挑取阳性克隆，根据两两相邻的发生同源重组片段的上游、下游序列设计引物：

F1：GTTTGATTCAGAAGCAGGTGG

R1：GACTAAATGATCGCTGGATG

F2：AGTCATACTTATTAGAGAAG

R2：GTTGACAAAGCAATTGTCAC

F3：TGATCCGATTTATGATCTTC

R3：CAACGAACCACACTAGAGAAC

4）用酵母质粒提取试剂盒提取经转化后的Mav203酵母细胞中的质粒，再用电转化法转化到鼠伤寒沙门氏菌UK1ΔasdΔrfbp感受态细胞中，进行表型性分析。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤1）所述的PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min，经94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，循环扩增10次，再经94 ℃变性30 s、48 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，再于72 ℃延伸10 min。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤3）中，F1和R1用于鉴定线性化的质粒的5’端与O1-1片段的连接效果，F2和R2用于鉴定O1-1与O1-2片段之间的连接效果，F3和R3用于鉴定O1-2与线性化的质粒的3’端的连接效果；对扩增的pYA3337、O1-1、O1-2三个线性化片段中两两相邻的片段之间的重组效果进行PCR鉴定，三个片段都连接正确的话，则在PCR扩增中可以同时扩增出大小为1586bp，435bp，1017bp的PCR产物，以此判断阳性克隆。