CN109609520A - 一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗 - Google Patents

一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗，非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，含有包被的非洲猪瘟的mRNA；非洲猪瘟病毒mRNA疫苗的制备方法为将重组K205R‑IRES‑A104R‑IRES‑E183L基因连接至pMD19‑T载体，构成亲本pMD19‑K205R‑IRES‑A104R‑IRES‑E183L质粒；将亲本质粒转化感受态细胞，扩增后提取质粒即克隆质粒，在克隆质粒中提取目的片段；将目的片段进行体外转录即得mRNA。本发明非洲猪瘟mRNA疫苗，填补现有的空白区域、用于预防ASFV感染；克隆质粒制备简单，成本较低，适用于产业化生产。

Description

一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起的猪的一种病毒性疾病，是一种急性、热性、高度接触性传染病，其常表现出全身出血、呼吸障碍和神经症状等临床症状，具有病程时间短、高病死率等特征，在家猪中导致的死亡率接近100％，因此我国将其列为一类传染病，同时该病也是世界动物卫生组织(OIE)的法定报告动物疫病之一。ASFV主要在巨噬细胞的细胞质中复制，并且是非洲猪瘟病毒科中唯一成员，也是唯一由节肢动物传播的DNA病毒。2018年8月2日经中国动物卫生与流行病学中心诊断，沈阳市发生第一例非洲猪瘟疫情，截至2018年11月23日共发生了74起非洲猪瘟疫情，全国累计扑杀生猪60万头，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。
近年来RNA分子领域相关技术突破性进展，mRNA疫苗在流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等多种传染病上取得了一定的研究成果，mRNA疫苗将mRNA传递至细胞，表达产生蛋白，从而使机体获得免疫保护。mRNA作为疫苗分子相对于DNA分子具有突出的优点：它不需要任何的核定位信号、体内无需转录使突变风险大大降低且不存在整合到基因组的可能。
K205R基因在病毒感染猪4h时表达，能抑制INF-β的表达，表达的蛋白pK205R能在猪中引起强烈的抗体反应；A104R基因表达蛋白为组蛋白类似蛋白，能启动强烈的抗体反应；
(Lokhandwala,Shehnaz et al.“Adenovirus-vectored novel African SwineFever Virus antigens elicit robust immune responses in swine”PloS one vol.12,5e0177007.8May.2017,doi:10.1371/journal.pone.0177007)；E183L基因合成的P54蛋白是ASFV的免疫显性结构病毒抗原。因此，可以针对上述基因开发预防非洲猪瘟的疫苗。
目前还没有非洲猪瘟病毒mRNA疫苗的研制，因此开发一种mRNA疫苗，用于预防ASFV感染。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)目前还没有非洲猪瘟病毒mRNA疫苗的研制；
(2)DNA疫苗不能完全排除少数质粒DNA插入到染色体上引起突变的可能性；
(3)一个或两个非洲猪瘟病毒抗原构建的DNA疫苗并不能诱导较高免疫保护。
解决上述技术问题的意义：
本发明填补目前非洲猪瘟病毒mRNA疫苗的空白；本发明最关键的部分就是进行体外转录获得mRNA分子，并且在大量生产mRNA疫苗过程中，需要确定mRNA的核糖核苷酸序列即可进行大规模的生产、复制；
本发明中mRNA作为疫苗分子相对于DNA作为疫苗分子有突出的优点：它不需要任何的核定位信号、转录让突变风险大大降低且不存在整合到基因组的可能；
本发明含有三个非洲猪瘟病毒抗原的mRNA能提供较高的免疫保护。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗。
本发明是这样实现的，一种非洲猪瘟病毒合成基因，所述非洲猪瘟病毒合成基因为K205R-IRES-A104R-IRES-E 183L，序列为SEQ ID NO：1。
本发明的另一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒合成基因的建立方法包括：
步骤一：合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段，将合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段用引物P1、P2进行扩增，构成重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因；
步骤二：将重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因连接至pMD19-T载体，构成亲本pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒；
步骤三：将上述亲本质粒转化感受态细胞，扩增后提取质粒即克隆质粒，在克隆质粒中提取目的片段；
步骤四：将上述目的片段进行体外转录即得合成基因。
进一步，所述步骤二中，优选的重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因为：将T7启动子、限制性酶切位点BamHⅠ和限制性酶切位点XhoⅠ重组到K205R-IRES-A104R-IRES-E183L的基因。
进一步，所述步骤三具体包括：
将亲本质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑取白色转化菌落，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；
将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/ml kana的LB液体培养基中，37℃，300rpm过夜培养；
将过夜培养的大肠杆菌采用无内毒素质粒抽提试剂盒进行抽提，抽提出的质粒即为克隆质粒。
进一步，所述步骤一具体包括：
K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段中三基因K205R、A104R和E183L由IRES链接；
IRES能招募核糖体对合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因进行翻译；
IRES与外源cDNA融合，IRES能独立地起始翻译。
本发明的另一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，所述的非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，含有包被所述的非洲猪瘟病毒合成基因。
具体包括：
合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因→利用P1、P2进行扩增，构成重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因→连接至pMD19-T载体→构成亲本pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒→转化进感受态细胞进行扩增→提取目的片段K205R-IRES-A104R-IRES-E183L(合成这个基因通过上述步骤进行扩增，也就是增值，低成本获得更多的目的片段/基因)基因→将提取的目的片段进行体外转录得mRNA(进行上述操作所需要得到的最终结果)→mRNA包被，得mRNA疫苗。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明提供一种非洲猪瘟mRNA疫苗，填补现有的空白区域。
本发明的mRNA疫苗用于预防ASFV感染；克隆质粒制备简单，成本较低，适用于产业化生产。
本发明的mRNA疫苗相对于DNA疫苗有突出的优点：它不需要任何的核定位信号、转录让突变风险大大降低且不存在整合到基因组的可能；它可以在胞质中直接翻译，无需转运至核内。
本发明的mRNA疫苗相对于传统疫苗有突出的优点：大多数传统疫苗是由一种病毒或其他病原体的灭活形式组成的，这些疫苗通常需要很长时间来生产，并不总是引起强烈的免疫反应；mRNA疫苗能快速生产，能诱导宿主细胞产生很多mRNA编码的蛋白质的副本，这会比把蛋白质接种到体内引起更强烈的反应。
附图说明
图1是本发明实施例提供的非洲猪瘟病毒合成基因建立方法流程图。
图2是本发明实施例提供的pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒构建示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，含有包被的非洲猪瘟的合成基因。
下面结合具体方案对本发明的应用原理作详细说明。
本发明实施例提供的非洲猪瘟病毒合成基因，所述非洲猪瘟病毒合成基因序列为SEQ ID NO：1。
如图1所示，本发明实施例提供的非洲猪瘟病毒合成基因建立方法具体包括以下步骤：
S101:合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段，将合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段用引物P1、P2进行扩增，构成重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因；
S102:将重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因连接至pMD19-T载体，构成亲本pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒；
S103:将上述亲本质粒转化感受态细胞，扩增后提取质粒即克隆质粒，在克隆质粒中提取目的片段；
S104:将上述目的片段进行体外转录即得合成基因。
步骤S102中，优选的重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因SEQ ID NO：4为：将T7启动子、限制性酶切位点BamHⅠ和限制性酶切位点XhoⅠ重组到K205R-IRES-A104R-IRES-E183L的基因。
步骤S103具体包括：
将亲本质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑取白色转化菌落，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；
将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/ml kana的LB液体培养基中，37℃，300rpm过夜培养；
将过夜培养的大肠杆菌采用无内毒素质粒抽提试剂盒进行抽提，抽提出的质粒即为克隆质粒。
步骤S101具体包括：
K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段中三基因K205R、A104R和E183L由IRES链接；
IRES能招募核糖体对合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因进行翻译；
IRES与外源cDNA融合，IRES能独立地起始翻译。
在本发明实施例中，提供一种非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，所述的非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，含有包被所述的非洲猪瘟病毒合成基因。
具体包括：
合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因→利用P1、P2进行扩增，构成重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因→连接至pMD19-T载体→构成亲本pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒→转化进感受态细胞进行扩增→提取目的片段K205R-IRES-A104R-IRES-E183L(合成这个基因通过上述步骤进行扩增，也就是增值，低成本获得更多的目的片段/基因)基因→将提取的目的片段进行体外转录得mRNA(进行上述操作所需要得到的最终结果)→mRNA包被，得mRNA疫苗。
下面结合具体实验对本发明的应用原理进行进一步说明；
实验1；
1、试剂准备
1)LB液体培养基：将酵母粉5g，胰蛋白胨10g和NaCl 10g溶解在1L蒸馏水中，调至pH＝7.2～7.6，待各组分溶解后高压灭菌。
2、DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备
1)将DH5α接种于固体培养基后挑取单菌落接种到LB液体培养基中，300r/min 37℃摇晃过夜；
2)将上述培养过夜的细菌1ml接种于50ml的LB液体培养基中，200r/min37℃振荡培养2～4h，使OD600约0.5；
3)将上述50ml菌液转移到50ml离心管中，冰浴30min后4℃3500r/min离心10min，弃上清；
4)在上述离心管中加入预先冰浴的0.1mol/L的CaCl2溶液25ml，重悬细菌并冰浴30min，之后4℃3500r/min离心10min，去上清；
5)在上述50ml离心管中加入预先冰浴的0.1mol/L的CaCl2溶液2ml，重悬细菌即为DH5α大肠杆菌感受态细胞。
3、克隆质粒的制备
1)设计能扩出K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因的引物，在上游引物P1添加限制性酶切位点BamHⅠ和T7启动子，在下游引物P2添加限制性酶切位点XhoⅠ。
2)合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段，并用上述引物扩增，得含有T7启动子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段。
3)将上述重组基因片段克隆至载体pMD19-T的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒；
如图2所示，本发明实施例提供的pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒构建示意图。
4)将上述亲本质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑取白色转化菌落，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；
5)将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/ml kana的LB液体培养基中，37℃，300rpm过夜培养；
6)将上述过夜培养的大肠杆菌采用Omega公司无内毒素质粒抽提试剂盒进行抽提，抽提出的质粒即为克隆质粒。
4、mRNA的制备
1)将上述克隆质粒的制备中步骤6)已抽提的克隆pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒进行双酶切，后回收得到线性化无内毒素片段。
2)将线性化无内毒素片段进行体外转录，体外转录参考Ambion公司发明技术进行体外转录操作。
5、mRNA的包被
1)将上述mRNA的制备步骤2)中的mRNA进行包被，在Eppendorf管中加入0.5μl脂质体混合粉末加入1ml DEPC水，涡旋混匀30s，加入1ml mRNA轻柔混匀，加入700μl DEPC水轻柔混匀；以上操作均在4℃环境内进行。
制备得到的包被mRNA可作为保护性mRNA疫苗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2633
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
<210> 4
<211> 2670
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4

Claims (6)

1.一种非洲猪瘟病毒合成基因，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒合成基因为K205R-IRES-A104R-IRES-E 183L，序列为SEQ ID NO：1。
2.一种如权利要求1所述非洲猪瘟病毒合成基因的建立方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒合成基因的建立方法包括：
步骤一：合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段，将合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段用引物P1、P2进行扩增，构成重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因；
步骤二：将重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因连接至pMD19-T载体，构成亲本pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒；
步骤三：将上述亲本质粒转化感受态细胞，扩增后提取质粒即克隆质粒，在克隆质粒中提取目的片段；
步骤四：将上述目的片段进行体外转录即得合成基因
K205R-IRES-A104R-IRES-E183L。
3.如权利要求2所述的非洲猪瘟病毒合成基因的建立方法，其特征在于，其特征在于，所述步骤一具体包括：
K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段中三基因K205R、A104R和E183L由IRES链接；
IRES能招募核糖体对合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因进行翻译；
IRES与外源cDNA融合，IRES能独立地起始翻译。
4.如权利要求2所述的非洲猪瘟病毒合成基因的建立方法，其特征在于，所述步骤二中，优选的重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因为：将T7启动子、限制性酶切位点BamHⅠ和限制性酶切位点XhoⅠ重组到K205R-IRES-A104R-IRES-E183L的基因。
5.如权利要求2所述的非洲猪瘟病毒合成基因的建立方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：
将亲本质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑取白色转化菌落，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；
将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/ml kana的LB液体培养基中，37℃，300rpm过夜培养；
将过夜培养的大肠杆菌采用无内毒素质粒抽提试剂盒进行抽提，抽提出的质粒即为克隆质粒。
6.一种非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，含有包被的权利要求1所述的非洲猪瘟病毒合成基因，具体包括：
合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因→利用P1、P2进行扩增，构成重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因→连接至pMD19-T载体→构成亲本pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒→转化进感受态细胞进行扩增→提取目的片段K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因→将提取的目的片段进行体外转录得mRNA→mRNA包被，得mRNA疫苗。
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CN109810948A (zh) * 2019-01-18 2019-05-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体
CN110218732A (zh) * 2019-06-14 2019-09-10 延安大学 一种非洲猪瘟病毒串联基因、共表达载体、构建方法及应用

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